CN108727372B

CN108727372B - 一种快速识别谷胱甘肽的荧光探针及其制备方法

Info

Publication number: CN108727372B
Application number: CN201810636563.8A
Authority: CN
Inventors: 佘能芳; 任瑞; 孙琦
Original assignee: Central China Normal University
Current assignee: Central China Normal University
Priority date: 2018-06-20
Filing date: 2018-06-20
Publication date: 2020-12-25
Anticipated expiration: 2038-06-20
Also published as: CN108727372A

Abstract

本发明公开了一种快速识别谷胱甘肽的荧光探针及其制备方法，该种荧光探针通过具有较强吸电子能力的2，4‑二硝基苯磺酰基识别基团和氮杂环丁烷基能够与谷胱甘肽快速反应，同时具有较强荧光性的萘啶类衍生物，可以生成具有强荧光性的反应产物，灵敏度高，响应速度快；由于该荧光探针具有较强的抗干扰能力，能够特异性识别谷胱甘肽，适用于各种干扰强度较大样品的谷胱甘肽检测。

Description

一种快速识别谷胱甘肽的荧光探针及其制备方法

技术领域

本发明涉及化学分析技术领域，具体涉及一种快速识别谷胱甘肽的荧光探针及其制备方法。

背景技术

谷胱甘肽（GSH）是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成。存在于几乎身体的每一个细胞。谷胱甘肽能帮助保持正常的免疫系统的功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用，半胱氨酸上的巯基为其活性基团，易与某些药物（如扑热息痛）、毒素（如自由基、碘乙酸、芥子气，铅、汞、砷等重金属）等结合，而具有整合解毒作用。谷胱甘肽具有广谱解毒作用，不仅可用于药物，更可作为功能性食品的基料，在延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品广泛应用。

谷胱甘肽广泛存在于动、植物中，在生物体内有着重要的作用。在面包酵母、小麦胚芽和动物肝脏中的含量很高，达100～1000mg/100g，在人体血液中含26～34mg/100g，鸡血中含58～73mg/100g，猪血中含10～15mg/100g，在西红柿、菠萝、黄瓜中含量也较高（12～33mg/100g），而在甘薯、绿豆芽、洋葱、香菇中含量较低（0.06～0.7mg/100g）。

谷胱甘肽不仅是衡量人类健康程度的一个标准，同时其在自然界中的含量也可为人类的获取提供的方向性，所以，对谷胱甘肽的识别检测技术越来越被人们关注，由于荧光探针的识别技术具有简单、快捷的优点，所以急需一种对谷胱甘肽响应速速快、抗干扰强的荧光探针。

发明内容

本发明的目的在于，针对上述现有技术的不足，提出一种快速识别谷胱甘肽的荧光探针，该种荧光探针在检测过程中对谷胱甘肽的响应速度较快以及很好的抗干扰性，进而大大的提高了该种荧光探针的适用范围。

本发明提出一种快速识别谷胱甘肽的荧光探针，通过与谷胱甘肽反应，生成具有强荧光性的反应产物，其特征在于，具有如下所示的结构式：

。

本发明的荧光探针由于含有吸电子的2，4-二硝基苯磺酰基识别基团，对谷胱甘肽具有特异选择性识别，使荧光探针处于荧光淬灭状态。当荧光探针检测到谷胱甘肽时，谷胱甘肽首先亲核进攻识别基团，并发生苯醚键断裂，得到具有强荧光的反应产物，通过监测产物的荧光强度，可以实时检测谷胱甘肽的浓度。

由于2，4-二硝基苯磺酰识别基团具有较强的吸电子能力，同时由于在本发明的荧光探针一侧具有氮杂环丁烷基，其对整个共轭体系的电子云密度发生变化，使苯醚键断裂速度较快，所以在检测谷胱甘肽时，本发明提供的荧光探针快速识别谷胱甘肽，具有较短的响应时间；同时本荧光探针具有萘啶类衍生物结构，萘啶类衍生物的发射波长在近红外区域，而且具有较大的Stokes位移。因此就荧光性能来说，是一种非常理想的荧光基团。斯托克斯位移大（225nm），具有很强的抗干扰能力，进而对谷胱甘肽识别针对性较强，从而达到灵敏度高、响应速度快的特点。

由于本发明的荧光探针具有较强的抗干扰能力和响应速度，所以可以适用于干扰性较强的样品检测。

进一步的，所述反应产物的激发波长为350nm～360nm。该反应产物在355nm处具有最大激发波长。

进一步的，一种快速识别谷胱甘肽的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)、将2，7-萘啶-1(2H)-酮与三溴氧磷的反应物经过萃取、干燥、分离纯化，制得中间体A；

(2)、将步骤(1)的中间体A与甲基硼酸和碳酸氢钠发生反应，得到中间体B；

(3)、将步骤(2)中的中间体B与液溴在乙酸溶液中反应，得到中间体C；

(4)、将步骤(3)的中间体C、氮杂环丁烷和2-二环己基磷-2，4，6-三异丙基联苯混合反应得到中间体D；

(5)、将步骤(4)的中间体D、对羟基苯甲醛、哌啶和乙酸溶于甲苯中，反应得到中间体E；

(6)、将步骤(5)的中间体E、2，4-二硝基苯磺酰氯溶于无水二氯甲烷中，反应得到荧光探针。

进一步的，步骤（1）中所述分离纯化采用硅胶色谱法。

进一步的，步骤（2）还包含Pd(PPh₃)Cl₂。

进一步的，步骤（3）中所述中间体C通过二氯甲烷萃取后制得。

进一步的，步骤（4）还包含催化剂。

进一步的，所述催化剂为叔丁醇钠和Pd(dba)₂。

进一步的，步骤（6）中所述反应先冰水浴反应0.5～1.5h，再常温反应9～11h，反应后进行柱色谱分离。

进一步的，所述柱色谱分离的洗脱机为石油醚和乙酸乙酯。

本发明的一种快速识别谷胱甘肽的荧光探针，该种荧光探针通过具有较强吸电子能力的2，4-二硝基苯磺酰基识别基团和氮杂环丁烷基能够与谷胱甘肽快速反应，同时具有较强荧光性的萘啶类衍生物，可以生成具有强荧光性的反应产物，灵敏度高，响应速度快；由于该荧光探针具有较强的抗干扰能力，能够特异性识别谷胱甘肽，适用于各种干扰强度较大样品的谷胱甘肽检测。

附图说明

图1为本发明荧光探针对谷胱甘肽的识别机理反应示意图；

图2为本发明荧光探针的1H NMR谱图；

图3为本发明荧光探针的1C NMR谱图；

图4为本发明荧光探针选择性测试结果示意图；

图5为本发明荧光探针抗干扰性测试结果示意图。

具体实施方式

为下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，本领域技术人员对本发明所做的各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所要求保护的范围内。本发明实施例中的配比均为以重量计。

实施例1

一种快速检测谷胱甘肽的荧光探针的制备方法，具体包括以下步骤：

中间体A的合成：将1 g(6.84 mmol)的2,7-萘啶-1(2H)-酮和9.81 g(34.21 mmol)的三溴氧磷溶于10 mL的乙腈中，加热到80 ℃反应1 h。向反应体系中加入冰水使三溴氧磷淬灭，然后调pH至中性。将溶液用二氯甲烷萃取3次，然后用Na₂SO₄干燥二氯甲烷萃取液，经过减压蒸馏得到红色粗产品，继续硅胶柱色谱纯化，制得白色固体，即为中间体A(980 mg,yield 69%)。1H NMR (400 MHz, CDC13): δ 9.76 (s, 1H), 8.82 (d, J = 4 Hz, 1H),8.48 (d, J = 4 Hz, 1H), 7.68 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 8 Hz, 1H)。

中间体B的合成：在氩气条件下，将400 mg(1.91 mmol)的中间体A和134 mg(0.19mmol)的Pd(PPh₃)Cl₂溶解于10 mL的二氧六烷。然后依次加入已溶解了138 mg(2.3 mmol)甲基硼酸的10 mL的二氧六烷溶液和209 mg(2.5 mmol)的碳酸氢钠，在130 ℃搅拌反应1 h。然后减压蒸馏除溶剂，残留液经硅胶柱色谱法纯化，制得黄色稠状液体，即为中间体B (180mg, yield 66%)。1H NMR (400 MHz, CDC13): δ 9.59 (s, 1H), 8.71 (d, J = 5.6 Hz,1H), 8.57 (d, J = 6 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 6 Hz,1H), 3.06 (s, 3H)。

中间体C的合成：将144 mg(1 mmol)的中间体b溶于10 mL的乙酸中，向反应液中滴加211 mg (1.2 mmol)的液溴，室温下搅拌5小时。反应完毕后用NaHCO₃调至中性，然后用二氯甲烷多次萃取，萃取液用Na₂SO₄干燥，经过减压蒸馏和硅胶柱色谱法纯化制得黄色油装液体，即为中间体C(154 mg, yield 69%)。

1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 9.66 (s, 1H), 9.02 (s, 1H), 8.73 (d, J =5.7 Hz, 1H), 7.78 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 3.04 (s, 3H)。

中间体D的合成：将100 mg(0.45 mmol)的中间体C、77.1 mg(1.35 mmol)的氮杂环丁烷、53 mg(0.54 mmol)的叔丁醇钠、51.8 mg(0.09 mmol)的Pd(dba)₂和85.8 mg(0.18mmol)的2-二环己基磷-2,4,6-三异丙基联苯溶解于二氧六烷，在氩气保护下100 ℃反应12h。反应完毕后，将反应液冷却至室温，经过滤、50 mL二氯甲烷洗涤、减压蒸馏制得粗产品。粗产品经硅胶柱色谱法纯化制得黄色油状液体，即为中间体D(53.8 mg, yield 60%)。1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.97 (s, 1H), 8.41 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 7.83 (s,1H), 7.63 (d, J = 5.7 Hz, 1H), 4.21 (t, J = 6.9 Hz, 5H), 2.91 (s, 3H), 2.43-2.33 (m, 2H)。

中间体E的合成：将199 mg(1 mmol)的中间体D、112 mg (0.92 mmol)的对羟基苯甲醛、0.5 mL哌啶和0.5 mL的乙酸溶于30 mL的甲苯中，140 ℃反应12 h。反应液经减压蒸馏、硅胶柱色谱法纯化制得黄色固体，即为中间体E (146 mg, Yield 48%)。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 9.50 (s, 1H), 8.93 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 8.62 (d, J = 5.6 Hz,1H), 8.49 -8.46 (m, 1H ), 8.38 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 8.08 (t, J =11.7 Hz,3H), 7.87 (s, 1H), 7.72 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.28(d, J = 9.2 Hz, 1H), 4.25 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 2.45-2.38 (m, 2H)。

荧光探针的合成：将50 mg(0.2mmol)的中间体E溶解在无水二氯甲烷（6mL）中，加入三乙胺（37mg，0.36mmol），在冰水浴搅拌下，逐滴加入溶解在无水二氯甲烷（10mL）中的2,4－二硝基苯磺酰氯（65mg，0.24mmol）。继续冰水浴搅拌1h后，反应体系澄清，红色溶液，常温反应10h，TLC板跟踪反应原料消失，停止反应。采用柱色谱分离，用石油醚：乙酸乙酯（1:1，v/v）作为洗脱剂淋洗，得到黄色固体55mg，即得荧光探针 (yield 57%)，请参见图2和图3。

实施例2

测定荧光探针与谷胱甘肽反应的效果。通过一系列条件的筛选，最终选择的测试条件是，PBS浓度10 mM, pH 7.4，温度 37 ℃，此为生物体适宜的生理条件。反应机理为亲核取代，谷胱甘肽利用自身的巯基，进攻探针醚键的氧原子，醚键断裂，由于2,4-二硝基苯磺酰氯的不稳定性，会生成SO₂气体同时释放出荧光团从而发射荧光。请参见图1。

实施例3

测定荧光探针对谷胱甘肽选择性。

将本荧光探针对20不同待测样品采用实施例2测试条件和方法进行测试反应，结果反映出本荧光探针对谷胱甘肽的选择性最高，请参见图4，图中18号样品即为谷胱甘肽。

实施例4

测定荧光探针在不同干扰因子下的抗干扰性。

将本荧光探针与带有不同干扰因子的谷胱甘肽样品进行测试反应，采用实施例2测试条件和方法，以检测本荧光探针在不同干扰因子下对谷胱甘肽的敏感度是否受到干扰，请参见图5，结果反映出不同干扰因子对谷胱甘肽的干扰非常小，说明本荧光探针抗干扰性强。

以上对本发明的实施例进行了示例性说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依据本发明申请范围的均等变化与改进等，均应归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims

1.一种快速识别谷胱甘肽的荧光探针，通过与谷胱甘肽反应，生成具有强荧光性的反应产物，其特征在于，具有如下所示的结构式：

。

2.如权利要求1所述的一种快速识别谷胱甘肽的荧光探针，其特征在于：所述反应产物的激发波长为350nm～360nm。

3.如权利要求1所述的一种快速识别谷胱甘肽的荧光探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

4.如权利要求3所述的一种快速识别谷胱甘肽的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述分离纯化采用硅胶色谱法。

5.如权利要求3所述的一种快速识别谷胱甘肽的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤（2）还包含Pd(PPh₃)Cl₂。

6.如权利要求3所述的一种快速识别谷胱甘肽的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述中间体C通过二氯甲烷萃取后制得。

7.如权利要求3所述的一种快速识别谷胱甘肽的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤（4）还包含催化剂。

8.如权利要求7所述的一种快速识别谷胱甘肽的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述催化剂为叔丁醇钠和Pd(dba)₂。

9.如权利要求3所述的一种快速识别谷胱甘肽的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤（6）中所述反应先冰水浴反应0.5～1.5h，再常温反应9～11h，反应后进行柱色谱分离。

10.如权利要求9所述的一种快速识别谷胱甘肽的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述柱色谱分离的洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯。