CN106905199A - 一种基于聚集诱导发光原理用于选择性检测半胱氨酸的荧光试剂的合成及应用 - Google Patents

一种基于聚集诱导发光原理用于选择性检测半胱氨酸的荧光试剂的合成及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106905199A
CN106905199A CN201710153023.XA CN201710153023A CN106905199A CN 106905199 A CN106905199 A CN 106905199A CN 201710153023 A CN201710153023 A CN 201710153023A CN 106905199 A CN106905199 A CN 106905199A
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
tpenno
selective enumeration
enumeration method
target compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710153023.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN106905199B (zh
Inventor
王建国
姜国玉
朱温平
吴勇权
范小林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gannan Normal University
Original Assignee
Gannan Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gannan Normal University filed Critical Gannan Normal University
Priority to CN201710153023.XA priority Critical patent/CN106905199B/zh
Publication of CN106905199A publication Critical patent/CN106905199A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106905199B publication Critical patent/CN106905199B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C303/00—Preparation of esters or amides of sulfuric acids; Preparation of sulfonic acids or of their esters, halides, anhydrides or amides
    • C07C303/36—Preparation of esters or amides of sulfuric acids; Preparation of sulfonic acids or of their esters, halides, anhydrides or amides of amides of sulfonic acids
    • C07C303/38—Preparation of esters or amides of sulfuric acids; Preparation of sulfonic acids or of their esters, halides, anhydrides or amides of amides of sulfonic acids by reaction of ammonia or amines with sulfonic acids, or with esters, anhydrides, or halides thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C1/00—Preparation of hydrocarbons from one or more compounds, none of them being a hydrocarbon
    • C07C1/20—Preparation of hydrocarbons from one or more compounds, none of them being a hydrocarbon starting from organic compounds containing only oxygen atoms as heteroatoms
    • C07C1/207—Preparation of hydrocarbons from one or more compounds, none of them being a hydrocarbon starting from organic compounds containing only oxygen atoms as heteroatoms from carbonyl compounds
    • C07C1/2072—Preparation of hydrocarbons from one or more compounds, none of them being a hydrocarbon starting from organic compounds containing only oxygen atoms as heteroatoms from carbonyl compounds by condensation
    • C07C1/2074—Preparation of hydrocarbons from one or more compounds, none of them being a hydrocarbon starting from organic compounds containing only oxygen atoms as heteroatoms from carbonyl compounds by condensation of only one compound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C201/00—Preparation of esters of nitric or nitrous acid or of compounds containing nitro or nitroso groups bound to a carbon skeleton
    • C07C201/06—Preparation of nitro compounds
    • C07C201/08—Preparation of nitro compounds by substitution of hydrogen atoms by nitro groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C209/00—Preparation of compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton
    • C07C209/30—Preparation of compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton by reduction of nitrogen-to-oxygen or nitrogen-to-nitrogen bonds
    • C07C209/32—Preparation of compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton by reduction of nitrogen-to-oxygen or nitrogen-to-nitrogen bonds by reduction of nitro groups
    • C07C209/36—Preparation of compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton by reduction of nitrogen-to-oxygen or nitrogen-to-nitrogen bonds by reduction of nitro groups by reduction of nitro groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings in presence of hydrogen-containing gases and a catalyst
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/15—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C311/21—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the sulfonamide groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
    • C09K2211/1014—Carbocyclic compounds bridged by heteroatoms, e.g. N, P, Si or B
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6443—Fluorimetric titration

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于聚集诱导发光原理用于选择性检测半胱氨酸的荧光试剂、合成方法及其应用。本发明以二苯甲酮为起始原料合成目标化合物TPENNO2。本发明开展了目标化合物TPENNO2对含巯基氨基酸(如：半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽)的检测研究，发现其对半胱氨酸具有很好的灵敏度和高度的选择性，高半胱氨酸、谷胱甘肽的干扰小。与现有技术相比，本发明具有合成简单、原料易得、目标化合物荧光量子产率高、抗光漂白能力强等优点，避免了传统荧光染料不宜在高浓度下检测的缺点，并且该目标化合物TPENNO2成功用于细胞内巯基化合物的荧光成像。因此，目标化合物TPENNO2在选择性检测半胱氨酸、检测细胞内巯基化合物含量方面具有很大的应用前景。

Description

一种基于聚集诱导发光原理用于选择性检测半胱氨酸的荧光 试剂的合成及应用
技术领域
本发明属于生物化学材料领域，涉及一种基于聚集诱导发光原理用于选择性检测半胱氨酸的荧光试剂、合成方法及应用。
背景技术
半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)是人体内最为常见的三种巯基氨基酸，是细胞中的主要活性物质。其中Cys是构成蛋白质的20种基本氨基酸中唯一的巯基氨基酸，具有重要的生理功能。两个Cys残基中的巯基可以通过形成二硫键来保持蛋白质空间立体结构。Cys中巯基的氧化还原性质直接决定了蛋白质和寡肽的生物活性，使其具有抗衰老性能，可清除生物体内自由基，对氨基酸的转换和吸收都有至关重要的作用。体内Cys的缺乏与多种疾病密切相关，如儿童生长缓慢、头发褪色、肝脏损伤、皮肤损伤、水肿、嗜睡症等。Cys的重要生理作用激发了科学家们对其检测方法的研究，其中荧光探针法由于具有操作简单、灵敏度高、检测限低、可应用于细胞内或活体成像等优点受到了科学家们的广泛关注。但是由于Cys、Hcy、GSH的结构十分类似，所含巯基的反应活性相当，因此目前能够特异性的将Cys与Hcy、GSH区分开来的荧光探针还比较少，并且这些为数不多的荧光探针所采用的荧光分子大多数在高浓度时极易发生荧光猝灭现象，即聚集诱导荧光猝灭现象(aggregation caused quenching，ACQ)。这种现象迫使研究人员在检测过程中只能使用稀溶液，导致检测信噪比低，限制了这些Cys荧光探针的实际应用。
2001年，唐本忠等人发现了一种在溶液状态下呈现无荧光或弱荧光，但是在聚集态呈现强荧光的特殊荧光分子，并将这种特殊的发光现象称为聚集诱导发光(aggregationinduced emission,AIE)效应。具有AIE效应的荧光分子由于具有高荧光量子产率、强抗漂白性、无需低浓度下检测等优点，为Turn-on型荧光探针的设计提供了新的思路。其中四苯乙烯类分子(tetraphenylethylene,TPE)更是设计AIE类荧光探针的热门分子。本发明利用TPE分子的AIE特性，通过在TPE分子上连接2,4-二硝基苯磺酰基团作为巯基的响应基团，合成了一种基于TPE分子的Cys特异性荧光试剂TPENNO2。其中2,4-二硝基苯磺酰基团可猝灭TPENNO2分子的荧光，当与巯基反应后，2,4-二硝基苯磺酰基团离去，生成具有AIE特性的TPE分子TPENH2，荧光恢复。该方法设计的Cys特异性荧光试剂TPENNO2具有选择性强、灵敏度高、抗漂白能力强、能够将Cys与结构和反应性相似的Hcy和GSH区分开来的特点。TPENNO2对Cys的特异性响应来源于其与Cys、Hcy、GSH中巯基的反应动力学差异。并且，TPENNO2还可在活细胞中检测巯基化合物。
发明内容
本发明的内容是一种基于聚集诱导发光原理用于选择性检测半胱氨酸的荧光试剂、合成方法及其应用。实现本发明目的的技术解决方案是：一种选择性检测Cys的荧光试剂，具有如下结构：
该目标化合物中的2,4-二硝基苯磺酰基团可猝灭分子的荧光，使其在溶液中不发光。
一种选择性检测Cys的荧光试剂的合成方法，合成路线如下：
第一步：二苯甲酮和锌粉加到四氢呋喃中，搅拌下冷却到-20℃半小时，然后缓慢滴入四氯化钛，在-20℃继续搅拌半小时后，缓慢升至室温，然后加热回流过夜，冷却，过滤，浓缩后利用柱层析法分离纯化，得到具有聚集诱导发光特性的化合物1；
第二步：将化合物1加入醋酸和二氯甲烷中，冷却到-20℃后，将浓硝酸(65％)加到反应液中，在-20℃继续搅拌15min后，加入冷水分液萃取，有机相用水洗涤三次，干燥浓缩，残余物用甲醇重结晶得黄色固体化合物2；
第三步：将化合物2、Pd/C加到乙醇中，室温下搅拌15min，将水合肼(85％)加入反应液中回流4h，冷却后抽滤，滤液浓缩后用甲醇重结晶得还原产物TPENH2；
第四步：化合物TPENH2与2,4-二硝基苯磺酰氯在碳酸钾作用下发生反应，生成目标化合物TPENNO2，利用柱层析提纯后，目标化合物TPENNO2的结构经1H NMR、13CNMR和高分辨质谱鉴定。
一种选择性检测Cys的荧光试剂的应用：
在目标化合物TPENNO2中含有一个2,4-二硝基苯磺酰基团，该基团的强拉电子能力可猝灭TPENNO2的发光。在本发明中，用于检测Cys的溶剂为PBS缓冲溶液(50mM,pH 7.4，含2.5％的DMSO，目标化合物TPENNO2的浓度为25μM)，向溶液中加入200μM的Cys，在37℃下孵化，检测溶液荧光强度随时间的变化情况，结果表明，在37℃下孵化30min后，溶液的荧光强度基本达到饱和。
在25μM的目标化合物TPENNO2的PBS溶液中加入不同浓度的Cys，在37℃下孵化30min后，测定目标化合物TPENNO2的荧光强度随Cys浓度的变化情况。在60至100μM Cys浓度范围内目标化合物TPENNO2的荧光强度呈现良好的线性关系。
向目标化合物TPENNO2的溶液中加入Cys后，Cys中的巯基与目标化合物TPENNO2发生亲核芳香取代反应(nucleophilic aromatic substitution reaction)，C-S键断裂，并进一步消除一分子SO2后生成TPENH2。TPENH2是具有AIE效应的分子，在水溶液中生成聚集态，因而溶液荧光大大增强。为了了解目标化合物TPENNO2对Cys的选择性，本发明对人体内必需氨基酸、Hcy、GSH等与目标化合物TPENNO2反应前后的荧光强度也进行了测定，结果表明，除Cys外的其他分子，特别是与Cys具有相似结构和反应性的Hcy、GSH与目标化合物TPENNO2反应前后的荧光强度均没有明显增强，说明TPENNO2对Cys的特异性。反应动力学研究结果表明，TPENNO2对Cys的特异性响应来源于TPENNO2与Cys、Hcy和GSH中巯基反应的动力学差异，如，TPENNO2与Cys、Hcy和GSH中巯基的一级反应动力学常数分别为1.3×10-1min-1，5.3×10-2min-1和4.8×10-3min-1。
人乳腺癌(HeLa)细胞内巯基化合物荧光成像：本发明测定了目标化合物TPENNO2对HeLa细胞中巯基化合物的荧光成像情况和应用潜力。目标化合物TPENNO2用二甲基亚砜(DMSO)溶解准确配制成1mM的母液，然后再用培养基稀释成4μM的稀释液。移取200μL的稀释液加入HeLa细胞培养皿中，于室温下孵育20min，用PBS缓冲溶液冲洗细胞培养皿洗去多余染料分子。在405nm激发下用共聚焦荧光显微镜观察细胞的荧光成像情况，采集450-550nm的荧光信号进行荧光成像。结果表明，目标化合物TPENNO2可在HeLa细胞中呈现绿色荧光信号。而同样条件下，先将含0.5mM Cys的培养基加入HeLa细胞培养皿中孵育24h，再加入含目标化合物TPENNO2 4μM的培养基孵育20min，用PBS缓冲溶液冲洗细胞培养皿洗去多余染料分子进行荧光成像，结果表明，目标化合物TPENNO2在HeLa细胞中的荧光信号增强。将0.5mMCys的培养基改为0.5mM NEM(N-乙基马来酰亚胺，一种可消耗细胞内巯基化合物的试剂)的培养基孵育15min，再用含目标化合物TPENNO2 4μM的培养基孵育20min，用PBS缓冲溶液冲洗细胞培养皿洗去多余染料分子进行荧光成像，结果表明，目标化合物TPENNO2在HeLa细胞中的荧光信号减弱，说明目标化合物TPENNO2可应用于对细胞内巯基化合物的荧光成像。
发明人通过简单的设计与合成，将目标化合物TPENNO2成功用于Cys的特异性检测。与现有技术相比，本发明合成步骤简单，较易大规模生产和应用，对Cys的选择性高，克服了传统染料分子易漂白、仅能在稀溶液中检测的缺点。
附图说明
图1(a)在25μM化合物TPENNO2的PBS缓冲溶液中加入不同浓度的Cys，37℃孵化30min后荧光发射光谱的变化；(b)25μM化合物TPENNO2在490nm处荧光强度与Cys浓度的关系及线性拟合曲线图。
图2(a)在25μM化合物TPENNO2的PBS缓冲溶液中分别加入300μM的体内必需氨基酸、Cys、Hcy、GSH孵化30min后荧光发射光谱的变化，(b)在25μM化合物TPENNO2的PBS缓冲溶液中分别加入300μM Cys、Hcy、GSH孵化30min后，490nm处荧光强度变化的柱状图。
图3化合物TPENNO2与HeLa细胞37℃下孵化20min后的激光共聚焦显微成像照片。(a)4μM化合物TPENNO2与HeLa细胞在37℃下孵化20min后的明场照片；(b)化合物TPENNO2与HeLa细胞在37℃下孵化20min后的荧光照片；(c)为(a)与(b)的叠加图；(d)0.5mM Cys与HeLa细胞在37℃下孵化24h后再与4μM化合物TPENNO237℃下孵化20min后的明场照片；(e)0.5mM Cys与HeLa细胞在37℃下孵化24h后再与4μM化合物TPENNO2与HeLa细胞在37℃下孵化20min后的荧光照片；(f)为(d)与(e)的叠加图；(g)0.5mM NEM与HeLa细胞在37℃下孵化15min后再与4μM化合物TPENNO2 37℃下孵化20min后的明场照片；(h)0.5mM NEM与HeLa细胞在37℃下孵化15min后再与4μM化合物TPENNO2与HeLa细胞在37℃下孵化20min后的荧光照片；(i)为(g)与(h)的叠加图。
具体实施方式
本实施例中所用的原料均为已知化合物，可以由商业途径获得。
实施例1
目标化合物TPENNO2的合成
(1)化合物1的合成：将二苯甲酮(1.8g,10mmol)和锌粉(5.2g,80mmol)加到四氢呋喃中，搅拌下冷却到-20℃半小时，然后缓慢滴入四氯化钛(4.4mL,40mmol)，在-20℃继续搅拌半小时后，缓慢升至室温，然后加热回流过夜，冷却，过滤，浓缩后利用柱层析法分离纯化，得到具有聚集诱导发光特性的化合物1，产率为72％。
(2)化合物2的合成：将化合物1(2.64g,8mmol)、醋酸(1.9mL,32mmol)加到二氯甲烷中，冷却到-20℃后，将浓硝酸(65％,1.6mL,24mmol)加到反应液中，在-20℃继续搅拌15min后，加入冷水分液萃取，有机相用水洗涤三次，干燥浓缩，残余物用甲醇重结晶得黄色固体2，产率为90％。
(3)化合物TPENH2的合成：将化合物2(1.2g,3.18mmol)、10％Pd/C(100mg)、加到乙醇中，室温下搅拌15min，将水合肼(85％)(5.4mL,95.4mmol)加入反应液中回流4h，冷却后抽滤，滤液浓缩后用甲醇重结晶得还原产物TPENH2，产率为85％。核磁表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ＝7.16–7.03(m,9H),6.99–6.93(m,4H),6.90(d,J＝6.7Hz,2H),6.57(d,J＝8.4Hz,2H),6.27(d,J＝8.5Hz,2H),5.06(br,2H).
(4)化合物TPENNO2的合成：将化合物TPENH2(50mg,0.14mmol)和碳酸钾(80mg,0.58mmol)加入20mL乙腈中冷却至0℃。之后分批加入2,4-二硝基苯磺酰氯(85mg,0.32mmol)，将混合液在室温下搅拌过夜，饱和食盐水洗三次，乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥、浓缩、柱层析分离后得到化合物TPENNO2，产率63％。核磁表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ＝10.91(s,1H),8.90(d,J＝2.3Hz,1H),8.57(dd,J＝8.7,2.3Hz,1H),8.09(d,J＝8.7Hz,1H),7.12–7.03(m,9H),6.93–6.85(m,10H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ149.91,147.75,142.94,142.93,142.75,140.82,140.30,139.61,136.16,134.03,131.68,131.58,130.52,127.77,127.75,127.73,126.95,126.55,126.50,126.33,120.82,120.22.HR-MS(MALDI-TOF):m/z:577.1316,[M]+.
实施例2
Cys选择性识别检测
(1)Cys响应时间测定：取50μL化合物TPENNO2的DMSO溶液(1mM)于2mL PBS缓冲溶液中，加入200μM Cys，混合液在37℃下孵化不同的时间，测定混合溶液的荧光强度随孵化时间的变化，结果表明，30min后，荧光强度基本达到饱和。
(2)Cys荧光滴定测试：取50μL化合物TPENNO2的DMSO溶液(1mM)于2mL PBS缓冲溶液中，然后加入不同量的Cys的PBS溶液，混合溶液在37℃下孵化30min后，测定加入不同Cys后溶液的荧光发射光谱(Ex＝341nm)，在60至100μM Cys浓度范围内混合液的荧光强度呈现良好的线性关系(如图1所示)。
(3)化合物TPENNO2对Cys的选择性测试：取50μL化合物TPENNO2的DMSO溶液(1mM)于2mL PBS缓冲溶液中，然后分别加入300μM的体内必需氨基酸、Cys、Hcy、GSH，混合溶液在37℃下孵化30min，然后测定溶液的荧光发射光谱(Ex＝341nm)。结果表明，除Cys外的其他分子与目标化合物TPENNO2反应前后的荧光强度均没有明显增强(如图2所示)，说明该荧光试剂可以选择性检测Cys，而结构和巯基反应活性类似的Hcy和GSH干扰均较小。
实施例3
人乳腺癌(HeLa)细胞内巯基化合物荧光成像：HeLa细胞经过复苏接种于含10％胎牛血清的DEME培养基中，在37℃、5％CO2、100％饱和湿度的培养箱中培养。然后在18mm盖玻片上培养24h，待用。
将HeLa细胞分别浸入含4μM化合物TPENNO2的培养基中，在37℃、5％CO2、100％饱和湿度的培养箱中培养20min后，倒出培养基，用新鲜培养基清洗细胞3遍。在激光共聚焦荧光显微镜下观察，并对其进行明场和暗场下拍照(如图3所示)。结果表明，目标化合物TPENNO2在HeLa细胞中呈现绿色荧光信号，而同样条件下，先将含0.5mM Cys的培养基加入HeLa细胞培养皿中孵育24h，再加入含目标化合物TPENNO2 4μM的培养基孵育20min，用PBS缓冲溶液冲洗细胞培养皿洗去多余染料分子进行荧光成像，结果表明，目标化合物TPENNO2在HeLa细胞中的荧光信号增强。将0.5mM Cys的培养基改为0.5mM NEM的培养基孵育15min，再用含目标化合物TPENNO2 4μM的培养基孵育20min，用PBS缓冲溶液冲洗细胞培养皿洗去多余染料分子进行荧光成像，结果表明，目标化合物TPENNO2在HeLa细胞中的荧光信号减弱，说明目标化合物TPENNO2可成功应用于对细胞内巯基化合物的荧光成像。

Claims (7)

1.一种选择性检测半胱氨酸的荧光试剂，其特征在于：所述选择性检测半胱氨酸的荧光试剂具有如下结构：
2.根据权利要求1所述的选择性检测半胱氨酸的荧光试剂，其特征在于：含有四苯乙烯结构作为荧光信号基团。
3.根据权利要求1所述的选择性检测半胱氨酸的荧光试剂，其特征在于：含有2,4-二硝基苯磺酰基结构作为荧光猝灭基团和巯基响应基团。
4.根据权利要求1所述的选择性检测半胱氨酸的荧光试剂的合成方法，其特征在于：包括如下步骤：
第一步：二苯甲酮在四氯化钛和锌粉的作用下发生McMurry反应，生成具有聚集诱导发光特性的化合物1；
第二步：化合物1在醋酸，硝酸的作用下发生硝化反应，生成化合物2；
第三步：化合物2在Pd/C催化下被水合肼还原为TPENH2；
第四步：化合物TPENH2与2,4-二硝基苯磺酰氯在碳酸钾作用下发生反应，生成目标化合物TPENNO2，利用柱层析提纯后，目标化合物TPENNO2的结构经1H NMR、13CNMR和高分辨质谱鉴定。
5.根据权利要求3所述的选择性检测半胱氨酸的荧光试剂的合成方法，其特征在于：包括如下步骤：
第一步：二苯甲酮和锌粉加到四氢呋喃中，搅拌下冷却到-20℃后半小时，然后缓慢滴入四氯化钛，在-20℃继续搅拌半小时后，缓慢升至室温，然后加热回流过夜，冷却，过滤，浓缩后利用柱层析法分离纯化，得到具有聚集诱导发光特性的化合物1；
第二步：将化合物1加入醋酸和二氯甲烷中，冷却到-20℃后，将浓硝酸(65％)加到反应液中，在-20℃继续搅拌15min后，加入冷水分液萃取，有机相用水洗涤三次，干燥浓缩，残余物用甲醇重结晶得黄色固体化合物2；
第三步：将化合物2、Pd/C加到乙醇中，室温下搅拌15min，将水合肼(85％)加入反应液中回流4h，冷却后抽滤，滤液浓缩后用甲醇重结晶得还原产物TPENH2；
第四步：将化合物TPENH2、碳酸钾加入乙腈中，冷却至0℃，之后分批加入2,4-二硝基苯磺酰氯发生反应，生成目标化合物TPENNO2；经柱层析提纯后，目标化合物TPENNO2的结构经1H NMR、13C NMR和高分辨质谱鉴定。
6.根据权利要求1所述的选择性检测半胱氨酸的荧光试剂的应用方法，其特征在于：可选择性检测半胱氨酸。
7.根据权利要求1所述的选择性检测半胱氨酸的荧光试剂的应用方法，其特征在于：可用于细胞内巯基化合物的检测。
CN201710153023.XA 2017-03-15 2017-03-15 一种基于聚集诱导发光原理用于选择性检测半胱氨酸的荧光试剂的合成及应用 Active CN106905199B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710153023.XA CN106905199B (zh) 2017-03-15 2017-03-15 一种基于聚集诱导发光原理用于选择性检测半胱氨酸的荧光试剂的合成及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710153023.XA CN106905199B (zh) 2017-03-15 2017-03-15 一种基于聚集诱导发光原理用于选择性检测半胱氨酸的荧光试剂的合成及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106905199A true CN106905199A (zh) 2017-06-30
CN106905199B CN106905199B (zh) 2018-04-20

Family

ID=59187619

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710153023.XA Active CN106905199B (zh) 2017-03-15 2017-03-15 一种基于聚集诱导发光原理用于选择性检测半胱氨酸的荧光试剂的合成及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106905199B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108129365A (zh) * 2018-01-03 2018-06-08 湖南韵邦生物医药有限公司 一种近红外检测半胱氨酸的荧光探针、其制备方法及应用
CN112304930A (zh) * 2020-04-20 2021-02-02 浙江今复康生物科技有限公司 二硫键检测方法及含二硫键的痰液检测试剂盒
CN113402398A (zh) * 2021-06-18 2021-09-17 湖北大学 基于聚集诱导发光效应的碳点前驱体、碳点及其制备方法和应用

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102532178A (zh) * 2011-12-23 2012-07-04 浙江理工大学 一种检测生物巯基的荧光探针及其制备方法与使用方法
US20120237964A1 (en) * 2011-03-17 2012-09-20 The Hong Kong University Of Science And Technology Luminogen compounds and the use of the same for biosensing and cellular imaging
US20130266953A1 (en) * 2011-10-11 2013-10-10 The Hong Kong University Of Science And Technology Aggregation induced emission of fluorescent bioprobes and methods of using the same
CN103351335A (zh) * 2013-05-28 2013-10-16 中南大学 一种荧光增强检测含巯基氨基酸的荧光分子探针的合成及应用
CN104059005A (zh) * 2014-06-13 2014-09-24 中南大学 一种荧光分子探针化合物及其制备方法和应用
CN104370848A (zh) * 2014-12-10 2015-02-25 湖南科技大学 以羟基尼罗红为母体的硫离子荧光探针的合成方法及应用
CN104447421A (zh) * 2014-10-28 2015-03-25 苏州罗兰生物科技有限公司 一种新型半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针的制备与应用
CN104560027A (zh) * 2015-01-13 2015-04-29 中国科学技术大学 一种可区分检测生物硫醇的荧光探针及其制备方法
CN105802606A (zh) * 2014-12-29 2016-07-27 苏州罗兰生物科技有限公司 一种含巯基氨基酸的荧光探针的制备和应用
CN105906534A (zh) * 2016-04-22 2016-08-31 山西大学 2,4-二硝基苯磺酰胺衍生物及其在检测硫醇中的应用

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120237964A1 (en) * 2011-03-17 2012-09-20 The Hong Kong University Of Science And Technology Luminogen compounds and the use of the same for biosensing and cellular imaging
US20130266953A1 (en) * 2011-10-11 2013-10-10 The Hong Kong University Of Science And Technology Aggregation induced emission of fluorescent bioprobes and methods of using the same
CN102532178A (zh) * 2011-12-23 2012-07-04 浙江理工大学 一种检测生物巯基的荧光探针及其制备方法与使用方法
CN103351335A (zh) * 2013-05-28 2013-10-16 中南大学 一种荧光增强检测含巯基氨基酸的荧光分子探针的合成及应用
CN104059005A (zh) * 2014-06-13 2014-09-24 中南大学 一种荧光分子探针化合物及其制备方法和应用
CN104447421A (zh) * 2014-10-28 2015-03-25 苏州罗兰生物科技有限公司 一种新型半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针的制备与应用
CN104370848A (zh) * 2014-12-10 2015-02-25 湖南科技大学 以羟基尼罗红为母体的硫离子荧光探针的合成方法及应用
CN105802606A (zh) * 2014-12-29 2016-07-27 苏州罗兰生物科技有限公司 一种含巯基氨基酸的荧光探针的制备和应用
CN104560027A (zh) * 2015-01-13 2015-04-29 中国科学技术大学 一种可区分检测生物硫醇的荧光探针及其制备方法
CN105906534A (zh) * 2016-04-22 2016-08-31 山西大学 2,4-二硝基苯磺酰胺衍生物及其在检测硫醇中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIA-BIN XIONG等: "Enantioselective Recognition for Many Different Kinds of Chiral Guests by One Chiral Receptor Based on Tetraphenylethylene Cyclohexylbisurea", 《J. ORG. CHEM. 》 *
XIN-FANG DUAN等: "Insights into the General and Efficient Cross McMurry Reactions between Ketones", 《J. ORG. CHEM.》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108129365A (zh) * 2018-01-03 2018-06-08 湖南韵邦生物医药有限公司 一种近红外检测半胱氨酸的荧光探针、其制备方法及应用
CN108129365B (zh) * 2018-01-03 2020-09-11 湖南韵邦生物医药有限公司 一种近红外检测半胱氨酸的荧光探针、其制备方法及应用
CN112304930A (zh) * 2020-04-20 2021-02-02 浙江今复康生物科技有限公司 二硫键检测方法及含二硫键的痰液检测试剂盒
CN112304930B (zh) * 2020-04-20 2022-08-23 浙江今复康生物科技有限公司 二硫键检测方法及含二硫键的痰液检测试剂盒
CN113402398A (zh) * 2021-06-18 2021-09-17 湖北大学 基于聚集诱导发光效应的碳点前驱体、碳点及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN106905199B (zh) 2018-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105924394B (zh) 一种双光子甲醛荧光探针及其制备与应用
CN107235946A (zh) 一种谷胱甘肽荧光探针及其制备方法和应用
CN105419788B (zh) 一种识别硫化氢的小分子荧光探针及其制备方法和应用
CN107602502B (zh) 一种用于生物硫醇检测的esipt型荧光探针及应用
CN103773361B (zh) 一种以香豆素为母核的半胱氨酸荧光探针及其应用
CN106243170B (zh) 具有聚集诱导荧光增强特性的β-半乳糖苷酶传感器的合成及应用
CN106905199B (zh) 一种基于聚集诱导发光原理用于选择性检测半胱氨酸的荧光试剂的合成及应用
CN104560027B (zh) 一种可区分检测生物硫醇的荧光探针及其制备方法
CN107446571A (zh) 一种内质网靶向的双光子硝基还原酶荧光探针及其合成方法和应用
CN110055055A (zh) 一种区分Cys和GSH/H2S的近红外发射荧光探针及其应用
CN106866689A (zh) 一种检测血液中谷胱甘肽的荧光探针及其合成方法与应用
CN108117544A (zh) 一种可逆二氧化硫/亚硫酸（氢）盐的荧光探针
CN110498758B (zh) 用于识别谷胱甘肽的近红外荧光探针及其制备和应用
CN108997326A (zh) 一种硫醇荧光探针及其制备方法和应用
CN110256218A (zh) 一种聚集诱导发光染料分子及其合成方法
CN110357865A (zh) 一种用于检测hNQO1酶的近红外荧光探针及其合成方法和应用
CN108440476A (zh) 一种用于同时检测水合肼和亚硫酸（氢）盐的荧光探针及其制备方法和用途
CN106814057A (zh) 一种基于聚集诱导荧光增强特性用于选择性识别atp的荧光探针、合成方法及其应用
CN111072648A (zh) 一种检测溶酶体内生物硫醇的荧光探针及其制备方法和应用
Zhang et al. Red emissive fluorescent probe for the rapid detection of selenocysteine
CN110092773B (zh) 一种氧杂蒽类衍生物及其制备方法和应用
CN108690011A (zh) 一种检测半胱氨酸的荧光探针
CN107286151A (zh) 一种基于咔唑的双光子荧光探针及其制备方法和用途
CN108383774A (zh) 一种基于端基炔酮的半胱氨酸荧光探针及其制备和应用
CN105884713A (zh) 一种荧光增强型硫化氢分子荧光探针及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant