CN106478505A - 一种双光子gsh探针及其制备与应用 - Google Patents

一种双光子gsh探针及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种式(I)所示双光子GSH探针及其制备与应用，本发明提供一种新型的化合物作为荧光探针，所用荧光探针的制备所需要的设备简单，操作过程简便，灵敏度与选择性良好，探针性质很稳定；与以往检测谷胱甘肽的荧光探针相比，具有双光子与双通道性能的优点。

Description

一种双光子GSH探针及其制备与应用
(一)技术领域
本发明涉及一种探针，特别涉及一种双光子GSH探针及其制备与应用。
(二)背景技术
谷胱甘肽是一种巯基化合物。由谷氨酸，半胱氨酸以及甘氨酸构成三肽结构。在人体内维护还原水平方面具有举足轻重的作用，是胞内具备一定的解毒作用的活性小分子。作为一种还原剂，谷胱甘肽可以防止细胞被活性氧自由基氧化，同时，谷胱甘肽的分泌水平与多种疾病相关，如肝炎，牛皮癣，癌症，艾滋病等诸多疾病都会伴随着谷胱甘肽的异常分泌。目前针对该物质的传统检测方法有比色法，电化学法，酶催化法以及高效液相色谱法等。但是这些方法不但复杂，而且灵敏性与专一性不高。荧光探针检测法具有快速响应以及专一性强等优点，经过不断地发展，已成为一种十分普遍的方法进行各种生物活性分子的检测。
目前，针对谷胱甘肽的传统检测方法如比色法，高效液相色谱法等，往往操作复杂，成本较大，同时检测的灵敏性与专一性均表现不佳。近年来，荧光探针一种新型的检测技术，具有高效，快捷，特异性强等优点。然而，就目前报导的谷胱甘肽检测探针而言，多数仍为短波激发与单一通道检测的阶段。考虑到谷胱甘肽的生物内源性，短波长激发的荧光探针，会导致激发光对细胞组织的损伤，而单检测通道荧光探针的检测的精确性，抗干扰性等相对较差，因此，设计一种针对谷胱甘肽检测的长波或双光子激发，同时具有双通道检测的探针具有很大的意义。
(三)发明内容
本发明目的是提对萘酰亚胺类荧光物质的自我π-π折叠荧光淬灭进行系统研究，并将这种淬灭体系应用于谷胱甘肽探针设计。其中探针结构如(I)所示。探针的制备方法简单，性质稳定，检测的精确度、准确度高，检测速度快。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种式(I)所示双光子GSH探针：
本发明提供一种用于制备式(I)所示双光子GSH探针的式(Ⅱ)所示中间体化合物，
式(Ⅱ)中，R为下列之一：
本发明还提供一种式(Ⅱ)所示中间体化合物的制备方法，所述方法为：(1)式(1)所示4-溴-1,8-萘二甲酸苷与3-氨基丙醇混合，于无水乙醇A中，加热回流反应，反应完全后，将反应液冷却至室温，过滤，滤饼用无水乙醇B洗涤后干燥，获得式(2)所示4-溴萘酰亚胺；所述4-溴-1,8-萘二甲酸苷与3-氨基丙醇投料物质的量之比为1-4:1(优选1.3:1)；所述无水乙醇A体积用量以4-溴-1,8-萘二甲酸苷物质的量计为1-20ml/g(优选5ml/g)；(2)将式(2)所示4-溴萘酰亚胺溶于无水甲醇，再加入碳酸钾，在0-100℃下搅拌2-48h(优选75℃搅拌24h)，反应液分离纯化(优选反应液加水后用二氯甲烷萃取，取有机相分别用水与饱和氯化钠溶液洗涤后用无水硫酸镁干燥，减压浓缩，再通过硅胶柱层析(洗脱液为二氯甲烷(DCM):甲醇(MEOH)＝100:1-20，v/v，优选100:1)，收集目标组分)得到式(II-1)所示化合物；所述式(2)所示4-溴萘酰亚胺与碳酸钾物质的量之比为1:2-6(优选1:3.75)；所述无水甲醇体积用量以式(2)所示4-溴萘酰亚胺质量计为10-50ml/g(优选18.75ml/g)；(3)将式(2)所示4-溴萘酰亚胺溶于苄胺，在10-100℃下搅拌1-24h(优选90℃搅拌24h)，反应液分离纯化(优选反应液加水后用二氯甲烷萃取，取有机相并分别用水与饱和氯化钠溶液洗涤后用无水硫酸镁干燥，减压浓缩，再通过硅胶柱层析(DCM:MEOH＝100:1-20，v/v，优选1:1)收集目标组分，得到式(II-5)所示化合物；所述苄胺体积用量以式(2)所示4-溴萘酰亚胺质量计为10-50ml/g(优选11.25ml/g)；
本发明还提供一种所述双光子GSH探针(I)的制备方法，所述方法为：(1)将式(II-1)和(II-5)所示化合物分别溶于二氯甲烷，再分别加入三乙胺，4-二甲氨基吡啶以及4-硝基氯甲酸苯酯，在室温下搅拌15min，反应液通过减压蒸馏除去溶剂，取浓缩液再通过硅胶柱层析(DCM:石油醚＝1:1，v/v)，收集目标组分，分别得到式(3a)和式(3e)所示化合物；所述三乙胺，4-二甲氨基吡啶以及4-硝基氯甲酸苯酯与式(II-1)或(II-5)所示化合物物质的量之比均为1.2:1-2:1-3:1-2(优选1.2:1:1:1)，所述二氯甲烷体积用量以式(II-1)或(II-5)所示化合物物质的量计为1-5ml/mmol(优选2ml/mmol)；(2)将式(3a)所示化合物溶于二氯甲烷a，加入三乙胺a和胱胺二盐酸盐，在室温下持续反应2-24h(优选6h)，向反应液中加入水后用二氯甲烷萃取，取有机相并依次用水和饱和氯化钠溶液洗涤后用无水硫酸镁干燥，减压蒸馏除去溶剂，取浓缩物重新溶于二氯甲烷b，加入三乙胺b和式(3e)所示化合物，在室温下搅拌过夜，向反应液中加入水后用二氯甲烷萃取，取有机相并用水洗后减压浓缩，最后通过硅胶柱层析(DCM:MEOH＝20:0.5-5，v/v，优选20:1)，收集目标组分，得到式(I)所示化合物；所述二氯甲烷a和二氯甲烷b体积用量以式(3a)所示化合物物质的量计均为1-50ml/mmol(优选23ml/mmol)，所述三乙胺a和三乙胺b与式(3a)所示化合物物质的量之比分别为1-5:1(优选1.5:1)和0.2-2:1(优选0.75:1)；所述胱胺二盐酸盐、式(3e)所示化合物与式(3a)所示化合物物质的量之比为1-4:0.1-2:1，优选2:1:1；
本发明还提供一种所述双光子萘酰亚胺二聚体的制备方法，所述方法为：(1)将式(II-1)和(II-4)所示化合物分别溶于二氯甲烷，再分别加入三乙胺，4-二甲氨基吡啶以及4-硝基氯甲酸苯酯，在室温下搅拌15min，反应液通过减压蒸馏除去溶剂，取浓缩液再通过硅胶柱层析(DCM:石油醚＝1:1，v/v)，收集目标组分，分别得到式(3a)和式(3d)所示化合物；所述三乙胺，4-二甲氨基吡啶以及4-硝基氯甲酸苯酯与式(II-1)或(II-4)所示化合物物质的量之比均为1.2:1-2:1-3:1-2(优选1.2:1:1:1)，所述二氯甲烷体积用量以式(II-1)或(II-4)所示化合物物质的量计为1-5ml/mmol(优选2ml/mmol)；(2)将式(3a)所示化合物溶于二氯甲烷c，加入三乙胺c和1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷，在室温下持续反应2-24h(优选6h)，向反应液中加入水后用二氯甲烷萃取，取有机相并依次用水和饱和氯化钠溶液洗涤后用无水硫酸镁干燥，减压蒸馏除去溶剂，取浓缩物重新溶于二氯甲烷d，加入三乙胺d和式(3d)所示化合物，在室温下搅拌过夜，向反应液中加入水后用二氯甲烷萃取，取有机相并用水洗后减压浓缩，最后通过硅胶柱层析(DCM:MEOH＝20:0.5-5，v/v，优选20:1)，收集目标组分，得到式(III-1)所示化合物；所述二氯甲烷c和二氯甲烷d体积用量以式(3a)所示化合物物质的量计均为1-50ml/mmol(优选23ml/mmol)，所述三乙胺c和三乙胺d与式(3a)所示化合物物质的量之比分别为1-5:1(优选1.5:1)和0.2-2:1(优选0.75:1)；所述1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷、式(3d)所示化合物与式(3a)所示化合物物质的量之比为1-4:0.1-2:1，优选2:1:1；
本发明还提供一种所述双光子GSH探针在检测谷胱甘肽中的应用，所述谷胱甘肽为250-10000μM谷胱甘肽缓冲溶液，检测限为0.34μM。
本发明如式(I)所示的化合物可作为针对谷胱甘肽特异性检测的荧光探针。探针是基于π-π折叠导致的荧光淬灭现象进行设计和应用。而式(II)与式(III)所示的化合物系列可用于针对荧光淬灭现象的研究。通过比较式(II)的萘酰亚胺单体的荧光强度和激发/发射波长，以及基于这些单体合成的式(III)所示的萘酰亚胺二聚体之间经π-π折叠导致的荧光淬灭现象，选择II-1和II-5为荧光基团构建探针。
本发明所述无水乙醇A和无水乙醇B均为无水乙醇，所述二氯甲烷a、二氯甲烷b、二氯甲烷c、二氯甲烷d均为二氯甲烷，所述三乙胺a、三乙胺b、三乙胺c、三乙胺d均为三乙胺，为了表述不同步骤用量不同而命名，字母本身没有含义。
本发明与现有技术相比，其有益效果体现在：
(1)本发明提供一种新型的化合物作为荧光探针，所用荧光探针的制备所需要的设备简单，操作过程简便，灵敏度与选择性良好，探针性质很稳定；
(2)与以往检测谷胱甘肽的荧光探针相比，具有双光子与双通道性能的优点。
(四)附图说明
图1为化合物II和III的荧光强度与紫外吸收图，A，B为式(II-1)-(II-6)中不同萘酰亚胺单体结构的紫外吸收，C,D,E为(II-1)-(II-6)、(Ⅲ-3)、(Ⅲ-6)、(Ⅲ-9)不同化合物单体的荧光发射图。
图2为本发明的GSH探针(I)与不同浓度谷胱甘肽反应的荧光强度变化图，A、B为激发波长365nm下的荧光光谱，C、D为激发波长450nm下的荧光光谱；激发下的最大信号随GSH浓度的变化图；A、C为全波长扫描，B、D为最大荧光发射强度随GSH浓度变化情况。
图3为本发明中的探针(I)性能检测图，A表示选择性实验结果，编号1～19依次为NaCl、KCl、MgSO4、FeCl2、CuSO4、Trp、Val、Phe、Ala、Ile、Tyr、Ser、Pro、Thr、Gly、Na2S、Cys、Hcy、GSH，激发波长为365nm，发射波长为450nm；B为5μM探针与1000μM GSH混合后荧光随时间变化曲线。
图4为探针(I)与不同浓度梯度GSH反应的荧光强度。A为探针浓度5μM，GSH浓度为2.5μM～20μM条件下，365nm激发下的荧光光谱图；B为450nm荧光强度随着GSH浓度的变化。
图5为探针(I)针对HeLa(人体宫颈癌)细胞的共聚焦荧光成像图。从左至右分别为蓝色通道成像图(405nm激发，430～460nm发射)，黄绿色通道成像图(488nm激发，510～560nm发射)，FRET通道(405nm激发，510～560nm发射)，三者的叠加的效果图，以及双光子成像通道(780nm激发，510～560nm发射)。从上至下横排分别为：仅通过探针(I)孵化后成像图、通过外界GSH与探针(I)共同孵化细胞后的成像图、经过硫醇抑制剂NEM与探针共同孵化后的效果图、同等浓度的DMSO代替探针对细胞进行孵化后的成像图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例所述室温为25℃。
实施例1萘酰亚胺系列单体化合物(II)的合成
(1)将4-溴-1,8-萘二甲酸苷10g(0.036mol，即化合物1)放置于100ml圆底烧瓶，加入50ml无水乙醇，再加入3-氨基丙醇3.51g(0.047mmol)，加热回流2小时，冷却至室温，将析出的固体进行过滤，滤饼用无水乙醇洗涤，干燥可得10.2g化合物2。
(2)将0.8g(2.4mmol)化合物2溶于15ml无水甲醇，再加入1.24g(9mmol)碳酸钾，在75℃环境下搅拌24h。将150ml水加入反应液，用250ml二氯甲烷萃取三次。合并有机相，并将其分别用水与饱和氯化钠溶液洗涤三次，用无水硫酸镁干燥，减压蒸馏浓缩，再通过硅胶柱层析(洗脱液DCM:MEOH＝100:1，v/v)，收集目标流出液，蒸除溶剂后得到化合物(II-1)(0.62g，78％)。同样条件下，将无水甲醇替换为无水乙醇获得化合物(II-2)(0.57g，66％)，替换为苯甲醇获得化合物(II-3)(0.65g，74％)。
核磁表征如下：
(II-1):1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.67–8.44(m,3H),7.69(dd,J＝8.3,7.4Hz,1H),7.04(d,J＝8.3Hz,1H),4.39–4.27(t,2H),4.14(s,3H),3.64–3.50(t,2H),1.98(dt,J＝11.7,6.0Hz,2H).
(II-2):1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.67–8.60(t,2H),8.58(d,J＝8.3Hz,1H),7.75–7.70(t,1H),7.05(d,J＝8.3Hz,1H),4.36(dd,J＝13.0,6.4Hz,4H),3.58(t,J＝5.4Hz,2H),2.00(dt,J＝11.6,5.8Hz,2H),1.63(t,J＝7.0Hz,3H).
(II-3):1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.71–8.61(m,2H),8.57(d,J＝8.3Hz,1H),7.77–7.69(t,1H),7.54(d,J＝7.3Hz,2H),7.50–7.39(m,3H),7.15(d,J＝8.3Hz,1H),5.40(s,2H),4.41–4.28(t,2H),3.64–3.54(t,2H),2.03–1.94(t,3H).
(3)将0.8g(2.4mmol)化合物2溶于9ml正丁胺，在90℃环境下搅拌5h。将150ml水加入反应液，用250ml二氯甲烷萃取三次。合并有机相，并将其分别用水与饱和氯化钠溶液洗涤三次，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩溶液，再通过硅胶柱层析(DCM:MEOH＝100:1，v/v)收集目标组分，蒸除溶剂，得到化合物(II-4)(0.61g，91％)。同样条件下，将正丁胺替换为苄胺获得化合物(II-5)(0.63g，66％)，替换为吗啉获得化合物(II-6)(0.58g，74％)。
核磁表征如下：
(II-4):1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.66(d,J＝8.2Hz,1H),8.39(d,J＝6.9Hz,1H),8.22(d,J＝8.5Hz,1H),7.70(t,J＝5.3Hz,1H),7.66–7.59(t,1H),6.71(d,J＝8.7Hz,1H),4.49(t,J＝5.1Hz,1H),4.10–4.01(t,2H),3.48(dd,J＝11.6,6.2Hz,2H),3.35–3.30(m,2H),1.82–1.72(m,2H),1.71–1.62(m,2H),1.42(m,J＝15.0,7.4Hz,2H),0.94(t,J＝7.4Hz,3H).
(II-5):1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.65–8.49(m,1H),8.43(d,J＝8.4Hz,1H),8.20(d,J＝8.1Hz,1H),7.62(dd,J＝8.2,7.6Hz,1H),7.46–7.32(m,5H),6.74(d,J＝8.5Hz,1H),5.91(t,J＝4.7Hz,1H),4.63(d,J＝5.2Hz,2H),4.38–4.21(t,2H),3.56(t,J＝5.5Hz,2H),2.05–1.91(m,2H).
(II-6):1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.51(d,J＝7.2Hz,1H),8.46(d,J＝8.0Hz,1H),8.38(d,J＝8.3Hz,1H),7.70–7.63(t,1H),7.18(d,J＝8.1Hz,1H),4.26(t,J＝6.2Hz,2H),4.06–3.95(t,4H),3.54(d,J＝4.3Hz,2H),3.37(s,1H),3.29–3.19(t,4H),1.98–1.87(m,
2H)
实施例2萘酰亚胺系列二聚体化合物(III)的合成
(1)详细制备过程如下所示：
将2.5mmol化合物(II-1)溶于50ml二氯甲烷，之后加入0.3g(0.03mol)三乙胺，0.3g(0.0025mol)4-二甲氨基吡啶以及11g(0.005mol)4-硝基氯甲酸苯酯，在室温下搅拌15min，反应液通过减压蒸馏除去溶剂，取浓缩液再通过硅胶柱层析(洗脱液，二氯甲烷(DCM):石油醚(PE)＝1:1，v/v)，收集目标组分，去除溶剂，可得到油状产物3a(0.76g，70％)。同样条件下，将化合物(II-1)依次替换为化合物(II-2)～(II-6)，分别获得产物3b(0.69g，62％)，产物3c(0.85g，67％)，产物3d(0.72g，61％)，产物3e(0.75g，59％)，产物3f(0.80g，66％)。
其中，3a与3e核磁表征如下：
3a:1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.54(m,J＝17.0,11.6,4.7Hz,3H),8.28–8.22(m,2H),7.68(t,J＝8.3,7.4Hz,1H),7.40–7.30(m,2H),7.02(d,J＝8.3Hz,1H),4.42(m,J＝6.2Hz,2H),4.35(m,J＝6.8Hz,2H),4.12(s,3H),2.23(m,J＝6.5Hz,2H).
3e:1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.61(d,J＝7.3Hz,1H),8.46(d,J＝8.4Hz,1H),8.35–8.20(m,2H),8.15(d,J＝8.0Hz,1H),7.69–7.59(m,1H),7.49–7.34(m,7H),6.78(d,J＝8.4Hz,1H),5.63(t,J＝5.0Hz,1H),4.64(d,J＝5.1Hz,2H),4.42(t,J＝6.2Hz,2H),4.37(t,J＝6.8Hz,2H),2.24(m,J＝6.5Hz,2H).
(2)
将化合物3a(1.3mmol)溶于30ml二氯甲烷，再加入200mg(2mmol)三乙胺，384mg(2.6mmol)1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷，在室温下持续反应6h，之后反应液加入150ml水，并用250ml二氯甲烷萃取三次，合并有机相并依次用水和饱和氯化钠溶液洗涤三次。用无水硫酸镁干燥，之后通过减压蒸馏除去溶剂，获得浓缩物。
取全部浓缩物重新溶于30ml二氯甲烷，加入0.1g(1mmol)三乙胺和1.3mmol化合物3d，在室温下搅拌过夜，反应液加入50ml水，用2×50ml二氯甲烷萃取，合并有机相并用3×100ml水洗，并通过减压蒸馏浓缩，最后通过硅胶柱层析(DCM:MEOH＝20:1，v/v)，收集目标组分并去除溶剂，得到产物(III-1)(0.56g，53％)。
同样条件下，将化合物3a替换为3b或3c，将化合物3d替换为3e或3f，分别获得产物(III-2)(0.51g，46％)，(III-3)(0.61g，58％)，(III-4)(0.54g，50％)，(III-5)(0.70g，63％)，(III-6)(0.64g，59％)，(III-7)(0.66g，57％)，(III-8)(0.76g，66％)，(III-9)(0.70g，60％)。
核磁表征如下：
(III-1):1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ8.52–8.37(m,4H),8.32(d,J＝8.4 Hz,1H),8.03(d,J＝8.3Hz,1H),7.60(t,J＝7.8 Hz,1H),7.48(t,J＝7.8 Hz,1H),6.94(d,J＝8.3Hz,1H),6.59(d,J＝8.5 Hz,1H),5.66–5.41(m,2H),4.20(m,J＝13.7,6.1 Hz,8H),4.08(s,3H),3.64–3.48(m,8H),3.37(m,J＝21.6,5.8 Hz,6H),2.03(t,J＝6.4 Hz,4H),1.79–1.69(m,2H),1.50(m,J＝15.0,7.5 Hz,2H),1.00(t,J＝7.4 Hz,3H).13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ164.46,164.29,163.85,163.69,160.68,156.70,149.52,134.36,133.34,131.39,130.91,129.61,129.15,128.51,125.92,125.76,124.38,123.28,122.74,122.11,119.98,114.79,109.69,105.09,104.09,70.18(d,J＝17.3 Hz),62.91(d,J＝17.1 Hz),56.13,43.35,40.75,37.29(d,J＝17.1 Hz),30.89,27.78(d,J＝6.0 Hz),20.30,13.81.
(III-2):1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ8.53–8.35(m,4H),8.27(d,J＝8.3 Hz,1H),8.13(d,J＝8.4Hz,1H),7.59(t,J＝7.8 Hz,1H),7.47(t,J＝7.8 Hz,1H),7.36(m,J＝12.9,7.4 Hz,4H),7.31–7.26(m,1H),6.92(d,J＝8.3 Hz,1H),6.59(d,J＝8.4 Hz,1H),6.10(s,1H),5.67–5.42(m,2H),4.56(d,J＝5.0Hz,2H),4.28–4.11(m,8H),4.06(s,3H),3.58(d,J＝26.1 Hz,8H),3.37(s,4H),2.14–1.94(m,4H).13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ164.33(d,J＝15.5Hz),163.72(d,J＝14.8 Hz),160.65,156.68,149.23,137.14,134.20,133.31,131.35,130.91,129.49,129.10,128.87,128.48,127.79,127.39,126.19,125.74,124.54,123.23,122.68,122.06,120.13,114.73,110.25,105.06,104.72,70.13(d,J＝19.5 Hz),62.89(d,J＝14.8 Hz),56.11,47.68,40.72,37.26(d,J＝15.5 Hz),27.75(d,J＝4.7 Hz).
(III-3):1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ8.48–8.32(m,5H),8.29(d,J＝8.3 Hz,1H),7.63–7.46(m,2H),7.11(d,J＝8.0 Hz,1H),6.91(d,J＝8.3 Hz,1H),5.55(s,2H),4.26–4.08(m,8H),4.05(s,3H),4.01–3.92(t,4H),3.64–3.50(m,8H),3.37(d,J＝4.8 Hz,4H),3.19(d,J＝4.0 Hz,4H),2.10–1.93(m,4H).13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ164.07(d,J＝10.4Hz),163.53(d,J＝6.7 Hz),160.55,156.57,155.41,133.21,132.29,131.25,130.91,129.83,129.56,129.01,128.36,125.93–125.42(m),123.05(d,J＝23.1 Hz),121.99,116.77,114.69(d,J＝3.8 Hz),105.00,70.09(d,J＝17.7 Hz),66.79,62.69(d,J＝9.5Hz),56.05,53.26,40.68,37.27,27.66.
(III-4):1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ8.45(d,J＝8.4 Hz,2H),8.42–8.36(t,2H),8.30(d,J＝8.3Hz,1H),8.03(d,J＝8.3 Hz,1H),7.58(t,J＝7.8 Hz,1H),7.46(t,J＝7.8Hz,1H),6.89(d,J＝8.3 Hz,1H),6.57(d,J＝8.5 Hz,1H),5.53(d,J＝3.4 Hz,2H),4.30–4.23(m,2H),4.19(m,J＝12.8,5.7 Hz,8H),3.58(d,J＝24.4 Hz,8H),3.42–3.27(m,6H),2.13–1.98(m,4H),1.80–1.68(m,2H),1.57(t,J＝7.0 Hz,3H),1.49(m,J＝15.0,7.5 Hz,2H),0.99(t,J＝7.4 Hz,3H).13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ164.37(d,J＝16.4 Hz),163.75(d,J＝17.5 Hz),160.08,156.69,149.55,134.32,133.37,131.32,130.87,129.58,129.17,128.61,125.97,125.59,124.33,123.29,122.68,122.04,119.97,114.46,109.60,105.64,104.04,77.29,77.04,76.78,70.16(d,J＝17.6 Hz),64.61,62.88(d,J＝15.5 Hz),43.33,40.73,37.25(d,J＝15.5 Hz),30.85,27.77(d,J＝5.9 Hz),20.27,14.49,13.78.
(III-5):1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ8.43(d,J＝7.9 Hz,2H),8.37(dd,J＝7.5,3.1Hz,2H),8.23(d,J＝8.4 Hz,1H),8.14(d,J＝8.4 Hz,1H),7.55(t,J＝7.8 Hz,1H),7.44(t,J＝7.8 Hz,1H),7.33(dt,J＝12.9,7.4 Hz,4H),7.26(dd,J＝8.5,6.2 Hz,1H),6.86(d,J＝8.3 Hz,1H),6.55(d,J＝8.5 Hz,1H),6.24(s,1H),5.66–5.50(m,2H),4.54(d,J＝5.1 Hz,2H),4.24(m,J＝13.9,6.9 Hz,2H),4.21–4.11(m,8H),3.62–3.48(m,8H),3.36(s,4H),2.12–1.92(m,4H),1.56(t,J＝7.0 Hz,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ164.31(d,J＝11.6Hz),163.69(d,J＝11.9 Hz),160.04,156.69,149.30,137.16,134.16,133.34,131.27,130.86,129.44,129.09,128.80,128.57,127.70,127.30,126.29,125.56,124.45,123.22,122.56,121.96,120.11,114.37,110.07,105.61,104.66,70.09(d,J＝18.1 Hz),64.59,62.84(d,J＝13.5Hz),47.58,40.68,37.20(d,J＝14.6 Hz),27.73(d,J＝4.7 Hz),14.45.
(III-6):1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ8.45(dd,J＝29.7,8.0 Hz,5H),8.33(d,J＝8.3Hz,1H),7.73–7.51(m,2H),7.15(d,J＝8.0 Hz,1H),6.94(d,J＝8.3 Hz,1H),5.58(s,2H),4.34–4.25(m,2H),4.19(dd,J＝15.4,6.1 Hz,8H),4.02–3.94(m,4H),3.63(s,4H),3.57(d,J＝4.4 Hz,4H),3.39(d,J＝4.8 Hz,4H),3.22(1,J＝4.0 Hz,4H),2.11–1.94(m,4H),1.59(t,J＝7.0 Hz,3H).13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ164.24(d,J＝18.1 Hz),163.70,160.12,156.67,155.51,133.43,132.42,131.39,131.05,129.94,129.70,129.23,128.65,125.95,125.68(d,J＝5.6 Hz),123.36,123.08,122.11,116.90,114.82,114.54,105.69,70.18(d,J＝15.1 Hz),66.88,64.64,62.75(d,J＝10.3 Hz),53.34,40.75,37.35,27.73,14.51.
(III-7):1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ8.47(t,J＝8.0 Hz,2H),8.39(d,J＝7.6 Hz,2H),8.29(d,J＝8.3 Hz,1H),8.03(d,J＝8.3 Hz,1H),7.58(t,J＝7.8 Hz,1H),7.52–7.29(m,6H),7.00(d,J＝8.3 Hz,1H),6.55(d,J＝8.5 Hz,1H),5.63–5.45(m,2H),5.28(s,2H),4.35–4.02(m,8H),3.59(m,J＝24.2Hz,8H),3.43–3.23(m,6H),2.14–1.93(m,4H),1.73(dd,J＝14.8,7.5 Hz,2H),1.48(dd,J＝15.0,7.4 Hz,2H),0.99(t,J＝7.4 Hz,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ164.20(d,J＝10.0 Hz),163.65(d,J＝8.9 Hz),159.68,156.67,155.50,135.45,133.27,132.42,131.46,131.05,129.94,129.69,129.25,128.85–128.38(m),127.48,125.90(d,J＝9.2 Hz),125.70,123.46,123.07,122.17,116.89,115.01,114.82,106.33,70.76,70.18(d,J＝14.6 Hz),66.87,62.73(d,J＝7.9 Hz),53.33,40.75,37.35,27.72.
(III-8):1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ8.54–8.44(3,2H),8.40(d,J＝7.6 Hz,2H),8.26(d,J＝8.3Hz,1H),8.11(d,J＝7.7 Hz,1H),7.58(t,J＝7.8 Hz,1H),7.53–7.26(m,11H),7.00(d,J＝8.3 Hz,1H),6.57(d,J＝8.4 Hz,1H),6.11(s,1H),5.79–5.49(d,2H),5.29(s,J＝3.5 Hz,2H),4.55(d,J＝5.1Hz,2H),4.28–4.09(m,8H),3.61(s,4H),3.55(d,J＝4.2 Hz,4H),3.37(s,4H),2.02(s,4H).13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ164.31(d,J＝19.1Hz),163.69(d,J＝20.8 Hz),159.64,156.71,149.24,137.14,135.45,134.20,133.22,131.40,130.91,129.48,129.18,128.67(dd,J＝33.0,15.3 Hz),127.78,127.43(d,J＝12.1 Hz),126.22,125.81,124.53,123.39,122.66,122.09,120.13,114.91,110.21,106.30,104.71,70.72,70.13(d,J＝17.6 Hz),62.85(d,J＝16.6 Hz),53.39,47.66,40.72,37.26(d,J＝17.8 Hz),27.74(d,J＝4.9 Hz).
(III-9):1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ8.55–8.46(m,3H),8.43(t,J＝7.0 Hz,2H),8.33(d,J＝8.3Hz,1H),7.62(dd,J＝14.3,7.2 Hz,2H),7.50(d,J＝7.2 Hz,2H),7.44(t,J＝7.3 Hz,2H),7.41–7.35(t,1H),7.14(d,J＝8.0 Hz,1H),7.05(d,J＝8.3 Hz,1H),5.61(s,2H),5.32(s,2H),4.18(dd,J＝13.2,6.7Hz,8H),4.04–3.93(t,4H),3.69–3.49(m,8H),3.40(d,J＝4.6 Hz,4H),3.21(s,4H),2.15–1.92(t,4H).13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ164.20(d,J＝10.0 Hz),163.65(d,J＝8.9 Hz),159.68,156.67,155.50,135.45,133.27,132.42,131.46,131.05,129.94,129.69,129.25,128.85–128.38(m),127.48,125.90(d,J＝9.2Hz),125.70,123.46,123.07,122.17,116.89,115.01,114.82,106.33,70.76,70.18(d,J＝14.6 Hz),66.87,62.73(d,J＝7.9 Hz),53.33,40.75,37.35,27.72.
实施例3双光子GSH探针(I)的合成
将化合物3a(585mg，1.3mmol)溶于30ml二氯甲烷，加入三乙胺(200mg，2mmol)和胱胺二盐酸盐(585mg，2.6mmol)，在室温下持续反应6h，向反应液中加入150ml水，并用250ml二氯甲烷萃取三次，合并有机相并依次用水和饱和氯化钠溶液洗涤三次。用无水硫酸镁干燥有机相，之后通过减压蒸馏除去溶剂，取浓缩物重新溶于30ml二氯甲烷，加入三乙胺(0.1g，1mmol)和化合物3e(582mg，1.3mmol)，在室温下搅拌过夜。向反应液中加入50ml水，用2×50ml二氯甲烷萃取，合并有机相并用3×100ml水洗，通过减压蒸馏浓缩，最后通过硅胶柱层析(DCM:MEOH＝20:1，v/v)收集Rf值为0.4的目标组分并去除溶剂，得到探针(I)(0.58g，53％)。
核磁表征如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.51(m,J＝15.8,7.7Hz,4H),8.36(d,J＝8.3Hz,1H),8.14(d,J＝8.2Hz,1H),7.65(t,J＝7.7Hz,1H),7.56(t,J＝7.8Hz,1H),7.47–7.29(m,5H),6.99(d,J＝8.2Hz,1H),6.69(d,J＝8.3Hz,1H),5.89(s,1H),5.30(t,J＝21.6Hz,2H),4.60(d,J＝4.7Hz,2H),4.21(d,J＝20.5Hz,8H),4.11(s,3H),3.55–3.35(m,4H),2.75(dd,J＝13.1,6.4Hz,4H),2.05(s,4H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ164.39(d,J＝16.4Hz),163.78(d,J＝15.9Hz),160.72,156.55,149.30,137.16,134.27,133.38,131.41,130.99,129.54,129.14,128.90,128.56,127.83,127.43,126.28,125.78,124.60,123.28,122.71,122.07,120.20,114.74,110.27,105.12,104.78,63.74–63.44(m),63.07(d,J＝20.3Hz),56.14,53.40,47.73,39.76,38.18,37.25(d,J＝9.8Hz),27.72.
实施例4：化合物紫外吸收与荧光强度测量
将实施例1制备的化合物(II-1)-化合物(II-6)及实施例3制备的化合物(III-1)-(III-9)分别用二甲基亚砜(DMSO)配制成10mM的化合物溶液，将该溶液通过乙腈(CH3CN)稀释至50μM的化合物稀释溶液，在ep管中分别加入100μL PBS缓冲液，80μL的CH3CN/水(1:1，v/v)溶液，以及20μL上述化合物的稀释溶液，最终制成各个化合物终浓度为5μM的样品溶液。将样品溶液200μL分别加入96孔筛板中，通过酶标仪在37℃下观测紫外吸收并根据不同化合物设定激发波长以检测荧光强度，结果见图1所示。
如图1所示，当萘酰亚胺单体的4位为不同醇类取代时(图1中A，C)，其紫外吸收最大值均十分接近(360～365nm)，其荧光强度最大值则为12000～17000，波长为450nm。与之相对的，当4位为不同胺类取代时(图1中B，D)，其最大吸收为400～450nm，发射波长分别为540nm和530nm以及550nm。(II-6)(图1中E)的荧光强度约为150，远远弱于(II-4)与(II-5)的强度(5500～5700)。之后将这些荧光单体与二聚体进行比较，可以发现当两大类萘酰亚胺单体(醇类取代与胺类取代)相连形成新的二聚体化合物时，醇类取代的萘酰亚胺单体原本的450nm的强烈荧光基本被淬灭，类似的，作为黄绿色荧光基团的化合物(II-4)与(II-5)，当与醇类修饰的萘酰亚胺化合物相连时，其原本的530～540nm处的黄绿荧光也被淬灭。由于化合物(II-6)本身的荧光较弱，所以与之相连的二聚体在550nm处相对淬灭程度较小，且从荧光光谱来看，也一定程度受到来自450nm蓝色荧光的影响。但是尽管如此，二聚体在550nm处荧光强度依旧弱于其单体。这些实验结果充分表明萘酰亚胺二聚体对其单个荧光具有较强的淬灭作用。
实施例5：萘酰亚胺二聚体的配体间距对荧光淬灭的影响探究
为了进一步研究分子的自我淬灭机制对FRET现象的影响，对萘酰亚胺二聚体进行了分子动态模拟研究。其中模拟工作通过YASARA分子模拟程序(版本15.4.17)(Krieger Eet al,2002)进行。在该软件上画出分子结构之后进行能量最小化的模拟，每个化合物的模拟时间为10ns，模拟的体系分别为真空状态和溶解于MeCN/PBS＝1:1，v/v的状态，为了消除偶然因素以及保持结果的一致性，所有性能的计算均在分子达到平衡后的最后5ns的运动轨迹进行，每一项性能的分析均是通过各个变量与其平均值的比较来进行。得出配体间距与双萘酰亚胺化合物中黄绿色信号部分(530nm或540nm)荧光强度的关系。
通过对以上平行化合物的最低能量模拟(表1)，可以看出在真空环境下，所有化合物的两个萘酰亚胺配体间的距离比较接近，处于到之间。然而当在MECN:PBS＝1:1(v/v)的环境下，Q和F的距离大于在这个距离下FRET效应产生(除了(III-3)，(III-6)，(III-9))。Q-F配体间距最大的化合物(I)，在530～540nm之间具有明显大于其他配体的荧光强度。(III-2)，(III-6)，(III-4)具有相对较强的荧光强度，也被证实具有较大的Q-F间距相对的，(III-1)，(III-3)，(III-5)的Q-F间距较短也导致其相对较弱的FRET效应。以上的模拟结果体现了较长的配体间距往往伴随着较高的荧光强度(FRET效应)，而随着间距变小，配体折叠导致的淬灭效应加剧从而使FRET荧光减弱。另外，由于作为F配体的(II-6)本身的荧光强度远远弱于(II-4)和(II-5)，同时它的最佳激发与供体荧光的发射波长吻合度不高，因此，(III-3)，(III-6)，(III-9)的FRET荧光与配体间距的问题暂时无法通过以上规律解释。
表1各个双萘酰亚胺化合物通过YASARA分子模拟程序
实施例6：探针(I)对不同浓度梯度GSH的检测实验
将实施例3制备的探针(I)用DMSO配制成10mM的探针溶液，继而通过MECN稀释至50μM的探针样品溶液。将谷胱甘肽(GSH)用pH7.4、20mM的PBS缓冲液配制不同浓度(250μM，500μM，750μM，1000μM，1500μM，2000μM，3000μM，4000μM，6000μM，8000μM，10000μM)的GSH溶液。
在ep管中分别加入80μL、pH 7.4、20mM的PBS缓冲液，80μL 50μM的MeCN水溶液(1:1，v/v)，20μL上述探针样品溶液以及20μL上述不同梯度的GSH溶液，37℃摇床反应150min，通过酶标仪检测荧光强度变化。
从检测数据图2来看，随着GSH浓度的增加，荧光强度也在不断增强。不论是以365nm或是450nm激发，两个信号均在GSH为1000μM的浓度下达到最大，之后荧光增强的趋势几乎平缓。蓝色荧光信号增强达到100倍以上，而黄绿色荧光信号也达到初始水平的4倍以上。说明探针对于不同浓度的GSH具有良好的信号响应。
实施例7：探针(I)选择性实验
将实施例3制备的探针(I)用DMSO配制成10mM的探针溶液，继而通过MECN稀释至50μM的探针样品溶液。分别配制2000μM的NaCl、KCl、MgSO4、FeCl2、CuSO4、Trp、Val、Phe、Ala、Ile、Tyr、Ser、Pro、Thr、Gly、Na2S、Cys、Hcy、GSH水溶液作为样品1-样品19。在ep管中分别加入80μL、pH 7.4、20mM的PBS缓冲液，80μL的50μM的MeCN水溶液(1:1，v/v)，20μL上述探针样品溶液以及20μL上述样品1-样品19，37℃摇床反应150min，通过酶标仪检测荧光强度变化，激发波长为365nm，发射波长为450nm。结果见图3中A所示。
如图3中A结果可知，常见金属离子和多数氨基酸与探针混合后无反应，信号基本无变化。Na2S(样品16)在水溶液中产生HS-，对二硫键具有很弱的还原性，具有较小的阳性信号。Cys以及Hcy属于常见的硫醇小分子物质，其结构类似于GSH，与(I)结合后发生较弱的反应(样品17，18)，使荧光信号一定范围内有增强。当探针与GSH结合后(样品19)，会产生强烈信号，其强度远远强过其他硫醇类物质。初步确定探针具有良好的检测专一性。
实施例8：探针(I)与GSH反应时间测定
将实施例3制备的探针(I)用DMSO配制成10mM的探针溶液，继而通过MECN稀释至50μM的探针样品溶液。用pH 7.4、20mM的PBS缓冲液配制10mM的GSH溶液。在ep管中分别加入80μL、pH 7.4、20mM的PBS缓冲液，80μL 50μM的MeCN水溶液(1:1，v/v)，20μL上述探针样品溶液以及20μL上述GSH溶液，37℃摇床反应，每隔20min取样测量。
如图3中B结果可以看出当探针与GSH作用时间在120min内，探针的荧光强度随着时间的变化趋势近似于线性增强，之后的时间中荧光强度变化逐渐平缓，到达150min信号达到最大，说明反应已达到平衡。继续增加反应时间基本无法令荧光信号产生进一步增强。本次实验结果也表明探针(I)对于GSH的检测的最佳时间为150min左右。
实施例9：探针(I)检测限的测定
将实施例3制备的探针(I)用DMSO配制成10mM的探针溶液，继而通过MECN稀释至50μM探针样品。用pH 7.4、20mM的PBS缓冲液配制不同浓度梯度(25μM，50μM，75μM，100μM，125μM，150μM，175μM，200μM)GSH溶液。在ep管中分别加入80μL PBS缓冲液，80μL50μM的MeCN水溶液(1:1，v/v)，20μL上述探针探针样品溶液以及20μL上述不同梯度的GSH溶液，37℃摇床反应150min，通过酶标仪检测荧光强度变化。
如图4，(B中每个点都取自A中不同GSH浓度下450nm处的荧光值)通过检出限(LOD)的计算公式：C＝3Sb/m(Sb为空白组的标准偏差，m为梯度斜率)对探针做了检测下限测定实验。由于探针在检测通道1(365nm激发，450nm发射)具有更好的灵敏性，因此本次试验针对此通道进行检测限的测定。检测限为：3S/K＝0.34μM，该探针具有良好的GSH检测灵敏度。
实施例10：探针(I)共聚焦显微成像实验
将HeLa(人体宫颈癌)细胞接种至含有10％牛胎盘血清+100.0mg/L链霉素+100IU/mL盘尼西林的细胞培养基中，再加入1ml、5μM探针的DMSO溶液，1ml、50μM的GSH溶液(pH7.4、20mM的PBS缓冲液配制)，在37℃以及5％CO2的条件下培养2h。以同样条件下不添加探针的DMSO组被用作背景对照。细胞荧光成像通道包括蓝色通道(λex＝405nm，λem＝430～460nm)，黄绿色通道(λex＝488nm，λem＝510～560nm)，FRET通道(λex＝405nm，λem＝510～560nm)，双光子通道(λex＝780nm，λem＝510～560nm)。
由成像结果图5可知探针可以顺利地进入HeLa细胞，可以较为清晰的辨别细胞的形态，说明探针具有良好的生物相容性。在未有外加GSH处理的情况下，无论是蓝色通道还是黄绿色通道，由于HeLa细胞内含有高含量的GSH，探针在细胞内均产生较强的信号，且反应较为彻底(加入外源性GSH荧光未显著增加)，说明探针具有良好的内源GSH检测性能，同时可用于双通道荧光检测。随着NEM(一种生物硫醇化合物的抑制剂)的加入，GSH的产生被抑制，间接导致荧光变弱。同时，在双光子的激发条件下，探针针对内源性GSH也具有良好的荧光报道性能，说明探针具有双光子检测能力。

Claims (8)

1.一种式(Ⅰ)所示双光子GSH探针：
2.一种用于制备所述双光子GSH探针的式(Ⅱ)所示中间体化合物，
式(Ⅱ)中，R为下列之一：
3.一种权利要求2所述中间体化合物的制备方法，其特征在于所述方法为：(1)将4-溴-1,8-萘二甲酸苷与3-氨基丙醇混合，于无水乙醇A中，加热回流反应，反应完全后，将反应液冷却至室温，过滤，滤饼用无水乙醇B洗涤后干燥，获得4-溴萘酰亚胺；所述4-溴-1,8-萘二甲酸苷与3-氨基丙醇投料物质的量之比为1-4:1；所述无水乙醇A体积用量以4-溴-1,8-萘二甲酸苷物质的量计为1-20ml/g；(2)将4-溴萘酰亚胺溶于无水甲醇，再加入碳酸钾，在0-100℃下搅拌2-48h，反应液分离纯化得到式(II-1)所示化合物；所述4-溴萘酰亚胺与碳酸钾物质的量之比为1:2-6；所述无水甲醇体积用量以4-溴萘酰亚胺质量计为10-50ml/g；(3)将4-溴萘酰亚胺溶于苄胺，在10-100℃下搅拌1-24h，反应液分离纯化，得到式(II-5)所示化合物；所述苄胺体积用量以4-溴萘酰亚胺质量计为10-50ml/g；
4.一种权利要求1所述双光子GSH探针的制备方法，其特征在于所述方法为：(1)将式(II-1)和(II-5)所示化合物分别溶于二氯甲烷，再分别加入三乙胺，4-二甲氨基吡啶以及4-硝基氯甲酸苯酯，在室温下搅拌15min，反应液通过减压蒸馏除去溶剂，取浓缩液再通过硅胶柱层析，收集目标组分，分别得到式(3a)和式(3e)所示化合物；所述三乙胺，4-二甲氨基吡啶以及4-硝基氯甲酸苯酯与式(II-1)或(II-5)所示化合物物质的量之比均为1.2:1-2:1-3:1-2，所述二氯甲烷体积用量以式(II-1)或(II-5)所示化合物物质的量计为1-5ml/mmol；(2)将式(3a)所示化合物溶于二氯甲烷a，加入三乙胺a和胱胺二盐酸盐，在室温下持续反应2-24h，向反应液中加入水后用二氯甲烷萃取，取有机相并依次用水和饱和氯化钠溶液洗涤后用无水硫酸镁干燥，减压蒸馏除去溶剂，取浓缩物重新溶于二氯甲烷b，加入三乙胺b和式(3e)所示化合物，在室温下搅拌过夜，向反应液中加入水后用二氯甲烷萃取，取有机相并用水洗后减压浓缩，最后通过硅胶柱层析，得到式(I)所示化合物；所述二氯甲烷a和二氯甲烷b体积用量以式(3a)所示化合物物质的量计均为1-50ml/mmol，所述三乙胺a和三乙胺b与式(3a)所示化合物物质的量之比分别为1-5:1；所述胱胺二盐酸盐、式(3e)所示化合物与式(3a)所示化合物物质的量之比为1-4:0.1-2:1；
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(1)所述三乙胺，4-二甲氨基吡啶以及4-硝基氯甲酸苯酯与式(II-1)或(II-5)所示化合物物质的量之比均为1.2:1:1:1，所述二氯甲烷体积用量以式(II-1)或(II-5)所示化合物物质的量计为2ml/mmol。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(2)二氯甲烷a和二氯甲烷b体积用量以式(3a)所示化合物物质的量计均为23ml/mmol，所述三乙胺a和三乙胺b与式(3a)所示化合物物质的量之比分别为1.5:1和0.75:1；所述胱胺二盐酸盐、式(3e)所示化合物与式(3a)所示化合物物质的量之比为2:1:1。
7.一种权利要求1所述双光子GSH探针在检测谷胱甘肽中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述谷胱甘肽为250-10000μM谷胱甘肽缓冲溶液。
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