ES2197332T3

ES2197332T3 - Fluoroforos polimericos mejorados por fracciones que crean un microentorno hidrofobo y conformacionalmente restrictivo.

Info

Publication number: ES2197332T3
Application number: ES97904060T
Authority: ES
Inventors: Christopher Bieniarz; Jeffrey B. Huff; Michael J. Cornwell; Seshagiri R. Tata Venkata
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1996-02-01
Filing date: 1997-01-30
Publication date: 2004-01-01
Anticipated expiration: 2017-01-30
Also published as: EP1019722A1; WO1997028447A1; JP4255514B2; DE69720809D1; ATE237138T1; US5994143A; EP1019722B1; JP2000509412A; DE69720809T2

Abstract

Un tinte polimérico consistente en: (a) una entidad polimérica y (b) covalentemente unidos a dicha entidad polimérica una pluralidad de grupos generadores de señal, donde dichos grupos generadores de señal derivan de un tinte que tiene al menos un resto de anilino acoplado a un resto heterocíclico que contiene al menos un átomo de nitrógeno en el heterociclo por medio de un grupo de unión etilénicamente insaturado, cuyo tinte polimérico tiene restos hidrofóbicos y conformacionalmente restrictivos seleccionados entre el grupo consistente en restos de ciclodextrinas, carcerands, calixiranos, grietas moleculares, cucurbiterilos y ciclofanos asociados al mismo.

Description

Fluorofóros poliméricos mejorados por fracciones que crean un microentorno hidrófobo y conformacionalmente restrictivo.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

La invención se relaciona con tintes fluorescentes útiles en diversos ensayos y, más concretamente, con tintes poliméricos fluorescentes, donde la florescencia es intensificada gracias a restos fluoróforos al menos parcialmente hospedadores, cuyos restos aportan un ambiente hidrofóbico y conformacionalmente restrictivo.

2. Discusión de la técnica

Se emplea una variedad de técnicas de ensayo en el análisis cuantitativo y cualitativo de mezclas químicas y bioquímicas. Una técnica de ensayo, a la que se hace referencia como "fluorescencia", es útil en muchos estudios bioquímicos. Esta técnica de ensayo utiliza un agente químico fluorescente para marcar ciertas moléculas con objeto de distinguirlas de moléculas no marcadas, pero similares. Se considera que un agente químico es fluorescente si absorbe luz a una longitud de onda dada (la longitud de onda de "excitación") y emite luz a una longitud de onda más larga (la longitud de onda de "emisión"). Con frecuencia, se hace referencia a los agentes químicos fluorescentes usados en este tipo de ensayo como tintes fluorescentes.

Existen numerosas técnicas ópticas para detectar los tintes fluorescentes usados en ensayos de fluorescencia. Una de tales técnicas es la citometría de flujo. La citometría de flujo es empleada en ensayos de fluorescencia para identificar moléculas o células particulares y para separar o distinguir esas moléculas o células de una mezcla. En un procedimiento típico de citometría de flujo, se une un tinte fluorescente a un anticuerpo. El anticuerpo es específico para un antígeno de una molécula particular o de una molécula de la superficie celular de una célula particular que se desea detectar. Se hace referencia a la unión del anticuerpo y el tinte fluorescente como "conjugación" y se hace referencia al complejo anticuerpo-tinte fluorescente unidos como "conjugado".

Después de unir un anticuerpo apropiado y un tinte apropiado para formar un conjugado, se añade el conjugado a una mezcla sospechosa de contener el antígeno o la molécula de la superficie celular que se quiere detectar. Cuando se añade el conjugado a la mezcla y se mantienen las condiciones apropiadas, el anticuerpo del conjugado se une al antígeno o a la molécula de la superficie celular. Se somete entonces toda la mezcla en la que está contenido el antígeno o la molécula de la superficie celular y a la que se añade el conjugado a un rayo láser de la longitud de onda de excitación del tinte fluorescente concreto. El rayo láser de esta longitud de onda hace que las moléculas o las células que contienen el conjugado anticuerpo-tinte fluorescente emitan fluorescencia. Un citómetro de flujo puede detectar y medir la cantidad de luz láser dispersada por la molécula o célula unida y, mediante esa medición, se pueden hacer las determinaciones de cantidad, cualidad y otras en relación al antígeno o molécula de la superficie celular detectada.

Típicamente, ha sido necesario tomar medidas para aumentar la intensidad de los tintes fluorescentes para una mejor detección. Se han empleado varios medios para aumentar la intensidad. Sin embargo, existen limitaciones significativas que reducen la efectividad de esos medios.

Un medio para aumentar la intensidad de los tintes fluorescentes a una longitud de onda dada ha sido el mecanismo de la transferencia de energía de fluorescencia, mediante lo cual se hace una transferencia de energía de un estado excitado de una molécula donante a una molécula aceptora. La transferencia es normalmente realizada situando un fluoróforo cerca de otro fluoróforo. Tal como se usa aquí, la expresión "fluoróforo" significa un vehículo de fluorescencia.

El primero de los fluoróforos situados en proximidad puede ser excitado por luz de una longitud de onda dada. Luego, en lugar de emitir luz de una longitud de onda más larga, el fluoróforo excitado transfiere energía al segundo fluoróforo. Esa energía transferida excita el segundo fluoróforo, que emite entonces luz de una longitud de onda incluso más larga que la que emitiría el primer fluoróforo. Un ejemplo de dicha disposición de transferencia de energía implica conjugados de tintes de ficobiliproteína-cianina. Al someter estos conjugados a una luz láser de aproximadamente 488 nm se excita la ficobiliproteína. La ficobiliproteína transferirá entonces, sin irradiar ella misma, energía al fluoróforo de cianina a la longitud de onda de excitación de la cianina, que coincide con la longitud de onda de emisión de la ficobiliproteína, aproximadamente 580 nm. En consecuencia, el fluoróforo de cianina es así excitado y posteriormente emite luz de su longitud de onda de emisión de aproximadamente 680 nm. Con frecuencia, se hace referencia a este tipo de sistema de transferencia de energía como "sistema tándem de transferencia de energía".

La transferencia de energía no es un medio muy simple para aumentar la fluorescencia por una serie de razones. Dos requerimientos fundamentales de la transferencia de energía son una relación de distancia espacial relativa apropiada entre las moléculas donantes y aceptoras y una relación angular relativa apropiada entre los dipolos de absorción y emisión de las dos moléculas. Obtener y mantener estas relaciones fundamentales es extremadamente difícil, si no imposible, en muchas circunstancias. Adicionalmente, existen otros muchos requerimientos, incluyendo el solapamiento del espectro de emisión del donante con el espectro de absorción del aceptor, la estabilidad de los fluoróforos, el cambio en las características fluorescentes con la conjugación, la eficacia cuántica de la transferencia, la unión no específica de los fluoróforos a otros compuestos y otros. La eliminación de la necesidad de cumplir estos requerimientos sería un perfeccionamiento en la técnica.

Otro medio para aumentar la intensidad fluorescente de los tintes fluorescentes es unir una multiplicidad de fluoróforos a un polímero y unir el polímero a un anticuerpo. En esta disposición, cada uno de los fluoróforos unido al polímero puede excitarse por una luz láser y emitir luz a su longitud de onda de emisión. Sin embargo, el uso de polímeros para este fin no ha sido, en general, efectivo. El problema primario encontrado con los polímeros es que, cuando se coloca aleatoriamente una multiplicidad de fluoróforos sobre un solo polímero, se apaga la señal entre los fluoróforos. Además, incluso si el conjugado de polímero/anticuerpo emite una cantidad acumulativa mayor de luz debido a la multiplicidad de fluoróforos, la longitud de onda de emisión es sólo la aplicable a los fluoróforos particulares. Los fluoróforos de la técnica anterior tienen un rango limitado de variación de longitud de onda entre longitud de onda de excitación y longitud de onda de emisión. Sería deseable disponer tanto de un polímero al que se pueda unir una multiplicidad de fluoróforos sin apagamiento como de un tinte fluorescente que emita luz de una longitud de onda mucho mayor que la longitud de onda de excitación. Dicha disposición polimérica y dicho rango de longitudes de onda permitirían una detección más exacta.

Aún otro medio para aumentar la intensidad de los tintes fluorescentes implica el uso de ciclodextrinas. Las ciclodextrinas son oligosacáridos cíclicos hidrosolubles conocidos que tienen una cavidad central hidrofóbica y una región periférica hidrofílica. En general, la forma de una molécula de ciclodextrina es substancialmente cilíndrica, teniendo un extremo del cilindro una abertura mayor que el otro. La abertura más pequeña es conocida como borde primario y la abertura más grande es conocida como borde secundario. Está presente una cavidad en la cual pueden entrar moléculas pequeñas a través del borde secundario mayor entre las dos aberturas de la molécula de ciclodextrina y, en sistemas acuosos, esta cavidad de una molécula de ciclodextrina proporciona un microambiente hidrofóbico para el acomplejamiento de moléculas hidrofóbicas de bajo peso molecular. La molécula de ciclodextrina actúa como hospedador para la molécula hidrofóbica de bajo peso molecular, es decir, el huésped.

Tal como se describe en WO-A-95 02700, se han hecho esfuerzos por generar ciclodextrinas poliméricas en un intento de aumentar la fluorescencia asociada a los fluoróforos. Teóricamente, las propiedades acomplejantes de una sola molécula de ciclodextrina pueden aumentar disponiendo de varias moléculas de ciclodextrina en estrecha proximidad las unas a las otras, por la razón de que tener varias moléculas de ciclodextrina en estrecha proximidad las unas a las otras aumenta la probabilidad de que una molécula huésped entre en la cavidad de una molécula de ciclodextrina. Según la teoría, si se creara una molécula de ciclodextrina polimérica, ésta sería capaz de hospedar una pluralidad de moléculas huésped. Además, si las moléculas huésped fueran grupos generadores de señales, habría varios fluoróforos en estrecha proximidad entre sí y la fluorescencia asociada al polímero sería mayor que la de un solo fluoróforo. Por ello, según la teoría, si se hiciera un conjugado con una ciclodextrina polimérica que contuviera una pluralidad de fluoróforos, la fluorescencia del polímero sería mayor que la de un conjugado consistente en un solo fluoróforo.

Se han fabricado varias ciclodextrinas poliméricas para validar la teoría antes descrita. Sin embargo, esos polímeros sufren de problemas que limitan gravemente su efectividad. Las ciclodextrinas poliméricas se sintetizan usando monómeros de ciclodextrina que han sido modificados para contener varios grupos reactivos sobre los bordes primario y secundario del monómero de ciclodextrina, permitiendo así que estos monómeros reaccionen a través de sus bordes primario y secundario, y reaccionan varias veces a través de sus múltiples grupos reactivos. Cuando una molécula de ciclodextrina se une por su borde secundario, se bloquea la abertura mayor a la cavidad hidrofóbica. Como resultado de ello, es difícil para una molécula huésped entrar en la cavidad de la molécula de ciclodextrina y la utilidad de la ciclodextrina como hospedadora queda comprometida. Además, los polímeros derivados de monómeros de ciclodextrina que tienen múltiples grupos reactivos dan lugar a un alto grado de entrecruzamiento. Cuando se produce entrecruzamiento, no sólo se unen las moléculas de ciclodextrina por los bordes secundarios, causando los problemas citados previamente, sino que se forme una matriz de ciclodextrinas.

En consecuencia, el número de monómeros de ciclodextrina polimerizados es limitado y muchos de los monómeros de ciclodextrina polimerizados quedan enterrados en la matriz. Aunque muchas moléculas de ciclodextrina están en estrecha proximidad, muy pocas de ellas tienen aberturas secundarias accesibles y muy pocos complejos de huésped/hospedador son capaces de formarse.

WO 95/02700 describe un conjugado consistente en un miembro de unión específica covalentemente unido a al menos un polímero altamente fluorescente consistente en un esqueleto polimérico que tiene compuestos fluorescentes directamente unidos al mismo. Alternativamente, el esqueleto polimérico puede tener moléculas de ciclodextrina covalentemente unidas al mismo y los compuestos fluorescentes pueden estar albergados dentro de los microambientes hidrofóbicos de las moléculas de ciclodextrina, asociando así indirectamente los grupos generadores de señales al polímero. Cuando los compuestos fluorescentes se unen directamente al esqueleto polimérico, se pueden añadir moléculas de ciclodextrina al polímero indirectamente haciendo que éstas se asocien a los grupos generadores de señales unidos, o se puede añadir la ciclodextrina al polímero fluorescente por unión covalente de la ciclodextrina al mismo.

Otro medio para aumentar la intensidad de los colorantes fluorescentes es la selección juiciosa de un tinte adecuado, entre los muchos tintes fluorescentes que hay para elegir. Ha sido una práctica común emplear substancias naturales como tintes fluorescentes para el estudio de la fluorescencia. Los tintes naturales más comunes incluyen las ficobiliproteínas, tales como la ficoeritrina, y otros. Como se ha dicho previamente en relación con la discusión de la transferencia de energía, las ficobiliproteínas están siendo aún usadas en algunos sistemas tándem de transferencia de energía. Sin embargo, las ficobiliproteínas presentan ciertos problemas en su utilización. Un problema particular de las ficobiliproteínas es su inestabilidad. La exposición a la luz y a otros efectos ambientales puede causar fotodecoloración, afectando así de manera adversa a los ensayos de fluorescencia.

En los últimos años, se ha fabricado una serie de tintes fluorescentes sintéticos y se han empleado para ensayos de fluorescencia. Una muy conocida clase de tintes fluorescentes son los tintes de cianina. Estos tintes son tintes de polimetina que contienen el resto -N-(-C=C-C)_{n}=N-.

Los tintes fluorescentes de cianina presentan también problemas cuando se emplean en procedimientos de ensayos biológicos fluorescentes, tales como la citometría de flujo. Por ejemplo, muchos de estos tintes son caros de usar y difíciles de fabricar. Además, muchos de los tintes de cianina no tienen un intervalo suficientemente largo, es decir, desviación de Stokes, entre su longitud de onda de excitación y su longitud de onda de emisión como para ser efectivos para los métodos de detección de fluorescencia sin utilizar transferencia de energía que involucre a otro fluoróforo. Aquellos tintes que sí tienen un intervalo suficientemente grande entre longitud de onda de excitación y longitud de onda de emisión son con frecuencia sensibles al ambiente.

En Chemical Abstracts, 1969, 71(8): 97, Abstract 71892u, se describen tintes poliméricos consistentes en un esqueleto carbonado nucleofílico que tiene covalentemente unido al mismo un grupo etinilpiridina al que se acoplan grupos generadores de señales compuestos por un resto aromático de fórmula p-Me_{2}NC_{6}H_{4}, p-Et_{2}NC_{6}H_{4} o p-Et_{2}NC_{6}H_{4}CH:CH a través de una unión de etileno. En WO-A-8605505 se describen tintes poliméricos consistentes en un esqueleto carbonado nucleofílico que es -CH_{2}-CH_{2}-N(fenil)-CH_{2}-CH_{2}-X-, donde X puede ser -OCOO-, por ejemplo, al que se acopla un resto heterocíclico que contiene un átomo de nitrógeno a través de una unión de etileno.

Otra clase de tintes fluorescentes que ha sido considerada para uso en procedimientos de ensayo biológico incluye los tintes de aminoestirilpiridinio. Debido a la sensibilidad ambiental, estos tintes han sido considerados inadecuados para aplicaciones de marcaje fluorescente, tales como la citometría de flujo. La sensibilidad ambiental de los tintes de aminoestirilpiridinio está bien estudiada y descrita por Anthony C. Stevens y col., "Synthesis of Protein-Reactive (Aminostyryl)pyridinium Dyes", Bioconjugate Chem., 1993, 4, 19-24.

Sería deseable desarrollar un tinte fluorescente mediante el cual se eliminara la necesidad de transferencia de energía y se resolvieran los problemas asociados a la sensibilidad.

Resumen de la invención

En un aspecto, la invención se relaciona con un tinte polimérico consistente en una entidad polimérica que tiene unida a la misma una pluralidad de grupos generadores de señal. El tinte polimérico es preferiblemente un polímero altamente fluorescente en el que el número de grupos generadores de señal unidos a la entidad polimérica se optimiza para conseguir el mayor nivel de señal. El tinte polimérico puede ser derivado sintéticamente. El tinte polimérico contiene además restos hospedadores, ya sea covalentemente unidos a la entidad polimérica, ya sea en estrecha proximidad a la entidad polimérica.

Los grupos generadores de señal derivan de tintes que tienen al menos un resto de anilino acoplado a un resto heterocíclico que contiene al menos un átomo de nitrógeno en el heterociclo por medio de un grupo de unión etilénicamente insaturado. Si la entidad polimérica es electrofílica, los grupos generadores de señal deben ser nucleofílicos. Si la entidad polimérica es nucleofílica, puede contener unidades repetitivas seleccionadas entre los grupos consistentes en acrilamida hidrazido, hidrazida y lisina. Si la entidad polimérica es electrofílica, puede contener unidades repetitivas seleccionadas entre el grupo consistente en acrílico, glutámico, aspártico y estirensulfónico. Si los grupos generadores de señal son electrofílicos, pueden contener grupos carboxílicos. Si los grupos generadores de señal son nucleofílicos, pueden contener grupos amina o grupos hidrazida o tanto grupos amina como grupos hidrazida.

El resto hospedador puede estar covalentemente unido a la entidad polimérica, pero no necesita estar covalentemente unido a la entidad polimérica. El resto hospedador puede estar unido a una entidad distinta de la entidad polimérica a la que se unen los grupos sintéticos generadores de señal. El resto hospedador es un resto hidrofóbico y de restricción conformacional, seleccionado entre el grupo consistente en restos de ciclodextrinas, carcerands, calixiranos, grietas moleculares, cucurbiterilos y ciclofanos.

El resto hospedador es preferiblemente una ciclodextrina, más preferiblemente un derivado del \beta-ci-clodextrinaldehído. Los grupos generadores de señal son sensibles a proteínas, ácidos nucleicos, macromoléculas y lípidos en un ambiente normal, pero substancialmente insensibles a estos materiales en este microambiente hidrofóbico y conformacionalmente restrictor.

\newpage

El resto generador de señal del tinte polimérico es preferiblemente un derivado de piridinio anilino. El derivado de piridinio anilino puede consistir en un derivado de piridinio anilino de fórmula:

1

donde R_{1} representa un grupo alquilo y R_{2} representa un grupo alquilo y n representa un número entero de 1 a 3, inclusive, y X^{-} representa un contraión cargado negativamente.

En otra realización, el resto generador de señal del tinte polimérico es un derivado de benzotiazolio anilino de fórmula:

2

donde R_{1} representa un grupo alquilo y R_{2} representa un grupo alquilo y n representa un número entero de 1 a 3, inclusive.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un conjugado que consiste en un miembro de un par de unión, tal como un anticuerpo, y al menos un tinte polimérico de esta invención conjugado con el miembro antes mencionado de un par de unión. Los restos hidrofóbicos y conformacionalmente restrictivos asociados al tinte polimérico están unidos covalentemente o están unidos no covalentemente a dicho al menos un tinte polimérico.

La invención puede ser empleada en una serie de aplicaciones, incluyendo, aunque sin limitación, ensayos de multiplexación, incluyendo la multiplexación por inmunoensayo de fluorescencia multicolor, la citometría de flujo, los ensayos de inmunofenotipificación, las aplicaciones de imagen, la tinción inmunológica, la microscopía de fluorescencia, la tinción inmunocromatográfica, el inmunoensayo de polarización de la fluorescencia ("FPIA"), la hibridación de fluorescencia in situ ("FISH"), la detección por fluorescencia de analitos y otros. La invención es particularmente efectiva para aplicaciones de citometría de flujo. Sin embargo, no se limita a esas aplicaciones y, de hecho, es adecuada para muchas aplicaciones en las que está implicado el estudio o la detección por fluorescencia y que están sujetas a problemas como los previamente discutidos con respecto a la técnica anterior.

Un método de inmunofenotipificación de células según la invención consiste en las etapas de (a) disponer de una muestra de ensayo, (b) aislar las células de la muestra de ensayo, (c) introducir un lisador en la muestra de ensayo, (d) añadir un conjugado de la invención a la muestra de ensayo y (e) medir la fluorescencia de la muestra de ensayo.

Esta invención reduce los problemas típicamente encontrados ante la inestabilidad de la ficobiliproteína y la bioconjugabilidad, junto con los problemas asociados al uso de sistemas tándem en los procedimientos de transferencia de energía. Adicionalmente, muchos de los grupos generadores de señal adecuados para uso en esta invención son sintéticos. Los grupos generadores de señal son típicamente más estables que los fluoróforos naturales.

La presente invención reduce la sensibilidad ambiental de estos y de otros tintes dando a estos tintes un microambiente apropiado y deseado. Fijando así los tintes en dicho microambiente, la efectividad de las propiedades fluorescentes de estos tintes no resulta significativamente afectada por el macroambiente, la conjugación u otros factores.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 compara la intensidad de fluorescencia del Tinte 1, del tinte polimérico 11B y del tinte polimérico 11D a la longitud de onda de excitación de 488 nm y a la longitud de onda de emisión de 614 nm.

La Fig. 2 compara la emisión de fluorescencia del tinte polimérico 11B y del tinte polimérico 11D.

La Fig. 3 muestra la respuesta en la señal de fluorescencia del tinte polimérico 11D en función de la concentración de polímero. La Fig. 3 también compara la fluorescencia el tinte polimérico 11B con el tinte polimérico 11D a la longitud de onda de emisión de 580 nm.

La Fig. 4 muestra la respuesta en la señal de fluorescencia del tinte polimérico 12B libre de ciclodextrina y en presencia de ciclodextrina no covalentemente unida a la entidad polimérica.

La Fig. 5 compara el espectro de fluorescencia del tinte polimérico 17B con modificación de ciclodextrina, sin modificación de ciclodextrina y con adición de ciclodextrina no covalentemente unida a la entidad polimérica a una concentración idéntica de ciclodextrina de 0,25 mg/ml.

La Fig. 6 muestra la respuesta de fluorescencia del tinte polimérico 17D en función de la concentración de tinte polimérico 17D. La Fig. 6 muestra también la respuesta de fluorescencia del tinte polimérico 17B en función de la concentración de tinte polimérico 17B y la respuesta de fluorescencia del tinte polimérico 17B en un diluyente stock de ciclodextrina de 0,25 mg/ml en función de la concentración de tinte polimérico 17B.

La Fig. 7 compara la fluorescencia del tinte polimérico purificado 13B con tinte polimérico modificado con ciclodextrinamina purificado 13D a una longitud de onda de excitación de 488 nm.

La Fig. 8 compara la fluorescencia de la ficobiliproteína natural ficoeritrina y del tinte polimérico 14D sobre una base de mol a mol a una longitud de onda de excitación de 488 nm.

Las Figs. 9A y 9B comparan la estabilidad del tinte polimérico 14D después de 16 horas de exposición a la luz ambiental de la sala con la estabilidad de la ficoeritrina después de 16 horas de exposición a la misma luz ambiental de la sala.

Las Figs. 10A y 10B muestran la utilidad de un conjugado que contiene un tinte polimérico 11D y un anticuerpo IgG en un ensayo de citometría de flujo. Ambos ensayos fueron realizados usando un microgramo de conjugado y sulfato de dextrano 10 mM en el diluyente.

Las Figs. 11A y 11B muestran la utilidad de un conjugado que contiene un tinte polimérico 11D y un anticuerpo IgG en un ensayo de citometría de flujo. Ambos ensayos fueron realizados usando un microgramo de conjugado y sulfato de dextrano 10 mM en el diluyente.

Las Figs. 12A y 12B muestran la utilidad de un conjugado que contiene un tinte polimérico 11D y un anticuerpo IgG en un ensayo de citometría de flujo. Ambos ensayos fueron realizados usando un microgramo de conjugado y sulfato de dextrano 10 mM en el diluyente.

Las Figs. 13A y 13B comparan el rendimiento de conjugados tándem comerciales de anti-CD8-ficoetrina-cianina consistentes en un anticuerpo anti-CD8 y tinte de ficoeritrina-cianina (Dako) con un conjugado consistente en anticuerpo anti-CD8 y tinte polimérico 12D para la tinción de linfocitos en citometría de flujo.

La Fig. 14 muestra alfa (\alpha), beta (\beta) y gamma (\gamma) ciclodextrinas y el sistema para numerar las unidades de glucosa que allí se encuentran.

Descripción detallada de la invención

Las siguientes definiciones son aplicables a esta descripción.

El término "analito" tiene al menos un epitopo o sitio de unión. Un analito puede ser cualquier substancia para la cual exista un miembro de unión natural o para la cual se pueda preparar un miembro de unión. Los analitos incluyen, aunque sin limitación, toxinas, compuestos orgánicos, proteínas, péptidos, microorganismos, células contenidas en la sangre humana o animal, antígenos de la superficie celular, ácidos nucleicos, hormonas, esteroides, vitaminas, fármacos (incluyendo los administrados para fines terapéuticos, así como los administrados para fines ilícitos), partículas víricas y metabolitos de, o anticuerpos para, cualquiera de las substancias anteriores. Como ejemplos representativos de analitos se incluyen ferritina, creatinina kinasa MIB (CK-MB), digoxina, fenitoína, fenobarbitol, carbamazepina, vancomicina, gentamicina, teofilina, ácido valproico, quinidina, hormona luteinizante (LH), hormona estimuladora del folículo (FSH), estradiol, progesterona, anticuerpos IgE, vitamina B2 microglobulina, hemoglobina glicada (Gly, Hb), cortisol, digitoxina, N-acetilprocainamida (NAPA), procainamida, anticuerpos para la rubéola, tales como IgG rubéola e IgM rubéola, anticuerpos para la toxoplasmosis, tales como IgG toxoplasmosis (Toxo-IgG) e IgM toxoplasmosis (Toxo-IgM), testosterona, salicilatos, acetaminofeno, antígeno superficial del virus de la hepatitis B (HBsAg), anticuerpos para el antígeno nuclear de la hepatitis B, tales como IgG e IgM para el antígeno nuclear de la hepatitis B (Anti-HBc), virus de la inmunodeficiencia humana 1 (HIV) y 2 (HTLV), antígeno e de la hepatitis B (HBeAg), anticuerpos para el antígeno e de la hepatitis B (anti-HBe), hormona estimulante del tiroides (TSH), tiroxina (T4), triyodotironina libre (T3 libre), antígeno carcinoembrionario (CEA) y alfa- proteína fetal (AFP), y fármacos de abuso y substancias controladas, incluyendo, aunque sin limitación, anfetamina; metanfetamina; barbituratos, tales como amobarbital, secobarbital, pentobarbital, fenobarbital y barbital; benzodiazepinas, tales como Librium y Valium; cannabinoides, tales como el hashish y la marihuana; cocaína; fentanilo; LSD; metapualona; opiáceos tales como la heroína, la morfina, la codeína, la hidromorfona, la hidrocodona, la metadona, la oxicodona, la oximorfona y el opio; feniciclina, y propoxifeno. El término "analito" incluye cualquier substancia antigénica, haptenos, anticuerpos, macromoléculas y combinaciones de éstos.

El término "ciclodextrina", tal como se usa aquí, se refiere de forma colectiva a \alpha, \beta o \gamma ciclodextrina, a menos que se indique expresamente que se trata de una particular de éstas.

La expresión "polímero optimizado altamente fluorescente", tal como se usa aquí, se refiere a una entidad polimérica que tiene una pluralidad de grupos generadores de señal inmovilizados sobre la misma. Los grupos generadores de señal inmovilizados están unidos a la entidad polimérica de tal modo que se maximice la señal generada por los grupos generadores de señal y que se minimice el efecto apagador asociado a la posesión de una pluralidad de grupos generadores de señal espaciados demasiado próximos entre sí.

La expresión "reactivo primario", tal como se usa aquí, se refiere a un reactivo que se une específicamente a analito. El reactivo primario es utilizado como puente entre el analito, al que se une, y un conjugado, que se une al reactivo primario.

La expresión "grupo generador de señal", tal como se utiliza aquí, se refiere a un resto fluorescente (al que a veces se hace referencia como fluoróforo) capaz de absorber energía y de emitir luz o de fluorescer. Como ejemplos representativos de tintes parentales que proporcionan grupos generadores de señal se incluyen tintes de aminoestirilpiridinio, benzotiazolanalinodieno, benzotiazolpiridiniotrieno, fluoresceína, azul cascada, Texas Red^{TM}, p-ftalocianinas, tintes de cianina, tiazoles, dansilo, naftaleno, ácido p-toluidinilnaftalenosulfónico, cumarina, ficoeritrina y aloficoeritrina. Los métodos de derivación de grupos generadores de señal a partir de los tintes parentales son conocidos para quienes tienen conocimientos ordinarios en la técnica.

La expresión "miembro de unión específica", tal como se usa aquí, significa un miembro de un par de unión específica. Un par de unión consiste en dos moléculas diferentes y distintas, donde una de las moléculas se une específicamente a la otra molécula por medios químicos o físicos. Además de pares de unión específica de antígeno y anticuerpo, otros pares de unión específica incluyen, aunque sin limitación, avidina y biotina, carbohidratos y lectinas, secuencias nucleotídicas complementarias, secuencias peptídicas complementarias, moléculas efectoras y receptoras, un cofactor o substrato enzimático y una enzima, un inhibidor enzimático y una enzima, ácidos y bases poliméricos, tintes y ligantes proteicos, péptidos y ligantes proteicos específicos (por ejemplo, ribonucleasa S-péptido y ribonucleasa S-proteína) y similares. Más aún, los pares de unión pueden incluir miembros que son análogos del miembro de unión original, por ejemplo, un analito-análogo o un miembro de unión preparado por técnicas recombinantes o por ingeniería genética. Si el miembro de unión es un inmunorrectivo, puede ser, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o policlonal, una proteína recombinante o un anticuerpo recombinante, un anticuerpo quimérico o una mezcla(s) o fragmento(s) de los anteriores.

La expresión "muestra de ensayo", tal como se usa aquí, se refiere a un material sospechoso de contener el analito. La muestra de ensayo puede ser usada directamente tal como es obtenida de la fuente o después de un pretratamiento para modificar el carácter de la muestra. La muestra de ensayo puede ser obtenida de cualquier fuente biológica, tal como un fluido fisiológico, incluyendo, aunque sin limitación, sangre, saliva, fluido de la lente ocular, fluido cerebroespinal, sudor, orina leche, fluido ascítico, mucus, fluido sinovial, fluido peritoneal, fluido amniótico y similares, y caldos de fermentación, cultivos celulares y mezclas de reacción química y similares. La muestra de ensayo puede ser pretratada antes de su uso, tal como mediante preparación de plasma a partir de sangre, dilución de fluidos viscosos y similares. Los métodos de tratamiento pueden incluir filtración, destilación, concentración, inactivación de componentes que interfieran y adición de reactivos. Además de fluidos biológicos o fisiológicos, se pueden usar otros tipos de muestras líquidas. Como ejemplos representativos de tales muestras líquidas se incluyen agua, productos alimenticios y similares, para la realización de ensayos ambientales o de producción de alimentos. Además, se puede usar un material sólido sospechoso de contener el analito como muestra de ensayo. En algunos casos, puede ser beneficioso tratar una muestra de ensayo sólida para formar un medio líquido o extraer el analito.

En un aspecto, la presente invención proporciona un tinte polimérico consistente en:

(1): una entidad polimérica y

(2): una pluralidad de grupos generadores de señal unidos a dicha entidad polimérica, donde dichos grupos generadores de señal derivan de un tinte que tiene al menos un resto anilino acoplado a un resto heterocíclico que contiene al menos un átomo de nitrógeno en el heterociclo por medio de un grupo de unión etilénicamente insaturado, cuyo tinte polimérico tiene restos hospedadores asociados al mismo, siendo dichos restos hospedadores restos hidrofóbicos y conformacionalmente restrictivos seleccionados entre el grupo consistente en restos de ciclodextrinas, carcerands, calixiranos, grietas moleculares, cucurbiterilos y ciclofanos.

Preferiblemente, el tinte polimérico consiste en una pluralidad de restos hospedadores para dichos grupos generadores de señal. Dichos restos hospedadores están covalentemente unidos a la entidad polimérica o en estrecha proximidad a la entidad polimérica. Tal como se usa aquí, "estrecha proximidad" significa típicamente 100 Angstroms o menos como media, preferiblemente de 10 a 20 Angstroms como media.

Entidad polimérica

Los grupos generadores de señal están unidos a la entidad polimérica. La entidad polimérica facilita la bioconjugación y la solubilidad del tinte polimérico. Además, la entidad polimérica permite la unión de una pluralidad de grupos generadores de señal a una sola célula o molécula.

En la realización preferida de la presente invención, la entidad polimérica es un polímero hidrosoluble que tiene grupos funcionales que permiten la unión de grupos generadores de señal por enlaces covalentes. Preferiblemente, la entidad polimérica contiene grupos funcionales, tales como, por ejemplo: -C(O)-NH-NH_{2}, -NH_{2} y -NHR, donde R representa un miembro seleccionado entre el grupo consistente en un grupo alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, inclusive, isopropilo, -(CH_{2})_{2}CO_{2}-, -(CH_{2})_{2}-SO_{3}-, -(CH_{2})_{2}NH_{3}^{+}, -(CH_{2})_{2}NH_{2}^{+}(CH_{2})_{2}SO_{3}-, -(CH_{2})_{2}O(CH_{2})_{2}O(CH_{2})_{2}-OH y -(CHOH)_{4}CH_{2}OH. La entidad polimérica puede también tener combinaciones de los grupos amino-funcionales antes enumerados. La entidad polimérica puede contener grupos funcionales electrofílicos, tales como grupos carboxilo, grupos cloruro de sulfonilo y grupos éster activados. Preferiblemente, la entidad polimérica tiene un peso molecular medio ponderal o peso molecular medio numérico de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 500.000, más preferiblemente de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 250.000 y más preferiblemente de aproximadamente 150.000 a aproximadamente 200.000.

Cuando se han de unir los grupos generadores de señal a la entidad polimérica por medio de enlaces covalentes, se prefiere utilizar como precursores para los grupos generadores de señal tintes parentales que tienen un grupo reactivo adecuado para formar enlaces covalentes con los grupos amino-funcionales de la entidad polimérica. Los tintes parentales capaces de dicha reacción incluyen, aunque sin limitación, los que tienen grupos éster activos de succinimidilo, grupos haluro de ácido, grupos haluro de sulfonilo, grupos aldehído, grupos yodoacetilo o grupos maleimida. Como ejemplos de clases de tintes parentales que pueden tener los grupos funcionales antes mencionados se incluyen, aunque sin limitación, tintes de hemicianina, por ejemplo tintes de piridinio anilina, tintes de quinolinio anilina, tintes de acridinio anilina, tintes de benzotiazolio anilina, tintes de benzoxazolio anilina, tintes de benimidizolio anilina, tintes de naftatiazolio anilina, tintes de naftindolio anilina, tintes de naftoxazolio anilina, tintes de naftimidizolio anilina y tintes de indolio anilina.

Como se ha descrito previamente, se provoca el apagamiento de la señal cuando una pluralidad de grupos generadores de señal están covalentemente unidos de manera aleatoria a una sola entidad polimérica en estrecha proximidad los unos a los otros. El apagamiento puede reducirse substancialmente optimizando el número de grupos generadores de señal covalentemente unidos a la entidad polimérica. A través de la optimización del número de grupos generadores de señal covalentemente unidos a la entidad polimérica, el conjugado de la presente invención puede emitir una señal que puede ser mejor detectada por un dispositivo de detección, tal como un citómetro de flujo.

Grupo generador de señal

El grupo generador de señal emite luz que tiene una longitud de onda lo suficientemente larga en relación a la longitud de onda de luz de excitación, prescindiendo así del requerimiento de un mecanismo de transferencia de energía y de los problemas relacionados con el mismo. Tal como se usa aquí, "suficientemente larga" significa típicamente al menos 50 nanometros, más preferiblemente al menos 100 nanometros y más preferiblemente al menos 200 nanometros. Se puede unir una pluralidad de grupos generadores de señal a la entidad polimérica. Incluso aunque el grupo generador de señal pueda ser él mismo sensible desde el punto de vista ambiental y, en consecuencia, inestable y, por esa razón, pueda tener una bioconjugabilidad limitada o problemática, el aumento debido a los grupos hospedadores fija el grupo generador de señal en un microambiente adecuado, preservando así la efectividad del grupo generador de señal.

Se puede usar una amplia variedad de grupos generadores de señal para la invención. Los grupos generadores de señal que exhiben una alta desviación de Stokes son particularmente útiles. Tal como se usa aquí, la alta desviación de Stokes varía en el rango de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 nanometros.

Los grupos generadores de señal derivan de tintes parentales que tienen al menos un resto anilino acoplado a un resto heterocíclico que contiene al menos un átomo de nitrógeno en el heterociclo por medio de un grupo de unión etilénicamente insaturado.

Si la entidad polimérica es nucleofílica, los grupos generadores de señal deben ser electrofílicos. Si la entidad polimérica es electrofílica, los grupos generadores de señal deben ser nucleofílicos. Si la entidad polimérica es nucleofílica, puede, por ejemplo, contener unidades repetitivas seleccionadas entre los grupos consistentes en acrilamida hidrazido, hidrazida y lisina. Si la entidad polimérica es electrofílica, puede, por ejemplo, contener unidades repetitivas seleccionadas entre el grupo consistente en acrílico, glutámico, aspártico y estirenosulfónico. Si los grupos generadores de señal son electrofílicos, pueden contener grupos carboxílicos. Si los grupos generadores de señal son nucleofílicos, pueden contener grupos amina o grupos hidrazida o tanto grupos amina como grupos hidrazida.

Como clases representativas de grupos generadores de señal adecuados para esta invención se incluyen tintes de hemicianina, por ejemplo tintes de piridinio anilina, tintes de quinolinio anilina, tintes de acridinio anilina, tintes de benzotiazolio anilina, tintes de benzoxazolio anilina, tintes de benimidizolio anilina, tintes de naftatiazolio anilina, tintes de naftindolio anilina, tintes de naftoxazolio anilina, tintes de naftimidizolio anilina y tintes de indolio anilina.

En general, los tintes parentales para los grupos generadores de señal adecuados para esta invención pueden ser representados por la fórmula:

A- -L- -B

donde A representa un grupo heterocíclico, L representa un grupo de unión y B representa un grupo anilino. Se prefiere que el grupo A contenga de uno a tres anillos. Si hay más de un anillo incluido en el grupo heterocíclico, se prefieren que estén fusionados. Los átomos que pueden estar en el anillo heterocíclico, aparte de los átomos de carbono, son preferiblemente átomos de nitrógeno, oxígeno y azufre. Al menos está presente un átomo de nitrógeno en el anillo heterocíclico. Los átomos del anillo pueden contener substituyentes distintos de hidrógeno. Sin embargo, estos substituyentes no deben afectar de manera adversa a la interacción entre los grupos generadores de señal y el resto hospedador. Se prefiere que el grupo B tenga la fórmula:

3

donde R_{1} representa un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono y R_{2} representa un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono.

Los átomos del anillo de B pueden contener substituyentes distintos de hidrógeno. Sin embargo, estos substituyentes no han de afectar de forma adversa a la interacción entre los grupos generadores de señal y el resto hospedador. Se prefiere que L tenga la fórmula:

-(-CH=CH-)_{n}-

donde n representa 1, 2 ó 3.

Aunque se puede emplear una serie de grupos generadores de señal para la invención, un grupo generador de señal preferido incluye tintes sintéticos de aminoestirilpiridinio, aminoestirilbenzotiazolio, quinolinio y acridinio. Esos tintes y su síntesis son conocidos para los que tienen conocimientos ordinarios en la técnica. Véase, por ejemplo, Anthony C. Stevens y col., "Synthesis of Protein-Reactive (Aminostyryl)pyridinium Dyes", Bioconjugate Chem., 1993, 4, 19-24.

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El tinte de piridinio anilino preferido es un fluorógeno de aminoestirilo monomérico de fórmula:

4

donde R_{1} representa un grupo alquilo y R_{2} representa un grupo alquilo y n representa un número entero de 1 a 3 inclusive y X^{-} representa un contraión cargado negativamente.

La longitud de onda de excitación de este tinte es de aproximadamente 488 nm y la longitud de onda de emisión es de aproximadamente 580 nm cuando n = 1; la longitud de onda de excitación de este tinte es de aproximadamente 488 nm y la longitud de onda de emisión es de aproximadamente 680 nm cuando n = 2, y la longitud de onda de excitación de este tinte es de aproximadamente 544 nm y la longitud de onda de emisión es de aproximadamente 790 cuando n = 3. Este tinte concreto, o un derivado amina o carboxílico del mismo, puede servir como precursor del grupo generador de señal del tinte polimérico de la invención. Se pueden obtener resultados excepcionales de fluorescencia en aplicaciones de citometría de flujo cuando el grupo generador de señal deriva de este tinte.

Como se ha descrito previamente, los tintes de aminoestirilpiridinio no habían sido considerados como adecuados para muchos de los ensayos de fluorescencia, tales como la citometría de flujo y otros procesos de fluorescencia, primariamente debido a que estos tintes son ambientalmente sensibles y la intensidad de emisión es muy débil en soluciones acuosas.

Otro tinte que ha resultado tener propiedades fluorescentes excepcionales cuando sirve como grupo generador de señal es el tinte de benzotiazolio anilino, que tiene la siguiente estructura:

5

donde R_{1} representa un grupo alquilo y R_{2} representa un grupo alquilo y n representa un número entero de 1 a 3 inclusive.

La longitud de onda de excitación de este tinte es de aproximadamente 488 nm y la longitud de onda de emisión de este tinte es de aproximadamente 580 nm cuando se emplea como fluoróforo en un polímero intensificado por unión covalente de \beta-ciclodextrinaldehído cuando n = 1. La longitud de onda de excitación de este tinte es de aproximadamente 488 nm y la longitud de onda de emisión de este tinte es de aproximadamente 680 nm cuando se emplea como fluoróforo en un polímero intensificado por unión covalente de \beta-ciclodextrinaldehído cuando n = 2. La longitud de onda de excitación de este tinte es de aproximadamente 488 nm y la longitud de onda de emisión de este tinte es de aproximadamente 750 nm cuando se emplea como fluoróforo en un polímero intensificado por unión covalente de \beta-ciclodextrinaldehído cuando n = 3. Ciertos análogos de estos tintes anilino darán también resultados de fluorescencia excepcionales. Estos análogos incluyen, aunque sin limitación, los tintes siguientes, donde n representa un número entero de 1 a 3 inclusive y X^{-} representa un contraión negativamente cargado.

6

Aminopiridinioanilino

7

Aminoquinolinioanilino

8

Carboxiquinolinioanilino

9

Carboxibenzotiazolioanilino

10

Carboxibenzoxazolioanilino

11

Carboxibenzimidazolioanilino

12

Carboxinaftindolioanilino

13

Carboxinaftindolioanilino

14

Carboxinaftindolioanilino

15

Carboxinaftotiazolioanilino

16

Carboxinaftotiazolioanilino

17

Carboxinaftotiazolioanilino

18

Carboxinaftimidazolioanilino

19

Carboxinaftimidazolioanilino

20

Carboxinaftimidazolioanilino

21

Carboxinaftoxazolioanilino

22

Carboxinaftoxazolioanilino

23

Carboxinaftoxazolioanilino

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Carboxiacridinioanilino

25

Aminoacridinioanilino

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Los tintes parentales pueden estar substituidos o sin substituir, es decir, que la porción heterocíclica del tinte parental puede contener substituyentes distintos de hidrógeno. Más aún, la porción anilino del tinte puede contener substituyentes distintos de hidrógeno. La naturaleza particular de estos substituyentes eventuales no es crítica. Sin embargo, estos substituyentes no deben producir efectos adversos sobre la interacción de los grupos generadores de señal con el resto hospedador. Entre los substituyentes que son adecuados para la porción heterocíclica del tinte o la porción anilino de tinte se incluyen, aunque sin limitación, alquilo, alquenilo, amino, metoxi, cloro, fluoro, bromo, hidroxi y nitro.

Se hace referencia al proceso de unión de los grupos generadores de señal a la entidad polimérica como carga del polímero. Sin embargo, la mera carga de la entidad polimérica con grupos generadores de señal puede no resultar en un tinte polimérico que emita la cantidad máxima de fluorescencia que se pueda conseguir. Si la entidad polimérica está sobrecargada, se puede producir el apagamiento; si la entidad polimérica está infracargada, los grupos generadores de señal que podrían haberse añadido sin experimentar apagamiento quedarán suprimidos, dando lugar a un nivel de fluorescencia por debajo del máximo. Así, se prefiere que el número de grupos generadores de señal unidos a una entidad polimérica se óptimo para generar un polímero capaz de emitir el mayor nivel de fluorescencia.

La optimización del número de grupos generadores de señal sobre una entidad polimérica puede ser conseguida ejecutando una serie de cargas y determinando después qué nivel de carga da el tinte polimérico que emite el mayor nivel de señal. En general, este procedimiento puede ser llevado a cabo creando un panel de cargas de prueba que combinen concentraciones variables de grupos generadores de señal con una cantidad constante de entidad polimérica. Las entidades poliméricas cargadas pueden ser entonces separadas de cualquier material no reaccionado mediante una variedad de métodos conocidos para quienes tienen conocimientos ordinarios en la técnica, tales como precipitación, enfoque isoeléctrico o, preferiblemente, cromatografía de exclusión por tamaños. Los polímeros separados pueden ser entonces estudiados en cuanto a su capacidad para emitir una señal y determinar qué concentración de carga da el tinte polimérico que emite el mayor nivel de señal. Típicamente, el tinte polimérico que exhibe el mayor nivel de señal ha sido óptimamente cargado y la concentración a la cual se cargó puede ser usada para cargar óptimamente cantidades de la entidad polimérica con fines de gran escala. Tal como se usa aquí, "carga óptima" significa unión del número máximo de grupos generadores de señal a la entidad polimérica sin conllevar apagamiento o efectos adversos sobre la bioconjugabilidad.

El método preferido para determinar el número óptimo de grupos generadores de señal para unión a una entidad polimérica particular incluye las siguientes etapas:

(1): cálculo del peso molecular de la entidad polimérica seleccionada;

(2): determinación de la cantidad molar total de grupos reactivos, por ejemplo, grupos funcionales amina, presentes sobre la entidad polimérica;

(3): creación de un panel consistente en una serie de soluciones stock, cada de las cuales contiene una concentración diferente de grupos generadores de señal;

(4): carga de grupos generadores de señal sobre las entidades poliméricas a través de la reacción con grupos reactivos, por ejemplo grupos amino-funcionales;

(5): purificación (separación) del polímero cargado con respecto a los materiales no reaccionados;

(6): análisis de los tintes poliméricos en cuanto a su capacidad para emitir señales, y

(7): aproximación a escala.

Las soluciones stock contienen varias concentraciones de los tintes que tienen grupos generadores de señales disueltos en un solvente adecuado, como, por ejemplo, dimetilformamida (DMF) o sulfóxido de dimetilo (DMSO). La razón molar de carga de grupos generadores de señal a grupos reactivos de la entidad polimérica, típicamente grupos amino-funcionales, en el panel puede variar como sigue: 5%, 10%, 15%, 20%, 40%, 75%, 100%, 140% y 200%. Las concentraciones del panel son preferiblemente escogidas de manera que incluyen razones molares de carga suficientemente grandes para que se produzca el apagamiento, o que el tinte se cargue de forma máxima, delineando así claramente el punto al cual se carga óptimamente la entidad polimérica. Después de haber establecido el panel, se añade cada miembro del panel a soluciones individuales y equimolares de la entidad polimérica.

Se puede separar entonces cada solución de polímero cargado de la entidad polimérica no reaccionada y/o de los tintes que tienen grupos generadores de señal por técnicas conocidas para alguien con conocimientos ordinarios en este campo. Como se ha indicado previamente, después de separar los polímeros éstos pueden ser analizados en cuanto a su capacidad para emitir señal y se puede producir entonces una cantidad a escala de polímero usando los datos así obtenidos.

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Se pueden ejecutar paneles de optimización adicional para determinar con mayor exactitud la concentración óptima de carga. Hay que entender, por supuesto, que no se pretende limitar la forma en que se optimiza un polímero a los métodos aquí descritos y que se pueden emplear también otros métodos.

El tinte polimérico puede unirse a un miembro de unión específica por medio de una variedad de técnicas conocidas para alguien con conocimientos ordinarios en este campo. Se prefiere unir el tinte polimérico a, o próximamente a, la porción Fc de un anticuerpo mediante un enlace covalente, formando así un conjugado. No deseando inclinarnos por ninguna teoría en concreto, se especula que la unión del polímero a un anticuerpo de este modo bloquea estéricamente la porción Fc del anticuerpo, evitando así que se una, por ejemplo, a los receptores Fc presentes sobre la superficie de determinadas poblaciones celulares. Adicionalmente, la unión específica de sitio deja a las regiones ligables de los anticuerpos desbloqueadas y capaces de unirse a su objetivo pretendido. Hay que entender, por supuesto, que la forma en que se une el miembro de unión específica a un tinte polimérico no pretende quedar limitada a los métodos aquí descritos y que se pueden emplear también otros métodos conocidos para los que tienen conocimientos ordinarios en esta área.

Se puede unir un tinte polimérico a un anticuerpo para formar un conjugado oxidando la región Fc del anticuerpo y haciendo reaccionar después al anticuerpo oxidado con un tinte polimérico del tipo aquí descrito. El anticuerpo es preferiblemente oxidado a una concentración de aproximadamente 1,0 mg/ml a aproximadamente 20,0 mg/ml, más preferiblemente de aproximadamente 1,0 mg/ml a aproximadamente 10,0 mg/ml y más preferiblemente de aproximadamente 2,0 mg/ml a aproximadamente 5,0 mg/ml. Si se obtiene el anticuerpo en concentraciones que quedan fuera de estos rangos, se le puede concentrar por métodos conocidos para los que tienen conocimientos ordinarios en la técnica o diluir con un tampón apropiado. El anticuerpo es preferiblemente oxidado en un tampón que tiene un pH de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8,0, más preferiblemente de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0 y más preferiblemente de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,0. La oxidación de la región Fc del anticuerpo puede ser llevada a cabo con un agente oxidante conocido para los que tienen conocimientos ordinarios en la técnica. Dichos agentes oxidantes incluyen, aunque sin limitación, peryodato de sodio, bromo y similares. Las soluciones que contienen los agentes oxidantes tienen típicamente una concentración de agente oxidante de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 250 mM, preferiblemente de aproximadamente 175 mM a aproximadamente 200 mM. La oxidación del anticuerpo puede tener lugar a una temperatura de desde aproximadamente 2ºC hasta aproximadamente 30ºC. Preferiblemente, la oxidación tiene lugar a una temperatura de desde aproximadamente 2ºC hasta aproximadamente 8ºC durante aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 5 horas, preferiblemente durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 2 horas. Después de haberse oxidado el anticuerpo, éste puede ser purificado por métodos conocidos en la técnica y puesto en un tampón apropiado, que tenga preferiblemente un pH de entre aproximadamente 3 y aproximadamente 6, más preferiblemente de entre aproximadamente 4 y aproximadamente 5. El anticuerpo oxidado puede ser entonces acoplado al tinte polimérico. Hay que entender, por supuesto, que la forma en que se oxida un anticuerpo no pretende estar limitada a los métodos aquí descritos y que se pueden emplear también otros métodos conocidos en la técnica.

Al reaccionar un anticuerpo oxidado con un tinte polimérico, la concentración del tinte polimérico puede variar entre aproximadamente 1,0 mg/ml y aproximadamente 20,0 mg/ml, preferiblemente entre aproximadamente 2,0 mg/ml y aproximadamente 5,0 mg/ml, en un tampón apropiado. Los tampones adecuados para esta reacción tienen preferiblemente un pH en el rango de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 7,0, más preferiblemente en el rango de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,0. Como tampones adecuados para la reacción se incluye, aunque sin limitación, el fosfato de trietanolamina. La cantidad de tinte polimérico añadido al anticuerpo oxidado puede variar entre aproximadamente 1,0 y aproximadamente 20 equivalentes de tinte polimérico por un equivalente de anticuerpo, en base al peso molecular del anticuerpo y al peso molecular estimado del tinte polimérico. La reacción entre el anticuerpo oxidado y el tinte polimérico puede tener lugar a una temperatura de desde aproximadamente 2ºC hasta aproximadamente 30ºC, preferiblemente de desde aproximadamente 2ºC hasta aproximadamente 8ºC, en un recipiente estanco a la luz. Se puede dejar que la reacción proceda durante aproximadamente 2 a aproximadamente 48 horas, preferiblemente durante aproximadamente 12 a aproximadamente 15 horas. Al completarse la reacción, se puede separar el conjugado de los componentes no reaccionados de la mezcla de reacción por medio de métodos de separación conocidos para los que tienen conocimientos ordinarios en la técnica.

En los casos en los que se unen tintes poliméricos que tienen grupos amino-funcionales primarios o secundarios a un miembro de unión específica por un enlace covalente, se prefiere una etapa adicional. Como resultado de la reacción inicial entre el anticuerpo y el tinte polimérico, se forma una base de Schiff y la reducción de la base de Schiff puede ser realizada por métodos conocidos para alguien con conocimientos ordinarios en la técnica, tales como el uso de un agente reductor adecuado, tal como NaCNBH_{3}, a una concentración que va de aproximadamente 0,25 mg/ml a aproximadamente 2,0 mg/ml. El conjugado reducido puede ser entonces separado del exceso de reactivos por técnicas de separación conocidas para alguien con conocimientos ordinarios en la técnica. Hay que entender, por supuesto, que la manera mediante la cual se reduce la base de Schiff no pretende estar limitada a los métodos aquí descritos y que pueden emplear también otros métodos.

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Se prefiere que los grupos generadores de señal covalentemente unidos a la entidad polimérica estén albergados en una cavidad hidrofóbica de una molécula que esté covalentemente unida a la entidad polimérica. En esta realización preferida, los grupos generadores de señal no necesitan tener ningún grupo reactivo. Sin embargo, como entenderán los que tienen conocimientos ordinarios en la técnica, el grupo generador de señal será uno capaz de ser albergado por el resto hospedador particular que esté siendo utilizado.

Resto hospedador

El resto hospedador debe proporcionar un microambiente hidrofóbico y conformacionalmente restrictivo. La hidrofobicidad permite al resto hospedador ser compatible con los grupos generadores de señal. Se piensa que la restrictividad conformacional mejora la fluorescencia de los grupos generadores de señal. Los grupos hospedadores usados en la invención se caracterizan por pequeñas moléculas seleccionadas entre el grupo consistente en restos de ciclodextrinas, por ejemplo \alpha-ciclodextrinas, \beta-ciclodextrinas, \gamma-ciclodextrinas, carcerands, calixiranos, grietas moleculares, cucurbiterilos y ciclofanos. Los carcerands están descritos en J.-M. Lehn, Struct. Bonding (Berlin) 16 (1973) 1; J.-M. Lehn, Acc. Chem. Res. 11 (1948) 49; P.G. Potvin, J.-M. Lehn, en R.M. Izatt, J.J. Christensen (Eds.): Synthesis of Macrocycles: The Design of Selective Complexing Agents (Progress in Macrocycle Chemistry, Vol. 3), Wiley, New York 1987, p. 167; D.J. Cram, Angew. Chem. 98 (1986) 1041; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 25 (1986) 1039; B. Dietrich, J. Chem. Ed. 62 (1985) 954, y D.J. Cram, K.N. Trueblood, Top. Curr. Chem. 98 (1981) 43. Los calixiranos están descritos en B. Xu y T. Swager, "Host-Guest Mesomorphism: Cooperative Stabilization of a Bowlic Columnar Phase", J. Am. Chem. Soc. 1985, 117, 5011-5012. Las grietas moleculares están descritas en J. Rebek, Jr., Acc. Chem. Res. 17 (1984) 258, y Science 235 (1987) 1478. Los cucurbiturilos están descritos en Mock, W.L., Shih, N.Y., J. Org. Chem., 1983, 48 (20), 3618-3619. Los ciclofanos están descritos en F. Diederich, M.R. Heester, M.A. Uyeki, Angew. Chem. 1988, 100, 1775; Angew Chem. Int. Ed. Engl., 1988, 27, 1705.

La intensificación de la señal generada por los grupos generadores de señal de los tintes poliméricos aquí descritos es preferiblemente conseguida uniendo ciclodextrina, preferiblemente \beta-ciclodextrinaldehído, mediante enlaces covalentes a la entidad polimérica, preferiblemente al esqueleto de un polímero altamente fluorescente optimizado. Alternativamente, la ciclodextrina no necesita estar covalentemente unida a la entidad polimérica, sino que sólo necesita estar en estrecha proximidad a la entidad polimérica.

A continuación se describirá el aumento de un polímero altamente fluorescente optimizado con \beta-ciclodextrinaldehído a través de enlaces covalentes. El aumento de un polímero altamente fluorescente optimizado con uno de los restos hospedadores alternativos es substancialmente similar al aumento que se puede conseguir con una ciclodextrina. Se prefiere la unión de ciclodextrinaldehído a la entidad polimérica del tinte polimérico por enlaces covalentes, ya que se ha visto que proporciona el mayor aumento de la fluorescencia. Se puede unir la molécula de ciclodextrina a la entidad polimérica por el borde primario de la molécula de ciclodextrina incorporando selectivamente un solo grupo reactivo al borde primario de la molécula de ciclodextrina. Así, el borde secundario estará sin bloquear y la cavidad hidrofóbica será accesible a las moléculas huésped. Se puede conseguir la unión del borde primario de una molécula de ciclodextrina a una entidad polimérica que tiene grupos funcionales amina convirtiendo un solo grupo aldehído sobre el borde primario de la molécula de ciclodextrina y haciendo reaccionar después ese grupo con un grupo amina presente sobre la entidad polimérica, mediante lo cual se une la molécula de ciclodextrina a la entidad polimérica a través de un enlace covalente. Como ya se indicado, la generación de un solo grupo aldehído en el borde primario de una molécula de ciclodextrina puede ser conseguida por métodos conocidos para alguien con conocimientos ordinarios en la técnica. Por ejemplo, se puede generar un aldehído en el borde primario de la ciclodextrina usando el reactivo de peryodonano de Dess-Martin. D.B. Dess y col., J. Org. Chem., 48, 4155-4156 (1983). Esta reacción puede ser llevada a cabo en un sistema heterogéneo que contenga cantidades estequiométricas de reactivo de Dess-Martin y ciclodextrina disueltos en tetrahidrofurano (THF). Aunque se produce 6-ciclodextrinamonoaldehído, el reactivo de Dess-Martin es potencialmente explosivo y ya no puede ser fácilmente adquirido de fuentes comerciales. Otras vías al monoaldehído implican de tres a cuatro etapas que producen intermediarios de azida tóxicos y potencialmente explosivos.

Alternativamente, se ha descubierto un método de producción de 5-ciclodextrinamonoaldehídos que no incluye la producción de intermediarios peligrosos. El método puede ser llevado a cabo con materiales que son fácilmente disponibles a nivel comercial. En general, el método incluye dos etapas y puede ser llevado a cabo según se muestra a continuación en el Esquema 1.

(Esquema pasa a la página siguiente)

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Esquema 1

Cloruro de tosilo

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La primera etapa del método incluye la conversión de una ciclodextrina en su derivado monotosilato. El derivado tosilato es entonces oxidado para obtener el ciclodextrinamonoaldehído.

Existen varios métodos para convertir la ciclodextrina en su derivado monotosilato. Véase L.D. Melton y col., Carbohydrate Research, 18, 1971, 29-37, o R.C. Petter y col., J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 3360-3368. Después de haberse formado el monohidrato, puede ser separado de la mezcla de reacción por métodos conocidos para los que tienen conocimientos ordinarios en la técnica, preferiblemente por cromatografía líquida de alto rendimiento ("HPLC"). El monotosilato sólido puede ser entonces recuperado eliminando el solvente de la solución que contiene monotosilato de ciclodextrina disuelto por métodos conocidos para quienes tienen conocimientos ordinarios en la técnica. El ciclodextrinamonoaldehído sólido puede ser entonces usado en la segunda etapa del proceso.

La etapa de oxidación del método puede ser llevada a cabo por una variedad de métodos. Típicamente, la etapa de oxidación incluye una reacción mediada por sulfóxido de dimetilo ("DMSO") que puede ser catalizada a través de la adición de una base. Se vio que, calentando el derivado monotosilato a una temperatura de aproximadamente 75ºC a aproximadamente 85ºC en DMSO, se obtenía la lenta conversión (aproximadamente 1-3 días) del derivado tosilato en el monoaldehído.

La adición de base a la reacción mediada por DMSO puede ser usada para aumentar la velocidad de conversión del monotosilato al monoaldehído. Por ejemplo, se puede usar una cantidad traza de hidróxido de sodio (NaOH) para acelerar la reacción. Las bases preferidas para uso en esta etapa del proceso incluyen bases de aminas bloqueadas, tales como diisopropilamina, N-metilmorfolina, trietilamina, trimetilamina y similares. La diisopropiletilamina (también conocida como Base de Hunig) es una base de amina bloqueada particularmente preferida. La conversión del monotosilato en el monoaldehído es preferiblemente conseguida cuando el monotosilato está presente en solución a una concentración de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 20% en peso, más preferiblemente de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 15% en peso y más preferiblemente de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 10% en peso. La cantidad de base de amina bloqueada adecuada para la conversión puede variar entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 1,0 equivalentes molares del monotosilato en solución, preferiblemente entre aproximadamente 0,3 y aproximadamente 0,7 equivalentes molares del monotosilato en solución. El ciclodextrinamonoaldehído así formado puede ser separado de cualquier material no reaccionado por métodos conocidos para alguien con conocimientos ordinarios en la técnica y reaccionar con un polímero amino-funcional. Alternativamente, la mezcla de reacción puede reaccionar directamente con un polímero amino-funcional.

El ciclodextrinamonoaldehído aquí presentado puede unirse fácilmente a compuestos que tengan grupos funcionales amina o hidrazida por medio de los métodos de química covalente estándar conocidos para quienes tienen conocimientos ordinarios en la técnica. Como ejemplos de tales grupos funcionales amina se incluyen, aunque sin limitación: -C(O)-NH-NH_{2}, -NH_{2} y -NHR, donde R representa un miembro seleccionado entre el grupo consistente en un grupo alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, inclusive, isopropilo, -(CH_{2})_{2}CO_{2}-, -(CH_{2})_{2}SO_{3}-, -(CH_{2})_{2}NH_{3}^{+}, -(CH_{2})_{2}NH_{2}^{+} -(CH_{2})_{2}SO_{3}-, -(CH_{2})_{2}O(CH_{2})_{2}O(CH_{2})_{2}OH y -(CHOH)_{4}CH_{2}OH. Como ejemplos de compuestos que tienen estos grupos amino-funcionales se incluyen, aunque sin limitación, polímeros amino-funcionales tales como poliacrilamidahidrazida y fases sólidas amino-funcionales, tales como micropartículas aminadas.

En casos en los que reaccionan compuestos con funcionalidad de amina primaria o secundaria con ciclodextrinamonoaldehído para formar enlaces covalentes, se prefiere una etapa adicional. Después de tener lugar la reacción inicial entre el compuesto y el monoaldehído, se forma una base de Schiff y se puede conseguir la reducción de la base de Schiff en la manera previamente descrita.

Se puede unir el ciclodextrinamonoaldehído a entidades poliméricas amino-funcionales que no contienen grupos generadores de señal o a tintes poliméricos amino-funcionales que contienen grupos generadores de señal. Si se añade el ciclodextrinamonoaldehído a una entidad polimérica amino-funcional que no contiene grupos generadores de señal, se puede hacer que la entidad polimérica se vuelva a continuación fluorescente por adición de fluoróforos generadores de señal a la entidad polimérica. Una forma en la que se puede hacer que la entidad polimérica se vuelva fluorescente es a través de la unión de los grupos generadores de señal a la entidad polimérica amino-funcional por enlaces covalentes.

La fluorescencia de conjugados que contienen los tintes poliméricos de esta invención puede aumentar por adición de ciclodextrina al conjugado por medio de un enlace no covalente. Cuando se usa ciclodextrina de este modo, no se necesita hacer modificación alguna en la molécula de ciclodextrina o en el conjugado. No deseando inclinarnos por ninguna teoría, creemos que la ciclodextrina se asocia a los grupos generadores de señal presentes sobre el tinte polimérico albergando los grupos generadores de señal covalentemente unidos en el centro hidrofóbico de la molécula de ciclodextrina. Cuando se usa ciclodextrina para aumentar la fluorescencia de un tinte polimérico, es preferiblemente usada en concentraciones que van de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 200 mM, preferiblemente de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 20 mM.

Como se ha indicado previamente, el conjugado de esta invención tiene una variedad de usos. El método preferido de utilización del conjugado de esta invención es en una aplicación de citometría de flujo que emplea un conjugado fluorescente o múltiples conjugados fluorescentes para detectar células contenidas en una muestra de ensayo. Un ejemplo de un citómetro de flujo es el Clasificador Celular Activado por Fluorescencia ("FACS II") fabricado por Becton, Dickinson & Co., Franklin Lakes, N.J. En general, un sistema de imagen contiene una fuente de excitación y un dispositivo de detección. La fuente de excitación excita el grupo generador de señal asociado al conjugado y el dispositivo de detección detecta la señal emitida por el grupo generador de señal excitado.

En un análisis típico de sistema de imagen, se incuba una muestra de ensayo con un conjugado fluorescente, que se une específicamente a ciertas células que pueden estar presentes en la muestra de ensayo. La incubación tiene lugar durante un tiempo y a una temperatura que favorece la unión del conjugado a poblaciones celulares específicas contenidas en la muestra. Se hace comúnmente referencia a las células unidas al conjugado como teñidas y se puede llevar a cabo el procedimiento de tinción múltiples veces, secuencialmente o al mismo tiempo, con múltiples conjugados, que emiten señales de longitudes de onda variables. Después de completarse el procedimiento de tinción, la muestra puede ser analizada usando un citómetro de flujo.

En una realización preferida alternativa de citometría de flujo con el tinte polimérico de la presente invención, se incuba una muestra de ensayo con una solución de reactivo primario que se une específicamente a ciertas células que pueden estar presentes en la muestra de ensayo para formar complejos primarios. El reactivo no unido, de haberlo, puede ser lavado de la muestra y se incuba entonces un conjugado fluorescente específico para el reactivo primario unido con los complejos primarios. El reactivo no unido, de haberlo, puede ser entonces eliminado de los complejos primarios y la fluorescencia asociada a las células puede ser determinada como antes. Se entenderá que el procedimiento de tinción puede ser repetido múltiples veces con reactivos primarios específicos para diferentes marcadores celulares y conjugados que fluorescen a las mismas o a diferentes longitudes de onda. Se entenderá también, por supuesto, que el procedimiento de tinción puede ser llevado a cabo de un modo secuencial o a modo de lotes, donde se añaden todos los componentes necesarios para la tinción de las células a la muestra antes de determinar la fluorescencia asociada a las células.

En una realización alternativa, se pueden adaptar el conjugado y el método de la presente invención para uso en inmunoensayos de fase sólida convencionales, tales como, por ejemplo, un inmunoensayo de tipo emparedado. Un inmunoensayo de tipo emparedado típicamente implica poner en contacto una muestra de ensayo sospechosa de contener un analito con una perla o micropartícula sólida de plástico, látex o vidrio substancialmente inerte u otro material de soporte que haya sido revestido con un miembro de unión específica que forme un par de unión con el analito. Se hace comúnmente referencia al material de soporte revestido con el miembro de unión como "reactivo de captura". Después de unirse el analito al material de soporte, se elimina el resto de la muestra del material de soporte. Se trata el material de soporte, al que se une el analito, con un conjugado, que generalmente incluye un segundo miembro de unión marcado con un grupo generador de señales. El conjugado se une al analito, que se une al material de soporte. La combinación del material de soporte que tiene el primer miembro de unión, el analito, y el conjugado al mismo, es separada de cualquier conjugado no unido, típicamente con una o más etapas de lavado. La señal generada por el grupo generador de señal, a través de la excitación apropiada, puede ser entonces observada visualmente, o más preferiblemente mediante un instrumento, para indicar la presencia o la cantidad de un analito en una muestra de ensayo. Se entenderá, por supuesto, que el orden y el número de las etapas empleadas para realizar dichos ensayos no pretenden limitar la invención aquí descrita.

Como se ha indicado previamente, el analito detectado mediante dicho inmunoensayo puede ser el producto o productos de una reacción de amplificación. En consecuencia, los analitos pueden tener secuencias de ácidos nucleicos o ser, por el contrario, los productos de una reacción de hibridación, tal como LCR, que aparece descrita en las Solicitudes de Patente Europeas EP-A-320-308 y EP-A-439-182, y PCR, que está descrita en las Patentes EE.UU. Números 4.683.202 y 4.683.195.

En casos en que los analitos consisten, por ejemplo, en los productos de reacción o secuencias de LCR o PCR, las secuencias pueden contener, o ser modificadas para que contengan, un miembro de unión que forma un par de unión con un reactivo indicador y un miembro de unión que forma un par de unión con un reactivo de captura.

Los sistemas automatizados adecuados para realizar inmunoensayos de tipo emparedado, tales como, por ejemplo, los enzimoinmunoensayos de micropartículas ("MEIAs") son bien conocidos en la técnica. Un instrumento automatizado particularmente preferido y comercializado que puede ser empleado para realizar MEIAs es el sistema Imx®, que puede ser adquirido de Abbott Laboratories, Abbott Park, IL. Los protocolos para MEIAs, tales como los realizados con el instrumento Imx® de Abbott son bien conocidos en la técnica y han sido descritos en Fiore, M. y col., Clin. Chem., 34/9: 1726-1732 (1988).

Los tintes poliméricos intensificados con grupos hospedadores de esta invención proporcionan resultados excepcionales en citometría de flujo, excediendo con mucho a los obtenidos con los tintes, polímeros y conjugados fluorescentes hasta ahora conocidos. Estos tintes poliméricos pueden ser usados en lugar de los tintes, polímeros y conjugados hasta ahora conocidos, tales como los tándem ficobiliproteína-Cy5 y similares.

Los grupos generadores de señales convencionales (es decir, los fluoróforos) con altas desviaciones de Stokes son demasiado débiles para detectarlos con una razonable sensibilidad para aplicaciones de multiplexación. La invención supera ese problema y puede ser empleada en una serie de aplicaciones, incluyendo, aunque sin limitación, los ensayos de multiplexación, incluyendo la multiplexación por inmunoensayo de fluorescencia multicolor, la citometría de flujo, los ensayos de inmunofenotipificación, las aplicaciones de imagen, la tinción inmunológica, la microscopía de fluorescencia, la tinción inmunocromatográfica, el inmunoensayo de polarización de la fluorescencia ("FPIA"), la hibridación de fluorescencia in situ ("FISH"), la detección de analitos por fluorescencia y otros. La invención es particularmente efectiva para aplicaciones de citometría de flujo. Sin embargo, no se limita a esas aplicaciones y, de hecho, es adecuada para muchas aplicaciones en las que está implicado el ensayo o la detección de fluorescencia y que están sometidas a problemas como los previamente discutidos con respecto a la técnica anterior.

Adicionalmente, muchos de los grupos generadores de señal adecuados para uso en la invención son sintéticos. Los grupos generadores de señal sintéticos son típicamente más estables que los fluoróforos naturales.

La presente invención reduce la sensibilidad ambiental de estos y de otros tintes dotando a estos tintes de un microambiente apropiado y deseado. Fijando de este modo los tintes en dicho microambiente, la efectividad de las propiedades fluorescentes de estos tintes no resulta significativamente afectada por el macroambiente, la conjugación u otros factores.

La invención será más específicamente ilustrada mediante los siguientes ejemplos no limitativos. En estos ejemplos, se emplearon los siguientes tampones:

Tampón fosfato que contenía fosfato 100 mM y NaCl 100 mM, pH 5,5 (en adelante, "Tampón Nº 1").

Tampón fosfato que contenía fosfato 100 mM y NaCl 100 mM, pH 7,0 (en adelante, "Tampón Nº 2").

Tampón de trietanolamina que contenía trietanolamina 50 mM y NaCl 160 mM, pH 8,0 (en adelante, "Tampón Nº 3").

Tampón acetato, pH 4,5 (acetato 0,1 N, NaCl 0,1 N) (en adelante, "Tampón Nº 4").

Tampón acetato, pH 5,5 (acetato 0,1 N, NaCl 0,1 N) (en adelante, "Tampón Nº 5").

Tampón fosfato que contenía trietanolamina 50 mM, NaCl 160 mM, pH 7,0, con ZnCl_{2} 0,1 mM y MgCl_{2} 1 mM (en adelante, "Tampón Nº 6").

Tampón HEPES, pH 6,8 (HEPES 0,1 N) (en adelante, "Tampón Nº 7").

Tampón fosfato que contenía fosfato 100 mM y NaCl 100 mM, pH 7,5 (en adelante, "Tampón Nº 8").

Tampón fosfato 20 mM, pH 7,0 (fosfato 0,02 N, cloruro de sodio 0,02 N) (en adelante, "Tampón Nº 9").

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En estos ejemplos, se emplearon las siguientes marcas registradas:

: "SEPHACRYL S-300", Pharmacia LKB Biotechnology AB.

: "CENTRICON-30", W.R. Grace & Co.

: "PARR", Parr Instrument Co.

: "CELITE", Celite Corporation.

: "SEPHADEX G-25", Pharmacia LKB Biotechnology AB.

: "CENTRIPREP-30", W.R. Grace & Co.

: "BIO-GEL TSK-50XL", Toso-Haas Corporation.

: "BIO-SIL SEC-300", BioRad Corporation.

Ejemplo I Preparación de un derivado de ciclodextrina de un polímero de acrilamida hidrazida piridinio anilina monoeno

Se preparó el Tinte 1 por reacción de 4-(dietilamino)benzaldehído con el Intermediario Sintético I en presencia de una base. Se preparó el Intermediario Sintético I por reacción de 4-metilpiridina con ácido 3-yodopropiónico. Se preparó el polímero de acrilamida hidrazida piridinio anilina monoeno 11B por reacción del Tinte 1 en el substituyente carboxilo con un resto de hidrazina del polímero de acrilamida hidrazida 11A usando 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (en adelante, "EDAC") como agente deshidratante. El tinte polimérico 11B resultante reaccionó aún con ciclodextrinaldehído 6 para producir un derivado de ciclodextrina del polímero de acrilamida hidrazida piridinio anilina monoeno 11D.

Preparación del Tinte 1

Se preparó una mezcla de reacción combinando 4-(dietilamino)benzaldehído (0,5 g, 2,8 mmoles, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI), un intermediario (Intermediario Sintético I, 0,462 g) y piperidina (1 ml) en etanol anhidro (5 ml).

Se calentó la mezcla de reacción a una temperatura de 10ºC y se mantuvo a esa temperatura durante cuatro horas y se enfrió después hasta la temperatura ambiente (25ºC). Se eliminó el solvente etanólico a vacío y se purificó a continuación el producto por HPLC preparatoria en una columna de fase invertida C-8 eluida con una fase líquida de metanol/agua 2:1. El rendimiento del Tinte 1 fue del 29%. La preparación está ilustrada en el Esquema 2A.

Esquema 2A

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Se preparó el Intermediario Sintético I por reflujo de una solución que consistía en 4-metilpiperidina (1 g, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) y ácido 3-yodopropiónico (10,7 g, Aldrich Chemical Co., Milwaukee) en etanol. La preparación es ilustrada en el Esquema 2B.

Esquema 2B

28

Se purificó el Intermediario Sintético I por cromatografía en gel de sílice usando un gradiente del 5 al 20% de CH_{3}OH en una fase móvil de CH_{2}Cl_{2}.

Alternativamente, se puede sintetizar el Tinte 1 usando una ruta sintética modificada según describen Stevens, A.C. y col., Bioconjugate Chemistry, 1993, 4, 19-24.

Preparación del tinte polimérico 11B

Se preparó el tinte polimérico 11B por unión del Tinte 1 a una entidad polimérica 11A usando EDAC como agente deshidratante. Se disolvió la entidad polimérica 11A (5 mg, Sigma Chemical Co., catálogo #P-9505, PM 180.000) en 1,0 ml de tampón fosfato que contenía fosfato 100 mM y NaCl 100 mM, pH 5,5 (en adelante, "Tampón Nº 1"). Se añadieron aproximadamente 150 equivalentes molares de Tinte 1 (1,4 mg, 4,2 x 10^{-6} moles) a esta solución. Se añadieron varias alícuotas de 10 mg de EDAC sólida a intervalos de aproximadamente 1/2 hora, mientras se agitaba la mezcla de reacción en el curso de varias horas. Se realizó la purificación por cromatografía de exclusión de tamaños ("SEPHADEX G-25") usando Tampón Nº 1 como fase móvil. Se juntaron entonces las fracciones del volumen vacío.

Preparación del tinte polimérico 11D

Después de llevar a cabo la etapa cromatográfica como se ha descrito antes, la concentración de la solución stock del tinte polimérico 11B resultante en Tampón Nº 1 era de 0,5 mg/ml. Se tomó una alícuota (3,0 ml) de la solución stock de tinte polimérico 11B en Tampón Nº 1 (1,5 mg de tinte polimérico 11B) y se añadió a la alícuota ciclodextrinaldehído 6 (9,0 mg, preparado como se describe en Huff, J.B., Bieniarz, C., J. Org. Chem. 1994, 59, 7511-7516). Se dejó incubar a la solución resultante a temperatura ambiente (25ºC) durante al menos 24 horas. Se purificó el tinte polimérico resultante 11D en una columna de media presión ("SEPHACRYL S-300") a una velocidad de flujo de aproximadamente 1,0 ml/min usando una bomba peristáltica. Se recogieron las fracciones de alto peso molecular, se juntaron y se concentraron usando un microconcentrador ("CENTRICON-30").

En la Fig. 1 se muestran las intensidades de fluorescencia relativas del Tinte 1, del tinte polimérico 11B y del tinte polimérico 11C con excitación a 488 nm y emisión a 614 nm. En las FIGs 1-9, se expresa la intensidad de fluorescencia, ya sea relativa o corregida, en unidades arbitrarias.

Ejemplo II Preparación del tinte polimérico 11D

Se preparó el tinte polimérico 11D como se describe en el Ejemplo I. Se preparó el Tinte 1 como se describe en el Ejemplo I. Se efectuó la unión del Tinte I a la entidad polimérica 11A usando EDAC como agente deshidratante según se describe en el Ejemplo I.

Se mejoró la intensificación de señal substancialmente gracias a la adición de ciclodextrinaldehído 6 a la solución de tinte polimérico 11B. Se unieron la ciclodextrina y el Tinte 1 al esqueleto polimérico de acrilamida hidrazida a través del grupo carboxílico del tinte, según se muestra en el Esquema 3. El tinte polimérico 11D resultante, que tenía ciclodextrina covalentemente unida (a través del ciclodextrinaldehído 6), puede ser diluido para obtener una respuesta lineal a la concentración del tinte polimérico, según se muestra en la Fig. 3. En la Fig. 3, la Curva A indica la intensidad de fluorescencia del tinte polimérico 11B en función de la concentración, donde la longitud de onda de excitación es de 488 nm y la longitud de onda de emisión es de 580 nm; la Curva B indica la intensidad de fluorescencia del tinte polimérico 11B en función de la concentración, donde la longitud de onda de excitación es de 488 nm y la longitud de onda de emisión es de 614 nm; la Curva C indica la intensidad de fluorescencia del tinte polimérico 11D en función de la concentración, donde la longitud de onda de excitación es de 488 nm y la longitud de onda de emisión es de 580 nm; la Curva D indica la intensidad de fluorescencia del tinte polimérico 11D en función de la concentración, donde la longitud de onda de excitación es de 488 nm y la longitud de onda de emisión es de 614 nm. En la Fig. 2 se muestra una comparación de la intensidad de fluorescencia relativa en función de la longitud de onda. En la Fig. 2, la Curva A indica la intensidad de fluorescencia relativa del tinte polimérico 11B en función de la longitud de onda; la Curva B indica la intensidad de fluorescencia relativa del tinte polimérico 11D en función de la longitud de onda.

Esquema 3

Polímero 11/12

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En los tintes poliméricos 11B y 11D, n = 1. En los tintes poliméricos 12B y 12D, n = 2.

Ejemplo III Preparación de un derivado de ciclodextrina del polímero de acrilamida hidrazida piridinio anilina dieno

Se preparó el Tinte 3 por reacción de trans-4-(dietilamino)cinamaldehído con el Intermediario Sintético I en presencia de una base. Se preparó el tinte polimérico 12B por reacción del Tinte 3 en el substituyente carboxilo con un resto de hidrazina del polímero 11A usando EDAC como agente deshidratante. El tinte polimérico 12B resultante reaccionó después con ciclodextrinaldehído 6 para producir el tinte polimérico 12D.

Preparación del Tinte 3

Se preparó una mezcla de reacción combinando trans-4-(dietilamino)cinamaldehído (0,43 g, Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI), Intermediario Sintético I (0,62 g) y piperidina (1 ml) en metanol (10 ml). Se calentó la mezcla de reacción a una temperatura de 110ºC y se mantuvo a esa temperatura durante 1/2 hora y se enfrió después en un baño de hielo (0ºC). Se eliminó el solvente metanólico por filtración en un embudo de vidrio sinterizado. Se lavó el precipitado resultante con éter dietílico. Se purificó entonces el producto sólido por HPLC preparatoria en una columna de fase invertida C-8 eluida con una fase líquida de metanol/agua 70:30 o por precipitación con éter dietílico. En el Esquema 4 se ilustra la preparación.

Esquema 4

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Preparación de tinte polimérico 12B

Se disolvió el polímero 11A (4 mg, Sigma Chemical Company, catálogo #P-9905, PM 180.000) en Tampón Nº 1 (2,0 ml) por medio de agitación magnética durante al menos 8 horas a temperatura ambiente (25ºC). Se disolvió el Tinte 3 (1,45 mg, 0,0268 mmol, 75 equivalentes molares del tinte por mol de polímero) en N,N-dimetilformamida (DMF) (200 \mul) para formar una solución stock y se añadió entonces la solución stock resultante a la mezcla de reacción que contenía el polímero 11A con agitación. Se añadieron cuatro alícuotas (50 \mul cada una) de un stock de EDAC compuesto por 2,37 mg de EDAC disueltos en 200 \mul de Tampón Nº 1 a intervalos de 1/2 hora (2,5 equivalentes molares de EDAC por mol de tinte para cada alícuota) a la mezcla de reacción. Se agitó la mezcla de reacción durante 3 a 4 horas y se purificó el tinte polimérico por cromatografía de exclusión por tamaños en columna ("SEPHADEX G-25") en tampón fosfato que contenía fosfato 100 mM y NaCl 100 mM, pH 7,0 (en adelante, "Tampón Nº 2"). El material del volumen hueco que contenía el tinte polimérico fue recogido y concentrado usando un microconcentrador ("CENTRICON-30") a aproximadamente 1,5 ml.

Ejemplo IV Preparación del tinte polimérico 12B

También se preparó el tinte polimérico 12B del siguiente modo: Se disolvió polímero 11A (10,0 mg, Sigma Chemical Co., catálogo #P-9905, PM 180.000) en Tampón Nº 1 (2,0 ml) por medio de agitación magnética durante al menos 8 horas a temperatura ambiente (25ºC). Se disolvió el Tinte 3 (2,9 mg, 0,0536 mmol, 150 equivalentes molares de tinte por mol de polímero) en N,N-dimetilformamida (200 \mul) para formar una solución stock. Se añadió entonces la totalidad de la solución stock que contenía Tinte 3 a la solución que contenía polímero 11A con agitación. Finalmente, se añadieron cuatro alícuotas (250 mg cada una) de EDAC sólida a la mezcla de reacción agitada en el momento inicial y a tiempos de 1/2 hora, 2 horas y 3 \sfrac{1}{2} horas. Se agitó la mezcla de reacción durante 3 a 4 horas adicionales.

Se purificó el tinte polimérico 12B por cromatografía de exclusión por tamaños en columna ("SEPHADEX G-25") en Tampón Nº 2. Se recogió el material del volumen vacío y se concentró entonces el tinte polimérico 12B usando un microconcentrador ("CENTRICON-30") a aproximadamente 1 a 2 ml.

Se muestra una comparación de la intensidad de fluorescencia relativa del Tinte 3, del tinte polimérico 12B y del tinte polimérico 12B en presencia de ciclodextrina 0,1 M en la Fig. 4.

Preparación del tinte polimérico 12D

Se hizo reaccionar al tinte polimérico 12B con ciclodextrinaldehído para obtener el tinte polimérico 12D. El tinte polimérico 12B (250 \mul a una concentración de 1,1 mg/ml) reaccionó con ciclodextrinaldehído (1,5 mg, preparado como se describe en Huff, J.B., Bieniarz, C., J. Org. Chem. 1994, 59, 7511-7516) a una concentración final de 6,0 mg/ml de ciclodextrina en Tampón Nº 1. Se llevó a cabo la reacción durante aproximadamente cuatro horas a temperatura ambiente en obscuridad. Se purificó entonces el tinte polimérico 12D resultante por cromatografía de exclusión por tamaños ("SEPHADEX G-25") y se reunieron las fracciones del volumen vacío y se concentraron usando un microconcentrador ("CENTRICON-30").

Ejemplo V Preparación de un derivado de ciclodextrina del polímero de acrilamida hidrazida benzotiazolio anilina monoeno

Se preparó el tinte polimérico 17D por reacción de ciclodextrinamonoaldehído con polímero monénico de acrilamida hidrazida benzotiazolio anilina. Este último polímero fue a su vez preparado por reacción de Tinte 2 con polímero 11A usando EDAC como agente deshidratante. El Tinte 2 fue sintetizado por condensación del Intermediario Sintético V y trans-4-(dietilamino)cinamaldehído en presencia de piperidina y se aisló el aducto estructural apropiado de la mezcla de reacción por HPLC. Alternativamente, se puede preparar el Tinte 2 por condensación del compuesto intermediario de 2-metilbenzotiazolio (en adelante, "Intermediario Sintético V) y 4-(dietilamino) benzaldehído en presencia de piperidina".

En el Esquema 5, se ilustra la síntesis del Tinte 2.

Esquema 5

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Preparación del Intermediario Sintético V

Se hizo reaccionar al éster monoetílico del ácido adípico (17,42 g, Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO) con SOCl_{2} (9,0 ml, Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO) sometiendo a reflujo una mezcla de reacción compuesta por los dos compuestos en presencia de una gota de N,N-dimetilformamida como catalizador para la reacción. Se calentó la mezcla de reacción a una temperatura de 90ºC y se mantuvo a esa temperatura durante 1/2 hora. Se eliminó el exceso global de SOCl_{2} a vacío. Se añadió entonces una cantidad mínima de éter dietílico a la mezcla y se calentó la mezcla a vacío para eliminar el azeótropo de SOCl_{2}/éter dietílico. Esta etapa que implica la eliminación del azeótropo fue repetida dos veces. Se eliminaron entonces las trazas restantes de cloruro de tionilo y de éter dietílico por exposición a alto vacío durante una hora. Se aisló el Intermediario Sintético II como un aceite y se le utilizó sin mayor purificación.

Se disolvieron el Intermediario Sintético II (5,83 g) y 5-amino-2-metilbenzotiazol (6,0 g, Aldrich) en piridina con dimetilaminopiridina (0,46 g) como catalizador de la acilación. Se calentó la mezcla de reacción durante varias horas a una temperatura de 110ºC. Se eliminó la totalidad del solvente de piridina a vacío y se eliminó el resto de las trazas por azeótropo de piridina/CH_{2}Cl_{2}. Se repartió la mezcla de reacción entre CH_{2}Cl_{2} y NaHCO_{3} saturado. Se secó la capa orgánica sobre Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtró y se eliminó el solvente a vacío. Se disolvió el residuo en una cantidad mínima de CH_{2}Cl_{2} y se añadió éter dietílico. Se filtró y desechó el precipitado. Se recogió el filtrado y se eliminó el solvente a vacío para obtener el Intermediario Sintético III cristalino.

Se disolvió el Intermediario sintético de amida III (7,4 g) en una mínima cantidad de acetonitrilo y se añadió 1,3-propanosulfona (6,9 g) a la solución. Se sometió la mezcla de reacción a reflujo durante 72 horas hasta que la cromatografía en capa fina ("TLC") indicó que no quedaba material de partida. Se aisló entonces el producto de reacción disolviendo en metanol y precipitando con éter dietílico. Se recuperó un éster cuaternizado, el Intermediario Sintético IV, como un sólido blanco.

Se hidrolizó el éster cuaternizado Intermediario Sintético IV en HCl 0,02 a 0,4 N. Se monitorizó cuidadosamente el grado de hidrólisis por TLC y se detuvo la hidrólisis al completarse. Se disolvió el éster cuaternizado Intermediario Sintético IV (0,30 g) en HCl 0,4 N (30 ml). En un método alternativo, se disolvió el éster cuaternizado Intermediario Sintético IV (0,5 g) en HCl 4,0 N en lugar de HCl 0,4 N para conseguir el mismo resultado. Se aisló el producto de hidrólisis de 2-metilbenzotiazolio, el Intermediario Sintético V, congelando primeramente la mezcla de reacción y eliminando después el solvente utilizando un evaporador rotatorio a aproximadamente 0,1 mm Hg de presión.

Preparación del Tinte 2

Se disolvieron el Intermediario Sintético V (100 mg, 0,24 mmol) y trans-4-(dietilamino)cinamaldehído (50 mg, 0,24 mmol) en metanol (4 ml) y se añadió piperidina (0,25 ml) a la solución. Se calentó la mezcla de reacción a reflujo durante cuatro horas. Se eliminó el exceso de solvente y se redisolvió el residuo en metanol. Precipitó un material sólido con éter dietílico y se recogió por filtración. Se secó el monoeno de benzotiazolio anilina, el Tinte 2, en una bomba de vacío durante la noche. Si se desea, se puede obtener el tinte puro por cromatografía HPLC de fase invertida y se puede confirmar la estructura por ^{1}H RMN y análisis de espectro de masas.

En un método alternativo, se pueden disolver el Intermediario Sintético V (100 mg, 0,24 mmol) y trans-4- (dietilamino) cinamaldehído (0,24 mmol) en metanol (4 ml) y se puede añadir piperidina (0,25 ml) a la solución. Se puede calentar la mezcla de reacción a reflujo durante cuatro horas. Se puede eliminar entonces el exceso de solvente y se puede redisolver el residuo en metanol. Se puede precipitar entonces el producto sólido con éter dietílico y recogerlo por filtración.

Preparación del tinte polimérico 17B

Se sintetizó el tinte polimérico 17B (un precursor del tinte polimérico 17D) por unión del Tinte 2 al polímero 11A usando EDAC como agente deshidratante. En el Esquema 6, se muestra la preparación.

(Esquema pasa a la página siguiente)

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Esquema 6

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Se disolvió el polímero 11A (20 mg, Sigma Chemical Co., catálogo #P-9505, PM 180.000) en Tampón Nº 1 (4,0 ml), para obtener una concentración de polímero de 5 mg/ml (2,78 x 10^{-8} moles de polímero). Se añadieron aproximadamente 150 equivalentes molares de Tinte 2 (5,0 mg, 4,17 x 10^{-6} moles) a la solución que contenía el polímero disolviendo el Tinte 2 (5,0 mg) en DMSO y añadiendo esta solución a la solución acuosa tamponada del polímero. Se añadieron cinco alícuotas de 300 mg de EDAC sólida a intervalos de aproximadamente 1/2 hora mientras se agitaba la mezcla de reacción en obscuridad durante la noche.

Se separó el tinte polimérico de la mezcla de reacción del tinte no unido por elución en Tampón Nº 1 en columna ("SEPHADEX G-25"). Se recogieron las fracciones del volumen vacío (aproximadamente 3,0 ml de volumen total) y se concentró el producto usando un microconcentrador centrífugo ("CENTRICON-30").

Preparación del tinte polimérico 17D

Se diluyó el tinte polimérico 17B a una concentración de 1,0 mg/ml en Tampón Nº 1 para formar una solución stock. Se tomó una alícuota de tinte polimérico 17B en solución (3,0 ml, 3,0 mg de polímero) de la solución stock que contenía tinte polimérico 17B y se añadió ciclodextrinaldehído 6 (1,9 mg, preparado como se describe en Huff, J.B., Bieniarz, C., J. Org. Chem. 1994, 59, 7511-7516). Se dejó incubar a la solución a temperatura ambiente (25ºC) durante 72 horas en obscuridad. Se purificó el tinte polimérico resultante 17D en columna ("SEPHACRYL S-300") por elución en Tampón Nº 2 a una velocidad de flujo de aproximadamente 1 a 3 ml/min usando una bomba peristáltica. Se recogieron las fracciones de alto peso molecular (aproximadamente 5,0 ml), se juntaron y se concentraron usando un microconcentrador ("CENTRICON-30").

Se muestra en la Fig. 5 una comparación de la emisión de fluorescencia para el tinte polimérico 17B solo, para el tinte polimérico 17B más ciclodextrina no covalentemente unida y para el tinte polimérico 17D (ciclodextrina covalentemente unida). En la Fig. 5, la Curva A indica la intensidad de fluorescencia relativa del tinte polimérico 17B en función de la longitud de onda. La Curva B indica la intensidad de fluorescencia relativa del tinte polimérico 17B más ciclodextrina no covalentemente unida en función de la longitud de onda; la Curva C indica la intensidad de fluorescencia relativa del tinte polimérico 17D en función de la longitud de onda. La FIG. 6 muestra las curvas de dilución del tinte polimérico 17D. Estas curvas demuestran una respuesta de fluorescencia lineal a la concentración del tinte polimérico 17D. También se incluye la curva de dilución para el tinte polimérico 17B solo y el tinte polimérico 17B en un diluyente stock de 0,25 mg/ml de ciclodextrina. En la Fig. 6, la Curva A indica la fluorescencia del tinte polimérico 17D en función de la dilución del tinte; la Curva B indica la fluorescencia del tinte polimérico 17B en función de la dilución del tinte; la Curva C indica el tinte polimérico 17B más ciclodextrina no covalentemente unida en función de la dilución del tinte.

Ejemplo VI Preparación de un derivado de ciclodextrina del polímero de ácido acrílico piridinio anilina monoeno 13D

Se unió covalentemente el Tinte 4 a un polímero de ácido acrílico usando la metodología EDAC. Se unió covalentemente ciclodextrina monoamina 7 a un polímero de ácido acrílico piridinio anilina usando la metodología EDAC.

Preparación del Tinte 4

Se hizo reaccionar 4-metilpiridina (10 g) con 3-bromopropilftalimida (28,8 g) en solvente etanólico (20 ml) a medida que se calentaba la mezcla de reacción a 100ºC y se mantuvo a esa temperatura durante 20 minutos. Se purificó la especie N-cuaternizada de N-(3-ftalimido-propil)-4-metilpiridinio bromo (en adelante, "Intermediario Sintético VI") eliminando el solvente a vacío y redisolviendo el residuo en metanol. Se tituló entonces esta solución con éter dietílico y se enfrió a una temperatura de 2 a 8ºC hasta formarse un precipitado. Se separó entonces el precipitado (23,3 g, Intermediario Sintético VI) por filtración. En el Esquema 7, se ilustra la preparación del Intermediario Sintético VI.

(Esquema pasa a la página siguiente)

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Esquema 7

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Se disolvió el Intermediario Sintético VI (5,0 g) en piridina (10 ml). Se añadió 4-(dietilamino)benzaldehído (7 g, Aldrich Chemical Co.) a la mezcla de reacción. Se solubilizó entonces la suspensión resultante por adición de etanol anhidro (4 ml). Se agitó esta mezcla de reacción durante cuatro horas a una temperatura de 100ºC y se eliminó el solvente a vacío. Se purificó el intermediario imida por cromatografía en columna de gel de sílice eluyendo con una mezcla de CH_{2}Cl_{2} (95% en volumen)/metanol (5% en volumen). Se hidrolizó el intermediario imida al compuesto de amina libre, el Tinte 4, mediante reflujo en HCl concentrado (30 ml) durante cinco horas. Se enfrió la mezcla ácida de reacción hasta la temperatura ambiente y se eliminó el resto del solvente a vacío. Se purificó el residuo para obtener el Tinte 4 por HPLC preparatoria usando una columna de fase invertida C-8 y metanol con un 0,5% de ácido trifluoroacético como fase móvil. La preparación de este tinte está ilustrada en el Esquema 8.

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Esquema 8

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Preparación de ciclodextrina monoamina

Se preparó ciclodextrina monoamina como se ilustra en el Esquema 9

Esquema 9

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Preparación de monotosilato de ciclodextrina

Se obtuvo beta-ciclodextrina de la Aldrich Chemical Company. Se preparó el monotosilato de ciclodextrina como se describe en Petter, R.C., Salek, J.S., Sikorski, C.T., Kumaravel, G., Lin, F.-T., J. Amer. Chem. Soc. 1990, 112, 3360-3368.

Preparación de ciclodextrina monoazida

Se preparó una mezcla de reacción por adición de tosilato de beta-ciclodextrina (3,06 g) y azida sódica (0,76 g) a solvente dimetilformamida (60 ml). Se calentó la mezcla resultante a una temperatura de 80ºC y se mantuvo a esa temperatura durante la noche y luego se concentró a vacío. Se filtró el residuo concentrado a través de sílice de fase invertida (C-18) (40 g, Fluka, #60756) en un embudo de vidrio sinterizado. Se lavó el monotosilato de ciclodextrina no reaccionado de la sílice C-18 con agua y se eliminó el producto de ciclodextrina mono-azida de la sílice C-18 por lavado a través de la columna con una mezcla de acetonitrilo (50% en volumen) y agua (50% en volumen), seguido de lavado a través de la columna con acetonitrilo (100%). Se comprobaron las fracciones de los lavados de la sílice C-18 por TLC de fase normal usando una mezcla solvente de isopropanol (55% en volumen)/hidróxido de amonio (35% en volumen)/agua (10% en volumen). El hidróxido de amonio era hidróxido de amonio concentrado en agua. Se combinaron las fracciones de los lavados de la sílice C-18 que estaban libres de monotosilato, según se determinó por TLC, y se concentraron a presión reducida. Se disolvió el material concentrado en metanol y se precipitó el producto, ciclodextrina mono-azida, con éter dietílico. Se filtró entonces la ciclodextrina monoazida sólida producto y se lavó con éter dietílico.

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Preparación de ciclodextrina monomina 7

Se disolvió ciclodextrina monoazida (0,51 g) en agua (50-100 ml). Se añadió carbono que contenía un 5% de paladio (150 mg) a la solución bajo una atmósfera de nitrógeno. El catalizador de carbono/paladio no se disolvió. Se puso la suspensión de reacción bajo una atmósfera de hidrógeno y se agitó durante la noche (a una presión de 20 psi de H_{2}) en un agitador/hidrogenador ("PARR"). Se monitorizó la mezcla de reacción por TLC de fase normal usando una mezcla de isopropanol (55% en volumen)/hidróxido de amonio (35% en volumen)/agua (10% en volumen) como solvente de revelado. El hidróxido de amonio era hidróxido de amonio concentrado en agua. Se filtró la mezcla de reacción a través de una ayuda de filtro ("CELITE") dos veces. Después de confirmar la falta de material de partida no reaccionado en la mezcla de reacción, se concentró el filtrado acuoso a vacío y se obtuvo ciclodextrina monoamina (0,28 g). Un lavado adicional del residuo de la reacción sobre ayuda de filtro ("CELITE") con agua (500 ml), seguido de concentración, dio ciclodextrina monoamina adicional (0,057 g). Se combinaron ambos lotes de producto y se usaron sin mayor purificación para la preparación de los tintes poliméricos 13D, 15D y 18D.

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Preparación del polímero de ácido acrílico piridinio anilina monoeno (tinte polimérico 13B)

Se preparó una solución stock de polímero de ácido acrílico 13A (aproximadamente 200.000 de PM, Polysciences, Warrington, PA) disolviendo polímero de ácido acrílico en agua desionizada a una concentración de 20 mg/ml. Se preparó una mezcla de reacción combinando una alícuota de 1 ml de la solución stock de polímero de ácido acrílico y Tinte 4 (0,68 mg, 20 equivalentes molares). Se añadieron alícuotas de EDAC sólida (3,3 mg cada una) a intervalos de 1/2 hora en cinco incrementos a lo largo de un período de dos horas, mientras se agitaba la mezcla de reacción de manera continua. Se purificó el tinte polimérico resultante 13B por recogida del volumen vacío en una columna de exclusión por tamaños (100-300 mallas, "SEPHADEX G-25").

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Preparación del derivado de ciclodextrina del polímero de ácido acrílico piridinio anilina monoeno (tinte polimérico 13D)

Se preparó una mezcla de reacción que contenía Tinte 4 (0,68 mg), ciclodextrina monoamina 7 (4,0 mg) y una solución de polímero de ácido acrílico (1,0 ml, 20 mg/ml) en agua desionizada. Se añadieron cinco alícuotas de EDAC (10 mg cada una) a la mezcla de reacción a lo largo de un período de dos horas. Se agitó la mezcla continuamente. Se purificó el tinte polimérico resultante por cromatografía de exclusión por tamaños ("SEPHADEX G-25"). Se combinaron las fracciones del volumen hueco y se concentraron a 3,0 ml usando un concentrador centrífugo ("CENTRIPREP-30"). Se congeló la mezcla usando un baño de hielo seco/acetona y se liofilizó a continuación para obtener el tinte polimérico sólido puro 13D. En el Esquema 10 se ilustra la preparación del tinte polimérico 13D.

La Fig. 7 compara la fluorescencia del tinte polimérico purificado 13B a 1,1 x 10^{-7} M (Curva A) con el tinte polimérico 13D purificado a 1,1 x 10^{-7} (Curva B) (ambas usando excitación a 488 nm).

(Esquema pasa a la página siguiente)

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Esquema 10

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Ejemplo VII Preparación del derivado de permetilciclodextrina del polímero monénico de ácido acrílico piridinio anilina

Se unieron tanto la permetilciclodextrina 8 como el Tinte 4 covalentemente a polímero de ácido acrílico usando metodología EDAC.

Preparación de permetilciclodextrina monoazida

Se obtuvo beta-ciclodextrina de la Aldrich Chemical Company. Se preparó el monotosilato de ciclodextrina como se describe en Petter, R.C., Salek, J.S., Sikorski, C.T., Kumaravel, G., Lin, F.-T., J. Amer. Chem. Soc. 1990, 112, 3360. Se convirtió entonces el monotosilato de ciclodextrina en la ciclodextrina monoazida según se describe en el Ejemplo VI y se convirtió después en la permetilciclodextrina monoazida del modo siguiente.

Se suspendió beta-ciclodextrina monoazida (0,242 g, 0,2 mmol) en una mezcla que contenía 3,5 ml de dimetilformamida y 3,5 ml de sulfóxido de dimetilo y se agitó la suspensión resultante durante 1/2 hora hasta que se observó que la suspensión agitada era transparente. Se añadieron entonces BaO (1,95 g) y Ba(OH)_{2}\cdot8H_{2}O (1,95 g) a la suspensión en porciones sucesivas. Se enfrió la suspensión a una temperatura de 0ºC usando un baño de hielo. Se añadió sulfato de dimetilo (3,3 ml, 34 mmol) a la suspensión a lo largo de un período de una hora. Se agitó la mezcla de reacción durante 48 horas a una temperatura de 2-8ºC. Se detuvo la reacción por adición de hidróxido de amonio concentrado (10 ml) y se eliminó el solvente restante a presión reducida. Se agitó el sólido restante en un litro de CHCl_{3} y se filtró la suspensión resultante. Se volvió a lavar entonces el sólido resultante con CHCl_{3} (un litro). Se combinaron los extractos de CHCl_{3} y se redujeron a un volumen mínimo eliminando la mayor parte del CHCl_{3} a presión reducida y añadiendo hexano (1 L), para obtener permetilciclodextrina monoazida (140 mg).

Preparación de permetilciclodextrina monoamina

Se disolvió permetilciclodextrina monoazida (100 mg) en agua (20 ml). Se añadió entonces carbono sólido que contenía un 10% de paladio (30 mg) y se agitó la mezcla de reacción vigorosamente durante la noche usando un agitador "PARR" bajo una atmósfera de hidrógeno a aproximadamente 20 psi de presión. Se filtró el producto resultante a través de una ayuda de filtro ("CELITE") y se concentró el filtrado a presión reducida, para obtener la permetilciclodextrina monoamina 8 producto. Se preparó la permetilciclodextrina monoamina 8 como se ilustra en el Esquema 11.

Esquema 11

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Preparación del derivado de permetilciclodextrina del polímero de ácido acrílico piridinio anilina monoeno monoamina (tinte polimérico 14D)

Se preparó el Tinte 4 del modo previamente descrito. Se disolvió ácido poliacrílico (5 mg) en agua desionizada (0,25 ml). Se añadieron a esta solución el Tinte 4 (3,4 mg) y permetilciclodextrina monoamina 8 (24 mg). Se añadieron cinco alícuotas de EDAC (cada una de 52 mg) a la mezcla de reacción, añadiendo cada alícuota a intervalos de 1/2 hora. Se purificó el producto resultante por centrifugación ("CENTRIPREP-30"), seguido de lavados repetidos con agua desionizada fresca hasta que ya no pasó ningún resto de tinte a través de la membrana. En el Esquema 12 se ilustra la preparación del tinte polimérico 14D.

Esquema 12

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El tinte polimérico resultante 14D fue entonces estudiado en cuanto a fluorescencia y se comparó su intensidad con la intensidad de la ficobiliproteína ficoeritrina. La Fig. 8 muestra los resultados de la prueba de fluorescencia que compara la fluorescencia del tinte polimérico 14D (Curva A) y de la ficoeritrina (Curva B) a la misma concentración.

En las Figs. 9A y 9B se muestra la fotoestabilidad relativa a lo largo de 16 horas para el tinte polimérico 14D en comparación con la de la ficoeritrina en las mismas condiciones en la luz ambiental de la sala. En la Fig. A, la Curva A indica la intensidad de fluorescencia relativa inicial del tinte polimérico 14D en función de la longitud de onda; la Curva B indica la intensidad de fluorescencia relativa del tinte polimérico 14D en función de la longitud de onda 16 horas después de observar los espectros iniciales. En la FIG. 9B, la Curva A indica la intensidad de fluorescencia relativa inicial de la ficoeritrina en función de la longitud de onda; la Curva B indica la intensidad de fluorescencia relativa de la ficoeritrina en función de la longitud de onda 16 horas después de observar los espectros iniciales. Las Figs. 9A y 9B indican que el tinte polimérico 14D es más estable que la ficoeritrina.

Ejemplo VII Preparación del polímero de ácido acrílico piridinio anilina dieno Preparación del Tinte 5

Se preparó el Tinte 5 por condensación del Intermediario Sintético VI con trans-4-(dietilamino) cina-maldehído en un procedimiento idéntico al descrito en el Ejemplo VI para la preparación del Tinte 4, excepto por la substitución con trans-4-(dietilamino)cinamaldehído del N,N-dietilbenzaldehído. El procedimiento está ilustrado en el Esquema 13.

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Esquema 13

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Se purificó el Tinte 5 por HPLC de fase invertida C-8 usando acetonitrilo (25% en volumen)/agua (75% en volumen) como fase móvil.

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Preparación de polímero de ácido acrílico piridinio anilina dieno modificado con ciclodextrina (tinte polimérico 18D)

Se puede preparar polímero de ácido acrílico piridinio anilina dieno como se describe en el Ejemplo VI, excepto por la substitución con el Tinte 5 del Tinte 4. Se ilustra este procedimiento en el Esquema 14.

Esquema 14

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Ejemplo IX Conjugación de polímero de acrilamida hidrazida piridinio anilina monoeno a anticuerpo IgG anti-CD8

Se preparó una solución stock de tinte polimérico 11D como se describe en el Ejemplo I para obtener una concentración de 2,7 mg/ml. Se preparó una solución stock de anticuerpo IgG anti-CD8 en Tampón Nº 2 a una concentración de 10 mg/ml. Se tomó una alícuota que contenía 5,0 mg de anticuerpo IgG anti-CD8 de la solución stock y se concentró a aproximadamente 300 \mul usando un microconcentrador ("CENTRICON-30"). Se diluyó entonces el material concentrado con un tampón que contenía trietanolamina 50 mM, NaCl 160 mM, pH 8,0 (en adelante, "Tampón Nº 3"). La concentración final de anticuerpo IgG anti-CD8 era de aproximadamente 3 a 4 mg/ml.

Se preparó una solución stock de peryodato de sodio en Tampón Nº 3 a una concentración de 42,8 mg/ml. Se añadieron aproximadamente 120 \mul de esta solución stock al anticuerpo IgG anti-CD8 en tampón de trietanolamina. Se incubó la mezcla de reacción a una temperatura de 2-8ºC en obscuridad, al tiempo que era suavemente agitada con un agitador mecánico durante una hora. Se purificó entonces el anticuerpo IgG oxidado resultante por elución a través de una columna (100-300 mallas, "SEPHADEX G-25") con Tampón Nº 1. Se estudiaron las fracciones por espectroscopía ultravioleta (UV) y se juntaron aquellas fracciones de volumen hueco con más de 0,2 UA (utilizando como blanco el mismo Tampón Nº 1) y se concentraron para obtener un volumen final de 1 a 3 mg/ml.

Se preparó el tinte polimérico 11D por reacción de tinte polimérico 11B (0,24 mg/ml) con ciclodextrinaldehído (6,0 mg/ml, preparado como se describe en J. Org. Chem., 1994, 59, 7511-7516). Se monitorizó el progreso de la reacción por HPLC de exclusión por tamaños usando una columna de exclusión ("BIO-GEL TSK-50XL" o "BIO-SIL SEC-300") a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto en Tampón Nº 2. Se combinó entonces el tinte polimérico 11D, preparado como se describe en el Ejemplo I, con el anticuerpo oxidado recién preparado. Las razones molares de tinte polimérico 11D a anticuerpo IgG eran de 1,5/1,0 ó 3,0/1,0. El rendimiento de la bioconjugación fue estimado por inyecciones exactas de stocks del material de partida y de mezcla de reacción en una columna de exclusión por tamaños ("BIO-SIL SEC-300" o "BIO-GEL TSK-50XL"). Se purificó entonces el conjugado resultante en una columna de media presión ("SEPHACRYL S-300") por elución con Tampón Nº 2. Se recogieron las fracciones de alto peso molecular y se estimaron las concentraciones por los espectros ultravioleta de las fracciones. Se estudiaron las fracciones en un citómetro de flujo para ver su rendimiento.

Ejemplo X Conjugación de polímero de acrilamida hidrazida piridinio anilina monoeno a anticuerpo IgG anti-CD8

Alternativamente, se puede conjugar el tinte polimérico 11B a anticuerpo IgG. Se usa el conjugado que contiene tinte polimérico 11B en lugar de un conjugado que contiene tinte polimérico 11D (véase el Ejemplo IX) y se convierte entonces el primero en el segundo in situ por adición de ciclodextrinaldehído a una concentración de aproximadamente 6 mg/ml. En un método alternativo, la concentración de conjugado es de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,4 mg/ml.

Ejemplo XI Conjugación de polímero de acrilamida hidrazida piridinio anilina dieno a anticuerpo IgG anti-Cd8

Se conjugó el tinte polimérico 12B a anticuerpo IgG de la forma siguiente. Se oxidó anticuerpo IgG como se describe en el Ejemplo IX. Se purificó el anticuerpo IgG usando una columna ("SEPHADEX G-25") equilibrada con Tampón Nº 1. Se diluyó entonces el anticuerpo a una concentración de aproximadamente 3,0 mg/ml (según se determina por medición UV a A_{280}). Se intercambió entonces el anticuerpo IgG en tampón acetato (pH 4,5, acetato 0,1 N, NaCl 0,1 N) (en adelante, "Tampón Nº 4") usando un microconcentrador ("CENTRICON-30"), siendo la concentración final de aproximadamente 3,0 mg/ml. Se intercambió entonces el tinte polimérico 12B (preparado como se describe en el Ejemplo IV) en tampón acetato (pH 5,5, acetato 0,1 N, NaCl 0,1 N) (en adelante, "Tampón Nº 5") usando un microconcentrador ("CENTRICON-30"). Finalmente, se añadió una porción (400 microlitros, 1,2 mg) de stock de anticuerpo en Tampón Nº 4 a una concentración de 3,0 mg/ml a una porción de tinte polimérico 12B (1,5 ml, 4,5 mg) a una concentración de 3,0 mg/ml en Tampón Nº 5. Se dejó que la mezcla resultante reaccionara durante la noche a una temperatura de 2-8ºC con suave agitación en la obscuridad.

Se hizo reaccionar entonces al conjugado resultante con ciclodextrinaldehído añadiendo suficiente ciclodextrinaldehído para dar una concentración final de 3,0 mg de ciclodextrinaldehído por ml de tampón. Se incubó luego el bioconjugado bruto durante la noche en presencia de ciclodextrinaldehído y se purificó usando una columna ("SEPHACRYL S-300").

Ejemplo XII Conjugación de polímero de acrilamida hidrazida piridinio anilina dieno a anticuerpo IgG anti-Cd8

En una realización alternativa, se conjugó el tinte polimérico 12D a anticuerpo IgG de la siguiente forma. Se preparó el tinte polimérico 12B como se describe en el Ejemplo IV. Se añadió entonces ciclodextrinaldehído sólido a una razón de 1,5 mg de ciclodextrinaldehído por cada 0,4 mg de tinte polimérico 12B en 0,250 ml de Tampón Nº 5. El ciclodextrinaldehído y el tinte polimérico 12B reaccionaron mientras se agitaba la mezcla de reacción a temperatura ambiente en obscuridad. Se purificó el producto de reacción por cromatografía de exclusión por tamaños ("SEPHADEX G-25") para obtener el tinte polimérico 12D. Se hizo reaccionar entonces al tinte polimérico 12D a una razón de 3,0 equivalentes de tinte polimérico por cada equivalente de anticuerpo IgG según se describe en el Ejemplo XI usando tinte polimérico 12B. La bioconjugación fue entonces seguida de HPLC según se describe en el Ejemplo XI. Se purificó el conjugado resultante usando una columna de exclusión por tamaños ("SEPHACRYL S-300").

Ejemplo XIII Conjugación de polímero de acrilamida hidrazida benzatiazolio anilina monoeno a anticuerpo IgG

Se preparó tinte polimérico 17D de la forma descrita en el Ejemplo V. Se retiró una alícuota de tinte polimérico (3,0 ml, 1,0 mg de tinte polimérico por 1,0 ml de solución) de una solución stock del tinte polimérico en Tampón Nº 2. Se usó Tampón Nº 1 para intercambiar el Tampón Nº 2 usando un microconcentrador ("CENTRICON-30"). La concentración del tinte polimérico era entonces de 2,36 mg/ml. Se oxidó el anticuerpo en la manera descrita en el Ejemplo IX y se llevó a cabo la bioconjugación del tinte polimérico 17D al anticuerpo IgG del modo descrito para el tinte polimérico 11D en el Ejemplo XI.

El Esquema 15 es un diagrama esquemático del procedimiento para preparar el conjugado de este ejemplo.

Esquema 15

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Ejemplo XIV Conjugación de polímero de ácido acrílico piridinio anilina monoeno tiolado a anticuerpo IgG anti-Cd4 derivatizado con maleimida Preparación del polímero de ácido acrílico tiofosforilado

Se disolvió polímero de ácido acrílico (100 mg) en agua desionizada (50 ml). Se añadió S-fosfato de cistamina (1,6 mg, Aldrich Chemical Company) a la solución. Se añadieron entonces cinco alícuotas de EDAC (8,5 mg cada una) a la solución a intervalos de 1/2 hora a lo largo de un período de varias horas, mientras se agitaba la solución de forma continua. Se purificó el producto resultante por filtración ("CENTRIPREP-30"). Se dispensó una porción, se hidrolizó y se estudió. Se usó metodología estándar de ensayos de DTNB tiol para determinar que la porción resultó contener nueve grupos tiol por tinte polimérico como media.

Preparación de polímero tiofosforilado de ácido acrílico piridinio anilina monoeno modificado con ciclodextrina (tinte polimérico 15D)

Se disolvió polímero de tiofosfato (5,0 mg) en agua desionizada (1,0 ml). A continuación, se añadieron Tinte 4 (1,7 mg, preparado como se describe en el Ejemplo VI) y ciclodextrinamina 7 (12 mg, preparada como se describe en el Ejemplo VI) a esta solución. Se añadieron cinco alícuotas de EDAC (26 mg cada una) a la mezcla de reacción a intervalos de 1/2 hora. Se purificó luego el material por centrifugación ("CENTRIPREP-30") y se usó para conjugación a anticuerpo IgG.

Conjugación del tinte polimérico 15D a anticuerpo IgG

Se tomó una alícuota de anticuerpo IgG anti-CD4 (0,500 ml) de una solución stock que contenía 4,0 mg de anticuerpo por 1,0 ml de solución. Se intercambió el material con Tampón Nº 3 usando un microconcentrador ("CENTRICON-30"). Se realizó un segundo intercambio para devolver el anticuerpo IgG al Tampón Nº 3. Se llevó a cabo la oxidación disolviendo peryodato de sodio (42,8 mg) en Tampón Nº 3 y añadiendo 0,100 ml de esta solución stock al anticuerpo para formar una mezcla de reacción. La concentración de anticuerpo para esta reacción era de 1,0 mg/ml. Se incubó la mezcla de reacción durante una hora a una temperatura de 2-8ºC. Se purificó entonces el anticuerpo oxidado usando una columna ("SEPHADEX G-25") equilibrada con Tampón Nº 5. Se recogieron las fracciones y se combinaron aquellas fracciones del volumen hueco que contenían lecturas de UA de al menos 0,1 a A_{280}. Se concentró después la solución que contenía anticuerpo IgG para obtener una concentración de aproximadamente 1,5 mg/ml.

Se disolvió entonces hidrazidomaleimida M2C2H (0,369 mg, Pierce Chemical, catálogo #22304) en Tampón Nº 2 (0,100 ml) y se añadió al anticuerpo IgG oxidado (aproximadamente 2,0 mg de anticuerpo IgG). Se incubó entonces la mezcla a temperatura ambiente durante dos horas y se agitó suavemente durante la noche a una temperatura de aproximadamente 2-8ºC. Se purificó después el anticuerpo IgG derivatizado con maleimida por cromatografía de exclusión por tamaños ("SEPHADEX G-25") y se combinaron las fracciones del volumen hueco.

Se concentró primeramente la solución de anticuerpo IgG (1,7 mg) a alrededor de 0,3-0,4 ml y se diluyó después a 1,0 ml con tampón fosfato a pH 7,0 con ZnCl_{2} 0,1 mM y MgCl_{2} 1 mM (en adelante, "Tampón Nº 6"). Se añadió entonces a esta solución una alícuota de fosfatasa alcalina (0,005 ml de una concentración stock de 10 mg enzima/ml, Boehringer-Mannheim).

A continuación, se diluyó tinte polimérico 15D (2,55 mg) con agua desionizada (2,31 ml) y se añadió la solución resultante al sistema de anticuerpo IgG derivatizado con maleimida/fosfatasa alcalina. Se incubó la mezcla de reacción durante 24 horas a una temperatura de 2-8ºC en obscuridad con suave agitación. Eventualmente, se puede rematar el resto de los tioles con 100 equivalentes de N-etilmaleimida antes de la purificación. Se purificó la mezcla de reacción usando una columna ("SEPHACRYL S-300") con Tampón Nº 2 y se aisló el conjugado del volumen hueco. Se estimó la cantidad de conjugado por análisis UV o puntuación visual. El análisis por HPLC indicó el consumo del anticuerpo IgG no conjugado.

El Esquema 16 ilustra la preparación del bioconjugado de este ejemplo.

Esquema 16

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Ejemplo XV Conjugación del polímero de ácido acrílico piridinio anilina monoeno a anticuerpo IgG

Se preparó tinte polimérico 13D del modo descrito en el Ejemplo VI. Se conjugó entonces el tinte polimérico 13D a anticuerpo IgG del siguiente modo. Se intercambió anticuerpo IgG anti-CD4 con tampón HEPES a pH 6,8 (HEPES 0,1 N) (en adelante, "Tampón Nº 7") usando un microconcentrador ("CENTRICON-30"). Se diluyó entonces el anticuerpo IgG con Tampón Nº 7 para obtener una concentración de 1,0 mg de anticuerpo por ml. Se intercambió entonces el tinte polimérico 13D por agua desionizada usando un microconcentrador ("CENTRICON-30") para obtener una concentración de aproximadamente 1,0 mg de tinte polimérico por ml. Se añadieron luego sulfo-N-hidroxisuccinimida (0,0036 ml de un stock de 30 mg/ml) en agua desionizada (0,108 mg) y EDAC (0,0039 ml de un stock de 50 mg/ml) en agua desionizada al tinte polimérico 13D en agua desionizada para activar el tinte polimérico 13D para la conjugación. Se mezcló el tinte polimérico 13D activado en agua desionizada (1,8 ml, 1,8 mg) con anticuerpo IgG (1,0 ml, 1,0 mg) en Tampón Nº 7. El progreso de la reacción fue entonces monitorizado por HPLC de exclusión por tamaños usando una columna "BIO-GEL TSK-50XL" con Tampón Nº 1 como fase móvil. Se purificó entonces la mezcla de reacción por cromatografía de exclusión por tamaños ("SEPHACRYL S-300") usando Tampón Nº 7 como fase móvil.

El Esquema 17 ilustra el procedimiento de este ejemplo.

Esquema 17

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Ejemplo XVI Conjugación de polímero de ácido acrílico piridinio anilina monoeno derivatizado con maleimida a anticuerpo IgG tiolado

Se disolvió polímero de ácido acrílico (100 mg) en agua desionizada (5,0 ml) y se le hizo reaccionar con ligante hidrazidomaleimida M2C2H (15 mg, Pierce Chemical Co., Rockford, IL) por acoplamiento de EDAC. Se efectuó el acoplamiento por adición de cinco alícuotas de EDAC (15 mg cada una) a lo largo de un período de dos horas a temperatura ambiente con agitación. Se purificó el polímero derivatizado con maleimida resultante por centrifugación ("CENTRIPREP-30").

Para el estudio de las maleimidas, se disolvió el polímero 13A derivatizado con maleimida (1 mg) en 1 ml de tampón fosfato 100 mM a pH 7,5. Se añadió cistamina\cdotHCl (0,1 mg) a la solución y se dejó incubar a la mezcla durante una hora. Se diluyeron exactamente 0,100 ml de la anterior mezcla a 1 ml con tampón fosfato que contenía fosfato 100 mM y NaCl 100 mM, pH 7,5 (en adelante, "Tampón Nº 8") y se realizó un ensayo DTNB estándar para tioles. Se leyó la adsorción de la solución a 412 nm y se comparó con la curva patrón de cistamina/DTNB. Así, se pudo determinar indirectamente el número de tioles que se habían unido covalentemente a las maleimidas disponibles por la diferencia observada.

Se disolvió el tinte polimérico derivatizado con maleimida (5,0 mg) preparado antes en agua desionizada (1,0 ml). Se añadieron luego el Tinte 4 (1,7 mg) y ciclodextrinamina 7 a esta solución. Finalmente, se añadieron cinco alícuotas de EDAC (26 mg cada una) a intervalos iguales a lo largo de un período de dos horas. Se purificó entonces el material resultante por cromatografía de exclusión por tamaños ("SEPHADEX G-25").

Se conjugó el tinte polimérico 16 a anticuerpo IgG tiolado del siguiente modo. Se intercambió anticuerpo IgG anti-CD4 (3,0 mg) con Tampón Nº 3 usando un microconcentrador ("CENTRICON-30") y se diluyó a un volumen final de 1,0 ml. Se añadió entonces NaIO_{4} (0,110 ml de una solución stock de 42,8 mg/ml) a esta solución que contenía anticuerpo IgG y se incubó la solución resultante durante una hora a una temperatura de 2 a 8ºC. Se purificó entonces el anticuerpo IgG oxidado por cromatografía de filtración por gel ("SEPHADEX G-25") con Tampón Nº 2 como eluyente. Se combinaron entonces las fracciones del volumen hueco y se concentraron a un volumen de 0,086 ml, para obtener una concentración final de anticuerpo IgG de aproximadamente 3,5 mg/ml.

Se añadió cistamina (0,250 ml de una solución stock de 170 mg/ml) en Tampón Nº 3 al anticuerpo IgG recién oxidado preparado como se ha descrito antes para formar una mezcla de reacción. Después de haber incubado la mezcla de reacción durante 15 minutos a temperatura ambiente, se añadió NaCNBH_{3} (0,063 ml de una solución stock de 20 mg/ml) en Tampón Nº 3 a esta mezcla y se incubó la mezcla resultante durante aproximadamente una hora a temperatura ambiente. Se purificó entonces el anticuerpo IgG modificado en columna ("SEPHADEX G-25") y se concentraron las fracciones del volumen hueco usando un microconcentrador ("CENTRICON-30"). Se redujo entonces el anticuerpo IgG funcionalizado con disulfuro resultante por adición de 0,050 ml de una solución stock de 6,2 mg/ml de ditiotreitol en Tampón Nº 2. Después de haber incubado la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos, se purificó el anticuerpo IgG reducido por cromatografía de exclusión por tamaños ("SEPHADEX G-25") y se juntó el volumen hueco y se concentró usando un microconcentrador ("CENTRICON-30"). Se diluyó la solución a aproximadamente 0,30 mg/ml usando tampón fosfato 20 mM, pH 7,0 (fosfato 0,02 N, cloruro de sodio 0,02 N) (en adelante, "Tampón Nº 9").

El tinte polimérico 16D, preparado como se ha descrito antes, fue entonces intercambiado con agua desionizada usando un microconcentrador ("CENTRICON-30") y luego diluido para obtener una concentración final de 1,0 mg/ml. Se añadió una porción de stock de tinte polimérico (0,500 ml, 0,5 mg de polímero, 1 mg/ml) en agua desionizada a anticuerpo IgG derivatizado con maleimida (1,0 ml, 0,3 mg/ml, 0,3 mg de anticuerpo IgG derivatizado con maleimida) en Tampón Nº 9. Se siguió el progreso de la reacción por HPLC y el consumo de anticuerpo IgG estaba indicado por la pérdida de área para el pico de IgG sin modificar. Se fraccionó la mezcla por cromatografía de exclusión por tamaños ("SEPHACRYL S-300").

El Esquema 18 ilustra el procedimiento de este ejemplo.

Esquema 18

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(Esquema continua en la página siguiente)

Esquema 18

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Ejemplo XVII Comparación de conjugados fluorescentes comerciales con los conjugados de esta invención

En este ejemplo, se usó un formato de citometría de flujo para hacer una comparación entre las señales generadas por inmunoconjugados fluorescentes basados en ficobiliproteína comerciales o de otro modo fácilmente preparados y los inmunoconjugados fluorescentes poliméricos sintéticos preparados en los Ejemplos IX, X y XI. Se hizo la comparación entre conjugados que son específicos para los marcadores linfocíticos CD4 ó CD8.

Los resultados para la comparación de los conjugados derivados del polímero 11D, preparados como se describe en el Ejemplo IX y los conjugados de ficoeritrina derivados de anticuerpo con la misma especificidad están mostrados en las Figs. 10-12.

Los conjugados de anti-ficoeritrina fueron obtenidos de Coulter (Hialeah, Florida) o derivados del anticuerpo anti-CD8 de Coulter. Alternativamente, se puede obtener anticuerpo anti-CD8 de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) o de DAKO Corporation (Copenhague, Dinamarca). En otra realización alternativa, se puede obtener ficoeritrina (producto #P-801) de Molecular Probes (Eugene, Oregon). Se pueden obtener SMCC y el reactivo de Traut de Pierce (Rockford, Illinois). La tiolación del anticuerpo IgG usando reactivo de Traut y derivatización con maleimida de la ficoeritrina puede ser llevada a cabo usando química de bioconjugación estándar, conocida para alguien con conocimientos ordinarios en la técnica. La purificación y la caracterización del anticuerpo IgG tiolado y de la ficoeritrina derivatizada con maleimida pueden ser llevadas a cabo usando procedimientos conocidos para alguien con conocimientos ordinarios en la técnica. La bioconjugación y la purificación del anticuerpo IgG tiolado y de la ficoeritrina derivatizada con maleimida pueden ser realizadas usando métodos conocidos para alguien con conocimientos ordinarios en la técnica. Alternativamente, la ficoeritrina puede ser derivatizada con reactivo de Traut y el anticuerpo IgG puede ser derivatizado con maleimida usando SMCC y la conjugación de las dos entidades puede ser llevada a cabo por métodos conocidos para alguien con conocimientos ordinarios en la técnica.

Los resultados de la comparación de los conjugados derivados del polímero 12D preparado como se describe en el Ejemplo XI y los conjugados de ficoeritrina-Cy5 derivados de anticuerpo con la misma especificidad están mostrados en la Fig. 13.

Se obtuvieron los conjugados de ficoeritrina-Cy5 por reacción de ficoeritrina con Cy5 como sigue. Se hizo reaccionar Cy5 reactivo (Biological Detection Systems, Pittsburgh, PA) con R-ficoeritrina (Molecular Probes Corporation, Eugene, Oregon). Se calcularon las razones de tinte a ficoeritrina entre 5:1 y 15:1. Se consiguió la derivatización usando métodos conocidos para alguien con conocimientos ordinarios en la técnica. Se consiguió la purificación por métodos tales como la cromatografía de filtración por gel o la concentración por membrana basada en centrifugación, cuyos métodos son conocidos para alguien con conocimientos ordinarios en la técnica. La conjugación del tinte resultante del tándem de ficoeritrina-Cy5 al anticuerpo anti-CD8 fue efectuada usando métodos conocidos para alguien con conocimientos ordinarios en la técnica. Se usó un ligante de 30 átomos, preparado como se describe en la Patente EE.UU. Nº 5.002.883, para derivatizar el tinte del tándem de ficoeritrina-Cy5. Se tioló el anticuerpo anti-CD8 usando métodos conocidos para alguien con conocimientos ordinarios en la técnica. El anticuerpo anti-CD8 tiolado y la ficoeritrina-Cy5 derivatizada con maleimida fueron entonces conjugados y purificados por cromatografía de exclusión por tamaños u otro método conocido para alguien con conocimientos ordinarios en la técnica. Alternativamente, se puede usar SMCC en lugar del ligante de 30 átomos. Se puede usar SMCC para derivatizar el tándem de ficoeritrina-Cy5 por reacción con ficoeritrina-Cy5, seguido de purificación usando cromatografía en columna u otros métodos de purificación conocidos para alguien con conocimientos ordinarios en la técnica.

Alternativamente, se pueden obtener conjugados de ficoeritrina-Cy5-anti-CD8 de Dako (Copenhague, Dinamarca), Coulter (Hialeah, Florida) o Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). Alternativamente, se puede obtener anti-CD8-Tricolor de Caltag.

Otros reactivos usados en este ejemplo incluían solución salina tamponada con fosfatos ("PBS") a pH 7,0 que tenía un 0,1% de azida sódica y un 1,0% de seroalbúmina bovina (BSA), que fueron añadidas a los conjugados, y solución de lisis de cloruro de amonio. Se preparó la solución de lisis como sigue:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  Ingrediente  \qquad\qquad\+\qquad\qquad  Cantidad \cr 
NH _{4} Cl \qquad\qquad\+\qquad\qquad 8,26\cr  KHCO _{3} 
\qquad\qquad\+\qquad\qquad 1,0\cr  NaEDTA \qquad\qquad\+\qquad\qquad
0,037\cr}

Los ingredientes antes indicados fueron disueltos en agua destilada (1,0 litro) y se ajustó la solución resultante a un pH de 7,3 con tampón HEPES, que está comercializado por Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. Se calentó la solución de lisis a una temperatura de 41ºC antes de su uso.

Protocolo

Se usaron los reactivos directamente para detectar un receptor específico de la superficie celular. Los tubos de ensayo en los que se llevaron a cabo las pruebas contenían los reactivos primarios en una cantidad de 5 \mug. Se puso entonces sangre entera fresca (200 \mul) en cada uno de los tubos de ensayo. Se agitaron luego los contenidos de cada tubo vorticialmente con suavidad y se incubaron a temperatura ambiente en obscuridad durante 15 minutos. Tras la incubación, los tubos fueron lavados una vez en 3 ml del PBS modificado. Se centrifugaron entonces los tubos lavados durante 3 minutos a 500 x gravedad, se aspiraron después los sobrenadantes de estos tubos y se resuspendieron las pellas celulares en el PBS modificado.

Tras la incubación, los tubos fueron tratados con solución de lisis de cloruro de amonio según el siguiente protocolo.

1.: Se añadieron 3,0 ml de la solución de lisis a cada tubo.

2.: Se mezclaron a conciencia los contenidos de cada tubo por medio de una pipeta desechable.

3.: Se incubaron los contenidos de cada tubo a temperatura ambiente durante 7 minutos.

4.: Los contenidos de los tubos fueron centrifugados durante 3 minutos a 2.000 rpm.

5.: Se aspiró la totalidad de los sobrenadantes de cada tubo a excepción de 100 \mul.

6.: Se agitaron vorticialmente los contenidos de los tubos para resuspender las pellas.

7.: Se añadieron entonces 3,0 ml de PBS que tenía un 0,1% de azida sódica y un 1,0% de BSA a las pellas resuspendidas.

8.: Se repitieron las etapas 4-7.

9.: Se añadieron entonces 0,5 ml de PBS que tenía un 0,1% de azida sódica y un 1,0% de BSA a las pellas resuspendidas. El PBS contenía también pentosanpolisulfato 10 mM (60 mg/ml) (Sigma Chemical Company (P8275)) ajustado a pH 7,5.

Se analizaron los contenidos de cada tubo usando un clasificador celular activado por fluorescencia Facscan II de Becton-Dickinson Inc. Se optimizaron los ajustes del instrumento para la visualización de linfocitos, monocitos y granulocitos en parámetros de dispersión frontal frente a lateral. Se utilizaron perlas "Quick Cal" (de Flow Cytometry Standards Corporation, Durham, N.C.) según las instrucciones del programa informático adjunto para generar una curva de calibración. Se determinó el porcentaje de fenómenos fluorescentes en el histograma para cada tubo usando las tres puertas de dispersión de la luz.

Resultados

Los resultados de estos experimentos son mostrados en las Figs. 10, 11 y 12 para el anti-CD8/ficoeritrina y el conjugado de anti-CD8-piridinio anilina monoeno del Ejemplo IX y, en la FIG. 13, para el anti-CD8/ficoeritrina-cianina y el conjugado de anti-CD8-piridinio anilina dieno del Ejemplo X. Los conjugados de la presente invención proporcionaban una resolución adecuada de linfocitos marcados y no marcados y proporcionaban resultados de resolución comparables a los de los conjugados comerciales.

Serán evidentes diversas modificaciones y alteraciones de esta invención para los expertos en la técnica sin desviarse del alcance y del espíritu de esta invención y habría que entender que esta invención no ha de quedar indebidamente limitada a las realizaciones ilustrativas aquí expuestas.

Claims

1. Un tinte polimérico consistente en:

(a): una entidad polimérica y

(b): covalentemente unidos a dicha entidad polimérica una pluralidad de grupos generadores de señal, donde dichos grupos generadores de señal derivan de un tinte que tiene al menos un resto de anilino acoplado a un resto heterocíclico que contiene al menos un átomo de nitrógeno en el heterociclo por medio de un grupo de unión etilénicamente insaturado, cuyo tinte polimérico tiene restos hidrofóbicos y conformacionalmente restrictivos seleccionados entre el grupo consistente en restos de ciclodextrinas, carcerands, calixiranos, grietas moleculares, cucurbiterilos y ciclofanos asociados al mismo.

2. El tinte polimérico de la reivindicación 1, donde dicha entidad polimérica es nucleofílica y dichos grupos generadores de señal son electrofílicos.

3. El tinte polimérico de la reivindicación 1, donde dichos grupos generadores de señal derivan de un tinte representado por la fórmula:

A- -L- -B

donde A representa un grupo heterocíclico, L representa un grupo de unión y B representa un grupo anilino.

4. El tinte polimérico de la reivindicación 3, donde B tiene la fórmula:

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donde R_{1} y R_{2} son independientemente seleccionaos entre grupos alquilo que tienen de _{1} a _{6} átomos de carbono.

5. El tinte polimérico de la reivindicación 3, donde L tiene la fórmula:

-(-CH=CH-)_{n}-

donde n representa 1, 2 ó 3.

6. El tinte polimérico de la reivindicación 2, donde dichos grupos generadores de señal contienen grupos carboxílicos.

7. El tinte polimérico de la reivindicación 6, donde dichos grupos generadores de señal derivan de un tinte seleccionado entre el grupo consistente en carboxiquinolinioanilino, carboxibenzatiazolioanilino, carboxibenzoxazolioanilino, carboxiacridinioanilino, carboxibenzimidazolioanilino, carboxinaftindolioanilino, carboxinaftotiazolioanilino, carboxinaftimidazolioanilino y carboxinaftoxazolioanilino.

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8. El tinte polimérico de la reivindicación 6, donde dichos grupos generadores de señal consisten en un tinte que tiene la siguiente estructura:

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: donde R_{1} representa un grupo alquilo y R_{2} representa un grupo alquilo y n representa un número entero de 1 a 3, inclusive.

9. El tinte polimérico de la reivindicación 6, donde dichos grupos generadores de señal consisten en un tinte que tiene la siguiente estructura:

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: donde R_{1} representa un grupo alquilo y R_{2} representa un grupo alquilo y n representa un número entero de 1 a 3 inclusive y X^{-} representa un contraión cargado negativamente.

10. El tinte polimérico de la reivindicación 2, donde dicha entidad polimérica tiene una pluralidad de dichos restos hidrofóbicos y conformacionalmente restrictivos covalentemente unidos a la misma.

11. Una composición consistente en el tinte polimérico de la reivindicación 2, donde una pluralidad de dichos restos hidrofóbicos y conformacionalmente restrictivos asociados a dicho tinte polimérico no están covalentemente unidos a dicha entidad polimérica.

12. El tinte polimérico de la reivindicación 1, donde dicha entidad polimérica es electrofílica y dichos grupos generadores de señal son nucleofílicos.

13. El tinte polimérico de la reivindicación 12, donde dichos grupos generadores de señal contienen grupos amina o grupos hidrazida o tanto grupos amina como grupos hidrazida.

14. El tinte polimérico de la reivindicación 12, donde dichos grupos generadores de señal derivan de un tinte seleccionado entre el grupo consistente en aminopiridinioanilino, aminoquinolinioanilino y aminoacridinioanilino.

15. El tinte polimérico de la reivindicación 12, donde dicha entidad polimérica tiene una pluralidad de dichos restos hidrofóbicos y conformacionalmente restrictivos covalentemente unidos a la misma.

16. Una composición que contiene el tinte polimérico de la reivindicación 12, donde una pluralidad de cichos restos hidrofóbicos y conformacionalmente restrictivos asociados a dicho tinte polimérico no están covalentemente unidos a dicha entidad polimérica.

17. Un conjugado consistente en:

un miembro de un par de unión,

al menos un tinte polimérico unido a dicho miembro y

restos hidrofóbicos y conformacionalmente restrictivos seleccionados entre el grupo consistente en restos de ciclodextrinas, carcerands, calixiranos, grietas moleculares, cucurbiterilos y ciclofanos asociados a dicho tinte polimécrio, donde dicho tinte polimérico consiste en:

(a): una entidad polimérica y

(b): covalentemente unidos a dicha entidad polimérica una pluralidad de grupos generadores de señal, donde dichos grupos generadores de señal derivan de un tinte que tiene al menos un resto de anilino acoplado a un resto heterocíclico que contiene al menos un átomo de nitrógeno en el heterociclo por medio de un grupo de unión etilénicamente insaturado.

18. El conjugado de la reivindicación 17, donde dichos restos hidrofóbicos y conformacionalmente restrictivos asociados a dicho tinte polimérico no están covalentemente unidos a dicho al menos un tinte polimérico.

19. El conjugado de la reivindicación 17, donde dichos restos hidrofóbicos y conformacionalmente restrictivos asociados a dicho tinte polimérico están covalente unidos a dicho al menos un tinte polimérico.

20. El conjugado de la reivindicación 17, donde el número de grupos generadores de señal covalentemente unidos a dicha entidad polimérica es optimizado para conseguir el mayor nivel de señal.

21. El conjugado de la reivindicación 17, donde dicho tinte polimérico deriva de un tinte seleccionado entre el grupo consistente en aminopiridinioanilino, aminoquinolinioanilino y aminoacridinioanilino.

22. El conjugado de la reivindicación 17, donde dicho tinte polimérico deriva de un tinte seleccionado entre el grupo consistente en carboxiquinolinioanilino, carboxibenzatiazolioanilino, carboxibenzoxazolioanilino, carboxiacridinioanilino, carboxibenzimidazolioanilino, carboxinaftindolioanilino, carboxinaftotiazolioanilino, carboxinaftimidazolioanilino y carboxinaftoxazolioanilino.

23. El conjugado de la reivindicación 17, donde dicho t9nte polimérico consiste en un benzotiazolpiridiniotrieno de fórmula:

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24. El conjugado de la reivindicación 17, donde dicho tinte polimérico consiste en un aminoestirilpiridinio de fórmula:

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25. El conjugado de la reivindicación 17, donde dichos restos hidrofóbicos y conformacionalmente restrictivos asociados a dicho tinte polimérico son restos de \beta-ciclodextrinaldehído covalentemente unidos a dicho tinte polimérico.

26. Un método de inmunofenotipificación de células consistente en las siguientes etapas:

a.: disponer de una muestra de ensayo,

b.: aislar las células de dicha muestra de ensayo,

c.: introducir una lisis en dicha muestra de ensayo,

d.: añadir el conjugado de la reivindicación 17 a dicha muestra de ensayo y

e.: medir la fluorescencia de dicha muestra de ensayo.