CN106995451B - 一种反应型半胱氨酸探针及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种反应型半胱氨酸探针及其制备方法，以罗丹明衍生物为荧光团，丙烯酸酯结构为半胱氨酸的特异性反应基团；探针本身荧光极弱，与半胱氨酸反应后荧光增强，可用于半胱氨酸的检测。该探针在PBS 7.4（30%乙醇）体系中对半胱氨酸反应比较迅速，具有良好的选择性和较高的灵敏度；可用于确定生物和环境体系中半胱氨酸的含量而进行的荧光检测、目视定性检测、细胞成像检测。

Description

一种反应型半胱氨酸探针及其制备方法
技术领域
本发明属于有机合成技术领域，具体涉及一种反应型半胱氨酸探针及其制备方法。
背景技术
氨基酸是构成蛋白质的基本物质，并且与生物的生命活动有着密切的联系。半胱氨酸(Cysteine，Cys)和同型半胱氨酸(Homocysteine，Hey)是含有巯基(-SH)并且结构相差很小的两种氨基酸，在生理过程中有着重要的作用，医学研究表明他们与很多疾病有关，比如肾功能衰竭、老年痴呆症、帕金森疾病、心血管疾病、冠心病，它们在生物体内含量变化可以作为这些疾病诊断的依据。因此，人们投注了很大的精力来研究快速灵敏并且有选择性的检测半胱氨酸和同型半胱氨酸的技术，目前已经应用的技术包括高效液相色谱法、毛细管电泳法、电化学检测、光学分析和质谱鉴定，这些方法可以在体外监测半胱氨酸和同型半胱氨酸，不能在活细胞中的监测。
近年来，荧光探针技术在生物学、疾病诊断、靶向药物开发以及生命活动机制的研究中起到了越来越重要的作用。由于荧光探针具有灵敏度髙、选择性好、响应时间短、可直接观测等优点，荧光型探针越来越受到科学家的青睐，所以研究者们开始关注将荧光分子探针的这项技术应用于对体外或者细胞内的半胱氨酸和同型半胱氨酸进行监测或者细胞荧光成像。目前已经报导了多种基于化学反应的该类探针，例如Michael加成、醛环化反应和裂解反应。在这些方法中，在荧光子内引入荧光淬灭剂2,4-二硝基-苯磺酸盐或2,4-二硝基苯磺酰胺基团，导致荧光猝灭，在半胱氨酸和同型半胱氨酸诱导下发生的裂解，荧光得以恢复，这是一种特别有效的方法。
由于荧光方法具有高灵敏度、高选择性以及非生物破坏性等优点，检测小分子巯基化合物的荧光传感技术迅速发展。各种各样的荧光探针被设计合成，荧光机制主要有迈克尔加成反应；磺酰胺、磺酸酯键的裂解反应；金属配合物取代配位反应；二硫键断裂反应。但是，由于小分子巯基化合物结构上相似性，区分研究各种巯基化合物(如半胱氨酸、谷胱甘肽)各自对生物体生理病理的影响，具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种反应型半胱氨酸探针，可用于确定生物和环境体系中半胱氨酸的含量而进行的荧光检测、目视定性检测、细胞成像检测，还提供了该反应型半胱氨酸探针的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种反应型半胱氨酸探针，结构式如下：
上述反应型半胱氨酸探针的制备方法，包括以下步骤：
1)间苯二酚与邻苯二甲酸酐反应得到化合物1，化合物1的结构式如下：
2)化合物1与苊酚反应得到化合物2，化合物2的结构式如下：
3)化合物2与丙烯酰氯反应得到目标产物反应型半胱氨酸探针。
优选地，步骤(1)中化合物1的制备方法具体为：将间苯二酚及邻苯二甲酸酐溶解于甲苯中，搅拌回流至生成固体，抽滤取固体，用甲醇重结晶，即得；其中，甲苯中间苯二酚的投加量为2～3mol/L，间苯二酚与邻苯二甲酸酐的摩尔比为1：1。
优选地，步骤(2)中苊酚的制备方法包括以下步骤：
(1)向苊中依次加入三氯氧磷及N，N-二甲基甲酰胺，搅拌混匀后升温至90～95℃，继续搅拌2.5～3.5小时，得到反应液；将反应液加入冰水混合物中，生成粘稠固体，经抽滤及真空干燥，得到5-苊醛粗品；其中，苊、三氯氧磷及N，N-二甲基甲酰胺的摩尔比为1：2～2.5：5～6，冰水混合物的体积为反应液体积的10～20倍；
(2)将步骤(1)所得5-苊醛粗品采用柱色谱分离，真空干燥，得到5-苊醛纯品；其中，柱色谱分离时洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝38～42：1；
(3)向二氯甲烷中加入5-苊醛纯品、二氧化硒、过氧化氢及冰乙酸，于20～30℃搅拌35～40小时，过滤取滤液、静置分层后，取有机层蒸发掉溶剂，并于冰浴环境溶于氢氧化钾的甲醇溶液中，再置于室温下水解2.5～3.5小时后，加入盐酸酸化，再用乙酸乙酯萃取，水洗乙酸乙酯萃取相、干燥，得到苊酚粗品；其中，二氯甲烷中5-苊醛纯品的投加量为80～100g/L、二氧化硒的投加量为2～3g/L、过氧化氢的投加量为1.6～2mol/L、冰乙酸的投加量为0.29～0.35mol/L，所述氢氧化钾的甲醇溶液中氢氧化钾的浓度为0.13～0.16g/mL，氢氧化钾与氯化氢的摩尔比为1：1～1.1；
(4)将步骤(3)所得苊酚粗品采用柱色谱分离，真空干燥，即得苊酚纯品；其中，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝28～32：1。
优选地，步骤(2)中化合物2的制备方法具体为：向甲苯中加入化合物1、苊酚及甲磺酸，于60～70℃搅拌25～35分钟，将反应液用乙酸乙酯萃取，再水洗乙酸乙酯萃取相、干燥，得到化合物2粗品；将化合物2粗品进一步用柱色谱分离，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝48～52：1，真空干燥，得到化合物2纯品；其中，甲苯中化合物1的投加量为0.09～1.0mol/L，化合物1、苊酚及甲磺酸的摩尔比为1：1：26～27。
优选地，步骤(3)中反应型半胱氨酸探针的制备方法具体为：向乙腈中加入化合物2、丙烯酰氯及三乙胺，搅拌20～30小时，进一步用柱色谱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝4.5～5.5：1，旋蒸出溶剂后真空干燥，即得；其中，乙腈中化合物2的投加量为0.01～0.02mol/L，化合物2、丙烯酰氯及三乙胺的摩尔比为1：1.2～1.3：0.71～0.73。
上述苊酚的合成路线如下：
上述反应型半胱氨酸探针的合成路线如下：
本发明中所使用的各种原料均为普通市售产品，或者通过本领域技术人员公知的方法或现有技术中公开的方法获得。
本发明以新型罗丹明染料，设计并合成了罗丹明-丙烯酸酯光化学传感分子，在PBS/乙醇的混合体系中，探针分子骨架上的螺环部分处于闭环状态，整体分子无色、无荧光，随着体系中特定分析物半胱氨酸浓度的不断增加，诱导丙烯酸酯与半胱氨酸反应，阻断PET进程，传感分子释放出罗丹明染料分子单体，荧光强度显著性增强并伴随明显的颜色变化，选取的干扰离等对检测效果几乎无影响，因而实现了对半胱氨酸的特异性识别响应，检测限达0.076μM.。
附图说明
图1是反应型半胱氨酸探针的核磁氢谱图；
图2是反应型半胱氨酸探针的质谱图；
图3是反应型半胱氨酸探针(10μM)的溶液随半胱氨酸浓度的增大而呈现的荧光光谱及颜色变化；
图4是10当量的半胱氨酸加入到反应型半胱氨酸探针(10μM)后荧光光谱随时间的变化趋势(点状线为552nm处荧光强度随时间的变化情况)；
图5是反应型半胱氨酸探针(10μM)溶液在分别加入10当量的不同氨基酸及离子后紫外-可见吸收光谱的变化；
图6是反应型半胱氨酸探针(10μM)随着半胱氨酸浓度的增加紫外可见光谱及颜色变化。
具体实施方式
以下通过优选实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此。
实施例1
(1)化合物1的制备
向150mL圆底烧瓶中加入40mL甲苯，再加入间苯二酚11.0g(0.1mol)及邻苯二甲酸酐14.8g(0.1mol)，搅拌溶解，搅拌回流5小时，逐渐生成固体，抽滤去固体，用甲醇重结晶，得橙色固体。
合成路线如下：
(2)苊酚的制备
向100mL的三口烧瓶中加入5.0g(32mmol)苊，然后将6.5mL三氯氧磷(POCl3)用恒压漏斗缓慢加入三口烧瓶中(15分钟内滴加完毕)，再加入13.5mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌5分钟后缓慢升温至90～95℃，继续搅拌3小时，得到反应液；将反应液加入270mL冰水混合物中，搅拌出现大量粘稠固体，经减压抽滤及真空干燥，得到苊醛粗品；然后采用柱色谱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝40：1，真空干燥，得到2.759g浅黄色针状固体，即5-苊醛纯品，收率为46.74％。
向50mL的圆底烧瓶中加入11mL二氯甲烷和1.0g 5-苊醛，再加入30mg二氧化硒(SeO2)及2mL 30％过氧化氢(H2O2)，然后滴加4滴冰乙酸(约0.2mL)，于25℃水浴搅拌38小时，过滤取滤液、静置分层后，取有机层旋蒸掉溶剂，并于冰浴环境溶于氢氧化钾的甲醇溶液(由0.85g氢氧化钾溶于6mL甲醇制得)中，再置于室温下水解3小时后，加入5mL质量分数为10％的稀盐酸酸化，再用乙酸乙酯萃取，用去离子水洗涤乙酸乙酯萃取相2次，然后用适量无水硫酸钠干燥30分钟，得到苊酚粗品；将苊酚粗品采用柱色谱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝30：1，真空干燥，得到573mg浅黄色针状固体，即苊酚纯品，收率为61.3％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.72(d,J＝8.3Hz,1H),7.46–7.40(m,1H),7.28(d,J＝6.8Hz,1H),7.08(d,J＝7.3Hz,1H),6.79(d,J＝7.3Hz,1H),5.08(s,1H),3.43–3.38(m,2H),3.31(dd,J＝8.2,5.0Hz,2H)。
合成路线如下：
(3)化合物2的制备
向50mL圆底烧瓶中加入3mL甲苯，再中加入75mg(0.29mol)化合物1、50mg(0.29mol)苊酚及0.5mL甲磺酸，于65℃油浴加热，搅拌30分钟，将反应液用乙酸乙酯萃取，再水洗乙酸乙酯萃取相2次、用无水Na2SO4干燥，得到化合物2粗品；将化合物2粗品进一步用柱色谱分离，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇(DCM：MeOH)＝50：1，旋蒸出溶剂，真空干燥，得到暗红色固体85mg(yield,74％)。1H NMRδH(400MHz,CDCl3)8.11(1H,d,J 8.2),8.07(1H,dd,J6.3,1.8),7.68–7.62(2H,m),7.62–7.56(1H,m),7.41(1H,d,J 6.8),7.14(1H,dd,J 6.2,1.5),6.92(1H,d,J 2.5),6.73(1H,d,J 8.6),6.58(1H,dd,J 8.6,2.5),6.51(1H,s),3.38(2H,dd,J 11.7,5.3),3.24–3.17(2H,m).δC(101MHz,CDCl3)169.79,157.27,154.22,152.10,145.66,140.92,135.10,129.65,128.46,126.48,125.04,124.02,121.60,117.89,116.49,113.98,112.31,111.36,103.14,30.84,29.62。
合成路线如下：
(4)反应型半胱氨酸探针的制备
向50mL圆底烧瓶中加入7mL乙腈，再加入40mg(0.1mol)化合物2、10μL丙烯酰氯、10μL三乙胺，室温下搅拌24小时，再采用色谱柱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯(PE：EA)＝5：1，旋蒸出溶剂，真空干燥，得到淡黄色反应型半胱氨酸探针19mg(yield,42％)。1H NMRδH(400MHz,CDCl3)8.09(1H,dd,J 11.5,4.9),7.71–7.63(1H,m),7.60(1H,dd,J8.1,7.1),7.42(1H,d,J 6.9),7.33(1H,d,J 1.9),7.16(1H,dd,J 6.1,1.5),6.94–6.84(1H,m),6.65(1H,dd,J 17.3,1.1),6.54(1H,s),6.35(1H,dd,J 17.3,10.5),6.07(1H,dd,J 10.5,1.1),3.38(1H,dd,J 11.3,5.2),3.25–3.18(1H,m).δC(101MHz,CDCl3)169.55,164.04,154.11,151.75,151.45,145.67,144.42,141.24,140.38,135.20,133.26,129.81,129.21,128.59,127.59,126.16,125.12,124.11,121.85,121.70,117.84,117.47,116.39,116.31,113.84,110.38,83.42,77.34,77.23,77.02,76.70,30.84,29.64,22.70,14.85,14.21。
合成路线如下：
对反应型半胱氨酸探针进行核磁氢谱分析及质谱分析，结果分别如图1及图2所示，说明本发明合成了反应型半胱氨酸探针。
(5)应用试验
1)检测用储备液的配置
a.反应型半胱氨酸探针样品溶液(1.00×10-3mol·L-1)的配制：取0.0022g(M＝446)反应型半胱氨酸探针溶于5mL乙腈中，配成浓度为1.00×10-3mol·L-1的溶液。
b.各种氨基酸及阴离子均用去离子水配置成为浓度为1.00×10-3mol·L-1或1.00×10-2mol·L-1的溶液。
c.PBS缓冲溶液(0.01mol·L-1，pH＝7.4)的配制：
母液配置：0.2mol·L-1K2HPO4：称取78g K2HPO4·12H2O溶于1000mL水中；0.2mol·L-1K2HPO4：称取27.2g K2HPO4·2H2O，溶于1000mL水中。
0.2mol·L-1PBS母液(pH＝7.4)：取19mL的0.2mol·L-1K2HPO4，81mL 0.2mol·L- 1K2HPO4，即可。然后取50mL 0.2mol·L-1PBS溶液，加水稀释至1000mL即可。
下述检测中使用的缓冲溶液均为PBS(0.01mol·L-1，pH＝7.4，30％乙醇)，实验用水均为去离子水。
2)检测分析
取3mL缓冲溶液，加入30μL反应型半胱氨酸探针样品溶液(1.00×10-3mol·L-1)，再分别加入半胱氨酸储备液(1.00×10-3mol·L-1)0～3当量，于25℃反应30分钟，然后进行荧光检测，激发波长为525nm，狭缝：2.5/5nm，结果如图3所示，随着半胱氨酸加入当量的增大，探针与半胱氨酸反应释放出荧光，使荧光强度逐渐增大。图3中右上角插图为反应前后的荧光照片，右上角插图中为仅反应型半胱氨酸探针(左)和反应型半胱氨酸探针+半胱氨酸(右)，通过两者的对比，可以明显看出，反应型半胱氨酸探针与半胱氨酸共存时存在荧光响应，在待测样品溶液中，加入反应型半胱氨酸探针后，即可判定半胱氨酸的存在。
取3mL缓冲溶液，加入30μL反应型半胱氨酸探针样品溶液(1.00×10-3mol·L-1)，再分别加入30μL半胱氨酸储备液(1.00×10-3mol·L-1)，开始时每隔10秒进行荧光测试，然后间隔时间逐渐增长，荧光测试的激发波长为525nm，狭缝：2.5/5nm，结果如图2所示，图2中右上角插图为525nm处荧光强度随时间的变化情况，从图4中可见，探针与半胱氨酸反应释放出荧光，使荧光强度逐渐增大。
取3mL缓冲溶液，加入30μL反应型半胱氨酸探针样品溶液(1.00×10-3mol·L-1)，再加入(0)Probe；(1)100μM Cys；(2)100μM Hcy；(3)100μM GSH；(4)100μM CN-；(5)100μMHS-；(6)100μM CH3COO-；(7)100μM HCO3 -；(8)100μM HSO3 -；(9)100μM SO4 2-；(10)100μMCO3 2-；(11)100μM SCN-；(12)100μM NO2 -；(13)100μM F-；(14)100μM Cl-；(15)100μM Br-；(16)100μM I-，反应30min后进行紫外可见光谱检测，结果如图5所示，探针与半胱氨酸反应后在520nm处吸光度明显升高，而其他氨基酸和阴离子与探针反应后在此处没有明显的吸光度变化。
取3mL缓冲溶液，加入30μL反应型半胱氨酸探针样品溶液(1.00×10-3mol·L-1)，再分别加入半胱氨酸储备液(1.00×10-3mol·L-1)0～3当量，于25℃反应30分钟，然后进行紫外-可见光谱扫描，结果如图6所示，随着半胱氨酸加入当量的增大，探针与半胱氨酸反应，使吸光度逐渐增大。图6中插图为反应前后可见光下的照片，肉眼可见，半胱氨酸可以使反应型巯基化合物探针样品溶液发生明显的颜色变化。

Claims (7)

1.一种反应型半胱氨酸探针，其特征在于，结构式如下：
2.权利要求1所述反应型半胱氨酸探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)间苯二酚与邻苯二甲酸酐反应得到化合物1，化合物1的结构式如下：
2)化合物1与5-苊酚反应得到化合物2，化合物2的结构式如下：
3)化合物2与丙烯酰氯反应得到目标产物反应型半胱氨酸探针。
3.根据权利要求2所述反应型半胱氨酸探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中化合物1的制备方法具体为：将间苯二酚及邻苯二甲酸酐溶解于甲苯中，搅拌回流至生成固体，抽滤取固体，用甲醇重结晶，即得；其中，间苯二酚与邻苯二甲酸酐的摩尔比为1：1。
4.根据权利要求2所述反应型半胱氨酸探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中5-苊酚的制备方法包括以下步骤：
(1)向苊中依次加入三氯氧磷及N，N-二甲基甲酰胺，搅拌混匀后升温至90～95℃，继续搅拌2.5～3.5小时，得到反应液；将反应液加入冰水混合物中，生成粘稠固体，经抽滤及真空干燥，得到5-苊醛粗品；其中，苊、三氯氧磷及N，N-二甲基甲酰胺的摩尔比为1：2～2.5：5～6；
(2)将步骤(1)所得5-苊醛粗品采用柱色谱分离，真空干燥，得到5-苊醛纯品；
(3)向二氯甲烷中加入5-苊醛纯品、二氧化硒、过氧化氢及冰乙酸，于20～30℃搅拌35～40小时，过滤取滤液、静置分层后，取有机层蒸发掉溶剂，并于冰浴环境溶于氢氧化钾的甲醇溶液中，再置于室温下水解2.5～3.5小时后，加入盐酸酸化，再用乙酸乙酯萃取，水洗乙酸乙酯萃取相、干燥，得到5-苊酚粗品；其中，二氯甲烷中5-苊醛纯品的投加量为80～100g/L、二氧化硒的投加量为2～3g/L、过氧化氢的投加量为1.6～2mol/L、冰乙酸的投加量为0.29～0.35mol/L，所述氢氧化钾的甲醇溶液中氢氧化钾的浓度为0.13～0.16g/mL，氢氧化钾与氯化氢的摩尔比为1：1～1.1；
(4)将步骤(3)所得5-苊酚粗品采用柱色谱分离，真空干燥，即得5-苊酚纯品。
5.根据权利要求2所述反应型半胱氨酸探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中化合物2的制备方法具体为：向甲苯中加入化合物1、5-苊酚及甲磺酸，于60～70℃搅拌25～35分钟，将反应液用乙酸乙酯萃取，再水洗乙酸乙酯萃取相、干燥，得到化合物2粗品；将化合物2粗品进一步用柱色谱分离，真空干燥，得到化合物2纯品；其中，化合物1、5-苊酚及甲磺酸的摩尔比为1：1：26～27。
6.根据权利要求2至5任一所述反应型半胱氨酸探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)中反应型半胱氨酸探针的制备方法具体为：向乙腈中加入化合物2、丙烯酰氯及三乙胺，搅拌20～30小时，进一步用柱色谱分离，旋蒸出溶剂后真空干燥，即得；其中，化合物2、丙烯酰氯及三乙胺的摩尔比为1：1.2～1.3：0.71～0.73。
7.权利要求1所述反应型半胱氨酸探针在制备检测半胱氨酸的荧光成像剂中的应用。
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