CN102348980A

CN102348980A - 应用非粒子化学发光试剂的免疫分析

Info

Publication number: CN102348980A
Application number: CN2010800109998A
Authority: CN
Inventors: P.辛赫; 郑一枫; 耿利萍; R.延岑; C.谢尔普
Original assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany; Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 2009-03-12
Filing date: 2010-02-25
Publication date: 2012-02-08
Anticipated expiration: 2030-02-25
Also published as: ES2665953T3; RU2559581C2; EP2406630A4; CN102348980B; JP2012520378A; US9347947B2; US20100233725A1; US9720004B2; RU2011141265A; EP2406630A1; EP2406630B1; US20160231336A1; WO2010104683A1

Abstract

本发明公开了用于进行分析的方法和试剂。本发明方法和试剂的实施方案涉及用于测定怀疑含有分析物的样品中分析物的存在和/或数量的化学发光试剂。该试剂是非粒子的，并且包含对于分析物的结合配偶体和含有烯烃化合物和金属螯合物的化学发光组合物。在分析的实施方案中，提供了包含怀疑含有分析物的样品、如上所述的化学发光试剂以及能够产生单线态氧的敏化剂试剂的联合物。对该联合物实施用于使分析物与对于分析物的结合配偶体结合的条件。敏化剂被激活并且化学发光组合物产生的荧光的数量被检测，其中所述发光的数量与样品中分析物的数量有关。

Description

应用非粒子化学发光试剂的免疫分析

背景

本发明涉及能够产生信号的试剂，其在用于测定样品中分析物的方法、组合物和试剂盒中应用。

临床诊断领域在近年来已得到广泛扩展，关于可被容易和准确地测定的目的材料的种类以及用于所述测定的方法也得到扩展。大多数方法牵涉与样品中一种或多种分析物的存在和/或数量有关的信号的产生。发光化合物，如荧光化合物和化学发光化合物，由于它们发射光的能力在分析领域中具有广泛应用。粒子例如胶乳粒子、脂质体等已经被应用于分析中。已将吸收性染料和赋予荧光或化学发光性质的染料掺入粒子中。在一个特定方法中，使用包含一种或多种金属螯合物如例如镧系元素螯合物的粒子以产生信号。

美国专利号5,340,716和6,251,581中描述了诱导发光免疫分析，其公开内容通过引用并入本文。在一个方法中，分析使用掺入光敏剂的粒子和掺入化学发光化合物的标记粒子。标记粒子与结合配偶体偶联，所述配偶体能够与分析物结合以形成复合物，或与其它部分结合以形成与分析物的存在有关的复合物。如果分析物存在，光敏剂和化学发光化合物会紧密接近。当两个标记紧密接近时，光敏剂产生单线态氧并激活化学发光化合物。被激活的化学发光化合物随后产生光。产生的光的数量与形成的复合物的数量相关，形成的复合物的数量进而与存在的分析物数量相关。在一个特定方法中，化学发光粒子包含一种或多种金属螯合物，如例如镧系元素螯合物。

在诱导发光方法的一个变体中，应用粒子支持体，其包含：(a)能够在照射后产生单线态氧的光敏剂，和（b）能够被单线态氧激活的化学发光化合物。该方法使得能够产生延迟发光，这可以在照射支持体后实现。该方法应用于测定怀疑含有分析物的介质中的分析物。一种方法包含：对怀疑含有分析物的介质实施以下条件，在该条件下，结合配偶体的复合物有关分析物的存在而形成；和通过使用具有化学发光和光敏剂性质的粒子组合物作为标记来测定是否形成了复合物。在光敏剂性质激活后，单线态氧产生并激活化学发光性质。这样的组合物和方法描述在美国专利5,709,994号中，其相关公开内容通过引用并入本文。

概述

本发明的一个实施方案是用于测定在怀疑包含分析物的样品中分析物的存在和/或数量的化学发光试剂。该化学发光试剂是非粒子的，并且包含对于分析物的结合配偶体以及包含烯烃化合物和金属螯合物的化学发光组合物。

本发明的另一个实施方案是用于测定在怀疑包含分析物的样品中分析物的存在和/或数量的方法。提供了包含样品、如上所述的化学发光试剂和能够产生单线态氧的敏化剂试剂的联合物。对该联合物实施用于将分析物与对于分析物的结合配偶体结合的条件。敏化剂得以激活并且化学发光组合物产生的发光数量得以检测，其中发光数量与样品中分析物的数量相关。

附图简述

图1是用于生产依照本发明实施方案的化学发光试剂的示意图描述。

图2是描绘使用依照本发明实施方案的化学发光试剂进行TSH分析的校准曲线的图。

图3是使用依照本发明实施方案的化学发光试剂进行TSH分析的结果的表格描述，并显示了在校准器之间获得的信号的分离。

图4是描绘依照本发明实施方案的化学发光试剂的稳定性研究结果的图。

图5是描绘依照本发明实施方案的化学发光试剂的稳定性研究结果的图。

具体实施方案详述

一般论述

本发明方法和试剂的实施方案涉及化学发光试剂，其用于测定在怀疑含有分析物的样品中分析物的存在和/或数量。试剂是非粒子的，并且包含对于分析物的结合配偶体以及包含烯烃化合物和金属螯合物的化学发光组合物。依照本发明实施方案的化学发光试剂在含水介质例如含水分析介质中显示良好的溶解性。非粒子学发光试剂具有增强的稳定性以用于检测分析物的分析中；此外，该试剂对分析物的浓度变化显示良好的信号反应。当应用于分析中时，按照本发明实施方案的非粒子化学发光试剂在含水分析介质中可溶并提供包括产生的信号的准确性和灵敏度以及稳定性的最大化性能。

在医疗决策范围低端(low end)的具体分析形式的性能可以通过监测跨越目的分析物怀疑浓度范围的校准器所得到信号数量的差异进行监测。期望对于校准器如例如校准器L1和校准器L2或校准器L2和校准器L3的信号之间有大的差异或分离。例如，可以使用6个校准器，其随意命名为L1-L6。信噪比可以通过测定使用不含分析物的校准器即随意命名的校准器L1（背景）的信号数量和对于包含大于零的第一已知分析物数量的校准器即随意命名的校准器L2获得的信号数量来评估。这一评估也可包括测定使用校准器L1的信号数量和对于包含大于零的第二已知分析物数量的校准器即随意命名的校准器L3的信号数量。这样的评估也可以包括使用校准器 L4、L5、L6等的这种测定。本文所论述的实施方案在对分析物的分析中比不依据本发明实施方案的试剂提供更好的性能。

期望校准器，例如对于校准器L1和校准器L2、或校准器L1和校准器L6的信号之间有大的差异。对于在医疗决策范围内良好的灵敏度，在校准器L1和校准器L2之间测定的信号中的差异是至少大约50％、至少大约75％、至少大约90％、至少大约100％、至少大约125％、至少大约150％、至少大约175％、至少大约200％、至少大约225％、至少大约250％、至少大约275％、至少大约300％、至少大约325％、至少大约350％、至少大约375％、至少大约400％、至少大约425％等等。在某些实施方案中，对校准器L6检测的信号是对校准器L1检测的信号的至少大约10倍、至少大约20倍、至少大约30倍、至少大约40倍、至少大约50倍、至少大约60倍、至少大约70倍、至少大约80倍、至少大约90倍、至少大约100倍。根据分析形式，信号中的差异可以是信号的增强或者信号的减弱。一般地，使用校准器的分析结果以图形式呈现，其中将信号的数量针对校准器的浓度绘图。按照本发明的实施方案，校准器L1和校准器L2之间的线的斜率通常比用不按照本发明实施方案的分析试剂得到的结果陡。而且，从校准器L1至校准器L6的线的斜率通常比用不按照本发明实施方案的分析试剂得到的结果陡。

如上所述，本发明化学发光试剂的实施方案是非粒子的。如此地，将所述试剂与前面提到的利用粒子化学发光试剂的已知诱导发光分析中使用的那些试剂区分开。本发明化学发光试剂显示含水介质中的良好溶解性。在化学发光试剂的实施方案中，将对于分析物的结合配偶体共价或非共价地与包含烯烃化合物和金属螯合物的化学发光组合物结合。

对于分析物的结合配偶体可以通过键与化学发光组合物共价结合。另一方面，对于分析物的结合配偶体可以通过连接基团与化学发光组合物共价结合。在某些实施方案中，连接基团是亲水的。术语“亲水的”或“亲水性”是指极性部分，并且因而优选极性分子和优选极性溶剂。亲水分子相比于疏水部分具有对其它亲水部分的亲和性。亲水性程度由连接基团中杂原子的数目来控制。

在某些实施方案中，连接基团是高分子并且可以是聚合的。聚合高分子大致为大约 1至大约 10,000个单体单元或更长长度、或大约 10至大约 10,000个单体单元长度、或大约 100至大约 10,000个单体单元长度、或大约 500至大约 10,000个单体单元长度、或大约 1,000至大约 10,000个单体单元长度、或大约 2,000至大约 10,000个单体单元长度、或大约 3,000至大约 10,000个单体单元长度、或大约 5,000至大约 10,000个单体单元长度、或大约 10至大约 8,000个单体单元长度、或大约 100至大约 8,000个单体单元长度、或大约 1,000至大约 8,000个单体单元长度、或大约 100至大约 7,000个单体单元长度等。单体单元的数目取决于单体单元链中的原子数目、单体单元的组成等等。

聚合高分子的分子量是至少大约 2,000。分子量可以是大约 2,000至大约 10,000,000或更高、或大约 2,000至大约 8,000,000、或大约 2,000至大约 6,000,000、或大约 2,000至大约 5,000,000、或大约 2,000至大约 4,000,000、或大约 2,000至大约 3,000,000、或大约 2,000至大约 2,000,000、或大约 2,000至大约 1,000,000、或大约 5,000至大约 10,000,000或更高、或大约 5,000至大约 8,000,000、或大约 5,000至大约 6,000,000、或大约 5,000至大约 5,000,000、或大约 5,000至大约 4,000,000、或大约 5,000至大约 3,000,000、或大约 5,000至大约 2,000,000、或大约 5,000至大约 1,000,000、或大约 10,000至大约 10,000,000或更高、或大约 10,000至大约 8,000,000、或大约 10,000至大约 6,000,000、或大约 10,000至大约 5,000,000或大约 10,000至大约 4,000,000、或大约 10,000至大约 3,000,000或大约 10,000至大约 2,000,000、或大约 10,000至大约 1,000,000等。

聚合高分子可以是线性的或者支化的或者它们的结合。线性聚合物包含线性原子链，以及支化聚合物包含支化原子链。线性链的每个原子可以有一个或多个取代基替代氢。在某些实施方案中，聚合物可以是包含多于一种类型的单体单元的共聚物。聚合物中不同单体单元的关联可为交替的、随机的、周期性的等，以及也可以是其中重复单体单元的嵌段形成聚合物链的嵌段共聚物排列。

在某些实施方案中，聚合高分子的单体单元中的一个或多个包含碳原子、和一个或多个杂原子，如例如氧、硫、氮、磷等。单体单元可以包含大约 2至大约 50个原子或更多、或5至大约 50个原子、或大约 10至大约 50个原子、或大约 20至大约 50个原子、或大约 30至大约 50个原子、或大约 2至大约 40个原子或更多、或5至大约 40个原子、或大约 10至大约 40个原子、或大约 20至大约 40个原子、或大约 30至大约 40个原子、或大约 2至大约 30个原子或更多、或5至大约 30个原子、或大约 10至大约 30个原子、或大约 20至大约 30个原子，不计数氢；并且可以包含2至大约 30个原子、或大约 5至大约 30个原子或更多、或10至大约 30个原子、或大约 15至大约 30个原子、或大约 20至大约 30个原子、或大约 2至大约 25个原子或更多、或5至大约 25个原子、或大约 10至大约 25个原子、或大约 15至大约 25个原子、或大约 20至大约 25个原子、或大约 2至大约 20个原子或更多、或5至大约 20个原子、或大约 10至大约 20个原子、或大约 15至大约 20个原子、或大约 2至大约 15个原子、或大约 5至大约 15个原子、或大约 10至大约 15个原子的链，每一原子独立地选自通常由碳、氧、硫、氮和磷构成的集合。

聚合高分子的单体单元中杂原子的数目可以是从大约 0至大约 20、或大约 0至大约 15、或大约 0至大约 10、或大约 0至大约 5、或大约 1至大约 20、或大约 1至大约 15、或大约 1至大约 10、或大约 1至大约 5、或大约 2至大约 20、或大约 2至大约 15、或大约 2至大约 10、或大约 2至大约 5、或大约 5至大约 20、或大约 5至大约 15、或大约 5至大约 10等的范围。在某些实施方案中，杂原子数目足以使连接基团亲水并增强按照本发明实施方案的化学发光试剂的溶解性。就这点而言，聚合高分子的单体单元中的杂原子数目可以是从大约 1至大约 20、或大约 1至大约 15、或大约 1至大约 10、或大约 1至大约 5、或大约 2至大约 20、或大约 2至大约 15、或大约 2至大约 10、或大约 2至大约 5、或大约 5至大约 20、或大约 5至大约 15、或大约 5至大约 10等的范围。当杂原子存在时，氧一般作为氧代或氧基存在，与碳、硫、氮或磷结合；氮一般作为偶氮、氰基、异氰基、硝基，亚硝基，酰氨基或氨基存在，一般与碳、氧、硫或磷结合；硫类似于氧；而磷通常作为膦酸酯和磷酸一酯或二酯与碳、硫、氧或氮结合。

在连接基团和待偶联分子之间形成共价键中的一般官能度是烷基胺、脒、硫代酰胺、醚、脲、硫脲、胍、偶氮、硫醚以及羧酸酯、硫酸酯和磷酸酯、酰胺和硫酯。多半，当连接基团具有连接官能度（用于与部分反应的官能度）如例如，包括氮和硫类似物的非氧代羰基基团、磷酸酯基团、氨基基团、烷化剂例如卤代或甲苯磺酰烷基、氧基（羟基或硫类似物，巯基）、氧代羰基(例如醛或酮)、或活性烯烃例如乙烯砜、或α-, β-不饱和酯时，这些官能度与胺基、羧基基团、活性烯烃、烷基剂例如溴乙酰基结合。在胺和羧酸或其氮衍生物或磷酸衍生物连接的情况下，分别形成酰胺、脒和磷酰胺。在硫醇和活性烯烃连接的情况下形成硫醚。在硫醇和烷化剂连接的情况下形成硫醚。在醛和胺在还原条件下连接的情况下形成烷基胺。在酮或醛和羟胺（包括羟基中的氢被取代基替代的其衍生物）连接的情况下形成肟官能度(=N-O-)。在羧酸或磷酸和醇连接的情况下形成酯。

在某些实施方案中，连接基团不是高分子，并具有小于大约2000、或者小于大约1500、或者小于大约1000、或者小于大约500等的分子量。这类连接基团可以包含大约2到大约200个原子、或者4到大约150个原子、或者大约5到大约100个原子，不计数氢原子；并且可以包含2到大约100个原子、或者3到大约90个原子、或者大约4到大约80个原子、或者大约5到大约70个原子等的链，每一原子独立选自一般由碳、氧、硫、氮和磷组成的集合。这类连接基团中杂原子的数目取决于连接基团的大小，并且一般是大约0到大约50、1到大约45或者大约2到大约40的范围。杂原子可以是上文关于高分子连接基团的论述中指出的形式。在某些实施方案中，杂原子的数目足以使连接基团亲水，并增强根据本发明实施方案得到的组合物的溶解性。在这点上，连接基团中杂原子的数目取决于连接基团的大小，并且可以是大约5到大约50、或大约10到大约50、或大约15到大约50、或大约5到大约40、或大约10到大约40、或大约15到大约40、或大约5到大约30、或大约10到大约30、或大约15到大约30、或大约5到大约25、或大约10到大约25等的范围。

作为连接基团的聚合高分子可以是天然发生的材料或者合成构建体。在某些实施方案中，聚合高分子连接基团是多肽。举例说明但非限制地，多肽的例子包括蛋白质，例如白蛋白、γ-球蛋白、免疫球蛋白、血蓝蛋白、合成多肽等。举例说明但非限制地，其它聚合高分子的例子包括树枝状大分子、聚合羧酸酯（例如聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚半乳糖醛酸、聚甲基丙烯酸等）、聚合胺（例如聚乙烯胺、聚赖氨酸、聚谷氨酰胺、聚乙烯亚胺、聚烯丙基胺等）、聚合醚（聚乙二醇或聚环氧乙烷等）、聚合硫醚（例如聚乙烯硫醚等）、聚合巯基（例如聚半胱氨酸）等等。

对于分析物的结合配偶体可以以多种不同的方式与化学发光组合物结合，其中的某些方式在下面以举例说明但非限制的方式进行论述。在某些实施方式中，连接基团是蛋白质，并且化学发光组合物的成分即烯烃化合物和金属螯合物各自结合于该蛋白质，对于分析物的结合配偶体也与该蛋白质结合。这一实施方案阐述如下：

其中Ab是对于分析物的结合配偶体（在这一例子中是抗体），L是蛋白质连接基团，MC是金属螯合物并且OC是烯烃化合物，并且a、b、c独立地是例如1到大约10、或者1到大约9、或者1到大约8、或者1到大约7、或者1到大约6、或者1到大约5、或者1到大约4、或者1到大约3、或者1到大约2、或者2到大约10、或者2到大约9、或者2到大约8、或者2到大约7、或者2到大约6、或者2到大约5、或者2到大约4、或者2到大约3、或者大约3到大约10、或者大约3到大约9、或者大约3到大约8、或者大约3到大约7、或者大约3到大约6、或者大约3到大约5、或者大约3到大约4的整数。各种官能度例如胺、羧基等存在于蛋白质上，用于与MC、OC和Ab连接，并且可以看出，MC、OC和Ab的多个分子可以结合于蛋白质。可结合的各自分子数目取决于蛋白质的大小、MC和OC的大小以及抗体的大小。

在某些实施方案中，连接基团是蛋白质，并且化学发光组合物的成分即烯烃化合物和金属螯合物各自结合于同一蛋白质分子。蛋白质具有与其结合的特异性结合对的一个成员的一个或多个分子。对于分析物的结合配偶体具有与其结合的特异性结合对的另一成员的一个或多个分子。特异性结合对的成员的结合导致对于分析物的结合配偶体与蛋白质非共价结合。这一实施方案阐述如下：

其中Ab是对于分析物的结合配偶体（在这一例子中是抗体），L是蛋白质连接基团，MC是金属螯合物，OC是烯烃化合物，SBPM1和SBPM2是特异性结合对的互补成员，“=”是非共价键，并且a、b、c独立地是例如1到大约10、或者1到大约9、或者1到大约8、或者1到大约7、或者1到大约6、或者1到大约5、或者1到大约4、或者1到大约3、或者1到大约2、或者2到大约10、或者2到大约9、或者2到大约8、或者2到大约7、或者2到大约6、或者2到大约5、或者2到大约4、或者2到大约3、或者大约3到大约10、或者大约3到大约9、或者大约3到大约8、或者大约3到大约7、或者大约3到大约6、或者大约3到大约5、或者大约3到大约4的整数。各种官能度例如胺、羧基等存在于蛋白质上，用于与MC、OC和SBPM1连接，并且可以看出，MC、OC和SBPM1的多个分子可以结合于蛋白质。可结合的各自分子数目取决于蛋白质的大小，MC、OC、SBPM1和SBPM2的大小以及抗体的大小。

在某些实施方案中，连接基团是蛋白质，并且化学发光组合物的成分即烯烃化合物和金属螯合物各自结合于同一蛋白质分子。蛋白质具有与其结合的特异性结合对的一个成员的一个或多个分子以及抗体的一个或多个分子。OC和MC各自独立地具有与其结合的特异性结合对的另一成员的一个或多个分子。特异性结合对的成员的结合导致OC和MC与蛋白质非共价结合。这一实施方案阐述如下：

其中Ab是对于分析物的结合配偶体（在这一例子中是抗体），L是蛋白质连接基团，MC是金属螯合物，OC是烯烃化合物，SBPM1和SBPM2是特异性结合对的互补成员，“=”是非共价键，并且a、b、c独立地是例如1到大约10、或者1到大约9、或者1到大约8、或者1到大约7、或者1到大约6、或者1到大约5、或者1到大约4、或者1到大约3、或者1到大约2、或者2到大约10、或者2到大约9、或者2到大约8、或者2到大约7、或者2到大约6、或者2到大约5、或者2到大约4、或者2到大约3、或者大约3到大约10、或者大约3到大约9、或者大约3到大约8、或者大约3到大约7、或者大约3到大约6、或者大约3到大约5、或者大约3到大约4的整数。各种官能度例如胺、羧基等存在于蛋白质上，用于与MC、OC和SBPM1连接，并且可以看出，MC、OC和SBPM1的多个分子可以结合于蛋白质。可结合的各自分子数目取决于蛋白质的大小，MC、OC、SBPM1和SBPM2的大小以及抗体的大小。值得注意的是，在以上实施方案中，对于OC和MC的连接，SBPM1和SBPM2所属的特异性结合对可以是相同的，或者可以使用两个不同的特异性结合对，一个用于OC并且一个用于MC。

在某些实施方案中，连接基团是蛋白质，并且化学发光组合物的成分即烯烃化合物和金属螯合物各自结合于同一蛋白质分子。蛋白质具有与其结合的特异性结合对的一个成员的一个或多个分子。OC和MC各自独立地具有与其结合的特异性结合对的另一成员的一个或多个分子。特异性结合对的成员的结合导致OC和MC与蛋白质非共价结合。对于分析物的结合配偶体也具有与其结合的特异性结合对的另一成员的一个或多个分子。特异性结合对的成员的结合导致对于分析物的结合配偶体与蛋白质非共价结合。这一实施方案阐述如下：

其中Ab是对于分析物的结合配偶体（在这一例子中是抗体），L是蛋白质连接基团，MC是金属螯合物，OC是烯烃化合物，SBPM1和SBPM2是特异性结合对的互补成员，“=”是非共价键，并且a、b、c独立地是例如1到大约10、或者1到大约9、或者1到大约8、或者1到大约7、或者1到大约6、或者1到大约5、或者1到大约4、或者1到大约3、或者1到大约2、或者2到大约10、或者2到大约9、或者2到大约8、或者2到大约7、或者2到大约6、或者2到大约5、或者2到大约4、或者2到大约3、或者大约3到大约10、或者大约3到大约9、或者大约3到大约8、或者大约3到大约7、或者大约3到大约6、或者大约3到大约5、或者大约3到大约4的整数。各种官能度例如胺、羧基等存在于蛋白质上，用于与SBPM1连接，并且可以看出，SBPM1的多个分子可以结合于蛋白质。可结合的各自分子数目取决于蛋白质的大小，MC、OC、SBPM1和SBPM2的大小以及抗体的大小。值得注意的是，在以上实施方案中，对于OC、MC和抗体的连接，SBPM1和SBPM2所属的特异性结合对可以是相同的，或者可以使用两个或三个不同的特异性结合对，一个用于OC、一个用于MC以及一个用于抗体。

在某些实施方案中，连接基团是蛋白质，并且化学发光组合物的成分即烯烃化合物和金属螯合物分别结合于不同蛋白质分子。蛋白质具有与其结合的特异性结合对的一个成员的一个或多个分子。对于分析物的结合配偶体具有与其结合的特异性结合对的另一成员的一个或多个分子。特异性结合对的成员的结合导致对于分析物的结合配偶体与蛋白质非共价结合。这一实施方案阐述如下：

其中Ab是对于分析物的结合配偶体（在这一例子中是抗体），L是蛋白质连接基团，MC是金属螯合物，OC是烯烃化合物，SBPM1和SBPM2是特异性结合对的互补成员，“=”是非共价键，并且a、b、c独立地是例如1到大约10、或者1到大约9、或者1到大约8、或者1到大约7、或者1到大约6、或者1到大约5、或者1到大约4、或者1到大约3、或者1到大约2、或者2到大约10、或者2到大约9、或者2到大约8、或者2到大约7、或者2到大约6、或者2到大约5、或者2到大约4、或者2到大约3、或者大约3到大约10、或者大约3到大约9、或者大约3到大约8、或者大约3到大约7、或者大约3到大约6、或者大约3到大约5、或者大约3到大约4的整数。各种官能度例如胺、羧基等存在于蛋白质上，用于与MC、OC和SBPM1连接，并且可以看出，MC、OC和SBPM1的多个分子可以结合于蛋白质。可结合的各自分子数目取决于蛋白质的大小，MC、OC、SBPM1和SBPM2的大小以及抗体的大小。值得注意的是，在以上实施方案中，对于OC和MC的连接，SBPM1和SBPM2所属的特异性结合对可以是相同的，或者可以使用两个不同的特异性结合对，一个用于OC以及一个用于MC。也值得注意的是，在以上实施方案中，对于OC和MC，L可以是相同的或不同的。

在某些实施方案中，连接基团是蛋白质，并且化学发光组合物的成分即烯烃化合物和金属螯合物通过非共价结合方式分别结合于不同蛋白质分子。蛋白质具有与其结合的特异性结合对的一个成员的一个或多个分子。对于分析物的结合配偶体具有与其结合的特异性结合对的另一成员的一个或多个分子。特异性结合对的成员的结合导致对于分析物的结合配偶体与蛋白质非共价结合。OC和MC也各自独立地具有与其结合的特异性结合对的另一成员的一个或多个分子。特异性结合对的成员的结合导致OC和MC与蛋白质非共价结合。这一实施方案阐述如下：

其中Ab是对于分析物的结合配偶体（在这一例子中是抗体），L是蛋白质连接基团，MC是金属螯合物，OC是烯烃化合物，SBPM1和SBPM2是特异性结合对的互补成员，“=”是非共价键，并且a、b、c独立地是例如1到大约10、或者1到大约9、或者1到大约8、或者1到大约7、或者1到大约6、或者1到大约5、或者1到大约4、或者1到大约3、或者1到大约2、或者2到大约10、或者2到大约9、或者2到大约8、或者2到大约7、或者2到大约6、或者2到大约5、或者2到大约4、或者2到大约3、或者大约3到大约10、或者大约3到大约9、或者大约3到大约8、或者大约3到大约7、或者大约3到大约6、或者大约3到大约5、或者大约3到大约4的整数。各种官能度例如胺、羧基等存在于蛋白质上，用于与MC、OC和SBPM1连接，并且可以看出，MC、OC和SBPM1的多个分子可以结合于蛋白质。可结合的各自分子数目取决于蛋白质的大小，MC、OC、SBPM1和SBPM2的大小以及抗体的大小。值得注意的是，在以上实施方案中，对于OC、MC和抗体的连接，SBPM1和SBPM2所属的特异性结合对可以是相同的，或者可以使用两个或三个不同的特异性结合对，一个用于OC、一个用于MC以及一个用于抗体。也值得注意的是，在以上实施方案中，对于OC和MC，L可以是相同的或不同的。

烯烃化合物是能够与单线态氧反应的化合物。在某些实施方案中，烯烃与单线态氧的反应是2+2加成以形成二氧杂环丁烷(dioxetane)。合适的烯烃化合物通常不具有连接于烯烃碳的饱和C-H基团，除了非反应性桥头碳，并且在某些实施方案中，具有一个或多个直接连接于烯烃碳或与烯烃结合的供电子基团。二氧杂环丁烷能够自发解离或通过加热解离并伴随自发化学发光，或者形成的羰基能够作为荧光基团的一部分形成或能够经历产生荧光分子的随后反应。可选地，该解离反应可以导致猝灭基团与基础荧光基团的分离，从而重新获得其荧光性质。

在某些实施方案中，单线态氧与烯烃的反应是与二烯的4+2环加成，所述二烯通常是芳香族化合物例如萘、蒽、唑、呋喃、吲哚等。这样的反应首先产生内过氧化物。在某些情况下，内过氧化物能够重排以激活酯或酐，酯或酐能够与位于适当位置的基团反应，以提供可为荧光性的内酯或内酰胺。可选地，内过氧化物可以氧化荧光或化学发光化合物前体。内过氧化物也能够自发解离或在加热后解离并伴随化学发光的发射，或者氧化荧光无色染料。

在某些实施方案中，单线态氧与烯烃的反应是产生烯丙基氢过氧化物的“烯(ene)”反应。合适的烯烃具有连接于烯烃碳的反应性饱和C-H。这一产物能够与同一分子中的活性酯反应，形成能够自发解离或通过加热解离并伴随化学发光发射的二氧杂环丁烷酮(dioxetanone)。

总之，目的烯烃是经历下列化学反应的烯烃，与单线态氧反应后形成亚稳定的反应产物，通常是二氧杂环丁烷或内过氧化物，它们能够分解并同时或随后发射通常在250到1200nm波长范围内的光。优选的是通常包含供电子基团的富含电子的烯烃。示范性的这种富含电子的烯烃是烯醇醚、烯胺、9-亚烷基-N-9,10二氢化吖啶、芳基乙醚烯、1,4-二氧杂环己烯、1,4-二甲基噻吩、1,4-

嗪、芳基咪唑、9-亚烷基-苍耳烷和光泽精。

合适的富含电子的化学发光烯烃的例子在美国专利号5,709,994中列出，其相关的公开内容通过引用并入本文。这些烯烃一般具有与烯烃结合的供电子基团。

二氧杂环丁烷可以单独或与荧光能量受体联合发光。烯醇醚是这样的烯烃的例子。在某些实施方案中，烯醇醚化合物将具有至少一个结合于烯烃碳的芳基，其中芳环在某个位置处被供电子基团取代，以增加烯烃对单线态氧的反应性和/或为得到的二氧杂环丁烷的解离产物赋予荧光。供电子基团可以是，例如，羟基、烷氧基、双取代氨基、烷基硫代、呋喃基、吡咯基(pyryl)等。优选地，烯醇醚具有直接结合于烯烃碳的供电子基团。

烯胺是这样的烯烃的另一个例子。一般而言，有用的烯胺将服从于上面提出的关于烯醇醚的规则。化学发光剂的另一个家族是2,4,5-三苯基咪唑，其母体产物的通用名是洛粉碱。化学发光类似物包括对二甲氨基和对甲氧基取代基。满足上面给出的要求的其它化学发光烯烃可以在欧洲专利申请号0,345,776中找到。

除了烯烃化合物之外，化学发光组合物还包含金属和一个或多个螯合剂的复合物。形成复合物的一部分的金属的例子包括，例如，稀土金属、VIII族金属等。稀土金属包含镧系元素（镧系元素金属）（从镧到镥的15个元素，原子序数57-71）。特别感兴趣的稀土金属包括铕，铽、镝和钐。特别感兴趣的VIII族金属包括锇和钌。在某些实施方案中，稀土金属具有正3价的氧化态，钌具有正2价的氧化态并且锇具有正2价的氧化态。在某些实施方案中，金属选自铕，铽、镝、钐、锇和钌。在某些实施方案中，金属至少是6配位的；然而，金属可以是8配位或更高配位的，这取决于金属螯合剂。

金属螯合剂是下列化合物，其中同一分子的两个或更多原子可以与金属配位以形成金属螯合物。所述两个或更多个原子可以是，例如，氧、氮、硫等。所述原子可为一种或多种官能度形式，如例如，酮、醛、羟基、胺、硫酮、硫醛、硫醇等。所述官能度可以是苄基或衍生自例如萘、蒽、菲、吖啶等的缩合芳环系统的一部分。

上述金属之一与一种或多种螯合剂配位，其具体例子包括，例如，2-(1',1',1',2',2',3',3'-七氟-4',6'-己二酮-6'-基)-萘(NHA)、4,4'-二(2'',3'',3''-七氟-4'',6''-己二酮-6''-基)-邻-三联苯 (BHHT)、4,4'-二(1,''1'',1'',2'',2'',3'',3''-七氟-4'',6''-己二酮-6''-基)-氯代磺基-邻-三联苯(BHHCT)、菲咯啉(phen)和菲咯啉相关化合物（菲咯啉的衍生物)如例如菲咯啉羧酸、4,7-联苯-1,10-菲咯啉(DPP)等、3-(2-噻吩酰(thienoyl), 1,1,1-三氟丙酮(TTA)、噻吩三氟丁二酮(TTB)、3-萘酰-1,1,1-三氟丙酮(NPPTA)、萘基三氟丁二酮(NTA)、三辛基氧化膦(TOPO)、三苯基氧化膦(TPPO)、3-苯甲酰-1,1,1-三氟丙酮(BFTA)、2,2-二甲基-4-全氟丁酰(butynoyl)-3-丁酮 (fod)、2,2'-联吡啶(bpy)、水杨酸,、联吡啶基羧酸、氮杂冠醚三辛基氧化膦、氮杂穴状配体等，以及上述的组合。如上所述，在某些实施方案中，金属螯合物中的金属至少是6配位的。金属螯合物将是不带电的；因此，螯合物提供的酸性基团数目将与金属氧化态相等。举例说明而非限定地，示范性的具体金属螯合物包括Eu(BHHCT)₂DPP、Eu(TTA)₃DPP、Eu(NTA)₃DPP、Eu(NHA)₃DPP、 Eu(BHHT)₂DPP、以及其相关内容在此引入作为参考的美国专利号6,916,667（例如，5-9栏）和美国专利申请号20060270063（3-4栏）中所论述的金属螯合物等等。

许多螯合剂和金属螯合物是本领域中已知的，并且许多是可商购的。一般而言，金属螯合物可以由金属螯合剂通过使金属氯化物与期望比率的金属螯合剂分子在含水缓冲溶剂和吸收反应中产生的盐酸的足量碱中结合而制备。例如，金属螯合物可以通过例如Shinha, A. P., "Fluorescences and laser action in rare earth chelates," Spectroscopy Inorganic Chemistry, Vol 2, (1971), 255-288描述的那种程序制备。

化学发光试剂可以包括赋予亲水性或水溶性的基团或官能度，其增加利用水的固体湿润能力和其结合的化合物在含水系统中的溶解度。一种或多种这样的官能度可以存在于烯烃化合物或金属螯合物或两者上。这样的官能团或官能度可以是具有1到50个或更多原子的取代基，并可包括磺酸酯、硫酸酯、磷酸酯、脒、膦酸酯、羧酸酯、特别是多元醇的羟基、胺、醚、酰胺等。举例说明的官能团是羧基烷基、磺基氧基烷基(sulfonoxyalkyl)、CONHOCH₂COOH、CO-(葡糖胺)、糖、葡聚糖、环糊精、SO₂NHCH₂COOH、SO₃H、CONHCH₂CH₂SO₃H、PO₃H₂、OPO₃H₂、羟基、羧基、酮及其组合。这样的基团或官能度可以通过本领域公知的用于将这些基团或官能度引入化合物中的方法而引入螯合剂中。

在化学发光试剂制备后，可以将化学发光试剂置于合适的介质中进行存储，直至在分析中使用。在许多实施方案中，介质是含水介质，通常是含水缓冲介质。含水介质可以是单独的水或者可以含有0.1%到大约40%体积的助溶剂，如例如，有机溶剂，其可以是醇、醚、酯、胺、酰胺等。介质的pH值将通常是大约4到大约11的范围，或者大约5到大约10的范围，或者大约6.5到大约9.5的范围。可以使用各种缓冲液以实现期望的pH值并维持该pH值。举例说明的缓冲液包括硼酸盐、磷酸盐、碳酸盐、tris、巴比妥、PIPES、HEPES、MES、ACES、MOPS、BICINE等。所使用的具体缓冲液并不重要，但对于特定的化学发光试剂而言，一种或另一种缓冲液可能是优选的。在某些实施方案中，化学发光试剂储存于其中的介质与用于分析物的分析的介质基本上类似或者相同，在该分析中，化学发光试剂是所用的分析试剂中的一种。化学发光试剂在室温下在含水介质中的溶解度是，例如，至少50%、或者至少55%、或者至少60%、或者至少65%、或者至少70%、或者至少75%、或者至少80%、或者至少85%、或者至少90%、或者至少95%（重量比体积）。

举例说明但非限定地，在上文的一个具体实施方案中，化学发光试剂包含均共价结合于BSA的二甲基噻吩和Eu(BHHCT)₂DPP，对于分析物的结合配偶体也与BSA结合。

在本发明实施方案中用于非共价连接的特异性结合对的一个成员("sbp成员")是两个不同分子之一，其在表面上或腔中具有特异性结合另一分子的特定空间和极性结构的区域，因而定义为与另一分子的特定空间和极性结构互补。在本发明实施方案中使用的特异性结合对选自：(i)小分子和对于小分子的结合配偶体，和(ii)大分子和对于大分子的结合配偶体。在某些实施方案中，小分子具有小于大约2000、或小于大约1500、或小于大约1000、或小于大约500、或小于大约400、或小于大约300等的分子量。举例说明但非限定地，用于小分子对的小分子结合配偶体的例子包括：对于生物素的生物素结合配偶体（例如，抗生物素蛋白、链霉亲和素、针对生物素的抗体等），对于地高辛(digoxin)的地高辛结合配偶体（例如，针对地高辛的抗体等），对于荧光素的荧光素结合配偶体（针对荧光素的抗体等），对于罗丹明的罗丹明结合配偶体（例如针对罗丹明的抗体），对于肽的肽结合配偶体（针对肽的抗体等），分析物特异性结合配偶体（例如，对于B12的内因子、对于叶酸的叶酸结合因子）等等。

在本发明实施方案中使用的特异性结合对的某些实施方案中，大分子的分子量大于大约2,000、或者大于大约5,000、或者大于大约10,000、或者大于大约50,000、或者大于大约100,000、或者大于大约500,000、或者大于大约1,000,000、或者大于大约5,000,000、或者大于大约10,000,000等。举例说明但非限定地，用于大分子对的大分子结合配偶体的例子包括免疫对例如抗原-抗体、激素-激素受体、核酸双链体、IgG -蛋白质A、多核苷酸对例如DNA-DNA、DNA-RNA、其它受体与配体等的成员。

对于分析物的结合配偶体的性质主要取决于分析物的性质。对于分析物的结合配偶体可以是抗体、多核苷酸、不同于抗体的分析物特异性结合蛋白等。抗体是特异结合于另一分子的特定空间和极性结构，因而定义为与另一分子的特定空间和极性结构互补的免疫球蛋白。抗体可以是单克隆的或多克隆的，并且可以如下制备：通过本领域公知的技术，如免疫宿主并收集血清（多克隆的）；或通过制备连续杂交细胞系并收集分泌蛋白（单克隆的）；或通过克隆并表达编码至少对于天然抗体的结合特异性所需的氨基酸序列的核苷酸序列或其诱变形式。抗体可包括完整免疫球蛋白或其片段，所述免疫球蛋白包括各种种类和同种型，例如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3、IgM等。其片段可包括Fab、Fv和F(ab')₂、Fab'等。此外，在适当时可以使用免疫球蛋白或它们的片段的聚集物、聚合物和偶联物，只要对于特定分子的结合亲和力得以维持。

分析物可以是配体，其为单价（单表位的）或多价（多表位的）的，通常是抗原或半抗原的，并且是单一化合物或共享至少一个共同表位或决定簇位点的多个化合物。分析物可以是细胞的一部分，所述细胞如细菌或具有如A、B、D等血型抗原或HLA抗原的细胞，或者分析物可以是微生物，例如细菌、真菌、原生动物或病毒。

多价配体分析物可以是聚(氨基酸)即多肽和蛋白质，多糖，核酸以及它们的组合。这些组合包括细菌、病毒、染色体、基因、线粒体、细胞核、细胞膜等的成分。多半，多表位配体具有至少大约5,000、更经常的是至少大约10,000的分子量。在聚(氨基酸)种类中，目的聚(氨基酸)可以具有大约5,000到5,000,000的分子量，更经常是大约20,000到1,000,000的分子量；在目的激素中，分子量将通常是大约5,000到60,000分子量范围。

分析物可以是蛋白质，如例如免疫球蛋白、细胞因子、酶、激素、癌抗原、营养标记、组织特异性抗原等。举例说明但非限制地，这些蛋白质包括：鱼精蛋白，组蛋白，白蛋白，球蛋白，硬蛋白，磷蛋白，粘蛋白，色蛋白，脂蛋白，核蛋白，糖蛋白，T细胞受体，蛋白聚糖，HLA，未分类蛋白质如生长激素、催乳素，胰岛素、胃蛋白酶、人血浆中发现的蛋白、凝血因子，蛋白质激素如例如促卵泡激素、促黄体激素、催乳激素、催乳素、绒毛膜促性腺激素、组织激素、细胞因子，癌抗原如例如PSA、CEA、甲胎蛋白、酸性磷酸酶、CA19.9、CA15.3 和CA125，组织特异性抗原如例如碱性磷酸酶、肌红蛋白、CK-MB和降钙素，和肽激素。其它的目的分析物是粘多糖和多糖。

单表位配体分析物将一般具有大约100到2,000的分子量，更经常的是大约125到大约1,000的分子量。分析物包括药物（例如滥用药、治疗药等）、代谢物、农药、污染物等。举例但非限定地，代表性滥用药(包括误用药)包括：(i) 生物碱如吗啡生物碱，其包括吗啡、可待因、海洛因、右美沙芬、它们的衍生物和代谢物；可卡因生物碱，其包括可卡因和苄基芽子碱、它们的衍生物和代谢物；麦角生物碱，其包括麦角酸二乙酰胺；类固醇生物碱；iminazoyl生物碱、喹唑啉生物碱；异喹啉生物碱；喹啉生物碱，其包括奎宁和奎尼丁；二萜烯生物碱、它们的衍生物和代谢物；(ii)类固醇，其包括雌激素、雄激素、肾上腺皮质类固醇、胆汁酸、强心甙和苷元(cardiotonic glycosides and aglycones)，其包括地高辛和异羟基洋地黄毒苷、皂苷和皂苷配基、它们的衍生物和代谢物；类固醇模拟物如乙烯雌酚；(iii) 具有5到6个环成元的内酰胺，其包括巴比妥类，例如苯巴比妥和司可巴比妥、苯妥英、去氧苯巴比妥、乙琥胺以及它们的代谢物；(iv)具有2到3个碳原子的烷基链的氨基烷基苯，其包括安非他命；儿茶酚胺，其包括麻黄碱、左旋多巴、肾上腺素；那碎因；罂粟碱；以及上述物质的代谢物；(v)苯并杂环，其包括去甲羟基安定、氯丙嗪、卡巴咪嗪、它们的衍生物和代谢物，杂环为氮杂

、二氮杂

和吩噻嗪；(vi)嘌呤，其包括茶碱、咖啡因、它们的代谢物和衍生物；(vii) 衍生自大麻的药物，其包括大麻酚和四氢大麻酚；(viii)激素，例如甲状腺素、皮质醇、三碘甲状腺原氨酸、睾酮、雌二醇、雌酮、黄体酮；(ix)三环抗抑郁药，其包括丙咪嗪、去甲丙咪嗪、阿米普林、去甲普林、普罗普林、曲米帕明、氯米帕明、多虑平和去甲多虑平；和(x)抗肿瘤药，其包括甲氨蝶呤；等等。

利用本发明试剂进行分析物分析的一般描述

本发明的实施方案对用于测定分析物的分析有用。一般而言，在这样的分析中，试剂包含对于分析物的结合配偶体及其它。将怀疑含有分析物的样品在分析介质中与对于分析物的结合配偶体结合。测定由分析物和对于分析物的结合配偶体之间的结合程度构成。将根据本发明实施方案的化学发光试剂用作这一结合事件检测中的标记试剂。分析可以在分析组分或产物的任一种不分离（同质的）或分离（异质的）下进行。异质分析通常牵涉一个或多个分离步骤，并且可以是竞争性的或非竞争性的。

一些已知分析利用使用粒子化学发光试剂的信号产生系统（sps），其具有与支持体关联的金属螯合物并具有至少第一和第二sps成员。名称“第一”和“第二”是完全随意的，并且不意欲表明本发明方法中sps成员间的任何顺序或等级、或sps成员添加的任何顺序。sps成员可为有关的，这在于，sps的一个成员的活化产生如例如光的产物，其导致另一sps成员的活化。在已知分析的某些实施方案中，sps成员包含敏化剂和化学发光组合物，其中敏化剂的活化产生激活化学发光组合物的产物。第二sps成员通常产生与结合和/或未结合的sps成员的数量相关的可测定信号，即，与被检测的分析物或与反映待检测分析物的数量的试剂结合或未结合的sps成员数量。根据本发明，根据本发明实施方案并如上述所描述的非粒子化学发光试剂可以用于代替已知方法的粒子化学发光试剂。

在根据本发明实施方案的方法的某些实施方案中，第一sps成员是如例如光敏剂的敏化剂，并且第二sps成员是由于第一sps成员活化而活化的本发明实施方案的非粒子化学发光试剂。敏化剂可以是活化后产生产物的任何部分，所述产物激活化学发光试剂，这进而产生可检测信号。在许多实施方案中，敏化剂能够在活化后产生单线态氧。

在某些实施方案中，敏化剂是通常通过光的激发产生单线态氧的光敏剂。光敏剂可以是可光活化的（例如，染料和芳族化合物）或者化学活化的（例如，酶和金属盐）。当被光激发时，光敏剂通常是包含共价键合原子的化合物，其通常具有多个共轭双键或三键。该化合物应当吸收波长范围为大约200到大约1100nm、或大约300到大约1000nm、或大约450到大约950nm的光，其在激发波长处的最大吸收的消光系数为大于大约500M^-1 cm^-1、或至少大约5000M^-1 cm^-1、或至少大约50,000 M^-1 cm^-1。待被光激发的光敏剂将是相对光稳定的，并且将不与单线态氧有效地反应。几个结构特征存在于大多数有用的光敏剂中。大多数光敏剂具有至少一个、并常常是三个或更多个保持在刚性结构、通常为芳香结构中的共轭双键或三键。光敏剂通常包含至少一个加速系统内交叉的基团，例如羰基或亚胺基，或选自周期表中第3到6行的重原子，特别是碘或溴，或者它们可以具有扩展的芳香结构。典型的光敏剂包括丙酮、二苯酮、9-噻吨酮、曙红、9,10-二溴蒽、亚甲蓝、金属卟啉例如血卟啉、酞青、叶绿素、玫瑰红、巴基球等，以及具有1到50个原子的取代基的这些化合物的衍生物，所述取代基使这些化合物更亲脂或更亲水和/或作为用于吸附、例如与sps成员或sbp成员吸附的连接基团。

在上述方法中有用的光敏剂包括在被外部光源激活或不太优选地不被外部光源激活的情况下能够产生单线态氧的其它物质和组合物。因而，例如，钼酸盐和氯过氧化物酶和髓过氧化物酶加溴或氯离子(Kanofsky, J. Biol. Chem. (1983) 259 5596)已经显示出催化过氧化氢转变为单线态氧和水。同样包括在光敏剂范围中的是并非真正的敏化剂但在热、光激发或化学活化下会释放单线态氧分子的化合物。这类化合物的最知名成员包括内过氧化物，如1,4-二羧乙基-1,4-萘内过氧化物、9,10-二苯基蒽-9,10-内过氧化物和5,6,11,12-四苯基萘5,12-内过氧化物。这些化合物的加热或对光的直接吸收释放单线态氧。可以利用的其它光敏剂的例子是在美国专利号5,340,716和6,251,581中列出的那些，其相关公开内容在此引入作为参考。

在特定实施方案中，本发明在标题为“Assay Method Utilizing Photoactivated Chemiluminescent Label"的美国专利号5,340,716 (Ullman)中提及的诱导发光免疫分析("诱导发光分析")中有用，其公开内容在此引入作为参考。在根据本发明实施方案的一个方法中，分析使用掺入光敏剂的粒子和如上所述的非粒子化学发光试剂。本发明化学发光试剂的对于分析物的结合配偶体与分析物结合形成复合物，或者与第二sbp成员结合形成复合物，其与分析物的存在相关。如果分析物存在，光敏剂和化学发光化合物会紧密接近，所述接近是由于在光敏剂粒子上的对于分析物的结合配偶体、和作为根据本发明实施方案的非粒子化学发光试剂的一部分的对于分析物的结合配偶体与分析物的结合。光敏剂产生单线态氧并在两个标记紧密接近时激活非粒子化学发光试剂。激活的化学发光试剂随后产生光。产生的光的数量与形成的复合物的数量相关，形成的复合物的数量进而与存在的分析物的数量相关。

在诱导发光分析的某些实施方案中，使用与抗生物素蛋白偶联的光敏剂粒子。还使用对于分析物的生物素化结合配偶体。使用根据本发明实施方案的非粒子化学发光试剂作为检测系统的一部分。对反应介质进行温育以允许光敏剂粒子借助抗生物素蛋白与生物素之间的结合而结合于对于分析物的生物素化结合配偶体，并且也允许作为光敏剂试剂的一部分的对于分析物的结合配偶体与作为根据本发明实施方案的非粒子化学发光试剂的一部分的对于分析物的结合配偶体与分析物结合。然后，用光照射介质以激发能够在其激发态将氧活化为单线态的光敏剂。由于化学发光试剂现在借助分析物的存在而与光敏剂紧密接近，其被单线态氧激活并发射光。随后检查介质中发光或发射的光的存在和/或数量，其存在与分析物的存在和/或数量相关。

待分析的样品是怀疑含有分析物的样品。样品优选来自人或动物，并包含生物流体，例如全血、血清、血浆、痰、淋巴液、精液、阴道粘液、排泄物、尿、脊髓液、唾液、粪便、脑脊液、泪、粘液等；生物组织，例如毛发、皮肤、来自器官或其它身体部分的切片或切除组织等。在许多例子中，样品是全血、血浆或血清。

样品可以在任何方便的介质中制备。方便地，样品可以在分析介质中制备，其在本文更充分地进行论述。在某些例子中，可对样品进行预处理，如例如裂解血细胞等。这种预处理通常在不随后干扰分析的介质中进行。优选含水介质用于预处理。

如上文简要论述的，分析通常在中等pH的含水缓冲介质中进行，这通常提供最佳的分析灵敏度。含水介质可为单独的水或者可包括0.1%到大约40%体积的助溶剂。用于介质的pH将通常是大约4到大约11的范围、更通常是大约5到大约10的范围、并且优选是大约6.5到大约9.5的范围。pH将通常是在任何特异性结合对的结合成员的最佳结合、对于其它分析试剂如信号产生系统成员最佳的pH值等之间的折衷。可以使用各种缓冲液以实现期望的pH值并在测定中维持pH值。说明性缓冲液包括硼酸盐、磷酸盐、碳酸盐、tris、巴比妥、PIPES、HEPES、MES、ACES、MOPS、BICINE等。所使用的具体缓冲液并不重要，但在个别分析中可优选一种或另一种缓冲液。

上述方法中可以使用多种辅助物质。例如，除缓冲液外，介质还可包含对于介质或对于所用试剂的稳定剂。在某些实施方案中，除这些添加剂外，还可包括蛋白质如白蛋白、有机溶剂如甲酰胺、季铵盐、聚阴离子如硫酸葡聚糖、结合增强剂例如聚亚烷基二醇、多糖如葡聚糖、海藻糖等。介质还可包含用于防止血栓形成的试剂。这些试剂在本领域中是公知的，并且包括例如EDTA、EGTA、柠檬酸盐、肝素等。介质还可包含一种或多种本领域已知的防腐剂，如例如叠氮化钠、硫酸新霉素、PROCLIN^? 300、链霉素等。如果应用上述材料中的任一种，其以足以实现期望效果或功能的浓度或数量存在。

可将一个或多个温育期以一个或多个间隔应用于介质，包括上述提到的各种试剂的添加之间的任何间隔。介质通常在足以使试剂的各种成分发生结合的温度和时长下进行温育。一般使用中等温度进行本方法，并且在测量期间通常是恒温，优选室温。温育温度通常是大约5℃到大约99℃、通常是大约15℃到大约70℃、更通常是20℃到大约45℃。用于温育的时间段是大约0.2秒到大约24小时、或大约1秒到大约6小时、或大约2秒到大约1小时、或大约1到大约15分钟。时间段取决于介质的温度和各种试剂的结合速率，所述结合速率由缔合速率常数、浓度、结合常数和解离速率常数确定。测量期间的温度一般是大约10到大约50℃、或大约15到大约40℃的范围。

可被分析的分析物的浓度一般从大约10^-5到大约10^-17 M，更通常从大约10^-6到大约10^-14 M变化。考虑事项如分析是否是定性的、半定量或定量的（相对于样品中存在的分析物的数量）、具体检测技术以及分析物浓度通常决定各种试剂的浓度。

分析介质中各种试剂的浓度将一般由目的分析物的浓度范围、分析的性质等决定。然而，每种试剂的终浓度通常经验性地确定以便在该范围优化分析的灵敏度。也就是说，明显的分析物浓度变化应当提供可精确测量的信号差异。考虑事项如信号产生系统的性质以及分析物的性质一般决定各种试剂的浓度。

如上所述，样品和试剂在介质中联合提供。尽管向介质中的添加顺序可以变化，但对在此描述的分析形式的某些实施方案将存在一定的偏爱。最简单的添加顺序当然是将所有材料同时加入并测定分析介质对信号的影响，如在均质分析中。可选地，试剂中的每一种、或试剂组可以按顺序组合。在某些实施方案中，在如上所述的每次添加后可包含温育步骤。

如上所述，上述分析的实施方案使用粒子光敏剂试剂。该粒子可包含有机或无机的、固体或液体的水不溶性材料，其可为透明的或部分透明的。粒子一般具有至少大约0.02微米并且不大于大约100微米的平均直径。在某些实施方案中，粒子具有大约0.05微米到大约20微米、或大约0.3微米到大约10微米的平均直径。粒子可以是有机的或无机的、可膨胀的或不可膨胀的、多孔的或非多孔的，优选具有接近水的密度，一般是大约0.7 g/mL到大约 1.5 g/mL，并且包含可为透明的、部分透明的或不透明的材料。粒子可以是生物材料如细胞和微生物，例如红细胞、白细胞、淋巴细胞、杂交瘤、链球菌(streptococcus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(E. coli)、病毒等。粒子也可以是包含有机和无机聚合物、脂质体、乳胶粒子、磁性或非磁性粒子、磷脂囊泡、乳糜微粒、脂蛋白等的粒子。在某些实施方案中，粒子是铬粒子或乳胶粒子。

检查步骤

在分析方法的下一步骤中，检查介质中包含分析物和对于分析物的结合配偶体的复合物的存在。复合物的存在和/或数量指示样品中分析物的存在和/或数量。

短语“测量分析物的数量”指分析物的定量、半定量和定性测定。将定量、半定量和定性的方法、以及全部其它用于测定分析物的方法考虑为用于测量分析物的数量的方法。例如，将仅检测怀疑含有分析物的样品中分析物的存在或不存在的方法考虑为包括在本发明的范围内。术语“检测”和“测定”以及对于测量的其它普通同义词都在本发明的范围内预期。

在许多实施方案中，介质的检查牵涉从介质中检测信号，其中信号根据依照本发明实施方案的化学发光组合物的牵涉情况产生结果。信号的存在和/或数量与样品中分析物的存在和/或数量有关。检测的具体模式取决于sps的性质。如上面所论述的，存在众多下列方法，通过该方法，sps的标记能够产生可通过外部手段检测的信号。信号产生系统的激活取决于信号产生系统成员的性质。对于作为被光激活的敏化剂的sps成员，用光对该sps成员进行照射。鉴于本文的公开内容，对本领域技术人员暗示了其它激活方法。

在使用光敏剂时，光敏剂用于在含有上述反应物的介质被照射时激活化学发光试剂。将介质用具有足够能量的波长的光照射，以便将光敏剂转化成激发态并使其能够将分子氧活化为单线态氧。当与对于分析物的结合配偶体结合时，光敏剂浓度可能非常低，经常是大约10^-6到大约10^-12 M或更低。一般而言，对于牵涉光敏剂的上述实施方案，将介质用具有大约300到大约1200nm、或者大约450到大约950、或者大约550到大约800nm的波长的光照射。

照射期将取决于本发明化学发光试剂的实施方案的激活的化学发光组合物的寿命、和光强度以及期望的发射强度。对于短寿命的激活的化学发光组合物，该时期可以小于1秒，通常是大约是1毫秒，但当使用强闪光灯或激光时可以短如1微秒。对于较长寿命的激活的化学发光组合物，照射时期可以较长，并且可以使用强度较低的稳定光源。总之，照射期期间的积分光强度应当足以激发至少0.1%的光敏剂分子，优选至少30%，并且最优选每个光敏剂分子将被激发至少一次。

氦氖激光器是用于在632.6 nm处激发的便宜的光源。在这一波长吸收光的光敏剂与氦氖激光器的发射线相容，并且因此特别用于其中使用光敏剂的本发明方法中。其它光源包括，例如，其它激光器如氩、YAG、He/Cd和红宝石；光电二极管；汞、钠和氙蒸汽灯；白炽灯如钨和钨/卤素；以及闪光灯。

测量期间的温度一般是从大约10℃到大约70℃、或从大约20℃到大约45℃、或大约20℃到大约25℃的范围。在一种方法中，使用已知浓度的待筛选分析物制作标准曲线。如上面所论述的，也可使用校准器和其它控制器。

在上述方法中任一种中产生的发光或光可以通过目测、照相、光能测定、分光光度地或通过任何其它方便的手段测量，以测定其数量，该数量与介质中分析物的数量有关。对信号的存在和/或数量的检查也包括信号的检测，其通常仅是其中对信号进行阅读的步骤。信号一般应用仪器进行阅读，仪器的性质取决于信号的性质。所述仪器可以是分光光度计、荧光计、吸收分光计、发光计、化学发光计等。检测的信号的存在和数量与样品中分析物的存在和数量有关。

包含用于进行分析的试剂的试剂盒

本发明化学发光试剂和用于进行特定分析的其它试剂可呈现在试剂盒中，所述试剂盒用于方便地进行用于分析物的测定的分析。在某些实施方案中，试剂盒以包装联合物包含用于分析物偶联的生物素-结合配偶体、链霉亲和素-敏化剂粒子以及根据本发明实施方案的非粒子化学发光试剂，其中化学发光试剂的对于分析物的结合配偶体识别分析物上的表位并与其结合，所述表位不同于作为用于分析物偶联的生物素-结合配偶体的一部分的、对于分析物的结合配偶体。试剂盒可进一步包含用于进行分析的其它试剂，其性质取决于具体的分析形式。

试剂可以各自处于分开的容器中，或者多种试剂可以组合在一个或多个容器中，这取决于试剂的交叉反应性和稳定性。试剂盒可以进一步包括用于进行分析的其它分开包装的试剂，如额外的sbp成员、辅助试剂等。

试剂盒中的各种试剂的相对数量可以广泛变化，以提供基本上最佳化在本发明方法中需要发生的反应的试剂浓度，并且进一步基本上最佳化分析的灵敏度。在合适的情况下，试剂盒中的一种或多种试剂可以作为干粉提供，通常是冻干的，包括溶解后会提供具有用于实施根据本发明的方法或分析的合适浓度的试剂溶液的赋形剂。试剂盒可以进一步包含根据如上所述的本发明的方法的书面说明书。

本文使用的短语“至少”意味着指定项目的数目可等于或大于陈述的数目。本文使用的短语“大约”意味着陈述的数目可有加或减10%的差异；例如，“大约5”意味着4.5到5.5的范围。名称“第一”和“第二”仅用于在两个项目如例如“第一sps成员”和“第二sps成员”之间进行区分的目的，并不意味着是对一个项目相对于另一项目的任何次序或顺序或重要性的暗示。

下面的实施例通过举例说明但非限定的方式进一步描述了本发明的具体实施方案，并且意图对本发明的范围进行描述而非限定。除非另外指明，本文公开的份和百分数均是按体积计。

实施例

材料：

测试使用DIMENSION? RxL分析仪进行，其可从Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Newark DE得到。该仪器利用诱导发光免疫分析技术而使用并配有合适的读数器。

除非另外说明，试剂购自Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI)并且除非另外指明则按原样使用。BHHCT如Yuan J. and Matsumoto K. (Anal. Biochem. 1998, 70: 596-601)所描述地进行合成。抗TSH抗体单克隆抗体通过已知的体细胞杂交技术制备，例如参见K?hler and Milstein, Nature 265:495-497, 1975。

样品的纯度通过分析型薄层色谱法（TLC）分析，所述TLC在使用指定溶剂的Analtech Uniplate Silica Gel GF (0.25 mm)玻璃背板上进行。通过紫外光（短和/或长波长）和/或碘蒸汽可见TLC斑点。快速色谱在Whatman硅胶60 ? (230-400目)上进行。 ¹H-NMR谱记录在Bruker Ultrashiel^TM-400 (400 MHz)分光计上。化学位移以百万分率(ppm，δ)相对于作为内标的四甲基硅烷进行报告。应用的NMR缩写是：s（单峰），d（双峰），m（多重峰）和t（三重峰）。

化合物II的制备(图1)：将N-甲基苯胺(I) (25 g, 233.3 mmol) 和5-溴-戊酸乙酯(25 g, 119.6 mmol)加入100 ml圆底烧瓶中。将烧瓶的内容物在搅拌下于100℃加热16小时。使反应混合物冷却至室温并将其倒入乙酸乙酯(50 mL)中。将乙酸乙酯溶液用20%氢氧化钠洗涤(3×50 mL)；将合并的氢氧化钠溶液用乙酸乙酯(25 mL)反萃取（extracted back）一次，并将残余氢氧化钠水溶液弃去。将合并的乙酸乙酯萃取物用水(10 mL)洗涤，并在硫酸镁上干燥。将澄清（clear）的乙酸乙酯溶液在旋转蒸发器上浓缩至干燥。将这样获得的残渣油在高度真空(130-134℃, 0.5 mm Hg)下通过蒸馏纯化，得到21 g无色液体化合物II。¹H-NMR (CDCl₃) δ: 7.18 (m, 2H)，6.68 (m, 3 H)，4.2 (q, J = 8.0 Hz, 2H)，3.36 (t, J = 8.0 Hz, 2H)，2.92 (s, 3H)，2.33 (t, J = 8.0 Hz, 2H)，1.64 (m, 4H)，1.24 (t, J = 8.0 Hz, 3H)。

化合物III的制备(图1)：在0-4℃下，在10分钟期间内通过滴液漏斗向搅拌的N,N-二甲基甲酰胺(DMF; 8.8 g, 120 mmol)中逐滴加入三氯氧化磷(POCl₃; 5g, 33 mmol)。在0-4℃下10分钟后，以一份快速加入化合物II (3.7 g, 15.96 mmol)。用1 ml DMF漂洗用于化合物II的小瓶，并将DMF溶液加入搅拌的反应混合物中，所述反应混合物在100℃下在搅拌下加热1小时。使反应混合物冷却至室温，并将其缓慢倒入冰水混合物中。将水相用20%氢氧化钠中和并用乙酸乙酯萃取(3×50 mL)。将合并的乙酸乙酯溶液用水(20 mL)洗涤并在硫酸镁上干燥。将澄清的有机溶剂在减压下浓缩至干燥。将所得油性残渣通过应用乙酸乙酯/二氯甲烷(9/1; v/v)的快速柱色谱纯化，得到2.46 g化合物III。¹H-NMR (CDCl₃) δ: 9.72 (s, 1H)、7.18 (d, J = 8.0 Hz, 2H)、6.68 (d, J = 8.0 Hz, 2 H)、4.22 (q, J = 8.0 Hz, 2H)、3.40 (m, 2H)、3.05 (s, 3H)、2.35 (t, J = 8.0 Hz, 2H )、 1.65 (m, 4H)、1.25 (t, J = 8.0 Hz, 3H)。

化合物IV的制备(图1)：将氰化钾(1.0 g, 15.3 mmol) 加入化合物III (2.46 g, 9.34 mmol)在于氮气氛下搅拌的15 mL的60%乙醇中的溶液中。将混合物在回流下加热15分钟。在45分钟期间内将溶解在10 ml乙醇中的苯甲醛(1.05 g)加入回流的反应混合物中。15分钟后，将冷却的反应混合物倒入乙酸乙酯(30 mL)中。将水相分离并用乙酸乙酯反萃取(3×30 mL)。将合并的乙酸乙酯溶液在硫酸镁上干燥，并将澄清的溶液在减压下浓缩至干燥。将粗反应混合物溶解在10ml无水乙醇中，与0.25ml氯化三甲基硅烷混合并在室温下搅拌16小时。将反应混合物倒入饱和碳酸氢钠(120 mL)和二氯甲烷(30 mL)的混合物中。将水相分离并用二氯甲烷(2×30 mL)萃取。将合并的有机相用饱和碳酸氢钠(60 ml)洗涤并在硫酸镁上干燥。将澄清的有机溶剂在减压下浓缩至干燥。将油性残渣通过使用乙酸乙酯/己烷 (1/5; v/v)的快速柱色谱纯化，得到196 mg化合物 IV。¹H-NMR (CDCl₃) δ: 7.84 (d, J = 8 Hz, 2H)、7.34 (m, 5H)、6.54 (d, J = 8 Hz, 2H)、5.86 (d, J = 4 Hz, 1H)、4.86 (d, J = 4 Hz, 1H)、4.14 (q, J = 8.0 Hz, 2H)、3.38 (t, J = 8.0 Hz, 2H)、3.00 (s, 3H)、2.34 (t, J = 8.0 Hz, 2H )、1.64 (m, 4H)、1.25 (t, J = 8.0 Hz, 3H)。

化合物V的制备(图1)：将化合物IV(176 mg, 0.476 mmol)在8 mL无水甲苯中的搅拌溶液与硫代乙醇(0.28 ml, 312 mg, 4.0 mmol)和氯化三甲基硅烷(0.51 mL, 436 mg, 4.0 mmol)混合。回流下加热24小时后，在氮气下将冷却的反应混合物倒入饱和碳酸氢钠(15 mL)中。分离有机相并用饱和碳酸氢钠(10 mL)洗涤。将合并的水相用二氯甲烷(3×30 mL)反萃取，并将二氯甲烷萃取物用水(20 mL)洗涤。将合并的二氯甲烷溶液在硫酸镁上干燥、过滤并浓缩至干燥。将油性残渣通过使用乙酸乙酯/二氯甲烷(5/95; v/v)的制备型薄层色谱进行纯化，得到93 mg化合物V。¹H-NMR (CDCl₃) δ: 7.20-7.04 (m, 7H)，6.50 (d, J = 8.0 Hz, 2 H)，4.48 (m, 2H)，4.12 (q, J = 8.0 Hz, 2H)，3.28 (m, 2H)，3.20 (m, 2H)，2.87 (s, 3H)，2.32 (t, J = 8.0 Hz, 2H )，1.60 (m, 4H)，1.25 (t, J = 8.0 Hz, 3H)。

化合物VI的制备(图1)：将氢氧化钠(30 mg, 0.75 mmol)加入化合物V (28 mg, 0.068 mmol)的MeOH(1mL)-THF(2ml)-水(0.5mL)搅拌溶液中。当TLC分析物显示不存在任何起始产物时，将反应混合物在室温下搅拌4小时。将反应混合物与1.5mL水混合，并通过缓慢加入1 N盐酸将pH值调整到3.0。将反应混合物在真空下蒸发至干燥。将油性残渣溶解在二氯甲烷(50 ml)中并用10 mL水洗涤。将澄清的有机溶液在硫酸镁上干燥，过滤并浓缩至干燥，得到23.6 mg化合物 VI。FAB-MS (负模式(negative mode)) m/z: 382 [(M-H)^-, 100)；¹H-NMR (CD₃OD) δ: 7.15-7.09 (m, 7H)，6.81 (d, J = 8.0 Hz, 2 H)，4.47 (m, 2H), 3.35 (m, 2H)，3.22 (m, 2H)，2.97 (s, 3H)，2.31 (t, J = 8.0 Hz, 2H)，1.58 (m, 4H)。

BSA-偶联的二甲基噻吩羧酸酯的合成：将二甲基噻吩羧酸酯VI (12.2 mg; 32 mmol)溶解在0.5 mL的DMF中。将混合物与0.1 mL N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) (16 mg; 140 mmol)的DMF 溶液和0.1 mL 二环己基碳二亚胺(16 mg; 79 mmol)的DMF溶液混合。在环境温度下搅拌16小时后，将有机反应混合物缓慢加入牛血清白蛋白（BSA）(55 mg; 0.82 mmol)在pH值7.60的100 mM 磷酸钠-0.2 mM 三氯化铕中的5 mL 溶液中。4小时后，通过离心将沉淀的固体分离并弃去。使澄清的溶液经过Sephadex G25 柱 (2.6×30 cm)，其用pH值8.20的100 mM碳酸氢钠-0.2 mM三氯化铕平衡和洗脱。将含蛋白质级分合并。计算如此得到的BSA-二甲基噻吩，其每摩尔蛋白质掺入31个二甲基噻吩残基，其中利用330 nm处的消光系数1.33×10⁴ mole^-1 cm^-1。

活化BSA-二甲基噻吩的制备：将12 mL的BSA-二甲基噻吩 (2 mg/mL 蛋白质; 0.36 mmol)溶液与1.2 mL的10 mg/mL的sulfoSMPB (磺基琥珀酰亚胺基[4-[-马来酰亚胺基苯基]丁酸盐])；26.2 mmol)溶液混合。在环境温度下3小时后，将蛋白溶液经过Sephadex G25柱(2.6×30 cm)从过量试剂中分离，所述柱用pH值6.0的100 mM碳酸氢钠-200 μM三氯化铕平衡和洗脱。

IgG-BSA-二甲基噻吩的制备：来自上文的活化的BSA-二甲基噻吩与还原抗体的偶联是通过将3.0 mL的抗-TSH抗体（在上述偶联物中称为“IgG”）溶液与0.33 mL的的二硫苏糖醇在100 mM 磷酸钠-5.0 mM EDTA、pH值6.0中的100 mM溶液混合进行的。在37℃加热1小时后，将蛋白溶液经过Sephadex G25柱 (1.6×30 cm)，其用100 mM 磷酸钠-200 μM 三氯化铕、pH值 6.0平衡和洗脱。计算还原抗体，其每摩尔蛋白包含7.2摩尔游离巯基。将含有19mg蛋白质(136 μmoles)的这种还原抗体的7.3 mL溶液与含有31 mg蛋白(463 μmoles)的28 mL活化 BSA-二甲基噻吩混合，并在将pH值调整到7.0后将反应混合物浓缩至3 mL。在4℃下16小时以后，将反应混合物用50 μL的20 mg/mL的N-乙基马来酰亚胺水溶液猝灭。随后将蛋白质溶液经过AcA-34柱(1.6×70 cm)经凝胶过滤纯化，所述柱用50 mM Hepes-300 mM NaCl-0.2% 聚乙二醇 (PEG8000)-0.2 mM三氯化铕、pH 8.0平衡和洗脱。将对应于从柱中洗脱的第一蛋白质峰的级分汇合，并在存在0.25 mg/mL硫酸新霉素下贮存。

IgG-BSA-二甲基噻吩与BHHCT的反应：将5 mL来自上文的包含大约1 mg/mL蛋白质的IgG-BSA-二甲基噻吩溶液与0.5 mL 包含4.5 mg BHHCT的 BHHCT的DMF 溶液混合。在环境温度下振荡反应混合物16小时，并在3000 rpm下离心10分钟，并使澄清的溶液经过Sephadex G50 柱(2.6×30 cm)，所述柱用50 mM Hepes-300 mM NaCl-0.2%聚乙二醇 (PEG8000)-0.2 mM三氯化铕、pH 8.0平衡和洗脱。将包含蛋白质的级分汇合，并在存在0.25 mg/mL硫酸新霉素下贮存以得到IgG-BSA-(二甲基噻吩) (BHHCT)。

利用IgG-BSA-(二甲基噻吩)(BHHCT)的分析：将来自上文的IgG-BSA-(二甲基噻吩)-(BHHCT)在包含0.2% PEG8000、2mg/mL BSA、50 μM EuCl₃、1μM DPP、 0.15% PROCLIN300? 和0.2mg/mL硫酸新霉素的 50mM HEPES缓冲液中1:100稀释。以这种方式，上面试剂的BHHCT在原位形成Eu(BHHCT)₂DPP。将Dimension Vista? TSH FLEX? (Cat No. K6412, Lot 06229AB)的孔5-8 的内容物移去，并用去离子水漂洗孔并重新填充以上面得到的稀释试剂 (IgG-BSA-(二甲基噻吩)-(Eu(BHHCT)₂DPP)。使包含生物素化的抗-TSH抗体(R1, 孔1-4)和链霉亲和素Sensibeads (光敏剂珠) (R3, 孔9-12)的孔保持不变。将6-水平LOCI? 1校准器(Cat No. KC660, Lot 6BD036)在VISTA?上使用这一FLEX?和VISTA? TSH 方法参数(VISTA? Software 2.0)测试。校准曲线如图2所示，其中千数(kcounts)是千计数(kilocounts)并且TSH是促甲状腺素。LOCI?信号中的分离在水平B和A之间是2.2倍，并且在水平F和A之间是101倍。N = 3运行内(within-run) %CV对于校准器B到F的范围是1.1%到6.3%。结果如图3所示。

将带有1:100稀释的(IgG-BSA-(二甲基噻吩)-(Eu(BHHCT)₂DPP)的FLEX?储存于2-8℃并使用 LOCI? 1校准器进行周期性测试。在16天期间内，对于所有非零校准器(B至F)的LOCI?信号均在第0天值的10%以内。结果显示在图4和图5中。

在本说明书中引用的所有出版物和专利申请都通过引用并入本文，如同每一单个出版物或专利申请被明确和单独地指明通过引用并入一样。

尽管为了清楚理解的目的，前述发明已通过说明和举例方式进行了某些细节的描述，然而对本领域普通技术人员而言，显而易见的是，鉴于本发明的教导，可对本发明进行某些改变和修改而不背离所附权利要求书的精神或范围。此外，为了说明目的，前面的描述使用了具体的命名以便提供对本发明的彻底理解。然而，对本领域技术人员而言，显而易见的是，这些具体的细节并不是实现本发明所必需的。因此，前面对本发明具体实施方案的描述是为了阐述和说明的目的呈现的；它们不意图是穷尽性的或将本发明限制为公开的精确形式。各种修改和改变鉴于上述教导是可能的。对实施方案进行选择和描述，以便解释本发明的原理和它们的实际应用，以及从而使其它本领域技术人员能够利用本发明。

Claims

1.化学发光试剂，其用于测定怀疑含有分析物的样品中所述分析物的存在和/或数量，所述试剂是非粒子的、并且包含对于所述分析物的结合配偶体和化学发光组合物，所述化学发光组合物包含烯烃化合物和金属螯合物。

2.根据权利要求1的化学发光试剂，其中所述对于分析物的结合配偶体通过键或连接基团与所述化学发光组合物共价结合。

3.根据权利要求2的化学发光试剂，其中所述对于分析物的结合配偶体通过连接基团与所述化学发光组合物共价结合，并且其中所述连接基团包含亲水性高分子。

4.根据权利要求3的化学发光试剂，其中所述烯烃化合物和所述金属螯合物与所述对于分析物的结合配偶体共价结合的所述连接基团的同一分子连接。

5.根据权利要求3的化学发光试剂，其中所述烯烃化合物和所述金属螯合物与所述对于分析物的结合配偶体共价结合的所述连接基团的分开分子连接，并且其中所述连接基团可以是相同的或不同的。

6.根据权利要求3的化学发光试剂，其中所述亲水性高分子选自多肽、树枝状大分子、聚羧酸酯、聚胺、聚巯基和聚乙二醇。

7.根据权利要求1的化学发光试剂，其中所述对于分析物的结合配偶体通过特异性结合对与所述化学发光组合物非共价结合，其中所述特异性结合对的一个成员与所述对于分析物的结合配偶体连接，并且所述特异性结合对的另一个成员通过键或连接基团与所述化学发光组合物连接。

8.根据权利要求7的化学发光试剂，其中所述对于分析物的结合配偶体通过特异性结合对与所述化学发光组合物非共价结合，其中所述特异性结合对的一个成员与所述对于分析物的结合配偶体连接，并且所述特异性结合对的另一个成员通过连接基团与所述化学发光组合物连接，其中所述连接基团是蛋白质。

9.根据权利要求8的化学发光试剂，其中所述烯烃化合物和所述金属螯合物与所述对于分析物的结合配偶体非共价结合的所述连接基团的同一分子连接。

10.根据权利要求8的化学发光试剂，其中所述烯烃化合物和所述金属螯合物与所述对于分析物的结合配偶体非共价结合的所述连接基团的分开分子连接，并且其中所述连接基团可以是相同的或不同的。

11.根据权利要求1的化学发光试剂，其中所述亲水性高分子是蛋白质。

12.根据权利要求7的化学发光试剂，其中所述特异性结合对选自：(i)小分子和对于所述小分子的结合配偶体，以及 (ii)大分子和对于所述大分子的结合配偶体。

13.根据权利要求1的化学发光试剂，其中所述金属螯合物的金属是稀土金属或VIII族金属。

14.根据权利要求1的化学发光试剂，其中所述金属选自铕、铽、镝、钐、锇和钌。

15.根据权利要求1的化学发光试剂，其中所述金属螯合物包含选自下列的螯合剂：NHA、BHHT、BHHCT、DPP、TTA、NPPTA、NTA、TOPO、TPPO、BFTA、2,2-二甲基-4-全氟丁酰-3-丁酮 (fod)、2,2’-联吡啶(bpy)、联吡啶基羧酸、氮杂冠醚、氮杂穴状配体和三辛基氧化膦以及它们的衍生物。

16.根据权利要求1的化学发光试剂，其中所述烯烃化合物选自二甲基噻吩、二氧杂环己烯、烯醇醚、烯胺、9-亚烷基苍耳烷、9-亚烷基-N-9,10二氢化吖啶、芳基乙醚烯、芳基咪唑和光泽精以及它们的衍生物。

17.根据权利要求1的化学发光试剂，其中所述金属是铕，所述螯合剂是BHHCT，并且所述烯烃化合物是二甲基噻吩的羧基衍生物。

18.用于测定怀疑含有分析物的样品中所述分析物的存在和/或数量的方法，所述方法包括：

(a) 在介质中以联合物方式提供：

(i) 样品，

(ii) 化学发光试剂，所述试剂是非粒子的、并且包含与化学发光组合物连接的对于分析物的结合配偶体，所述化学发光组合物包含金属螯合物和烯烃化合物，和

(iii) 能够产生单线态氧的敏化剂试剂，

(b) 对所述联合物实施用于使所述分析物与对于所述分析物的特异性结合对成员结合的条件，以及

(c) 激活所述敏化剂并检测由所述化学发光组合物产生的发光的数量，所述发光的数量与所述样品中所述分析物的数量有关。

19.根据权利要求18的方法，其中所述对于分析物的结合配偶体通过连接基团与所述化学发光组合物共价结合，并且其中所述连接基团包含亲水性高分子。

20.根据权利要求18的方法，其中所述对于分析物的结合配偶体通过特异性结合对与所述化学发光组合物非共价结合，其中所述特异性结合对的一个成员与所述对于分析物的结合配偶体连接，并且所述特异性结合对的另一个成员通过连接基团与所述化学发光组合物连接，其中所述连接基团包含亲水性高分子。

21.根据权利要求18的方法，其中所述对于分析物的结合配偶体与所述敏化剂试剂相关联并且所述敏化剂试剂包含粒子。