JP4134304B2 - ラベル剤およびそれを用いた高感度分析方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラベル剤およびそれを用いた高感度分析方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
生体成分を高感度に分析するために、通常の蛍光性化合物でラベルし、その蛍光測定により分析することが知られている。しかし、かかる通常の蛍光性化合物はバックグラウンド蛍光が大きく、環境中のエストロゲン等の微量成分を高感度に測定するにはさらにバックグラウンド蛍光を除き十分な検出限界を確保する必要がある。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規なEu(3+)イオンと蛍光性の錯体を形成するラベル剤と、該ラベル剤を用いた高感度分析方法を提供する。特に環境中のエストロゲンを高感度で分析する方法を提供する。
【0004】
【課題を解決するための手段】
本発明者は従来の蛍光性化合物の有する問題点を解決すべく鋭意研究した結果、新規な構造を有するラベル剤を見出した。このラベル剤は分析目的物に共有結合して安定に標識することが可能であり、通常のカラムクロマトグラフにより分離精製することができる。さらに、分離された標識された目的物はEuイオンと反応して安定な蛍光性錯体を形成し、得られる錯体の時間分解蛍光測定により、低バックグラウンドの十分な検出限界を有する高感度分析が可能とする。
【0005】
すなわち、本発明にかかる新規なラベル剤は、環境中のエストロゲン等と反応して共有結合を形成する官能基を有する。さらに、Euイオンと安定な蛍光性錯体を形成するためのフッ素置換アルキル基とビフェニル基を有するβ−ジケトン骨格を有する配位子構造を有するものである。
【0006】
より詳しくは、本発明にかかる新規なラベル剤は、式(I)により表される構造を有する。
【化4】
【0007】
また、本発明は、上で説明した本発明にかかるラベル剤を用いた目的物の高感度分析方法を提供するものである。すなわち、目的物をラベル剤反応させて標識し、標識された前記目的物をクロマトグラフにより分離し、前記分離された目的物にEuイオンを反応させてEuイオン錯体を形成し、前記Euイオン錯体の濃度を時間分解蛍光検出法により分析することを特徴とする前記目的物の高感度分析方法を提供するものである。
【0008】
さらに、本発明は、前記ラベル剤が、特に式(I)または式(II)により表されるラベル剤であることを特徴とする高感度分析方法をも提供するものである。
【化5】
【化6】
【0009】
さらに、本発明は、前記Euイオン錯体を、Eu(3+)塩とトリ−n−オクチルホスフィンオキシドとから形成することを特徴とする高感度分析方法をも提供するものである。
また、本発明は、特に前記目的物が、環境中のエストロゲンであることを特徴とする高感度分析方法をも提供するものである。
以下、本発明を実施の形態に即して詳細に説明する。
【0010】
【発明の実施の形態】
ラベル剤
本発明にかかるラベル剤は、分析目的物に共有結合して安定に標識することを可能とし、通常のカラムクロマトグラフによる良好な分離を可能とする機能と、分離された標識された目的物はEuイオンと反応して安定な蛍光性錯体を形成し、得られる錯体の時間分解蛍光測定により、低バックグラウンドの十分な検出限界を有する高感度分析が可能とする。
【0011】
すなわち、本発明にかかる新規なラベル剤は、標識される目的物(例えば環境中のエストロゲン等)と反応して共有結合を形成する官能基を有する。かかる官能基としては、目的物が有する置換基により種々選択することが可能である。エストロゲンのような水酸基を有する目的物の場合、SO2Cl基のような基が特に好ましい。以下説明する本発明のラベル剤が芳香環を有するものであるからかかるSO2Cl基の導入はHSO3Clと反応させることにより容易である。
【0012】
さらに、本発明においては、Euイオンと安定な錯体を形成し、かつその錯体が十分な蛍光強度および寿命を有するものとするために、フッ素置換アルキル基(CnF2n+1、nは2〜5の整数)とビフェニル基を有するβ−ジケトン骨格を有する配位子構造を有するものが好ましい。より詳しくは、本発明にかかる新規なラベル剤は、式(I)または(II)により表される構造を有する。式(II)で示す構造は、式(I)で示すEuイオンへのβ−ジケトン配位子を1分子中に2個有する構造である。
【化7】
【化8】
【0013】
式(I)に示す構造のラベル剤は、他の配位子、例えばトリフェニルホスフィンオキシドとともにEuイオンと式(III)に示すような蛍光性錯体を形成する(nが2の場合を示した)。一方、式(II)で示すラベル剤はその分子中で」Euイオンと錯体を形成する(図示せず)。
【0014】
【化9】
【0015】
高感度分析方法
本発明にかかる高感度分析方法は、上で説明した本発明にかかるラベル剤を用いることを特徴とするものである。また、目的物に該ラベル剤を反応させて標識し、カラムクロマトグラフで分離精製した後、分離した標識目的物にEuイオンを反応させて蛍光性錯体とし、得られる錯体の蛍光強度を時間分解蛍光測定で分析することを特徴とする。Euイオン錯体の時間分解蛍光測定の測定データを、あらかじめ標準物を用いて作成した検量線を利用することにより、各目的物の濃度を分析することが可能となる。
【0016】
具体的には、本発明を用いる目的物の高感度分析方法は、(1)目的物を前記ラベル剤と反応させて標識するステップと、(2)該標識された前記目的物をクロマトグラフにより分離するステップと、(3)前記分離された目的物にEuイオンを(または他の配位子とともに)反応させてEuイオン錯体を形成するステップと、(4)前記Euイオン錯体の濃度を時間分解蛍光検出法により測定して目的物の濃度を分析するステップからなる。また、ステップ(4)では、標準目的物を用いた検量線をあらかじめ作成するステップをも含む。特に、式(I)のラベル剤を用いる場合、前記他の配位子としてトリ−n−オクチルホスフィンオキシドを用いることが好ましい。
【0017】
かかる分析方法を用いる目的物としては、特に制限はないが、本発明は、環境中のエストロゲン(またはその混合物)の各成分を高感度に分析可能とする。
また、ラベル剤との反応は温和な条件で攪拌するのみで十分安定な標識が可能である。必要ならば適当な時間加温して反応を促進完了させることが好ましい。
【0018】
標識された目的物を分離精製する手段についても特に制限はないが、通常公知のクロマトグラフであって、迅速にかつ再現性よく高い分離性能を得る条件を選択することは当業者にとって容易である。具体的には実施例で使用したような逆相型の充填剤カラムを用いた高速液体クロマトグラフの使用が好ましい。目的物の性質や他の成分の種類や量により条件を適宜選択することも容易である。
【0019】
分離した標識された目的物は単離することなく、クロマトグラフから出てきた溶液にポストカラム条件でEuイオンを含む溶液と混合して反応させて安定な蛍光性錯体を含む溶液とすることが可能である。
【0020】
蛍光性錯体を含む溶液の吸収測定、蛍光測定、時間分解蛍光測定の方法または装置については特に制限されず、公知の装置がそのまま、または必要な改変を行って使用することができる。励起光波長、検出波長、ゲート時間等の設定については当業者が容易に最適化することができる。
【0021】
目的物の濃度を測定するためには、濃度既知の標準物を用いて、同様の方法でラベル剤と反応させ、またEuイオンと蛍光性錯体を調整することにより容易に検量線を作成することができる。標準物の濃度を変えて測定することにより検出限界値を求めることも容易である。
以下、本発明を、実施例に基づいてさらに詳細に説明する。
【0022】
【実施例】
実施例1
4,4′−bis(1″,1″,1″,2″,2″,3″,3″−heptafluoro-4″,6″−hexanedione−6″−yl)−chlorosulfo-o-terphenyl(以下BHHCTとする)の合成:
J.Yuan,K.Matsumoto,H.Kimura,Anal.Chem.,70,596(1998)に従って合成した。
元素分析:
計算値C30H17F14O7ClS(BHHCT(H2O)とした):C 43.78; H 2.08、実測値:C 43.96; H 2.10.
1H NMR (270 MHz, acetone-d6 r.t.) δ 8.34, 8.33, 8.31, 8.30(1H),8.24,8.23(1H),8.16,8.13(4H),8.00,7.98(1H),7.57, 7.56, 7.54, 7.53(4H),7.02(2H).
【0023】
実施例2
5−(4″−chlorosulfo−1′,1″−diphenyl−4′−yl)−1,1,1,2,2−pentafluoro−3,5−pentanedione(以下CDPPとする)の合成(図1):
(1) 5−(1′,1″−diphenyl−4′−yl)−1,1,1,2,2−pentafluoro−3,5−pentanedione(DPP)の合成:
無水ジエチルエーテル70ml、ナトリウムメトキシド(3.0g, 55mmol)、およびペンタフルオロプロピオン酸エチル(東京化成、3.80g、20mmol) に4′−フェニルアセトフェノン(Merck、3.881g, 20mmol) を加え24時間攪拌した。減圧濃縮によりジエチルエーテルを除去した後、15%硫酸水溶液を100ml加えて中和し、沈殿をろ過、純水で洗浄した。100mlのエタノールから再結晶を1回行い、得られた固体を48時間真空乾燥してDPPを得た(収量 2.88g、収率 42.4%)。
元素分析:
計算値C17H11F5O2 : C, 59.65; H, 3.24、実測値: C, 60.82; H, 3.29.
1H NMR (270 MHz, acetone-d6 r.t.) δ 8.27 (m, 2H, Ha) ; 7.92 (m, 2H, Hb) ; 7.79 (m, 2H, Hc) ; 7.56-7.44 (m, 3H, Hd and He) ; 7.07 (s, 1H, Hα).
(2) 5-(4″−chlorosulfo−1′,1″−diphenyl−4′−yl)−1,1,1,2,2−pentafluoro−3,5−pentanedione(CDPP)の合成:
クロロ硫酸12.5gにDPP2.50g(7.30mmol)を加え常温にて7時間攪拌した後、攪拌下の200ml H2O(氷浴中)に反応溶液を滴下した。生成する沈殿を遠心分離し、冷水で洗浄した。吸引ろ過後、得られた固体を48時間真空乾燥してCDPPを得た(収量 2.46g、収率 73.2%)。
元素分析:
計算値C17H11F5O4.5SCl (CDPP・0.5 H2Oとした): C, 45.40; H, 2.46、実測値: C, 45.33; H, 2.01.
1H NMR ( 270 MHz, acetone-d6 r.t.) δ 8.35 (m, 2H, Ha) ; 8.28 (m, 2H, Hb) ; 8.20 (m, 2H, Hc) ; 8.06 (m, 2H, Hd) ; 7.12 (s, 1H, Hα).
【0024】
実施例3 エストロゲンの標識化反応
用いたBHHCT、CDPPおよび3種類のエストロゲンであるエストリオール(E3)、エストラジオール(E2)、エストロン(E1)の構造を図2に示した。
(1)測定対象物質
エストロゲンのフェノール性水酸基とBHHCTもしくはCDPP中のクロロスルホニル基との反応でエストロゲンの標識化を行なった(図3)。
(2)エストロゲン標準溶液の調製
estriol (和光純薬、2.8mg, 10μmol)、estradiol (和光純薬、2.8mg, 10μmol)、estrone (ナカライテスク、2.7mg, 10μmol)、CDPP (45.0mg, 100μmol) をジメチルアセトアミド(DMA)400μlに溶解し、トリエチルアミン100μl を加え、室温で2時間攪拌した後、アセトニトリルで10mlに定容した。BHHCT(80.0mg, 100μmol)についても同様の操作を行い標識化した。
【0025】
実施例4 エストロゲンの分離分析
HPLC条件:
移動相溶液としてトリフルオロ酢酸(関東化学)、アセトニトリル(関東化学,HPLC用)を、ポストカラム溶液として酢酸ユウロピウム(III)四水和物(和光純薬),トリ−n−オクチルホスフィンオキシド(MERCK)、ポリエチレングリコール モノ−4−オクチルフェニルエーテル(Triton-X-100, 東京化成)を用いた。
試料は上記(2)で調整した標準溶液をアセトニトリルにて希釈して用いた。
図4に実験で用いたポストカラム法による分離システムの概略を示した。
【0026】
実施例5
(1)蛍光スペクトルおよび蛍光寿命の測定
1μM(CDPP)、5μM(Eu3+)、10μM(TOPO)、0.1% Triton-X-100を含む20%アセトニトリルTris-HCl緩衝溶液(pH=8.0)の蛍光スペクトルをF-4500 (HITACHI)、蛍光寿命をLS 50B(PERKIN ELMER)にて測定した。BHHCTについても同様の操作を行った(図5)。
CDPP標識蛍光性錯体のλex.max は345nmと613nmであり、蛍光寿命は664μsであった。また、BHHCT標識蛍光性錯体のλex.max は342nmと613nmであり、蛍光寿命は722μsであった。
(2)吸収スペクトルおよび吸光度の測定
15μM(CDPP)、および16μM(BHHCT)のアセトニトリル溶液の吸収スペクトルをV-570(JASCO)にて測定した。
CDPP標識蛍光性錯体のλmax は343nm(ε350 :22000)、BHHCT標識蛍光性錯体のλex.max は340nm(ε350 :34000)であった。
CDPPおよびBHHCTで標識したエストロゲンは、エストリオール、エストラジオール、エストロンの順に検出された。また、得られたCDPPならびにBHHCTで標識したエストロゲンの検出限界(S/N=3)は表1、2に示した。
【0027】
【表1】
【0028】
【表2】
【0029】
5pmolから500pmolにおけるUV、TRFDの検量線をそれぞれ図6〜9に示した。CDPPで標識したエストロゲンとBHHCTで標識したエストロゲンのTRFDによるクロマトグラムを図10、11に示す。
各種エストロゲンを個別に標識して得られたクロマトグラムについて、UVおよびTRFDの測定結果を図12〜19に示した。
【0030】
この結果から、CDPPで標識したエストロゲンも、BHHCTで標識したエストロゲンよりもTRFDでの検出限界は良好であり、また検量線の傾きも十分大きい(特にCDPPが大きい)ため、エストロゲンはCDPPを用いるとより高感度に測定できる。
CDPPとBHHCTの蛍光スペクトルを比較するとBHHCTのほうが蛍光強度は強い。しかしHPLCへ応用すると、BHHCTで標識したエストロゲンの保持時間はCDPPで標識したエストロゲンの2倍であるためピークは広がった。BHHCTで標識したエストロゲンの保持時間を短くするために、移動相中に含まれるアセトニトリルの割合や流速を増やすとTRFDでの蛍光強度は小さくなった。CDPPについても同様のことが言え、TRFDでの蛍光強度はHPLCシステムにおける水とアセトニトリルの割合に大きく依存していた。
【0031】
本発明により、HPLCにおける分離能からはCDPPのほうがBHHCTよりもより最適であるとされたが、ユウロピウムとCDPPの錯形成反応時間や温度などについてさらに最適化することによりより高感度な検出が行えるシステムへ改良することは当業者にとって容易である。従って、本発明にかかる方法を用いることで、河川水などの環境中に含まれるエストロゲンの定量が行える。
【0032】
【発明の効果】
本発明にかかる新規なラベル剤は共有結合を形成する官能基を有することから、環境中のエストロゲン等の目的物を容易に標識することができる。また、フッ素置換アルキル基とビフェニル基を有するβ−ジケトン骨格を有する配位子構造を有することから、Euイオンと安定な長寿命の蛍光性錯体を形成することができる。従って、新規なラベル剤により標識された目的物を、カラムクロマトグラフで分離精製し、その後にEuイオンで蛍光性錯体を形成させ、得られた蛍光錯体の時間分解蛍光測定を行うことにより、目的物を低バックグラウンドで高感度に分析することができる。特に前記目的物が、環境中のエストロゲンである場合、これらの微量成分を十分高感度(十分な検出限界)で分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明にかかるCDPPの合成経路を示す図である。
【図2】本発明にかかるCDPP、BHHCTおよびエストロゲンの構造を示す図である。
【図3】本発明にかかるCDPPにより目的物を標識する反応を示す図である。
【図4】本発明にかかる高感度分析方法の一態様を示す図である。
【図5】CDPPおよびBHHCTの蛍光スペクトルを示す図である。
【図6】CDPPエストロゲンの検量線(UV)を示す図である。
【図7】CDPPエストロゲンの検量線(TRFD)を示す図である。
【図8】BHHCTエストロゲンの検量線(UV)を示す図である。
【図9】BHHCTエストロゲンの検量線(TRFD)を示す図である。
【図10】CDPPエストロゲンのクロマトグラム(TRFD)を示す図である。
【図11】BHHCTエストロゲンのクロマトグラム(TRFD)を示す図である。
【図12】CDPPのクロマトグラム(UV)を示す図である。
【図13】CDPP−estriolのクロマトグラム(UV)を示す図である。
【図14】CDPP−estradiolのクロマトグラム(UV)を示す図である。
【図15】CDPP−estroneのクロマトグラム(UV)を示す図である。
【図16】CDPPのクロマトグラム(TRDF)を示す図である。
【図17】CDPP−estriolのクロマトグラム(TRDF)を示す図である。
【図18】CDPP−estradiolのクロマトグラム(TRDF)を示す図である。
【図19】CDPP−estroneのクロマトグラム(TRDF)を示す図である。
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