CN114344483A - 基于超小分子H-dot纳米载药系统的肺癌诊疗一体化的靶向纳米药物及其制备方法 - Google Patents
基于超小分子H-dot纳米载药系统的肺癌诊疗一体化的靶向纳米药物及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114344483A CN114344483A CN202210055437.XA CN202210055437A CN114344483A CN 114344483 A CN114344483 A CN 114344483A CN 202210055437 A CN202210055437 A CN 202210055437A CN 114344483 A CN114344483 A CN 114344483A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dot
- drug
- nano
- cdpl
- gef
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Abstract
本发明公开了一种基于超小分子H‑dot纳米载药系统的肺癌诊疗一体化的靶向纳米药物(Gef/H‑dot)及其制备方法，属于靶向纳米药物技术领域，制备方法包括以下步骤：将β‑CD转化为Ald‑CD，将Ald‑CD与EPL结合，形成CDPL，将CDPL与近红外(NIR)荧光基团结合，再琥珀酰化，得到NIR荧光体‑CDPL±，并将其命名为H‑dot，将H‑dot与Gef靶向药物复合，得到Gef/H‑dot；是一种理想的多功能纳米药物，在进行实时NIR荧光图像引导的分期检测、手术干预和病理辅助方面具有无限潜力，还可以定向输送抗肿瘤药物(Gef)，实现高效的靶向治疗，并减少治疗相关不良反应。
Description
技术领域
本发明涉及靶向纳米药物技术领域，特别是涉及一种基于超小分子H-dot纳米载药系统的肺癌诊疗一体化的靶向纳米药物及其制备方法。
背景技术
为了提高肺癌患者的生存率，人们开发了一种新的围手术期治疗策略，在手术切除前后采用多功能纳米粒子治疗(即新辅助治疗/辅助治疗)。这种围手术期治疗方式有助于控制微转移，并且能够降低手术切除的风险和难度。基于此，多功能纳米药物作为新一代的靶向治疗方法而备受关注。
表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)作为治疗EGFR突变型 NSCLC的标准方案已被广泛应用于临床，其开发引领了恶性肺肿瘤靶向治疗的长足进展。吉非替尼(Gef，Gefitinib)属于一代经典的EGFR-TKIs，通过靶向 ATP裂隙诱导细胞凋亡，阻止EGFR自体磷酸化的发生。与传统化疗相比，EGFR 突变的NSCLC患者在围手术期接受Gef治疗，其生存率有所提高。然而，大多数患者不可避免地在8至12个月内对Gef产生获得性耐药。同时，Gef可能导致间质性肺病(ILD)和急/慢性肝损伤等药物相关不良反应，严重甚至致命。因此，为改善肺癌患者的预后，针对降低EGFR-TKIs不良发应的开展研究至关重要。
肿瘤切除不完整或手术切缘阳性会导致术后患者复发和转移。尽管支气管内超声引导下的经支气管针吸术(EBUS-TBNA)和正电子发射断层扫描(PET)/ 计算机断层扫描(CT)已被用于肿瘤术前评估。但是，对于术中肉眼难以辨别的肿瘤和/或淋巴结转移(LNM)，难以快速准确定位并有效确定安全边缘。因此，术中对肿瘤和淋巴结转移的正确识别是完整切除的关键。针对复杂外科手术，迫切需要开发新的有效策略，使肿瘤得以精确识别。多种术中成像技术中，NIR实时荧光成像是新型安全有效的探测手段，近年来备受关注。
肺部表面积大，是适合工程化纳米载体药物输送的靶器官。纳米药物能够促进所载治疗药物在肺组织中的调节释放，反之可以减少药物剂量频率，提高患者的依从性。因此，使用纳米药物对肺肿瘤进行肿瘤成像和治疗，显示出巨大的临床应用潜力。然而，由于精确的纳米药物工程化需要考虑药物形状、流体动力学直径、表面电荷、溶解度、稳定性、灵活性、组成和配方等因素，因此工程化纳米药物的进展仍然极具挑战。这些因素可能会影响到药物本身的药代动力学、血清中的理化特性(如生物分布、目标结合、清除，以及最终疗效和毒性等)。而尺寸和表面特征则是设计靶向肿瘤以及肿瘤微环境输送药物的纳米载体的关键因素。理想的纳米药物应该能够精确地靶向肿瘤，并且对正常组织比较安全，这通常需要它能够快速排泄到体外和/或有效地降解为无毒代谢产物。
发明内容
由于肿瘤以及转移淋巴结安全边缘的定位存在一定难度，在没有影像指引的情况下，外科医生在手术过程中常常通过肉眼难以准确判断。因此，使用术中实时图像引导的方式协助外科医生进行肿瘤以及转移淋巴结的切除，被认为是彻底清除肿瘤组织的最佳方法。基于此，本发明提供了一种基于超小分子H-dot纳米载药系统的肺癌诊疗一体化的靶向纳米药物(Gef/H-dot)及其制备方法。在近红外(NIR)荧光追踪H-dot靶向纳米药物的引导下，清晰划定肿瘤边界以及转移淋巴结，实时图像引导开展手术。在动物实验中，该靶向纳米药物以高信号背景比(SBRs)明确区分了肿瘤和周围组织，成功协助术者切除了肺原位肿瘤以及转移淋巴结。并且，术后通过红外线荧光探测，在切除的体外标本中明确检测到肿瘤病变。该技术有助于病理医师轻松、准确地从术后淋巴结清扫组织中分离出转移淋巴结，并且快速判断可能存在的肿瘤阳性切缘。
Gef/H-dot靶向纳米药物能够针对EGFR敏感突变的肺癌患者提供高效的个性化围手术期靶向治疗，以降低肿瘤复发和转移的可能性。H-dot纳米载药系统能够更快更多地将药物带入肿瘤部位，进一步Gef/H-dot靶向纳米药物在肿瘤内部通过调节各靶点以及信号通路实现抗肿瘤靶向治疗，减缓肿瘤的发展。同时，本发明使用NIR成像技术，对靶向药物(Gef)的输送以及肿瘤辩护情况进行了实时动态监测。
Gef/H-dot药代动力学研究显示，H-dot载药系统通过改善所载Gef体内分布以及排泄速度，能够有效降低其不良反应，进一步提高患者的依从性。Gef可能影响健康相关的生活质量，部分患者会因不良反应而中断治疗。H-dot纳米载药平台改变了所载靶向药物的药效和毒性。不但可以避免非目标组织的非特异性摄取，而且由于纳米药物的EPR特性，可以更有效地将所在药物递送到肿瘤部位。
H-dot超小纳米药物载药系统是一种集生物医学成像、诊断和靶向药物输送为一体的诊疗一体化的工程化药物优化体系纳米平台，这种个性化多功能的纳米医学技术必将显示出巨大的临床应用潜力。基于前期探索的“模块化设计技术”的考量，本发明合成了肾脏可清除H-dot为药物载体的纳米药物递送系统。该系统在ε-聚赖氨酸骨架上有一个两性离子表面以保证其不粘特性，并使用环糊精用于疏水性目标药物的递送。Gef/H-dot具有理想的PK模式以及两室模型曲线，表现为快速的初始衰减，显示出高效的肿瘤靶向分布。Gef/H-dot在术中、术后实时NIR荧光图像引导进行实时的分期检测、手术干预和病理辅助方面具有极大潜力；同时H-dot纳米载药系统还可以定向输送抗肿瘤药物(Gef)到达肿瘤局部，以实现高效靶向治疗，并减少药物不良反应。未来期望通过更加广泛深入的临床研究，验证Gef/H-dot在肺癌患者体内增效、解毒的作用，实现其临床转化。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种基于超小分子H-dot纳米载药系统的肺癌诊疗一体化的靶向纳米药物的制备方法，包括以下步骤：首先将β-环糊精(β-CD)转化为单醛- 环糊精(Ald-CD)，将Ald-CD与e-多聚-L-赖氨酸(EPL)结合，形成单醛-环糊精结合的e-多聚-L-赖氨酸，记作CDPL，然后将CDPL与近红外(NIR)荧光基团结合，得到NIR荧光基团-CDPL，再将NIR荧光基团-CDPL琥珀酰化，得到近红外荧光体-CDPL±，即为H-dot，将H-dot与吉非替尼(Gef)靶向药物复合，得到基于超小分子H-dot纳米载药系统的肺癌诊疗一体化的靶向纳米药物。
进一步地，β-CD转化为Ald-CD的方法如下：将β-CD溶解于无水二甲基亚砜(DMSO)中，并向该溶液中加入邻苯二甲酸二甲酯(DMP)，室温搅拌；将上述反应液倒入乙酸乙酯/丙酮混合液中沉淀，储存过夜；次日，真空过滤回收沉淀物，并将其溶解于DMSO中；然后将此溶液倒入乙酸乙酯/丙酮中，离心，丢弃上清液；将沉淀重溶于去离子水中，并再次倒入乙酸乙酯/丙酮中沉淀，重复上述操作两次；最后一次沉淀后，将沉淀物溶解在去离子水中并搅拌，然后冻干；冻干后，回收白色固体，白色固体即为单醛-环糊精(Ald-CD)。
进一步地，所述β-CD与DMSO的料液比为15g：100mL，所述β-CD与DMP 的质量比为15：(6～7)。
进一步地，Ald-CD与EPL结合的方法如下：将Ald-CD溶解在醋酸缓冲液中，然后加入EPL，室温搅拌，得到混合物，向所述混合物中加入硼氢化钠，继续室温搅拌，随后，用分子量截止值为6～8kDa的纤维素膜进行动态透析；透析后于-80℃下冻干，获得米白色绒毛状固体，即为CDPL。
进一步地，所述Ald-CD与所述醋酸缓冲液的料液比为16g：(500～600) mL，所述Ald-CD与所述EPL的质量比为16：(2～3)，所述Ald-CD与所述硼氢化钠的质量比为16：1。
进一步地，所述CDPL与近红外荧光基团结合过程如下：将NIR荧光团溶解于DMSO中以制备NIR荧光团溶液，将CDPL溶解在pH 9.0的磷酸缓冲盐 (PBS)中，制备CDPL溶液，在搅拌状态下，将所述近红外荧光团溶液滴加到所述CDPL溶液中，室温继续搅拌；加入氢氧化钠(NaOH)水溶液，使反应液的pH值始终保持在9.0；3h后，将所述反应液倒入乙酸乙酯/丙酮中沉淀，离心，丢弃上清液，再用去离子水溶解沉淀，随后再次倒入乙酸乙酯/丙酮中沉淀；重复上次操作两次，所得产品在真空中干燥过夜，得到固体，即为NIR荧光基团-CDPL。
进一步地，所述NIR荧光团为ZW800-1C-NHS酯。
进一步地，所述NIR荧光基团-CDPL琥珀酰化过程如下：用琥珀酸酐的二甲基亚砜溶液进行琥珀酰化。
进一步地，所述Gef靶向药物与H-dot的摩尔比为(2：1)。
本发明将β-环糊精(β-CD)转化为单醛-环糊精(Ald-CD)，将Ald-CD与e- 多聚-L-赖氨酸(EPL，Epsilon-poly-L-lysine)结合，形成环糊精共轭EPL(CDPL， CD conjugatedEPL)。将CDPL与近红外(NIR)荧光基团结合，再琥珀酰化，得到NIR荧光体-CDPL±，并将其命名为H-dot(Harvard-dot)。将H-dot与吉非替尼(Gef，Gefitinib)靶向药物复合，得到Gef/H-dot。诊疗一体化的Gef/H-dot 是一种理想的多功能纳米药物，在进行实时NIR荧光图像引导的分期检测、手术干预和病理辅助方面具有无限潜力，还可以定向输送抗肿瘤药物(Gef)，实现高效的靶向治疗，并减少治疗相关不良反应。
本发明还提供所述制备方法制备得到的基于超小分子H-dot纳米载药系统的肺癌诊疗一体化的靶向纳米药物。
本发明还提供所述基于超小分子H-dot纳米载药系统的肺癌诊疗一体化的靶向纳米药物在提高靶向药物靶向性以及降低药物副作用中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明所构建的以H-dot为载体的多功能纳米平台系统，能够将图像引导与靶向治疗相结合，使用诊疗一体化的模式，手术过程中在NIR荧光图像引导下实时探测肺肿瘤以及转移淋巴结，同时施以针对特定肿瘤细胞的靶向治疗。由于 H-dot超小分子纳米载体具有改变药物生物分布、优化药物水溶性以及生物利用度，并且具有无毒易清除的特性，因此可以将靶向药物更好地带入肿瘤组织的同时，降低正常组织的非特异性摄取量。H-dot纳米载药平台在提升靶向药物疗效的同时，也减少了其相关不良反应，是一种极具转化潜力的诊疗一体化多功能新型纳米药物。
本发明公开了以下技术效果：
在小鼠肺肿瘤模型动物体内实验中，使用Gef/H-dot以提高SBRs，通过NIR 荧光实时引导清晰划定肿瘤以及转移淋巴结的边界，成功切除了肺原位肿瘤、皮下移植瘤以及转移淋巴结。该技术转化应用，将有助于协助手术医师准确快速切除肿瘤。并且，通过术后使用荧光探测，在切除的体外标本中快速探测肿瘤病变，准确分离转移淋巴结并识别阳性切缘，有助于协助病理医师快速判断并准确取材。同时，Gef/H-dot可能对于EGFR敏感突变的肺癌患者提供高效的个性化围手术期靶向治疗，有助于阻止肿瘤的浸润并清除微小残留病灶，从而降低肿瘤复发和转移的风险。
药代动力学研究显示，Gef/H-dot的PK曲线较游离药物有所改善。Gef/H-dot 可以避免正常组织的非特异性吸收，并且借助H-dot的聚合表面能够更有效地将目标药物输送到肿瘤部位。此外，由于纳米药物的持续释放特性，在肿瘤部位能够有效维持药物浓度。pH诱导的药物释放试验表明，由于目标药物与β-CD的非极性腔体之间的疏水作用减少，Gef/H-dot在酸性肿瘤微环境中失去稳定性并有效释放目标药物(Gef)，而在中性生理环境中保持稳定。基于此，H-dot纳米载药系统可以在肿瘤部位定向释放药物，增加肿瘤间的药物积累，抵抗非特异性吸收，进而提高抗肿瘤治疗效果，因此相较于其他纳米载药系统更有优势。本发明使用实时NIR成像技术，监测药物的输送、生物分布、在肿瘤中的积累，并且通过信号强度的变化观察肿瘤生长抑制情况，观察肿瘤高特异性摄取以及正常组织的低非特异性摄取和低背景信号。与游离靶向药物Gef相比，Gef/H-dot800复合纳米药物的抗肿瘤效果明显增强，与体外毒性试验结果一致。另外，Gef/H-dot 的最佳PK曲线显示了，Gef/H-dot可以有效避免非肿瘤组织的非特异性摄取，并且由于纳米药物的特性，可以更加有效地将目标药物传递到肿瘤部位，该药物分布特性有助于减少游离靶向药物Gef不良反应。因此，H-dot超小纳米载药平台可用于图像引导和药物输送应用，能够极大减少游离药物相关副作用，这也是纳米药物成功临床转化的关键。
综上所述，诊疗一体化的Gef/H-dot是一种理想的多功能纳米药物。该复合物在进行实时NIR荧光图像引导的分期检测、手术干预和病理辅助方面具有无限潜力；同时可以定向输送抗肿瘤药物(Gef)富集于肿瘤部位，以实现高效的靶向治疗，并减少治疗相关不良反应。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明诊疗一体化Gef/H-dot的理化特性图，其中a为H-dot的化学结构，b为Gef及其与β-CD复合物的化学结构，c为Gef/H-dot800复合物的吸收和荧光发射光谱；
图2为本发明靶向药物与H-dot摩尔比，其中a为Gef标准溶液的紫外吸收光谱，b为H-dot和Gef/H-dot的紫外吸收光谱；
图3为不同物质的SEC-HPLC检测结果，其中a为H-dot的检测结果，b为 CDPL的检测结果，c为ZW800的检测结果；
图4为测定流体力学直径的蛋白质标准曲线，其中a为蛋白质标准混合物通过Waters XBridge
SEC柱的洗脱色谱图，检测波长为254nm，b为半对数图；
图5为ZW800-CDPL±(H-dot)茚三酮试验；
图6为β-CD、EPL+和CDPL+在D2O的1H-NMR光谱分析；
图7为Gef/H-dot药物释放检测结果；
图8为使用H-dot、Gef、Gef/H-dot处理24h前后，LLC细胞形态学改变图；
图9为Gef/H-dot的生物分布和药代动力学结果，其中a为肾脏可清除H- dot的药代动力学、药物分布和药物清除示意图，b为切除器官的彩色和NIR荧光图像，c为H-dot的生物分布，d为Gef/H-dot生物分布比较；
图10为Gef/H-dot在LLC肺肿瘤小鼠体内实时图像引导的手术干预以及 NIR荧光引导的组织病理学检测结果，其中a为NIR荧光图像引导下的皮下肿瘤手术，b为原位肺肿瘤和纵隔转移淋巴结，以及c为区域/远处转移淋巴结，包括腋窝和锁骨上淋巴结转移，d为术中荧光成像的引导下，切除转移淋巴结与正常淋巴结的比较，e为术后组织病理学检查(左上)，H&E染色图像(右上)和 NIR荧光显微镜图像(左下、右下)，通过荧光检测区分出LLC肿瘤细胞与正常细胞区域。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明中H-dot800指的是ZW800-1C-NHS酯制备得到的H-dot。
本发明ZW800-1C-NHS酯类溶液通过购买得到。
实施例1H-dot的制备
β-CD转化为Ald-CD：将15g的β-CD(13.22mmol)溶解于100mL的无水DMSO中，并向该溶液中加入6.73g的DMP(15.86mmol)，室温下搅拌2h； 2h后，将上述反应液倒入4℃的乙酸乙酯/丙酮(20％v/v)混合液中沉淀，4℃储存过夜。次日，真空过滤回收沉淀物，并将其溶解于DMSO中；然后将此溶液倒入750mL冷的乙酸乙酯/丙酮(20％v/v)中，3000rpm离心15min，丢弃上清液；将沉淀重溶于去离子水中，并再次倒入乙酸乙酯/丙酮中沉淀，重复上述操作两次；最后一次沉淀后，将沉淀物溶解在75mL去离子水中并搅拌1h；然后冻干以除去复合物丙酮和DMSO，冻干后，可回收得到16g的白色固体，即为Ald-CD。
Ald-CD与EPL的结合：将16g的Ald-CD(14.10mmol)溶解在550mL的醋酸缓冲液(0.2M，pH 4.5)中，然后加入2.2g的EPL(0.564mmol)；室温下搅拌2h后，向该反应混合物中加入1g硼氢化钠(26.45mmol)，将希夫碱还原成二级胺，继续室温下搅拌72h，随后用分子量截止值(MWCO)为6～8kDa 的纤维素膜进行动态透析24h；透析后于-80℃下冻干，以获得3.75g的米白色绒毛状固体。为了表征β-CD结合的EPL(CDPL)，使用1H-NMR光谱法确定共轭到EPL的β-CD数量。此外，使用尺寸排除色谱法(SEC)确定CDPL的纯度，并确认不存在未结合的Ald-CD。
NIR荧光团与CDPL的结合：将22.9mgNIR荧光团(22.38mmol)溶解于 1mL的DMSO中，以制备ZW800-1C-NHS酯的溶液。将250mg CDPL(18.65 μmol，MW 13，403)溶解在25mL的PBS(pH 9.0)中，制备CDPL溶液；将 ZW800-1C-NHS酯类溶液滴加到CDPL溶液中，室温下搅拌3h，并根据需要加入0.6M的NaOH水溶液，使反应液的pH值始终保持在9.0，3h后将上述反应液倒入250mL的乙酸乙酯/丙酮(20％v/v)中得到沉淀，3000rpm离心15min，丢弃上清液；再用去离子水溶解ZW800-CDPL，随后再次倒入乙酸乙酯/丙酮中沉淀，重复上次操作两次，所得产品在真空中干燥过夜，得到绿色固体。
ZW800-CDPL的琥珀酰化：为了获得兼性离子型的H-dot，将152.8mg琥珀酸酐(1.53mmol)溶解在DMSO(250mg/mL)中，将上述溶液滴加到用PBS (pH 9.0；10mg/mL)溶解的1：9ZW800-CDPL：CDPL(1.8g，130mmol)中，并在室温下将混合物搅拌30min(在整个反应过程中，根据需要加入0.6M NaOH，使反应液pH值保持在9.0)，一旦通过茚三酮试验确认了发生部分琥珀酰化，随即将产品用分子量截止值(MWCO)为6～8kDa的纤维素膜对去离子水透析24 h；将终溶液在-80℃下冻干，得到最终具有兼性离子型的NIR荧光体-CDPL±，也被称为H-dot。
本发明诊疗一体化Gef/H-dot的理化特性见图1。其中a为H-dot的化学结构，b为Gef及其与β-CD复合物的化学结构，c为Gef/H-dot800复合物的吸收和荧光发射光谱。从图1可知，H-dot的精确结构被阐明(图1a)。纳米平台的尺寸和表面特性是设计纳米平台的关键，这些因素影响血清结合、生物分布、药代动力学/药效学(PK/PD)、靶向性、疗效和毒性。Gef/H-dot在非常高浓度(～0.5 M)下也没有溶解度问题，说明H-dot可以通过形成稳定的包合物，大大增加疏水性药物的水溶性。此外，使用Discovery Studio 3.0中的CDOCKER协议进行对接模拟，结果显示Gef与CD复合物的结合能较低，为-35.67kcal/mol，表明 Gef/H-dot在生理条件下相当稳定(图1b)。
实施例2Gef/H-dot的制备
选择β-CD的三维结构作为对接受体(Protein Data Bank ID代码：1BFN)。用CHARMm力场对配体进行能量最小化，用Discovery Studio 3.0软件中的 CDOCKER协议选择具有最低结合能的模型。
为了制备Gef/H-dot800复合物，将Gef盐溶于2mM的去离子水中，H-dot800 粉末溶解于1mM去离子水中，用约0.3M盐酸溶液将上述溶液pH值调整到 5.33；将上述溶液以1：1的体积比混合，在室温下涡旋60min；然后，用14,000 rcf将该溶液离心10min以沉淀杂质，收集后上清液冷冻干燥获得Gef/H-dot产物，用紫外分光光度法确定Gef与H-dot的摩尔比。本发明靶向药物与H-dot摩尔比见图2，其中a为Gef标准溶液的紫外吸收光谱，b为H-dot和Gef/H-dot的紫外吸收光。从图2可知，本发明将Gef装入800nm荧光染料偶联的H-dot800中，通过在332nm处的紫外吸收增加来确定H-dot中Gef的负载量，计算出Gef与H- dot的摩尔比为1.8。
本发明不同物质的SEC-HPLC检测结果见图3。其中，a为H-dot的检测结果，b为CDPL的检测结果，c为ZW800的检测结果。从图3中a可以看出，最终产品H-dot的加权保留时间为4.22min，H-dot的加权保留时间介于其单独左峰和右峰的保留时间之间，分别为3.91min和4.33min，但由于右峰吸光度较大，所以偏向于右边。从图3中b可以看出，中间产物β-CDPL在254nm通道上的加权保留时间为5.11min，但在760nm通道上没有检测到信号。加权保留时间落在其单独的左峰和右峰的保留时间之间，分别为4.68min和5.32min，但由于右峰的吸光度强度较大而向右倾斜。从图3中c可以看出，游离的ZW800-1C在 760nm通道上的加权保留时间为8.1min。
实施例3H-dot的表征
茚三酮试验估计胺基数量：将0.8g茚三酮溶于10mL乙醇(8wt％)中制备茚三酮试剂。将1mL的反应液移入三个独立的10mL闪烁瓶中，在第一个小瓶中加入20μL加入琥珀酸酐(SA,succinicanhydride)前的反应混合物作为参考，在第二个小瓶中加入20μL加入SA后30min的反应混合物，在第三个小瓶中加入20μL的PBS作为阴性对照；涡旋小瓶后，在沸水浴中放置5min后在冰浴中放置3min以冷却；使用紫外/可见/NIR光谱仪在570nm处测量每个稀释溶液的吸光度，采用阴性对照作为空白；30min后，反应混合物在570nm处的吸光度大约是参考混合物的一半，表明约一半的游离胺已被琥珀酰化，说明H-dot具有兼性离子特性。
CDPL+的水动力直径为3.39nm，而最终H-dot的直径为5.66nm。为了评估 H-dot的表面电荷，本发明使用茚三酮试验确认产品分子的琥珀酰化率。为了实现H-dot的两性离子特性，阴离子分子(琥珀酸)应取代CDPL+至少50％的阳离子一级胺。ZW800-CDPL±(H-dot)茚三酮试验见图5，使用茚三酮测试溶液在 570nm处的吸光度，确定59％的伯胺(+电荷)已经转化为羧基(-电荷)，在最终产物(ZW800-H-dot)上形成了接近两性离子的表面。
尺寸排除色谱分析：通过使用尺寸排除色谱法(SEC)测定H-dot的纯度，该系统由Waterse2695分离模块和Waters2998PDA检测器组成。使用的色谱柱是Xbridge
3.5μm(7.8×150mm，Waters)SEC柱，流动相使用10mM PBS等压，流速为0.75mL/min，持续16min。反应混合物中的每种成分可以通过其保留时间(Rt)和吸光度来识别。
流体力学直径分析：为了测量H-dot的流体力学直径，首先如上所述进行尺寸排除色谱法，以获得H-dot样品的Rt。随后，用上述相同的流动相和流速，向高效液相色谱仪注入10μL蛋白质标准混合物，以获得已知流体力学直径的校准标准曲线。测定流体力学直径的蛋白质标准曲线见图4，其中a为蛋白质标准混合物通过Waters XBridge
SEC柱的洗脱色谱图，检测波长为254nm， b为半对数图，与蛋白质混合物中每种成分的分配系数(Kav)和流体力学直径 (nm)相关，使用sigmoid曲线进行拟合。上述蛋白质标准混合物中含有丙种球蛋白(6.5kDa，1.96nm)、核糖核酸酶(13.7kDa，3.28nm)、卵清蛋白(44kDa，6.10nm)和甲状腺球蛋白(669kDa，9.6nm)。虽然尿嘧啶(112Da)也包括在蛋白质混合物中，但是由于它不在目标流体力学直径范围内，因此也不包括在校准曲线中。每种蛋白质的分配系数(Kav)可以通过以下公式获得：
Kav＝(Ve-V0)/(Vc-V0)
其中，V0、Vc和Ve分别为柱空隙体积、几何柱体积和洗脱液体积。每种蛋白质的Kav与其流体力学直径的对数相比较，并对数据进行sigmoid曲线拟合。为了找到未知样品的流体力学直径，样品的Rt被转换为Kav，可以插入sigmoid 曲线方程来解决流体力学直径问题。
1H-NMR分析：为了确定EPL链上的β-CD共轭比率，在1.5mL的微管中，将5mg的CDPL溶解在600μL的重水中。完全溶解后，将该溶液转移到一个干净的核磁共振管中。对样品进行1H-NMR光谱分析，使用以下公式计算共轭率：
其中，H1是位于δ5.06ppm的β-CD上的质子的积分面积，ε是位于δ3.20ppm 的EPL上的ε质子的积分面积。通过比较起始材料和最终产品的核磁共振谱，确认β-CD在EPL+上的共轭比率。将来自β-CD的H1峰和来自EPL+的ε峰整合起来，计算每一个EPL+的β-CD共轭率。β-CD、EPL+和CDPL+在D2O的1H- NMR光谱分析见图6。从图6可知，H1在-CD上的积分面积位于5.06ppm，EPL 上质子的积分面积位于3.20ppm，通过1H-NMR谱显示，平均有8.1个CD基团被连接到EPL主干上。
实施例4Gef/H-dot的pH响应药物释放试验
Gef/H-dot药物释放试验见图7。本发明在37℃、不同pH值(6.0和7.4) 下测试Gef/H-dot的pH响应性24h药物释放情况。从图7可知，Gef/H-dot抗肿瘤疗效增强是由于纳米载药系统的高靶向性，并且在酸性肿瘤微环境中Gef得以从Gef/H-dot中释放，可以有效提高肿瘤局部的靶向药物浓度。
Gef/H-dot的pH响应性药物释放试验是使用快速平衡透析装置(8kDa MWCO，ThermoScientific)完成的。Gef/H-dot分别溶解在pH值为6.0和7.4的 PBS溶液中，相当于H-dot的浓度为500μM。对于每个复合物，样品室装入200 μL复合物溶液，相应的缓冲室装入400μL的PBS溶液，使其pH值与复合物溶液相当。将平板放在37℃、20rpm的上下振动器上，在0.25、0.5、1、1.5、2、 4、6、8和24h进行采样，从缓冲室吸出200μL释放溶液，并吸出200μL相应 pH值的新鲜PBS，通过测量332nm和258nm的紫外线吸光度，分别计算Gef 的浓度。累积药物释放百分比(Qn)可通过以下公式计算：
其中，Ci和Cn是每个时间点缓冲室中药物的浓度，C0是样品中药物的初始浓度。
实施例5Gef/H-dot的体外疗效测试
将LLC细胞以3×103个/孔的密度播种于96孔板，细胞贴壁后用H-dot、 Gef和Gef/H-dot从0.001μM到50μM的梯度浓度处理24h，设空白培养液为阴性对照。每孔加入10μL的CCK-8，孵化2h，在450nm处测量吸光度，所有实验设五个副孔，存活率根据以下公式计算：
其中，Asample、Ab和Ac分别为药物处理、空白和阴性对照的吸收值。
平均EC50值按以下公式计算：
其中，E为细胞存活率(％)，Top和Bottom为细胞存活率(％)的平稳点， x为浓度的对数，希尔系数(Hillcoefficient)为曲线的斜率。
实施例6Gef/H-dot的体内生物分布和药代动力学
动物被安置在AAALAC认证的设施中，并在MGH IACUC的监督下进行研究。用异氟醚和氧气对六周大的CD-1小鼠(雄性，25-30g)进行麻醉，并在0 min时间点略微切断尾巴末端进行毛细管血液采样。注射H-dot和Gef/H-dot，注射后1、3、5、10、30、60、120、180和240min再次采集血样，并测量毛细管中血清样本的荧光强度，以计算分布(t1/2α)和消除(t1/2β)半衰期值(每组n＝3- 4)；注射4h后，对小鼠器官(肝、肺、脾、肾、胃、脑、肠和膀胱)进行成像，结果使用Prism 9.0分析制图。
使用H-dot、Gef、Gef/H-dot处理24h前后，LLC细胞形态学改变情况见图 8。从图8可知，H-dot组，即使在最高剂量(50μM)下，与阴性对照组相比，也没有明显的细胞毒性或细胞形态变化的证据。与此相反，Gef和Gef/H-dot处理组在24h后，细胞死亡明显呈剂量依赖性。计算出Gef/H-dot的EC50为9.28 μM，优于单独使用Gef(14.40μM)。这是由于H-dot能够有效地将靶向药物输送到肿瘤细胞中，因此Gef/H-dot比Gef游离药物具有更好的体外肿瘤细胞杀伤能力。
Gef/H-dot的生物分布和药代动力学结果(将Gef/H-dot注入CD-1小鼠体内，并在注射4h后进行NIR成像)见图9，其中a为肾脏可清除H-dot的药代动力学、药物分布和药物清除示意图，b为切除器官的彩色和NIR荧光图像，c为H- dot的生物分布，d为Gef/H-dot生物分布比较。从图9可知，Gef/H- dot的药代动力学行为均符合二室模型，在所有器官中的积累几乎相同，可以快速通过肾脏清除。对于Gef/H-dot，心、肺、肝、胰、脾的信号背景比(SBR)略高于H-dot载体，这可能是由于Gef的加入增加了Gef/H-dot的疏水性，导致非特异性分布略有增加(图9b，9c，9d)。Gef/H-dot迅速分布到主要器官，然后从人体迅速消除，结果证明H-dot载药系统有利于快速有效的药物肾脏清除以降低药物相关不良反应。
实施例7体内实时动态图像引导手术
C57BL/6小鼠皮下注射2×105个LLC细胞建立动物肿瘤模型。将LLC细胞 (2×107)从气管注入小鼠的肺部，构建肺原位肿瘤动物模型。两周后肿瘤形成，静脉注射Gef/H-dot800，使用NIR成像系统在800nm进行体内荧光成像(注射后0、1、2、4和24h)，并引导手术切除肿瘤。术后安乐死小鼠，进行心、肝、胃、肺、肾、脑、脾、肠、膀胱、胰腺、骨、肌肉和肿瘤的组织学检测评估药物毒性。
体内实时图像引导的手术干预以及NIR荧光引导的组织病理学检测结果(注射Gef/H-dot后24h，LLC肺肿瘤小鼠的NIR荧光成像情况)见图10。其中，a 为NIR荧光图像引导下的皮下肿瘤手术，b为原位肺肿瘤和纵隔转移淋巴结，以及c为区域/远处转移淋巴结，包括腋窝和锁骨上淋巴结转移，d为术中荧光成像的引导下，切除转移淋巴结与正常淋巴结的比较，e为术后组织病理学检查；H&E 染色图像和NIR荧光显微镜图像；通过荧光检测区分出LLC肿瘤细胞与正常细胞区域。从图10可知，在皮下肺肿瘤动物模型中，肿瘤区域表现为高NIR荧光 SBR，基于荧光图像引导可轻松切除(图10a)。接下来，原位肺肿瘤模型小鼠的区域纵隔淋巴结和区域/远端淋巴结，包括腋窝和锁骨上淋巴结均有较强荧光，顺利在原位肺肿瘤小鼠模型中进行肺段切除和局部转移淋巴结切除，并进行术后病理分析(图10c-e)。在术后组织中进行红外荧光探测，与正常淋巴结相比，转移淋巴结的NIR荧光信号明显增高，在H&E染色图像中，肿瘤转移细胞与正常淋巴细胞明显分离。H&E染色图像和NIR荧光显微图像中转移性肿瘤细胞与正常淋巴细胞的界限一致，证实了淋巴结存在肿瘤转移，而非假阳性(图10d,10e)。该结果表明，Gef/H-dot特定靶向肿瘤细胞，可以快速准确鉴别肿瘤区域和转移淋巴结，图像引导下识别并手术切除肺肿瘤甚至淋巴结转移性肿瘤的准确度会更高。
在小鼠肺肿瘤模型动物体内实验研究中，本发明使用Gef/H-dot以高SBRs，通过NIR荧光实时引导清晰划定肿瘤以及转移淋巴结的边界，成功切除了肺原位肿瘤、皮下移植瘤以及转移淋巴结。该技术转化应用，将有助于协助手术医师精准快速切除肿瘤；并且术后使用荧光探测，在切除的体外标本中快速探测肿瘤病变，准确分离转移淋巴结并识别阳性切缘，有助于协助病理医师快速判断并准确取材。同时，Gef/H-dot有望为EGFR敏感突变的肺癌患者提了高效的个性化围手术期靶向治疗，有助于阻止肿的浸润和微小残留病灶，有助于降低肿瘤复发和转移风险。
药代动力学研究显示，Gef/H-dot的PK曲线较游离药物有所改善。Gef/H-dot 可以避免正常组织的非特异性吸收，并且借助H-dot的聚合表面输更有效地将目标药物输送到肿瘤部位。此外，由于纳米药物的持续释放特性，在肿瘤部位能够有效维持药物浓度。pH诱导的药物释放试验表明，Gef/H-dot在酸性肿瘤微环境中失去稳定性并有效释放目标药物(Gef)，而在中性生理环境中保持稳定。这是由于，目标药物与β-CD的非极性腔体之间的疏水作用减少。基于此，H-dot纳米载药系统可以在肿瘤部位定向释放药物，增加肿瘤间药物积累，抵抗非特异性吸收，进而提高抗肿瘤治疗效果，因此相较于其他传输系统更有优势。使用实时 NIR成像技术，监测药物的输送、生物分布、在肿瘤中的积累，以及通过信号强度的变化观察肿瘤生长抑制情况，可以观察到肿瘤高特异性摄取以及正常组织的低非特异性摄取和低背景信号。与游离靶向药物Gef相比，Gef/H-dot800复合纳米药物的抗肿瘤效果明显增强，该结果与体外毒性试验结果一致。并且，Gef/H- dot的最佳PK曲线显示了，它可以有效避免非肿瘤组织的非特异性摄取，并且由于纳米药物的特性，可以更有效地将目标药物传递到肿瘤部位。因此，H-dot 超小纳米载药平台可用于图像引导和药物输送应用，能够提升药物靶向性聚集并且减少与游离药物相关的副作用，这也是纳米药物得以临床转化的关键所在。
综上所述，诊疗一体化的Gef/H-dot是一种理想的多功能纳米药物，该复合物在进行实时NIR荧光图像引导的分期、手术干预和病理辅助方面具有极大潜力，同时还可以定向输送抗肿瘤药物(Gef)以实现高效的靶向治疗，并减少治疗相关不良反应。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种基于超小分子H-dot纳米载药系统的肺癌诊疗一体化的靶向纳米药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：首先将β-环糊精转化为单醛-环糊精，将单醛-环糊精与e-多聚-L-赖氨酸结合，形成单醛-环糊精结合的e-多聚-L-赖氨酸，记作CDPL，然后将CDPL与近红外荧光基团结合，得到近红外荧光基团-CDPL，再将近红外荧光基团-CDPL琥珀酰化，得到近红外荧光体-CDPL±，即为H-dot，将H-dot与吉非替尼靶向药物复合，得到基于超小分子H-dot纳米载药系统的肺癌诊疗一体化的靶向纳米药物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，β-环糊精转化为单醛-环糊精的方法如下：将β-环糊精溶解于无水二甲基亚砜中，并向该溶液中加入邻苯二甲酸二甲酯，室温搅拌；将上述反应液倒入乙酸乙酯/丙酮混合液中沉淀，储存过夜；次日，真空过滤回收沉淀物，并将其溶解于二甲基亚砜中；然后将此溶液倒入乙酸乙酯/丙酮中，离心，丢弃上清液；将沉淀重溶于去离子水中，并再次倒入乙酸乙酯/丙酮中沉淀，重复上述操作两次；最后一次沉淀后，将沉淀物溶解在去离子水中并搅拌，然后冻干；冻干后，回收白色固体，白色固体即为单醛-环糊精。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述β-环糊精与所述无水二甲基亚砜的料液比为15g：100mL，所述β-环糊精与所述邻苯二甲酸二甲酯的质量比为15：(6～7)。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，单醛-环糊精与EPL结合的方法如下：将单醛-环糊精溶解在醋酸缓冲液中，然后加入EPL，室温搅拌，得到混合物，向所述混合物中加入硼氢化钠，继续室温搅拌，随后，用分子量截止值为6～8kDa的纤维素膜进行动态透析；透析后于-80℃下冻干，获得米白色绒毛状固体，即为CDPL。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述单醛-环糊精与所述醋酸缓冲液的料液比为16g：(500～600)mL，所述单醛-环糊精与所述EPL的质量比为16：(2～3)，所述单醛-环糊精与所述硼氢化钠的质量比为16：1。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述CDPL与近红外荧光基团结合过程如下：将近红外荧光团溶解于二甲基亚砜中以制备近红外荧光团溶液，将CDPL溶解在pH9.0的磷酸缓冲盐中，制备CDPL溶液，在搅拌状态下，将所述近红外荧光团溶液滴加到所述CDPL溶液中，室温继续搅拌；加入氢氧化钠水溶液，使反应液的pH值始终保持在9.0；3h后，将所述反应液倒入乙酸乙酯/丙酮中沉淀，离心，丢弃上清液，再用去离子水溶解沉淀，随后再次倒入乙酸乙酯/丙酮中沉淀；重复上次操作两次，所得产品在真空中干燥过夜，得到固体，即为近红外荧光基团-CDPL。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述近红外荧光团为ZW800-1C-NHS酯。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述近红外荧光基团-CDPL琥珀酰化过程如下：用琥珀酸酐的二甲基亚砜溶液进行琥珀酰化。
9.一种权利要求1～8任一项所述制备方法制备得到的基于超小分子H-dot纳米载药系统的肺癌诊疗一体化的靶向纳米药物。
10.权利要求9所述基于超小分子H-dot纳米载药系统的肺癌诊疗一体化的靶向纳米药物在提高靶向药物靶向性以及降低药物副作用中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210055437.XA CN114344483A (zh) | 2022-01-18 | 2022-01-18 | 基于超小分子H-dot纳米载药系统的肺癌诊疗一体化的靶向纳米药物及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210055437.XA CN114344483A (zh) | 2022-01-18 | 2022-01-18 | 基于超小分子H-dot纳米载药系统的肺癌诊疗一体化的靶向纳米药物及其制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114344483A true CN114344483A (zh) | 2022-04-15 |
Family
ID=81091829
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210055437.XA Pending CN114344483A (zh) | 2022-01-18 | 2022-01-18 | 基于超小分子H-dot纳米载药系统的肺癌诊疗一体化的靶向纳米药物及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114344483A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995002700A1 (en) * | 1993-07-13 | 1995-01-26 | Abbott Laboratories | Fluorescent polymer labeled conjugates and intermediates |
| US20190224341A1 (en) * | 2016-06-29 | 2019-07-25 | The General Hospital Corporation | Renal clearable organic nanocarriers |
| CN112675306A (zh) * | 2021-01-30 | 2021-04-20 | 福州大学 | 一种靶向增强肿瘤光动力治疗效果的氟化纳米复合物及其制备和应用 |
-
2022
- 2022-01-18 CN CN202210055437.XA patent/CN114344483A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995002700A1 (en) * | 1993-07-13 | 1995-01-26 | Abbott Laboratories | Fluorescent polymer labeled conjugates and intermediates |
| US20190224341A1 (en) * | 2016-06-29 | 2019-07-25 | The General Hospital Corporation | Renal clearable organic nanocarriers |
| CN112675306A (zh) * | 2021-01-30 | 2021-04-20 | 福州大学 | 一种靶向增强肿瘤光动力治疗效果的氟化纳米复合物及其制备和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Shen et al. | Hierarchically targetable polysaccharide-coated solid lipid nanoparticles as an oral chemo/thermotherapy delivery system for local treatment of colon cancer | |
| Kang et al. | Renal clearable organic nanocarriers for bioimaging and drug delivery | |
| Kostiv et al. | A simple neridronate-based surface coating strategy for upconversion nanoparticles: Highly colloidally stable 125 I-radiolabeled NaYF 4: Yb 3+/Er 3+@ PEG nanoparticles for multimodal in vivo tissue imaging | |
| JP6598161B2 (ja) | ｐＨ応答性ポリマーのライブラリー及びそのナノプローブ | |
| Lee et al. | Tumor targeting efficiency of bare nanoparticles does not mean the efficacy of loaded anticancer drugs: importance of radionuclide imaging for optimization of highly selective tumor targeting polymeric nanoparticles with or without drug | |
| Wei et al. | TMTP1-modified indocyanine green-loaded polymeric micelles for targeted imaging of cervical cancer and metastasis sentinel lymph node in vivo | |
| Kim et al. | Peptide 18-4/chlorin e6-conjugated polyhedral oligomeric silsesquioxane nanoparticles for targeted photodynamic therapy of breast cancer | |
| Sun et al. | A targeting theranostics nanomedicine as an alternative approach for hyperthermia perfusion | |
| Lee et al. | Supramolecular assembly based on host–guest interaction between beta-cyclodextrin and adamantane for specifically targeted cancer imaging | |
| US20210113715A1 (en) | Targeted nanoparticles for diagnosing, detecting and treating cancer | |
| KR102099516B1 (ko) | 근적외선에 반응하는 암세포 표적 기능을 갖는 가교 마이셀, 이를 포함하는 약물 전달체 및 이의 제조방법 | |
| Tian et al. | Glypican-3 (GPC3) targeted Fe 3 O 4 core/Au shell nanocomplex for fluorescence/MRI/photoacoustic imaging-guided tumor photothermal therapy | |
| Xu et al. | Folate-functionalized mesoporous silica nanoparticles as a liver tumor-targeted drug delivery system to improve the antitumor effect of paclitaxel | |
| Jun et al. | Design of theranostic nanomedicine (Ii): Synthesis and physicochemical properties of a biocompatible polyphosphazene–docetaxel conjugate | |
| Shi et al. | Copper (II)-disulfiram loaded melanin-dots for cancer theranostics | |
| KR20070086803A (ko) | Ｍｒｉ 유도 광역학 암 치료 | |
| US9387267B2 (en) | Iodine-containing radial-shaped macromolecular compounds, preparation method thereof and contrast media compositions for CT comprising the same | |
| Wang et al. | Downshifting nanoprobes with follicle stimulating hormone peptide fabrication for highly efficient NIR II fluorescent bioimaging guided ovarian tumor surgery | |
| Yim et al. | Morphologically homogeneous, pH-responsive gold nanoparticles for non-invasive imaging of HeLa cancer | |
| Liu et al. | Synergistic non-bonding interactions based on diketopyrrolo-pyrrole for elevated photoacoustic imaging-guided photothermal therapy | |
| CN104815336B (zh) | 一种与叶酸受体靶向结合的叶酸二聚体复合物及其应用 | |
| CN113616803A (zh) | 一种gsh响应型吉西他滨纳米粒子及其制备方法与应用 | |
| CN114344483A (zh) | 基于超小分子H-dot纳米载药系统的肺癌诊疗一体化的靶向纳米药物及其制备方法 | |
| Uzgiris et al. | A multimodal contrast agent for preoperative MR Imaging and intraoperative tumor margin delineation | |
| Zhu et al. | Construction of long circulating and deep tumor penetrating gambogic acid-hydroxyethyl starch nanoparticles |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20220830 Address after: 710004 No. 157, five West Road, Shaanxi, Xi'an Applicant after: The Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University Address before: Beilin District Xianning West Road 710049, Shaanxi city of Xi'an province No. 28 Applicant before: XI'AN JIAOTONG University |
|
| TA01 | Transfer of patent application right |