CN105906643A - 一种近红外gsh荧光探针的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种近红外GSH荧光探针的制备方法和应用，该荧光探针的结构式为：。一方面，用费舍尔氏醛来增加罗丹明的波长，使波长延长到750 nm；另一方面，利用分析物的SH与探针的醛基之间发生加成‑水解反应，实现GSH与Cys、Hcy的区分。这是第一个基于罗丹明衍生物的能将GSH与Cys及Hcy高效区分的近红外荧光探针，该探针对GSH表现出很高的灵敏度。而且，当pH值在6.0到8.0之间时，不影响荧光探针对GSH的测定，该荧光探针与GSH响应迅速，且该探针不受其他生物硫醇（Cys，Hcy）以及其它19种氨基酸的干扰，表现出很好的选择性。最重要的是，该探针还可以应用于生物成像，检测细胞内及组织中的GSH。

Description

一种近红外GSH荧光探针的制备方法和应用
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种近红外GSH荧光探针的制备方法和应用。
背景技术
谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)以及同型半胱氨酸(Hcy)统称为生物硫醇，它们在许多生理和病理过程中都发挥着重要的作用(文献1:Shang,L.；Qin,C.J.；Wang,T.；Wang,M.；Wang,L.X.；Dong,S.J.J.Phys.Chem.C.2007,111,13414-13417.)。在细胞内，GSH是这三者中含量最丰富的，含量为1.0-15mM(文献2:Hassan,S.S.M.；Rechnitz,G.A.Anal.Chem.1982,54,1972-1976.)。研究表明，谷胱甘肽的水平异常与许多疾病有关，包括癌症，肝损伤，艾滋病，老年痴呆症，以及疾病所造成的老化(文献3:Estrela,J.M.；Ortega,A.；Obrador,E.Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.2006,43,143-181.文献4:Herzenberg,L.A.；De Rosa,S.C.；Dubs,J.G.；Roederer,M.；Anderson,M.T.；Ela,S.W.；Deresinski,S.C.；Herzenberg,L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1997,94,1967-1972.文献5:Banerjee,S.；Kar,S.；Perez,J.M.；Santra,S.J.Phys.Chem.C.2009,113,9659-9663.)。因此，设计一种有效检测谷胱甘肽的方法，以便更好地了解其生理和病理功能，是具有重要意义的。
由于对检测谷胱甘肽含量的需求越来越大，一些基于不同荧光团的荧光探针已经被合成，例如氟硼吡咯(文献6:Li,X.；Qian,S.J.；He,Q.J.；Yang,B.；Li,J.；Hu,Y.Z.Org.Biomol.Chem.2010,8,3627–3630.)、香豆素类(文献7:Kim,G.J.；Lee,K.；Kwon,H.；Kim,H.J.Org.Lett.2011,13,2799–2801.)、方酸类(文献8:Sreejith,S.；Divya,K.P.；Ajayaghosh,A.Angew.Chem.2008,120,8001–8005.)、花青素类(文献9:Niu,L.Y.；Guan,Y.X.；Chen,Y.Z.；Wu,L.Z.；Tung,C.H.；Q.Z.Yang,Chem.Soc.Rev.2015,44,6143-6160)以及荧光素类(文献10:Chen,X.；Ko,S.K.；Kim,M.J.；Shin,I.；Yoon,J.Chem.Commun.2010,46,2751–2753.)等。我们注意到，尽管这些荧光探针对谷胱甘肽的检测有着重要的意义，但他们的缺点仍然存在。他们主要存在两方面的问题，一方面，由于GSH、Cys和Hcy结构上非常相似，因此区分GSH、Cys和Hcy是很困难的。另一方面，一般探针的发射波长都是在可见光区域，这将阻碍探针在生物系统中的应用。因此，设计和合成一个近红外探针且能区分GSH和Cys/Hcy是迫在眉睫的。
近红外染料的波长范围一般是在650-900nm，且在体外和体内检测小分子具有独特优势，如组织深层渗透，对生物样品小的光损伤，背景荧光少，从而在生物体内检测小分子时产生的干扰小(文献11:Yuan,L.；Lin,W.Y.；Zhao,S.；Gao,W.S.；Chen,B.；He,L.W.；Zhu,S.S.J.Am.Chem.Soc.2012,134,13510-13523.)。因此，到目前为止，已经有少量的近红外荧光探针已被设计并用于检测谷胱甘肽(文献12:Yu,F.；Li,P.；Song,P.；Wang,B.；Zhao,J.；Han,K.Chem.Comm.2012,48,4980-4982.文献13:Lim,S.Y.；Hong,K.H.；Kim,D.I.；Kwon,H.；Kim,H.J.J.Am.Chem.Soc.2014,136,7018-7025.文献14:Xu,K.；Qiang,M.；Gao,W.；Su,R.；Li,N.；Gao,Y.；Tang,B.Chem.Sci.2013,4,1079-1086.文献15:Li,M.；Wu,X.；Wang,Y.；Li,Y.；Zhu,W.；James,T.D.Chem.Comm.2014,50,1751-1753.)。值得我们注意的是，大多数这些近红外荧光探针是花菁染料。然而这些近红外荧光探针存在着一些缺点。首先，大部分的荧光探针具有低的荧光量子产率(通常远小于0.25)。因此，由于这些探针有高背景信号和低的荧光信号，故用于生物成像时对比度较低。其次，所报导的这些探针表现出较弱的荧光变化(＜25倍)，所以当检测生物体内的谷胱甘肽时，这些探针的灵敏度往往是不够的。因此，设计一个能克服这些缺陷的并用于检测谷胱甘肽的近红外荧光探针是很重要的。
近日，罗丹明染料由于其优良的光谱性能如高的荧光量子产率、低的背景荧光而备受关注(文献16:Beija,M.；Afonso,C.A.M.；Martinho,J.M.G.Chem.Soc.Rev.2009,38,2410–2433)。此外，罗丹明的内酰胺螺环状结构是没有荧光的，而由检测物引起的内酰胺结构开环会产生强烈的荧光发射。到目前为止，大部分罗丹明类荧光探针都用来检测金属阳离子(文献17:Zhao,Y.；Zhang,X.B.；Han,Z.X.；Qiao,L.；Li,C.Y.；Jian,L.X.；Shen,G.L.；Yu,R.Q.Anal.Chem.2009,81,7022–7030.文献18:Du,J.；Fan,J.；Peng,X.；Sun,P.；Wang,J.；Li,H.；Sun,S.Org.Lett.2010,12,476–479)。然而，报道过的罗丹明类探针很少有用来检测谷胱甘肽的。此外，罗丹明类荧光探针的吸收和发射只在可见光区域(500-600nm)，这限制了它们在生物成像中的应用。因此，使罗丹明类荧光探针的吸收和发射延长到近红外区是非常有必要的。
本文利用罗丹明类染料具有高量子产率、低背景以及开关型的结构的优点，同时还利用了花菁染料长波长(发射峰在近红外区)的优点，设计并合成了一种基于罗丹明衍生物的近红外荧光探针，此探针具有高量子产率(Φ＝0.432)，并用于检测谷胱甘肽。一方面，用费舍尔氏醛来延长波长，使之延长到750nm；另一方面，利用分析物的SH与探针的醛基之间发生水解-加成反应，实现谷胱甘肽与半胱氨酸、同型半胱氨酸的区分。
发明内容
本发明的目的是提供了一种近红外GSH的荧光探针，该荧光探针具有长波长(在近红外区)、高荧光量子产率(Φ＝0.432)、高灵敏度以及高选择性的检测GSH，并能够应用于活细胞和组织中的荧光成像。
本发明的技术方案是，一种近红外GSH荧光探针，其结构式如下：
本发明的荧光探针应用于GSH的检测，其特征在于探针本身处于闭环状态没有荧光，探针与GSH反应后螺环打开，从而导致荧光改变。
所述的一种基于近红外GSH荧光探针的制备方法。步骤如下：
化合物1的合成：将环己酮逐滴加入到冷却至0℃的浓硫酸中，随后加入2-((4-二乙氨基)-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸，磁力搅拌回流1.5小时，停止反应；反应混合物冷却至室温后，在搅拌下将反应混合物倒入盛有冰水的烧杯中，随即加入70％高氯酸，立即产生大量红色沉淀。抽滤，用冰水洗涤固体，干燥后得到红色的固体化合物1，其中环己酮和2-((4-二乙氨基)-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸的摩尔比为2:1。
化合物2的合成：将化合物1和费舍尔氏醛溶解在无水醋酸中，在氮气保护下，磁力搅拌回流1.5小时，加水停止反应，减压蒸馏除去溶剂。粗产品通过柱层析梯度分离(CH2Cl2和CH2Cl2/C2H5OH＝200:1到20:1，V/V)得绿色固体(化合物2)，其中化合物1和费舍尔氏醛的摩尔比为1:1.05。
化合物3的合成：将化合物2溶解在CH2Cl2中，搅拌下加入80％水合肼和卡特缩合剂。在室温下，磁力搅拌1.5小时；减压蒸馏除去溶剂。粗产品通过柱层析梯度分离(CH2Cl2和CH2Cl2/C2H5OH＝200:1到20:1，V/V)得黄色固体(化合物3)，其中化合物2、80％水合肼和卡特缩合剂的摩尔比为1:10:1.05。
荧光探针NIR-Rh的合成：将化合物3和乙二醛溶解在无水甲醇中搅拌。在室温下，磁力搅拌12小时；减压蒸馏除去溶剂。粗产品通过柱层析梯度分离(CH2Cl2和CH2Cl2/C2H5OH＝200:1到20:1，V/V)得淡黄色固体，为目标产物(化合物NIR-Rh)，其中化合物3和乙二醛的摩尔比为1:2。制备反应式如下：
本发明的有益效果是：本发明的近红外荧光探针在GSH存在下荧光发生显著变化，荧光量子产率为0.432，可以用于高灵敏度的检测GSH。该荧光探针的检测范围为0.5～25μM，检测限为0.15μM。其次，该近红外荧光探针的检测环境为生理范围内的pH＝6-8。同时，该荧光探针对GSH的响应迅速，响应时间在3min以内。该近红外荧光探针对GSH表现出很好的选择性，不受其它生物硫醇(Cys，Hcy)及其它氨基酸(Ala,Ile,Leu,Met,Phe,Pro,Trp,Val,Asn,Gln,Gly,Ser,Thr,Tyr,Arg,His,Lys,Asp,Glu)的影响。
本发明的近红外探针不仅能检测溶液中的GSH，还可应用于生物成像，检测细胞内和组织中的GSH含量，这对于深入研究GSH在生物体内生理和病理过程的动力学机理具有重要意义。
附图说明
图1为荧光探针与不同浓度的GSH作用后的荧光光谱图。
横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。荧光探针的浓度均为10μM，GSH浓度分别为：0,0.5,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,20.0,22.0,25.0μM。荧光激发波长为690nm。插图为探针对GSH浓度的线性响应图。
图2为荧光探针与GSH的作用机理图。
图3为荧光探针与GSH作用后的紫外可见吸收光谱图。
横坐标为波长，纵坐标为吸光度。荧光探针的浓度均为100μM，GSH浓度分别为0,0.5,1.0,1.5,2.0,3.0,4.0,6.0,7.0,9.0,10.0μM。
图4为pH对荧光探针的影响图。
图5为荧光探针在不同GSH浓度(2,4,8,12μM)下，荧光强度随时间变化的关系曲线图。
图6为荧光探针的选择性图。F0和F表示探针溶液加入GSH前后的荧光强度。黑色柱表示探针溶液在空白或加入各种生物硫醇或氨基酸后的荧光变化情况，白色柱表示探针溶液在加入GSH后，又加入各种生物硫醇或氨基酸的荧光变化情况。
图7为细胞毒性试验。横坐标为荧光探针的浓度，纵坐标为细胞的存活率。
图8为GSH的细胞成像图。
图9为GSH的组织成像图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。
实施例1：
荧光探针的合成
化合物1的合成：将环己酮(6.4mmol,0.66mL)逐滴加入到冷却至0℃的浓硫酸(7.0mL)中，随后加入2-((4-二乙氨基)-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸(3.2mmol,1.003g)，磁力搅拌回流1.5小时，停止反应；反应混合物冷却至室温后，在搅拌下将反应混合物倒入盛有50g冰水的烧杯中，随即加入0.7mL 70％高氯酸，立即产生大量红色沉淀。抽滤，干燥后得到红色的固体化合物1，产品未经进一步纯化，直接用于下一步反应。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.30(d,J＝8.0Hz,1H),7.78(t,J＝7.2Hz 1H),7.69(t,J＝7.6Hz 1H),7.22(d,J＝7.5Hz,1H),7.06-7.13(q,2H),6.89(s,1H),3.61-3.66(q,4H),3.07-3.18(m,2H),2.29-2.31(m,2H),1.99(s,2H),1.79(s,2H),1.34(t,J＝6.6Hz,6H).MS(TOF)m/z 376.2.
化合物2的合成：将化合物1(4.2mmol,1.58g)和费舍尔氏醛(4.4mmol,0.88g)溶解在25.0mL无水醋酸中，在氮气保护下，磁力搅拌回流1.5小时，往反应混合物中加入25.0mL水淬灭反应，减压蒸馏除去溶剂。粗产品通过柱层析梯度分离(CH2Cl2和CH2Cl2/C2H5OH＝200:1到20:1，V/V)得绿色固体(化合物2)(0.59g,产率:25％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.51(d,J＝12.0Hz,1H),8.19(d,J＝8.0Hz,1H),7.93(d,J＝7.6Hz,1H),7.55-7.62(m,3H),7.16(s,1H),7.06(q,2H),6.48-6.60(m,3H),5.92(d,J＝8.0Hz,1H),3.57(s,3H),3.48(q,4H),2.59(t,J＝8.0Hz,2H),2.45(t,J＝8.0Hz,2H),1.76(8H),1.13(t,J＝8.0Hz,6H).MS(TOF)m/z 559.4.
化合物3的合成：将化合物2(0.76mmol,0.55g)溶解在CH2Cl2中，搅拌下加入化合物水合肼(7.6mmol,0.5ml)和卡特缩合剂(0.80mmol,0.36g)。在室温下，反应混合物1.5小时；减压蒸馏除去溶剂。粗产品通过柱层析梯度分离(CH2Cl2和CH2Cl2/C2H5OH＝200:1到20:1，V/V)得黄色固体(化合物3)(0.32g,产率：74％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.81(d,J＝8.8Hz,1H),7.34-7.43(m,3H),7.07-7.13(m,3H),6.76(d,J＝7.2Hz,1H),6.54(d,J＝7.6Hz,1H),6.29(d,J＝8.8Hz,2H),6.20(s,1H),5.30(d,J＝8.0Hz,1H),3.28(q,4H),3.07(s,3H),2.50(2H),1.63-1.65(10H),1.10(t,J＝8.0Hz,6H).MS(TOF)m/z 573.3.
荧光探针NIR-Rh的合成：将化合物3(0.5mmol,0.29g)和乙二醛(1.00mmol,0.058g)溶解在25.0mL无水甲醇中搅拌。在室温下，磁力搅拌反应混合物12小时；减压蒸馏除去溶剂。粗产品通过柱层析梯度分离(CH2Cl2和CH2Cl2/C2H5OH＝200:1到20:1，V/V)得淡黄色固体，得目标产物(化合物NIR-Rh)(0.26g,产率：85.8％).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.44(d,J＝6.8Hz,1H),7.82(d,J＝7.2Hz,1H),7.35-7.43(m,4H),7.08-7.13(m,3H),6.76(d,J＝8.0Hz,1H),6.53(d,J＝7.6Hz,1H),6.20-6.29(m,3H),5.29(d,J＝8.0Hz,1H),3.27(q,4H),3.07(s,3H),2.25(2H),1.63-1.65(10H),1.10(t,J＝8.0Hz,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ192.67,168.21,156.15,153.04,152.15,149.59,143.07,140.68,140.33,134.16,132.92,131.47,129.16,128.82,128.26,125.29,124.53,123.80,122.15,121.26,110.03,109.27,106.22,105.06,97.07,68.24,48.24,44.55,31.21,29.68,28.56,24.27,22.19,12.51.MS(TOF)m/z 613.4.Anal.calcd.for C39H40N4O3(1):C,76.44；H,6.58；N,9.14；O,7.83.Found:C,76.73；H,6.43；N,9.61；O,7.93.结果表明，所得产物结构正确。
实施例2：
荧光探针与GSH作用的溶液配制
将一定量的荧光探针溶解在H2O/EtOH(9:1，v/v)的混合溶液中，得到浓度为1.0×10-4mol·L-1探针的备用溶液。将一定量的GSH用水溶解后，转移到500mL的容量瓶中，加水至刻度线，得到浓度为1.0×10-2mol·L-1的GSH。将1.0×10-2mol·L-1的GSH溶液用水逐渐稀释，得到1.0×10-3-1.0×10-8mol·L-1的GSH水溶液。将1.0mL探针的备用溶液和1.0mL的GSH水溶液加入到10mL的容量瓶中，用缓冲溶液定容后，得到浓度为1.0×10-5mol·L-1的荧光探针和1.0×10-3-1.0×10-8mol·L-1的GSH混合待测溶液。
实施例3：
荧光探针与GSH作用的荧光光谱的测定
用pH值为7.4的缓冲溶液为溶剂测定了荧光探针与GSH作用的荧光光谱，结果如图1。荧光探针的浓度为10μM，GSH的浓度依次为0,0.5,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,20.0,22.0,25.0μM，激发波长固定为690nm，发射波长范围为720～800nm，狭缝宽度为5.0nm/5.0nm。从图1可以看出，加入GSH之前，荧光探针在750nm处没有荧光发射峰。随着GSH的加入，在750nm处发射峰大幅度的增强，并且随着GSH浓度的增大，探针的荧光强度不断增强，当加入20μM的GSH时，荧光强度增强至未加入GSH时的64倍。这是因为探针分子的醛基与GSH反应生成开环的罗丹明衍生物。如图1的插图所示，荧光强度跟GSH的浓度呈现线性关系，线性范围是0.5～25.0μM，检测限是0.15μM。所用的荧光测定仪器为Perkin Elmer LS 55荧光分光光度计。图2为荧光探针与GSH作用的机理图，从图中可以看出荧光探针与GSH发生反应后，使得螺环打开，从而导致荧光发生显著变化。
实施例4：
荧光探针与GSH作用的紫外可见吸收光谱性质的测定
图3为荧光探针与GSH作用后的紫外可见吸收光谱图。从图3中可以看出，没有加入GSH时，探针在698nm处几乎没有吸收峰，加入GSH之后，在该处的吸收峰大幅度增强。同时使用吲哚菁绿为标准物质，测得探针与GSH作用后的荧光量子产率为0.432。紫外可见吸收光谱测定用的仪器为Perkin ElmerLambda 25型紫外可见分光光度计。
实施例5：
溶液pH值对荧光探针测定GSH的荧光性质的影响
我们考察了pH值对荧光探针测定GSH的荧光强度的影响。我们研究的pH范围为4.0～12.0，荧光探针的浓度为10μM，GSH的浓度为20μM。实验结果如图4所示，荧光探针随着pH的变化，荧光强度基本不变，说明pH对探针本身没有很大的影响。然而，加入GSH之后，当pH＜6，荧光探针随着pH的降低荧光强度增大，这是因为在酸性条件下，探针发生质子化，使得探针的结构处于开环状态；在pH>8范围内，随pH的增大，荧光强度逐渐降低。pH在6～8的范围内荧光强度基本不变。综上所述，当pH值在6.0到8.0之间时，不影响荧光探针对GSH的测定，这非常有利于该探针用于实际样品中GSH的测定。
实施例6：
荧光探针与GSH作用的响应时间的测定
为了研究荧光探针对GSH的响应时间，我们考察了荧光探针在不同GSH浓度下(2,4,8,12μM)的荧光光谱的变化情况，其结果如图5。从图中可以看出，该探针对GSH的响应时间不到3min，满足在实际样品中进行实时监测时对响应时间的要求。从图5我们还可以看出，荧光强度一旦达到最大值后，在之后的时间里，荧光强度不再发生变化，会出现一个平台，这表明此荧光探针光稳定性好。
实施例7：
荧光探针对GSH测定的选择性
在浓度为10μM的荧光探针溶液中加入GSH、Cys、Hcy及其它19种氨基酸(GSH的浓度为20μM，其他的浓度均为1mM)前后的荧光强度变化。从图6中黑色柱可以看出，除GSH外加入其它的生物硫醇和其它19种氨基酸，荧光强度都没有明显的改变。尽管Asp和Glu有较小程度的荧光增强，但这个改变几乎可以忽略。而相同的条件下加入GSH，在750nm处出现一个很强的荧光发射峰。另外，我们也探究了在GSH存在的条件下，其它对探针NIR-Rh的荧光测定的影响，如图6白色柱所示，探针几乎不受其它生物硫醇和氨基酸存在的干扰。F0和F表示探针溶液加入GSH前后的荧光强度。这些现象表现探针NIR-Rh对GSH的测定表现出良好的选择性。
实施例8：
荧光探针在活细胞中的应用
首先，我们做了细胞毒性试验，如图7所示，当加入0～20μM GSH探针，20min之后，细胞的成活率均在97％以上，因此可以说明，该荧光探针可应用于检测活细胞内的GSH，并且毒性较小。
一般情况下，细胞内的GSH含量非常丰富，因此直接向细胞内加入探针，也能检测到强的红色荧光信号，如图8a所示。但是，当在加入探针之前加入一定量的硫醇抑制剂NEM时，如图8b所示，细胞内没有荧光信号。然而当再向此细胞中加入GSH时，检测到细胞内又出现了很强的红色荧光信号(图8c)。而加入Cys与Hcy时，细胞内没有荧光(图8d和8e)。因此可以说明，该探针可高选择性的检测细胞内的GSH。
实施案例9：
荧光探针在组织中的应用
近红外的探针具有背景低，穿透性强的优点。如图9所示，(a)图是在小鼠肝冷冻切片中加入10μM罗丹明B的荧光成像图，(b)图是在小鼠肝冷冻切片中先加入10μM探针NIR-Rh，再加入30μM GSH的荧光成像图。从图可以看出，探针NIR-Rh的穿透深度范围为40-120μm，而罗丹明B的穿透范围仅仅为45-70μm，由此我们能得出探针NIR-Rh的穿透能力远远强于罗丹明B。与此同时从图9中可以得出探针NIR-Rh对GSH的响应的荧光强度远远强于罗丹明B的荧光强度。由此说明，该荧光探针NIR-Rh具有良好的组织渗透和染色能力。

Claims (5)

1.一种近红外荧光探针（NIR-Rh）的制备方法和应用，其结构式如下：
。
2.根据权利要求1所述的一种近红外荧光探针的制备方法，其特征在于它的具体制备步骤为：
1）将环己酮逐滴加入到冷却至0 ℃的浓硫酸中，随后加入2-((4-二乙氨基)-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸，磁力搅拌回流1.5小时，停止反应；反应混合物冷却至室温后，在搅拌下将反应混合物倒入盛有冰水的烧杯中，随即加入70%高氯酸，立即产生大量红色沉淀，抽滤，用冰水洗涤固体，干燥后得到红色的固体化合物1，其中环己酮和2-((4-二乙氨基)-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸的摩尔比为2:1，化合物1的结构为：
；
2）将化合物1和费舍尔氏醛溶解在无水醋酸中，在氮气保护下，磁力搅拌回流1.5小时，加水停止反应，减压蒸馏除去溶剂，粗产品通过柱层析梯度分离（CH2Cl2和CH2Cl2/C2H5OH = 200:1到20:1，V/V）得绿色固体（化合物2），其中化合物1和费舍尔氏醛的摩尔比为1:1.05，化合物2的结构为：
；
3）将化合物2溶解在CH2Cl2中，搅拌下加入80%水合肼和卡特缩合剂，在室温下，磁力搅拌1.5小时；减压蒸馏除去溶剂，粗产品通过柱层析梯度分离（CH2Cl2和CH2Cl2/C2H5OH = 200:1到20:1，V/V）得黄色固体（化合物3），其中化合物3、80%水合肼和卡特缩合剂的摩尔比为1:10:1.05，化合物3的结构为：
；
4）将化合物3和乙二醛溶解在无水甲醇中搅拌，在室温下，磁力搅拌12小时；减压蒸馏除去溶剂，粗产品通过柱层析梯度分离（CH2Cl2和CH2Cl2/C2H5OH = 200:1到20:1，V/V）得淡黄色固体，为目标产物（化合物NIR-Rh），其中化合物3和乙二醛的摩尔比为1:2。
3.根据权利要求1所述的一种近红外荧光探针的应用，其特征在于：用于检测溶液中的谷胱甘肽。
4.根据权利要求1所述的一种近红外荧光探针的应用，其特征在于：用于检测细胞内的谷胱甘肽。
5.根据权利要求1所述的一种近红外荧光探针的应用，其特征在于：用于检测组织中的谷胱甘肽。
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