CN105802606A - 一种含巯基氨基酸的荧光探针的制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可以用于半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷甘胱肽荧光识别的新型化合物，具体涉及一种新型荧光探针的制备方法及其应用，属于化学分析检测技术领域。其分子结构式如下：该荧光探针用于环境或生物样品中的半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷甘胱肽的荧光传感分析，选择性好，抗干扰能力强，可以灵敏快速地从多种氨基酸中区分出含巯基氨基酸，具有很好的应用前景。

Description

一种含巯基氨基酸的荧光探针的制备和应用

技术领域

本发明涉及的是化学分析检测技术领域，具体涉及一种新型的含巯基氨基酸荧光探针的制备方法以及该荧光探针在检测半胱氨酸、同型半胱氨酸以及谷甘胱肽方面的应用。

背景技术

生物硫醇与生物的生命活动有着密切相关的联系。半胱氨酸(Cysteine，Cys)是一种人体内常见的氨基酸，它参与人体代谢过程，具有强大的生理功能。同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)是一种与半胱氨酸差别很小的氨基酸，它是由体内的重要氨基酸蛋氨酸转化过来的。医学研究表明它们在生物体内含量变化可以作为诊断疾病的依据，例如肾功能衰竭、老年痴呆症、帕金森疾病、心血管疾病、冠心病等。另外，谷甘胱肽(Glutathione，GSH)存在于几乎生物体内的每一个细胞，能帮助保持正常的免疫系统的功能，并具有抗氧化作用和解毒作用。因此，这三种生物体内含巯基的氨基酸的检测在生物科学、医学方面具有重大的意义。目前常用的分析检测技术有高效液相色谱法、毛细管电泳法、电化学检测、光学分析和质谱鉴定，然而这些方法无法在活细胞中实现检测。荧光分子探针不仅具有很高的灵敏度和很好的选择性，而且能够在活细胞中检测分析物，所以研究者们将荧光分子探针技术应用于对体外或者细胞内的半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷甘胱肽的监测或者细胞荧光成像。目前已报导的探针大多基于Michael加成、醛环化反应和裂解反应等。其中，在荧光分子内引入2,4-二硝基苯磺酰胺基团淬灭荧光，然后在含巯基氨基酸的诱导下发生的裂解，使荧光得以恢复，是一种特别有效的方法。这类荧光探针大部分水溶解性较差，只能在有机溶剂或者有机溶剂与水的混合溶剂中对半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷甘胱肽进行监测，使其在生物样品或者活体中的应用受到了限制，因此研发水溶液较高的荧光探针具有重要意义。

发明内容

本发明目的之一是提供一种合成简单、反应条件温和、成本较低的荧光探针合成方法；目的之二是提供一种灵敏度高、选择性好，抗干扰能力强，能够实现荧光法检测含巯基氨基酸的荧光探针。

本发明使用荧光法检测含巯基氨基酸，以邻苯二甲酰亚胺衍生物为荧光团，以2,4-二硝基苯磺酰胺基团为含巯基氨基酸的识别基团。

本发明解决问题采取的技术方案为，一种荧光检测含巯基氨基酸荧光探针，其分子结构式为，该荧光探针的合成路线如下，

具体制备方法包括以下步骤：1)将3-硝基邻苯二甲酸酐溶解于乙酸中，缓慢加入正丁胺，室温下搅拌10min后，加热升温，120℃控温回流2.5h。反应结束后，冷却至室温，将反应液倒入冰水中，待固体析出后，抽滤并用冷水洗涤3次，得粗产物为白色固体，无需进一步纯化，直接进行下一步。2)将上一步所得粗产物1溶解于甲醇中，加入催化量的Pd/C，将体系抽真空，通入氢气，加热搅拌，控温65℃，12h后停止反应，抽滤除去固体催化剂。将滤液减压旋干，经层析柱分离得目标产物。3)将上步得到产物2溶解在50％硫酸溶液中，冰水浴下缓慢加入亚硝酸钠溶液，继续搅拌30min后，换油浴加热，控温90℃反应1h。停止加热，将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后，减压旋干，经层析柱进一步纯化得目标产物。4)将上步得到的产物3溶解于二氯甲烷中，加入三乙胺，在冰水浴中搅拌5min后，缓慢加入2，4-二硝基苯磺酰氯的二氯甲烷溶液，继续搅拌2h。反应停止后，用水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后经层析柱分离得探针分子。在本说明书的实施例中更详细地说明了该探针的合成和检测方法。

本发明的荧光分子探针使用方法如下，将探针分子溶解在含有20％乙腈、pH为7.4的HEPES缓冲溶液中，室温下进行测试。当加入含巯基氨基酸时，由于2,4-二硝基苯磺酰胺基团可以在含巯基氨基酸的诱导下发生的裂解，使荧光得以恢复。探针分子与含巯基氨基酸作用原理如下，

本发明的含巯基氨基酸荧光探针的具体特征如下：探针分子荧光发射峰在516nm处，与含巯基氨基酸作用后，探针分子在516nm处的发射峰增强，荧光强度增强了80倍以上。

本发明所述的探针分子合成简单，成本较低，对含巯基氨基酸的选择性好、抗干扰能力强、响应速度快使得该荧光探针在生物化学，环境科学等领域具有实际的应用价值。

附图说明

图1为本发明荧光探针的选择性，荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在HEPES缓冲溶液(20mM，V_乙腈/V_HEPES＝2/8，pH＝7.4)中，与不同氨基酸作用后的荧光光谱，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图2为本发明荧光探针的抗干扰能力，半胱氨酸与其他氨基酸共存，与荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在缓冲溶液(V_乙腈/V_HEPES＝2/8，pH＝7.4)中作用后的荧光强度比值(I/I₀)柱状图。

图3为本发明的荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在HEPES缓冲溶液(20mM，V_乙腈/V_HEPES＝2/8，pH＝7.4)中，与不同浓度半胱氨酸作用后的荧光光谱变化，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图4为本发明的荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在HEPES缓冲溶液(20mM，V_{乙 腈}/V_HEPES＝2/8，pH＝7.4)中，与半胱氨酸浓度的线性关系，横坐标为半胱氨酸浓度，纵坐标为荧光强度。

图5为本发明的荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在HEPES缓冲溶液(20mM,V_乙腈/V_HEPES＝2/8，pH＝7.4)中，与不同浓度同型半胱氨酸作用后的荧光光谱变化，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图6为本发明的荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在HEPES缓冲溶液(20mM，V_{乙 腈}/V_HEPES＝2/8，pH＝7.4)中，与同型半胱氨酸浓度的线性关系，横坐标为同型半胱氨酸浓度，纵坐标为荧光强度。

图7为本发明的荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在HEPES缓冲溶液(20mM,V_乙腈/V_HEPES＝2/8，pH＝7.4)中，与不同浓度谷甘胱肽作用后的荧光光谱变化，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图8为本发明的荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在HEPES缓冲溶液(20mM，V_{乙 腈}/V_HEPES＝2/8，pH＝7.4)中，与谷甘胱肽浓度的线性关系，横坐标为谷甘胱肽浓度，纵坐标为荧光强度。

图9为本发明的荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在HEPES缓冲溶液(20mM，V_{乙 腈}/V_HEPES＝2/8，pH＝7.4)中，与半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷甘胱肽作用过程中荧光强度随时间的变化，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度。

图10为本发明的荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在不同pH值缓冲溶液中，与半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷甘胱肽作用前后的荧光强度，横坐标为pH，纵坐标为荧光强度。

具体实施方式

实施例1：化合物1的合成

3-硝基邻苯二甲酸酐(1.9361g,10mmol)溶于20ml乙酸中，缓慢加入正丁胺(1.0951g,15mmol)，室温下搅拌10min后，加热升温，120℃回流2.5h。反应结束后，冷却至室温，将反应液倒入50ml冷水中，待固体完全析出后，减压抽滤，并用冷水洗涤滤饼三次(9ml×3)，得化合物1，为白色固体。产量：2.1252g。产量：85.7％。化合物1表征如下:1HNMR(500MHz,DMSO):δH8.27(d,J＝8.1Hz,1H),8.16(d,J＝7.5Hz,1H),8.05(t,J＝7.8Hz,1H),3.57(t,J＝7.1Hz,2H),1.55–1.61(m,2H),1.39–1.20(m,2H),0.90(t,J＝7.4Hz,3H).13CNMR(126MHz,DMSO)δC:166.51,163.86,144.63,136.54,134.05,128.62,127.17,123.50,38.13,30.24,19.94,13.94.

实施例2：化合物2的合成

上步所得化合物1(0.4964g,2mmol)溶于15ml甲醇，加入10％w/wPd/C(0.0496g,5mol％)，将体系抽真空，通入氢气并搅拌，65℃下回流12h。反应停止后，减压抽滤除去固体催化剂，所得滤液减压旋蒸除去溶剂，经层析柱分离得化合物2。产量：0.6240g。产量：71.5％。化合物2表征如下：1HNMR(500MHz,CDCl3)δ7.42(dd,J＝8.3,7.1Hz,1H),7.16(d,J＝7.6Hz,1H),6.86(d,J＝8.8Hz,1H),5.13(s,1H),3.65(t,J＝7.3Hz,2H),1.63–1.70(m,2H),1.35–1.42(m,2H).0.95(t,J＝7.4Hz,3H).13CNMR(126MHz,DMSO)δC:170.38,168.77,145.15,135.02,132.86,120.96,112.58,111.38,37.37,30.76,20.09,13.69.

实施例3：化合物3的合成

将上步所得化合物2溶于10ml50％硫酸中，0℃冰水浴下搅拌，缓慢滴加亚硝酸钠水溶液(0.0692mg，1mmol，2mL水)。继续在0℃下搅拌30min后，加热升温至90℃，继续反应1h。反应结束后，将反应液倒入50ml水中，乙酸乙酯萃取3次(20mL×3)，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后，旋蒸除去溶剂，真空干燥后经柱层析分离得到化合物3。产量：0.1862g。产率：85.4％。化合物3表征如下：1HNMR(500MHz,CDCl3)δ7.70(s,1H),7.56(t,J＝7.6Hz,1H),7.36(d,J＝7.2Hz,1H),7.15(d,J＝8.4Hz,1H),3.65(t,J＝7.3Hz,2H),1.68–1.62(m,2H),1.40–1.32(m,2H),0.95(t,J＝7.4Hz,3H).13CNMR(126MHz,DMSO)δC:170.51,167.91,154.60,136.14,132.11,122.53,115.80,114.63,37.49,30.62,19.87,13.40.

实施例4：探针分子的合成

将上步所得化合物3(100mg,0.31mmol)溶于10ml二氯甲烷中，缓慢滴加入三乙胺，0℃冰水浴下搅拌5min后，将2，4-二硝基苯磺酰氯(93.2mg,0.62mmol)溶解于3ml二氯甲烷中，逐滴滴加入体系，0℃下继续搅拌2h。反应结束后，经水洗，无水硫酸钠干燥后，旋蒸除去溶剂，经柱层析分离得到探针分子。产量：0.6240g。产率：71.5％。探针分子表征如下：HRMS(EI)m/z:calcdforC20H18N2O4[M+Na]+,325.1504；found,325.1503.FT-IR(KBr,cm-1),3,424,3,098,2,929,1,648,1,582,1,383.,1HNMR(400MHz,CDCl3,TMS):δH8.61(m,1H),8.54(d,1H),8.45(m,1H),7.72(m,1H),7.22(d,1H),4.47(t,2H),3.99(t,2H),3.27(t,4H),3.22(t,4H).13CNMR(100MHz,CDCl3):δC165.44,165.01,133.04,131.46,130.76,130.03,126.13,125.66,122.92,116.17,114.96,62.11,54.43,46.22,and42.76.

实施例5：本发明含巯基氨基酸荧光探针的应用

将探针溶于缓冲溶液(V_乙腈/V_HEPES＝2/8，pH＝7.4)中配制成5.0×10^-6mol/L的溶液，向溶液中加入Asp,Ala,Val,Phe,His,Leu,Ser,Ile,Trp,Lys,Arg,Pro,Gly,Met,Tyr,Glu，Thr没有引起荧光的变化，加入Cys，Hcy，GSH后引起了荧光变化，该荧光探针对含巯基氨基酸表现出高灵敏度、高选择性的识别。当Cys，Hcy，GSH分别与干扰物质Asp,Ala,Val,Phe,His,Leu,Ser,Ile,Trp,Lys,Arg,Pro,Gly,Met,Tyr,Glu，Thr共存时，探针不受干扰因素的影响，表现出来很好的抗干扰能力。探针分子在pH为6至11的范围内都可以对含巯基氨基酸选择性识别，表现出了较宽的应用范围。

Claims (3)

1.一种硫醇荧光探针，其结构为：

2.如权利要求1所述的硫醇荧光探针的制备方法，其特征在于按以下步骤进行制备：

(a)将3-硝基邻苯二甲酸酐溶解于乙酸中，缓慢加入正丁胺，室温下搅拌10min后，加热升温，120℃控温回流2.5h。反应结束后，冷却至室温，将反应液倒入冰水中，待固体析出后，抽滤并用冷水洗涤3次，得粗产物为白色固体，无需进一步纯化，直接进行下一步。

(b)将上一步所得粗产物1溶解于甲醇中，加入催化量的Pd/C，将体系抽真空，通入氢气，加热搅拌，控温65℃，12h后停止反应，抽滤除去固体催化剂。将滤液减压旋干，经层析柱分离得目标产物。

(c)将上步得到产物2溶解在50％硫酸溶液中，冰水浴下缓慢加入亚硝酸钠溶液，继续搅拌30min后，换油浴加热，控温90℃反应1h。停止加热，将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后，减压旋干，经层析柱进一步纯化得目标产物。

(d)将上步得到的产物3溶解于二氯甲烷中，加入三乙胺，在冰水浴中搅拌5min后，缓慢加入2，4-二硝基苯磺酰氯的二氯甲烷溶液，继续搅拌2h。反应停止后，用水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后经层析柱分离得探针分子。

3.根据权利要求1所述的硫醇荧光探针的用途，其特征在于该硫醇荧光探针用于环境或生物样品中半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷甘胱肽的荧光检测和分析。