CN113956265A - 一种基于丙二醛响应的近红外分子探针、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于丙二醛响应的近红外分子探针、制备方法及其应用，本发明提供了基于丙二醛响应的近红外分子探针，以氧杂蒽衍有机染料为母体结构，含有吸电子基团硝基和丙二醛反应位点苯甲酰肼基，通过邻硝基苯甲酰肼的肼基与MDA的亲核反应改变分子共轭程度，导致吸光度的变化来实现MDA的检测。本发明提供了所述分子探针的应用，制备了一种用于MDA检测和成像的纳米探针NPs，这种纳米探针以近红外吸收的CS‑R和两亲性聚合物DSPE‑PEG2000为主体，通过MDA的加成反应改变纳米探针中CS‑R的共轭体系，从而实现荧光成像，实现了对MDA的灵敏度高和特异性好的检测和成像，极大改善了以往丙二醛探针存在的波长短和穿透深度差的问题。

Description

一种基于丙二醛响应的近红外分子探针、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种基于丙二醛(MDA)响应的分子探针、制备方法及其应用，具体涉及一种用于检测氧化应激生物标志物MDA的分子探针、制备方法及其应用。
背景技术
活性氧(ROS)与脂质的特定反应通常被称为“脂质过氧化”。脂质的非酶促脂质自氧化或过氧化是一种自由基驱动的链式反应，其中ROS引发多不饱和脂肪酸(PUFA)的氧化。此外，PUFA的持续大量氧化和消耗可能会改变膜的流动性和结构，并增加膜的渗透性，最终导致膜完整性的丧失。丙二醛(MDA)、4-羟基壬烯醛(4-HNE)和F2-异前列腺素是被广泛接受的氧化应激生物标志物，即脂质过氧化的终产物，其中MDA被认为是脂质过氧化氢分解脂质自氧化和过氧化的重要反应性有毒醛类生物标志物。MDA与DNA和蛋白质的相互作用表明MDA具有致突变性和致癌性。MDA引起的蛋白质变性和DNA损伤通常与多种人类疾病有关，如白血病、糖尿病、癌症、心血管疾病、哮喘和肝脏疾病。
现有技术中，大部分检测MDA的方法，包括2-硫代巴比妥酸(TBA)测定、质谱和拉曼光谱，都需要对生物样品进行破坏性制备；另一方面，已经有一些荧光探针能够检测MDA，但这些荧光探针由于波长较短(＜600nm)，导致这些探针仅限于细胞成像，这大大削弱了体内实际应用的有效性。目前还没有能够用于活体成像的MDA探针，主要原因是现有的MDA探针波长不足，限制了在活体成像的应用。因此，迫切需要开发一种在活体水平高特异性检测MDA的有效方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于丙二醛响应的近红外分子探针(CS-R)、制备方法及其应用，在CS-R基础上合成了纳米探针NPs，所得纳米探针NPs可用于MDA检测和活体成像，此过程的吸光度和荧光信号的变化可以实现对MDA的检测与成像，并且具有灵敏度高和特异性好的优势。
为了达到上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种基于丙二醛响应的近红外分子探针(CS-R)，其结构如式I所示：
Figure BDA0003358434910000021
其中，R基团的结构式采用式II中的任意一种：
Figure BDA0003358434910000022
优选的方案，所述近红外分子探针(CS-R)由硝基罗丹明酰肼结构为母体，通过共价连接R基团调控波长，利用邻硝基苯甲酰肼结构与丙二醛发生亲核加成反应，生成邻硝基苯甲酰吡唑结构，使得硝基罗丹明母核共轭结构开启，在600～1000nm波长范围出现明显吸收信号。
优选的方案，所述近红外分子探针(CS-R)的检测pH≤6.5。
优选的方案，所述CS-MDA的制备过程如下：
(1)在冰浴中将环己酮滴加到浓H2SO4中，在搅拌下加入化合物1(2-(4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲酰基)-6-硝基苯甲酸)，将反应混合物剧烈搅拌，在加热条件下进行反应，然后倒入冰水中，然后将沉淀物过滤并用水和石油醚快速洗涤，得到化合物2(9-(2-羧基-3-硝基苯基)-6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四氢黄嘌呤)；
(2)将化合物2和化合物3((E)-N-(2-(1-乙基-3,3-二甲基吲哚-2-基)乙烯基)苯胺)溶解在含有AcOH的Ac2O中，将所得混合物在保温条件下进行反应，随后将反应体系用饱和食盐水和二氯甲烷萃取，纯化残余物，得到CS-NO2；
(3)在室温下将CS-NO2加入到二氯甲烷中，将水合肼(N2H4·H2O)和苯并三唑-1-基-氧三吡咯烷鏻六氟磷酸盐(PyBOP)添加到该系统中，将溶液在室温下搅拌过夜，然后将溶液浓缩，残余物纯化处理，得到所述CS-MDA；
合成路线如下所示：
Figure BDA0003358434910000031
进一步，所述CS-MDA的制备过程如下：
(1)在冰浴中将环己酮滴加到浓H2SO4中，在搅拌下加入化合物1，将反应混合物剧烈搅拌，并在60～100℃加热0.5～6小时，然后倒入冰水中，然后将沉淀物过滤并用水和石油醚快速洗涤，得到化合物2；
(2)将化合物2和化合物3溶解在含有AcOH的Ac2O中，然后将混合物反应加热至40～70℃保持30～120分钟，随后将反应体系用饱和食盐水和二氯甲烷萃取2～6次，通过硅胶色谱法用二氯甲烷/甲醇作为洗脱剂纯化残余物，得到绿色固体CS-NO2；
(3)在室温下将CS-NO2加入到二氯甲烷中，将水合肼和苯并三唑-1-基-氧三吡咯烷鏻六氟磷酸盐添加到该系统中，将溶液在室温下搅拌过夜，然后将溶液浓缩，残余物通过硅胶色谱法纯化，用乙酸乙酯作为洗脱剂，得到橙黄色固体CS-MDA。
更进一步，步骤(1)中，环己酮与浓H2SO4的体积比为1:5～20，浓H2SO4为质量分数为98.3％；化合物1与环己酮的质量体积比为1:0.5～2g/ml。
更进一步，步骤(2)中，化合物2和化合物3的摩尔比为1:1～2，洗脱剂中二氯甲烷/甲醇的体积比为50/1～10/1。
更进一步，步骤(3)中，CS-NO2与二氯甲烷的质量体积比为3～3.2：1mg/ml；苯并三唑-1-基-氧三吡咯烷鏻六氟磷酸盐和水合肼的质量体积比为1：4～6mg/μL。
本发明还提供基于丙二醛响应的近红外分子探针(CS-R)的应用，以近红外分子探针(CS-R)为基础合成纳米探针NPs，所述纳米探针NPs由近红外分子探针(CS-R)和两亲聚合物DSPE-PEG2000自组装而成，该纳米探针NPs为球形结构，所述近红外分子探针(CS-R)为核心，所述两亲聚合物DSPE-PEG2000为表面修饰层；
所述近红外分子探针(CS-R)包括CS-MDA、CS-A、CS-B、CS-C中的任意一种。
纳米探针NPs在600～850nm的波长范围内无吸收信号，与MDA反应后在720～740nm出现最大吸收峰。
纳米探针NPs以近红外分子探针(CS-R)为主体，通过丙二醛与CS-R结构中的邻硝基苯甲酰肼结构的加成反应改变分子内的共轭程度，导致吸收荧光信号的变化来实现活体荧光成像。
作为具体的实施方式，所述纳米探针NPs的粒径为10～500nm。
作为具体的实施方式，所述纳米探针NPs的合成过程为：
(a)制备近红外分子探针(CS-R)；
(b)配制含CS-R和DSPE-PEG2000的四氢呋喃溶液；
(c)在圆底烧瓶中预先加入0.5～2ml含CS-R和DSPE-PEG2000的四氢呋喃溶液，超声处理1～10分钟，得到淡黄色溶液；
(d)将上述溶液快速与8～9.5ml去离子水混匀，超声5～20分钟，旋蒸除去多余的四氢呋喃溶剂，超滤浓缩，得到所述纳米探针NPs。
步骤(b)中，CS-R和DSPE-PEG2000的质量比为1:1～20。
优选的范围，CS-R和DSPE-PEG2000的质量比为1:5～10。
步骤(d)中，将纳米探针NPs分散在水中，置于3～6℃的环境下保存。
作为具体的实施方式，所述纳米探针NPs可用于MDA检测和活体成像，通过吸光度和荧光信号的变化来实现对MDA的高灵敏度、特异性检测。
与现有技术相比，本发明具有以下有益技术效果：
(1)本发明提供了基于丙二醛响应的近红外分子探针(CS-R)，以氧杂蒽衍有机染料为母体结构，含有吸电子基团硝基和丙二醛反应位点苯甲酰肼基，通过邻硝基苯甲酰肼的肼基与丙二醛(MDA)的亲核反应改变分子共轭程度，导致吸光度的变化来实现MDA的检测。
(2)本发明提供了所述近红外分子探针(CS-R)的应用，制备了一种用于MDA检测和成像的纳米探针NPs，这种纳米探针以近红外吸收的CS-R和两亲性聚合物DSPE-PEG2000为主体，通过MDA的加成反应改变纳米探针中CS-R的共轭体系，从而实现荧光成像，实现了对MDA的灵敏度高和特异性好的检测和成像，极大改善了以往丙二醛探针存在的波长短和穿透深度差的问题。
(3)本发明还提供了所述分子探针CS-MDA、纳米探针NPs的合成方法，制备速度快，原料简单易得，成本低。
(4)基于在MDA的加成反应作用下改变分子内共轭结构来实现信号变化，实现了对MDA灵敏度高、特异性识别、穿透深度深的检测和活体成像，极大改善了已经报道的丙二醛探针存在的波长短、无法应用于活体成像的问题，并且成功实现在荷瘤小鼠模型中MDA的成像，对于理解MDA相关病理学和疾病不同时期诊断具有非常重要的指导意义。
附图说明
图1为CS、CS-NO2、CS-MDA和CS-1的化学结构式与荧光成像过程示意图。
图2为CS-R的合成路线图。
图3为CS-MDA检测MDA的吸收谱图。
图4为CS-MDA在730nm处吸光度与MDA浓度的线性关系图。
图5为CS-MDA检测MDA的荧光谱图。
图6为CS-MDA在760nm处荧光强度与MDA浓度的线性关系图。
图7为CS-MDA在于不同分析物孵育过夜的吸收光谱。
图8为NPs的透射电镜图。
图9为NPs在pH 6.34时，与MDA反应前后的吸收光谱。
图10为NPs在pH 6.78时，与MDA反应前后的吸收光谱。
图11为NPs检测MDA的吸收谱图。
图12为NPs尾静脉注射前后，荷瘤小鼠的荧光成像图。
具体实施方式
基于发明人团队首次发现分子探针CS-MDA(CS-A、CS-B、CS-C)能对MDA响应这一现象，该响应被用于MDA的检测和成像。
以分子探针(CS-MDA)为例，发明人团队首次合成了纳米探针NPs，该纳米探针NPs由CS-MDA和两亲聚合物DSPE-PEG2000自组装形成。由于MDA的强反应活性，纳米探针NPs中的CS-MDA与MDA反应生成CS-1，从而导致分子内共轭程度的增加，并伴随着近红外吸收的显着升高和荧光信号的增加，重要的是，这种响应性信号首次通过荧光成像技术开发用于MDA的传感和活体成像(如图1所示)。
苯甲酰肼的肼上的孤对电子可以通过光诱导电子转移(PET)淬灭荧光，因此苯甲酰肼衍生物通常被设计为MDA识别基团。当苯甲酰肼衍生物骨架的肼基团被MDA的两个醛基依次进攻后，由于PET过程的中断，苯甲酰肼衍生物可以打开荧光。氧杂蒽类探针通常设计为分子内螺环形式，在没有分析物的情况下具有弱荧光。当探针被分析物识别并转化为开环形式，在近红外区域能够提供强大的“开启”信号。MDA在水溶液中存在三种主要形式，烯醇阴离子是pH 7.4的主要物质，反应活性低。因此，在生理条件下，MDA反应活性并不是很高。当环境pH降低后，β-羟基丙烯醛会成为MDA的主要存在形式，此时反应活性会明显增加。这种形式下的MDA是一种亲电试剂，它可以在迈克尔型1,4-加成反应中与亲核试剂反应。本发明以苯甲酰肼衍生物和CS探针为基础，在CS的苯甲酸基团的邻位引入硝基，得到了CS-NO2，并通过一步反应得到了丙二醛探针CS-MDA，它能够在弱酸条件下与MDA反应；此外这种设计策略可以使本发明所述基于CS-MDA的纳米探针NPs具有更好的准确性，特异性，敏感性和穿透深度，可用于MDA的检测，成像和可视化(作用过程如图1所示)。
本发明具体实施例中，将NPs纳米粒子直接和MDA溶液混合，制成荧光成像体系。
本发明具体实施例中，检测和成像方法包括了用吸光度和荧光信号的变化来对MDA进行检测和成像。
下面结合附图和具体实施例对本发明进一步说明。
实施例1 CS-MDA分子探针的制备
如图2所示，在冰浴中将环己酮(1mL)滴加到浓H2SO4(10mL)中，然后，在搅拌下加入1g化合物1(2-(4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲酰基)-6-硝基苯甲酸)，将反应混合物剧烈搅拌，并在90℃加热2小时，然后倒入冰水中，然后将沉淀的沉淀物过滤并用水和石油醚快速洗涤，最后得到化合物2(9-(2-羧基-3-硝基苯基)-6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四氢黄嘌呤)，为深红色粘稠液体，无需进一步纯化即可用于下一步反应；
将化合物2和化合物3((E)-N-(2-(1-乙基-3,3-二甲基吲哚-2-基)乙烯基)苯胺)溶解在含有AcOH的Ac2O中，化合物2和化合物3的摩尔比为1:1，然后将混合物反应加热至55℃保持60分钟，随后将反应体系用饱和食盐水和二氯甲烷萃取3次，通过硅胶色谱法用二氯甲烷/甲醇(50/1至10/1)作为洗脱剂纯化残余物，得到呈绿色固体状的CS-NO2；
在室温下将CS-NO2(6.2mg)加入到2ml二氯甲烷中，将水合肼(N2H4·H2O,50μL)和苯并三唑-1-基-氧三吡咯烷鏻六氟磷酸盐(PyBOP,10mg)添加到该系统中，将溶液在室温下搅拌过夜，然后将溶液浓缩，残余物通过硅胶色谱法纯化，用乙酸乙酯作为洗脱剂，得到橙黄色固体CS-MDA。
实施例2 CS-A分子探针的制备
如图2所示，合成方法同实施例1，只是加入的化合物3为(E)-N-(2-(1-乙基-3,3-二甲基苯并吲哚-2-基)乙烯基)苯胺。
实施例3 CS-B分子探针的制备
如图2所示，合成方法同实施例1，只是加入的化合物3为(E)-1-甲基-4-(2-(苯基氨基)乙烯基)喹啉-1-二甲基。
实施例4 CS-C分子探针的制备
如图2所示，合成方法同实施例1，只是加入的化合物3为(Z)-N-((6,11-二乙基-2-苯基-6,6a，7,8,9,10,10a，11-八氢-4H-吡喃并[2,3-b]吩嗪-4-亚基)甲基)苯胺。
实施例5 CS-MDA分子探针检测MDA的能力验证
采用实施例1所得CS-MDA探针，快速将不同浓度的MDA溶液添加到200μL含CS-MDA探针的磷酸盐缓冲盐水(20×PBS)(pH＝6.0)中。接下来，通过可见吸收光谱法记录吸收光谱。对于线性关系的拟合，分别记录上述反应溶液对应的MDA浓度以及730nm处吸光度数值，使用Origin软件进行线性拟合。
为了验证CS-MDA荧光检测能力，将上述溶液以660nm为激发光源，接收750-850nm的荧光信号，记录荧光光谱。为了进行选择性测试，将各种活性物质与CS-MDA一起孵育过夜，例如：PBS,·OH(500μM),ONOO-(500μM),1O2(500μM),tBuOOH(500μM),HClO(500μM),Fe3+(500μM),Cu2+(500μM),Hcy(500μM),Cys(500μM),GSH(500μM),H2O2(500μM),甲醛(500μM),甲基乙二醛(500μM),乙二醛(500μM),丙二醛(400μM)。
图3为验证CS-MDA在730nm吸收的增强是由MDA引起的，从图3可以看出丙二醛探针CS-MDA对MDA响应后伴随着730nm处最大吸收信号的增强。
图4为CS-MDA在730nm处吸收信号与MDA浓度之间的关系，从图4可以看出，MDA浓度在0-300μM时，CS-MDA在730nm处的吸收信号随着MDA的浓度升高而升高，线性相关系数R2＝0.984。
图5为验证CS-MDA在760nm荧光信号的增强是由MDA引起的，从图5可以看出丙二醛探针CS-MDA对MDA响应后伴随着760nm处最大荧光信号的增强。
图6为CS-MDA在760nm处荧光信号与MDA浓度之间的关系，从图6可以看出，MDA浓度在0-200μM时，CS-MDA在760nm处的荧光强度随着MDA的浓度升高而升高，线性相关系数R2＝0.965。
图7为CS-MDA和不同分析物孵育后吸收光谱的变化图，可以看出CS-MDA对MDA有特异性识别的能力，而其他活性物种不会明显改变CS-MDA吸光度数值。
分析：CS-MDA在近红外处(730nm)处具有增强的吸收是因为分子内共轭程度的增强所致。由于MDA的高反应活性，CS-MDA中的肼基被加成，从而导致螺环的开启与共轭程度的增加，并伴随着近红外区域吸光度和荧光信号的显著提高。
实施例6纳米探针NPs的制备
在超声处理下，将含有CS-MDA(50μg)和DSPE-PEG2000(500μg)的四氢呋喃溶液(1mL)快速注入去离子水(9mL)中；超声处理5-10分钟后，将溶液通过旋转蒸发仪在35-45℃蒸发，以除去过量的四氢呋喃溶液；最后，通过超滤或透析将NPs溶液纯化1-5次。
图8为NPs在透射电镜下呈现出均一球状结构，粒径大约为10-500nm。
实施例7 NPs通过可见光谱在弱酸环境检测MDA的能力
采用实施例3所得NPs，快速将MDA溶液(例如400μM)加入到含有NPs溶液的100-200μL PBS(pH＝6.34或6.78)中。反应过夜后进行光谱测试。
图9为NPs在pH＝6.34时与MDA反应前后的吸收光谱验证，从图9可以看出NPs在近红外区域的吸收信号随着MDA的加入有明显的升高。
图10为NPs在pH＝6.78时与MDA反应前后的吸收光谱验证，从图10可以看出NPs在近红外区域的吸收信号在加入MDA前后没有明显的变化。
图11为NPs在pH＝5.5时和不同浓度MDA孵育后吸收光谱的变化图，快速将不同浓度的MDA溶液添加到100-200μL含NPs探针的磷酸盐缓冲盐水(20×PBS)中。反应过夜后，通过分光光度法记录吸收光谱。
分析：由于MDA在弱酸条件(pH≤6.5)下反应活性提高，使NPs的近红外吸收的显着增加，所以体系吸收信号随着MDA浓度增加而增加。
实施例8纳米探针NPs通过荧光成像来检测荷瘤小鼠模型中丙二醛
所有动物实验均符合相关法律并获得湖南大学机构动物护理和使用委员会的批准。为了构建荷瘤小鼠模型，雌性BALB/c小鼠(5周)皮下注射50μL含有4T1细胞(5×105)的DPBS。
采用实施例3所得纳米探针NPs，小鼠尾静脉注射含NPs(100μL，100μg/mL)的PBS溶液，1.5小时后用含有异氟烷的氧气将小鼠麻醉，使用IVIS系统采集荧光信号，并与注射NPs之前的小鼠图像对比。
图12为纳米探针NPs通过荧光成像来检测荷瘤小鼠MDA的荧光图片，从图12可以看出荷瘤小鼠肿瘤部位的荧光信号在注射NPs后明显增强，这说明NPs可以在肿瘤区域富集，并且与肿瘤区域MDA反应，导致其荧光信号升高。这表明NPs可以监测荷瘤小鼠的丙二醛。
本发明提供了一种用于活体成像的MDA高特异性成像的荧光成像纳米探针NPs，它可以有效和被动的靶向肿瘤区域MDA反应。在被肿瘤中的MDA特异性激活后，纳米探针NPs可以快速打开其荧光信号。重要的是，NPs能够在弱酸条件下与MDA反应，可以表现弱酸的肿瘤微环境特异性成像MDA，而不会受到正常组织MDA的干扰。因此，NPs有望成为可视化肿瘤中MDA水平的有力工具，并为随后开发整合了肿瘤诊断和治疗的新型平台提供了新的策略。

Claims (12)

1.一种基于丙二醛响应的近红外分子探针(CS-R)，其特征在于，其结构如式I所示：
Figure FDA0003358434900000011
其中，R基团的结构式采用式II中的任意一种：
Figure FDA0003358434900000012
2.根据权利要求1所述基于丙二醛响应的近红外分子探针，其特征在于，所述近红外分子探针(CS-R)由硝基罗丹明酰肼结构为母体，通过共价连接R基团调控波长，利用邻硝基苯甲酰肼结构与丙二醛发生亲核加成反应，生成邻硝基苯甲酰吡唑结构，使得硝基罗丹明母核共轭结构开启，在600～1000nm波长范围出现明显吸收信号。
3.根据权利要求1所述基于丙二醛响应的近红外分子探针，其特征在于，所述近红外分子探针(CS-R)的检测pH≤6.5。
4.根据权利要求1所述基于丙二醛响应的近红外分子探针的制备方法，其特征在于，所述CS-MDA的制备过程如下：
(1)在冰浴中将环己酮滴加到浓H2SO4中，在搅拌下加入化合物1(2-(4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲酰基)-6-硝基苯甲酸)，将反应混合物剧烈搅拌，在加热条件下进行反应，然后倒入冰水中，然后将沉淀物过滤并用水和石油醚快速洗涤，得到化合物2(9-(2-羧基-3-硝基苯基)-6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四氢黄嘌呤)；
(2)将化合物2和化合物3((E)-N-(2-(1-乙基-3,3-二甲基吲哚-2-基)乙烯基)苯胺)溶解在含有AcOH的Ac2O中，将所得混合物在保温条件下进行反应，随后将反应体系用饱和食盐水和二氯甲烷萃取，纯化残余物，得到CS-NO2；
(3)在室温下将CS-NO2加入到二氯甲烷中，将水合肼(N2H4·H2O)和苯并三唑-1-基-氧三吡咯烷鏻六氟磷酸盐(PyBOP)添加到该系统中，将溶液在室温下搅拌过夜，然后将溶液浓缩，残余物纯化处理，得到所述CS-MDA；
合成路线如下所示：
Figure FDA0003358434900000021
5.根据权利要求4所述基于丙二醛响应的近红外分子探针的制备方法，其特征在于，所述CS-MDA的制备过程如下：
(1)在冰浴中将环己酮滴加到浓H2SO4中，在搅拌下加入化合物1，将反应混合物剧烈搅拌，并在60～100℃加热0.5～6小时，然后倒入冰水中，然后将沉淀物过滤并用水和石油醚快速洗涤，得到化合物2；
(2)将化合物2和化合物3溶解在含有AcOH的Ac2O中，然后将混合物反应加热至40～70℃保持30～120分钟，随后将反应体系用饱和食盐水和二氯甲烷萃取2～6次，通过硅胶色谱法用二氯甲烷/甲醇作为洗脱剂纯化残余物，得到绿色固体CS-NO2；
(3)在室温下将CS-NO2加入到二氯甲烷中，将水合肼和苯并三唑-1-基-氧三吡咯烷鏻六氟磷酸盐添加到该系统中，将溶液在室温下搅拌过夜，然后将溶液浓缩，残余物通过硅胶色谱法纯化，用乙酸乙酯作为洗脱剂，得到橙黄色固体CS-MDA。
6.根据权利要求4或5所述基于丙二醛响应的近红外分子探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，环己酮与浓H2SO4的体积比为1:5～20，浓H2SO4为质量分数为98.3％；化合物1与环己酮的质量体积比为1:0.5～2g/ml。
7.根据权利要求4或5所述基于丙二醛响应的近红外分子探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，化合物2和化合物3的摩尔比为1:1～2，洗脱剂中二氯甲烷/甲醇的体积比为50/1～10/1。
8.根据权利要求4或5所述基于丙二醛响应的近红外分子探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，CS-NO2与二氯甲烷的质量体积比为3～3.2：1mg/ml；苯并三唑-1-基-氧三吡咯烷鏻六氟磷酸盐和水合肼的质量体积比为1：4～6mg/μL。
9.根据权利要求1～3中任一项所述基于丙二醛响应的近红外分子探针的应用，其特征在于，以近红外分子探针(CS-R)为基础合成纳米探针NPs，所述纳米探针NPs由近红外分子探针(CS-R)和两亲聚合物DSPE-PEG2000自组装而成，该纳米探针NPs为球形结构，所述近红外分子探针(CS-R)为核心，所述两亲聚合物DSPE-PEG2000为表面修饰层；
所述近红外分子探针(CS-R)包括CS-MDA、CS-A、CS-B、CS-C中的任意一种。
10.根据权利要求9所述基于丙二醛响应的近红外分子探针的应用，其特征在于，所述纳米探针NPs的粒径为10～500nm。
11.根据权利要求9所述基于丙二醛响应的近红外分子探针的应用，其特征在于，所述纳米探针NPs的合成过程为：
(a)制备近红外分子探针(CS-R)；
(b)配制含CS-R和DSPE-PEG2000的四氢呋喃溶液；
(c)在圆底烧瓶中预先加入0.5～2ml含CS-R和DSPE-PEG2000的四氢呋喃溶液，超声处理1～10分钟，得到淡黄色溶液；
(d)将上述溶液快速与8～9.5ml去离子水混匀，超声5～20分钟，旋蒸除去多余的四氢呋喃溶剂，超滤浓缩，得到所述纳米探针NPs。
12.根据权利要求9所述基于丙二醛响应的近红外分子探针的应用，其特征在于，所述纳米探针NPs可用于MDA检测和活体成像，通过吸光度和荧光信号的变化来实现对MDA的高灵敏度、特异性检测。
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