CN109111421B - 一种氧杂蒽类荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的一种氧杂蒽类荧光探针及其制备方法和应用，具有通式(I)的化学结构：
Figure DDA0001827364960000011
与现有技术相比，本发明的荧光探针具有以下特点：1.合成方法简单；2.对GSH的选择性较好；3.对GSH的响应浓度为毫摩尔级别，适合细胞内定量检测GSH；4.对细胞毒性较小；5.与GSH作用后的生成物的荧光发射波长达到630nm，可用于细胞成像。

Description

一种氧杂蒽类荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及荧光探针技术领域，特别是涉及一种氧杂蒽类荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
谷胱甘肽(glutathione，GSH)、半胱氨酸(cysteine,Cys)和同型半胱氨酸(homcysteine,Hcy)等生物硫醇是许多细胞蛋白和分子的重要组成部分，在许多生理过程中发挥着重要作用。在这些细胞内硫醇中，GSH是真核细胞中最丰富的非蛋白硫醇，能维持活细胞中的氧化还原稳态、细胞内基因调节、信号转导和异种代谢。利用GSH的氧化还原电位，可以有效地克服活性氧(ROS)对细胞物质的破坏。此外，许多疾病，如艾滋病、肝损伤、癌症和神经退行性疾病(阿尔茨海默病、帕金森病等)都与GSH水平升高有关。因此，检测细胞内GSH的波动为某些疾病的诊断和生物分析提供了重要的思路。
荧光探针由于其高选择性、低成本、操作简单、不具侵袭性而受到越来越多的关注。如：
中国发明专利申请(申请号：2016 1 0321434.0)公开了“一种近红外GSH荧光探针的制备方法和应用”，该申请的荧光探针可以实现GSH与Cys、Hcy的区分，该荧光探针的检测范围为0.5～25μM，检测限为0.15μM。
中国发明专利申请(申请号：2017 1 1354325.X)公开了“一种GSH荧光传感器及其制备方法和应用”，该申请的得到GSH荧光传感器在检测到GSH时，发生发射波长红移现象，可经裸眼进行简单区别。
然而，由于细胞中的谷胱甘肽含量处于毫摩尔水平(0.5-10mM)，远远高于大多数有机小分子荧光探针在生物细胞中所能容忍的微摩尔级别最高浓度，因此限制上述荧光探针的进一步应用。
因此，针对现有技术中的存在问题，迫切需要开发更多过结构新颖的有机小分子荧光探针运用于细胞内GSH的定量检测。亟需提供一种能够匹配细胞中GSH的含量且用于细胞中GSH的定量检测技术以解决现有技术中的不足之处显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术中的不足之处而提供一种能够匹配细胞中GSH的含量且用于细胞中GSH定量检测的氧杂蒽类荧光探针。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
提供一种氧杂蒽类荧光探针，具有通式(I)的化学结构：
Figure BDA0001827364940000021
本发明的荧光探针由于受2,4-二硝基苯磺酰基强吸电子而引起的PET效应，本身不具有荧光，当加入GSH时，探针受到GSH巯基的亲核进攻离去2,4-二硝基苯磺酰胺，PET效应受到破坏而导致荧光显著增强，本发明的氧杂蒽类荧光探针与GSH作用机理如下所示。
Figure BDA0001827364940000022
一种氧杂蒽类荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
Figure BDA0001827364940000023
步骤一：将4-二乙氨基酮酸和6-氨基-1,2,3,4-四氢-1-萘酮先后慢慢地加入到甲基磺酸中，90-120℃下反应3-5小时，停止加热。反应混合物冷却至室温后，在搅拌下将反应物慢慢加入到盛有冰块的容器中，然后慢慢滴加高氯酸(70％)，容器中慢慢出现紫红色固体沉淀，放置冰箱中静置一段时间后，进行抽滤，干燥得紫色固体，即通式(III)的化合物；
步骤二：将所述通式(III)的化合物溶解于无水甲醇中，在冰水浴下滴加浓硫酸，加热回流，分离提纯，得绿色固体，即通式(II)的化合物；
步骤三：将所述通式(II)的化合物和无水碳酸钾溶于无水乙腈中，冰浴中搅拌30分钟后，滴加溶于无水乙腈的2,4-二硝基苯磺酰氯溶液，室温下搅拌3～9小时，分离提纯，得具有通式(I)的化学结构的化合物，即所述氧杂蒽类荧光探针。
优选的，步骤一所述4-二乙氨基酮酸与所述6-氨基-1,2,3,4-四氢-1-萘酮的摩尔比为1.1：1，在100℃下，反应时间为4小时。
优选的，步骤二所述通式(III)的化合物：浓硫酸＝1mmol：1.8mL，加热回流24小时。
优选的，步骤二所述分离提纯为蒸除甲醇，使用柱层析梯度分层提纯，以二氯甲烷：乙醇＝25：1到10：1(v/v)为淋洗液进行梯度淋洗。
优选的，步骤三所述通式(II)的化合物：碳酸钾：2,4-二硝基苯磺酰氯的摩尔比为1：6：2，搅拌时间为6小时。
优选的，步骤三所述分离提纯为蒸除无水乙腈，用二氯甲烷溶解，经过1mol/L的盐酸、饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，使用柱层析梯度分层提纯，以二氯甲烷：乙醇＝50：1到20：1(v/v)为淋洗液进行梯度淋洗。
本发明的另一目的在于，提供一种氧杂蒽类荧光探针的应用，通式(I)的化合物可作为细胞中谷胱甘肽定量检测的荧光探针的应用。
优选的，通式(I)的化合物作为检测谷胱甘肽荧光探针的响应浓度为0.013～7mM。
本发明的再一目的在于，提供一种氧杂蒽类荧光探针的应用，通式(I)的化合物在细胞成像中的应用。
本发明的有益效果：
本发明的一种氧杂蒽类荧光探针，与现有技术相比，具有以下特点：
1.本发明的荧光探针合成方法简单、便于推广应用；
2.本发明的荧光探针对GSH的选择性较好，在进行细胞中GSH检测时，可以不用受其他生物硫醇(Cys、Hcy)和其他氨基酸(Ala、Arg、His、Lys、Met、Ser、Tyr)的影响；
3.本发明的荧光探针对GSH的响应浓度位于毫摩尔级别，正好匹配细胞中GSH的含量，可以用于细胞中GSH的定量检测；
4.本发明的荧光探针对细胞毒性较小，且细胞的渗透性较好，能够很快的进入细胞；
5.本发明的荧光探针与GSH的荧光波长长，达到630nm，有利于避免生物样品背景荧光的干扰，可用于细胞成像。
附图说明
利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制。
图1为本发明的一种氧杂蒽类荧光探针的1H核磁共振图谱；
图2为本发明的一种氧杂蒽类荧光探针的13C核磁共振图谱；
图3为本发明的一种氧杂蒽类荧光探针的MS(ESI)图谱；
图4为本发明的一种氧杂蒽类荧光探针在水溶液中随GSH浓度变化的荧光光谱图；
图5为本发明的一种氧杂蒽类荧光探针在水溶液中，荧光光谱630nm处荧光强度与相应GSH浓度数据线性拟合图；
图6为本发明的一种氧杂蒽类荧光探针对其他分析物(包括生物硫醇、氨基酸和不同离子)在水溶液中，荧光光谱630nm处荧光光谱图；
图7为本发明的一种氧杂蒽类荧光探针在水溶液中随Cys浓度变化的荧光光谱图；
图8为本发明的一种氧杂蒽类荧光探针在加入其他分析物(包括生物硫醇、氨基酸和不同离子)后，再加入GSH在水溶液中，荧光光谱630nm处荧光光谱图；
图9为本发明的一种氧杂蒽类荧光探针在不同pH值下水溶液中，荧光光谱630nm处荧光强度的变化图；
图10为本发明的一种氧杂蒽类荧光探针在水溶液中，荧光光谱630nm处荧光强度随时间的变化图；
图11为本发明的一种氧杂蒽类荧光探针的细胞毒性实验；
图12为本发明的一种氧杂蒽类荧光探针在宫颈癌细胞Hela细胞中对GSH的识别图。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步描述。
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下的实施例是仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，并非是以此来限制本发明所要求保护的范围。
实施例1
一种氧杂蒽类荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)通式(III)的化合物的制备：将4-二乙氨基酮酸(1.72g,5.5mmol)加入到10mL甲基磺酸中，100℃下加热溶解，然后加入6-氨基-1,2,3,4-四氢-1-萘酮(0.81g,5mmol),继续加热搅拌4小时后，停止反应。反应混合物冷却至室温后，在搅拌下将反应物慢慢加入到盛有冰块的烧杯中，然后慢慢滴加10mL高氯酸(70％)，烧杯中慢慢出现棕红色固体沉淀，放置冰箱中静置一段时间后，进行抽滤，干燥得2.24g紫色固体，产率83％。1H-NMR(400MHz,MeOD),δ8.21(d,J＝7.7Hz,1H),8.08(dd,J＝8.8,4.3Hz,1H),7.74(t,J＝7.4Hz,1H),7.68(t,J＝7.5Hz,1H),7.29(d,J＝7.4Hz,1H),7.05(s,1H),7.02(s,2H),6.74–6.68(m,1H),6.52(s,1H),3.60(d,J＝7.0Hz,4H),2.82(t,J＝7.2Hz,2H),2.56(t,J＝7.2Hz,2H),1.17(t,J＝7.0Hz,6H)。
(2)通式(II)的化合物的制备：将通式(III)的化合物(440mg,0.82mmol)溶解于20mL无水甲醇中，然后在冰水浴下滴加1.5mL浓硫酸，然后转移至油浴中回流24小时，停止反应。反应混合物冷却至室温后，将甲醇蒸除。然后将蒸除后的残渣用饱和碳酸钠溶液进行中和，再用二氯甲烷萃取三遍，合并有机层，用饱和氯化钠洗涤后，加入无水硫酸镁干燥30分钟后，过滤旋干得紫色粗品。最后将粗品经硅胶层析柱进行分离提纯(二氯甲烷/乙醇＝25：1到10：1,V/V)，得408mg的绿色固体，产率90％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6),δ8.22(d,J＝7.9Hz,1H),8.15(d,J＝8.8Hz,1H),7.90(t,J＝7.5Hz,1H),7.78(t,J＝7.7Hz,1H),7.44(d,J＝7.6Hz,1H),7.33(s,2H),7.22(d,J＝2.2Hz,1H),7.07(dd,J＝9.4,2.2Hz,1H),6.85(d,J＝9.3Hz,1H),6.75(dd,J＝8.8,1.8Hz,1H),6.53(s,1H),3.66(s,3H),3.58(d,J＝7.1Hz,4H),2.91-2.69(m,2H),2.49-2.32(m,2H),1.20(t,J＝7.0Hz,6H).
(3)氧杂蒽类荧光探针的制备：将通式(II)的化合物(232.0mg,0.42mmol)和无水碳酸钾(348.0mg,2.52mmol)溶于10mL无水乙腈中，冰浴中搅拌30分钟后，将2,4-二硝基苯磺酰氯(224.0mg,0.84mmol)溶于10mL无水乙腈中，用恒压漏斗慢慢滴加入反应液中，滴加完毕后在室温下继续搅拌6小时后，停止反应。蒸除反应溶剂，并用二氯甲烷溶解，最后经过1mol/L的盐酸、饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤得紫色粗品。粗品经硅胶层析柱进行分离提纯(二氯甲烷/乙醇＝50：1到20：1,V/V)，得50mg的紫色固体，即通式(I)的化合物，产率15％。
1H NMR(见图1)(400MHz,CDCl3),δ8.44(d,J＝8.8Hz,1H),8.34(d,J＝7.8Hz,2H),8.24(d,J＝7.8Hz,1H),7.98(d,J＝9.0Hz,1H),7.79-7.75(m,1H),7.68(t,J＝7.6Hz,1H),7.24(d,J＝7.9Hz,1H),7.13(d,J＝9.0Hz,1H),7.02(s,1H),6.87(d,J＝5.4Hz,1H),6.80-6.75(m,2H),3.72(s,3H),3.56(q,J＝7.1Hz,4H),2.79(t,J＝7.3Hz,2H),2.48(t,J＝7.4Hz,2H),1.30(t,J＝7.1Hz,6H).
13C NMR(见图2)(100MHz,CDCl3),δ164.95,164.30,159.34,156.81,155.74,152.36,147.66,147.54,144.53,143.42,134.48,132.69,131.10,130.63,129.27,128.62,128.41,128.31,128.10,124.86,121.98,119.50,118.99,118.26,114.83,113.89,113.49,95.62,51.95,44.84,26.70,23.54,11.88.
MS(ESI)(见图3):calcd for[C35H31N4O9S]+683.2,found 683.1.
实施例2
一种氧杂蒽类荧光探针及一些分析物储备液的配制
将一定量的实施例1制备所得的氧杂蒽类荧光探针溶解于色谱级的乙腈溶剂中，配制成0.5mM的储备液并保存于冰箱中。将一定量的GSH溶解于二次蒸馏水中，配制成35mM的储备液并保存于冰箱中。其他分析物包括氨基酸(Ala、Arg、His、Lys、Met、Ser、Tyr)，无机盐(Al(NO3)3、CaCl2、CuSO4、MgCl2、NaBr、NaCl、Na2S)和其他生物硫醇(Cys、Hcy)均用二次蒸馏水作为溶剂，配制成10mM的储备液并保存于冰箱中。将一定量的N-乙基马来酰亚胺(NEM)溶解于二次蒸馏水中，配制成50mM的储备液并保存于冰箱中。将一定量的N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)溶解于二次蒸馏水中，配制成10mM的储备液并保存于冰箱中。
氧杂蒽类荧光探针的荧光性质测试：
将0.5mM的GSH检测的小分子氧杂蒽类荧光探针用PBS：CH3CN＝8:2(pH＝7.4)的混合溶剂稀释至荧光探针分子浓度为5μM的溶液。然后分别加入不同体积的GSH的储备溶液使GSH得最终浓度为0-7mM。在37℃震荡30分钟后，将各测试溶液转移至1cm×1cm的标准石英比色皿中，进行荧光光谱测定。其中，激发波长为550nm，光栅缝隙大小为10×10nm，电压为400V。图4为本发明所涉及的基于氧杂蒽类的GSH检测的小分子荧光探针在水溶液中随GSH浓度变化的荧光光谱图。将荧光光谱中630nm处的荧光强度与相应的GSH浓度进行线性拟合，在GSH浓度为1-6mM范围内得到一线性拟合直线(图5)，其检测限为0.013mM，表明GSH可以运用于水溶液中GSH的定量检测。另外细胞中GSH的含量为0.5-10mM，本发明的探针的线性关系的GSH的浓度正好处于该范围内，因此该发明的探针也能够用于细胞中GSH的定量检测。
实施例3
氧杂蒽类荧光探针的选择性及抗干扰实验：
使用实施例2配制的溶液，在探针浓度为5μM的混合溶剂(PBS：CH3CN＝8:2，pH＝7.4)中分别加入不同的氨基酸(Ala、Arg、His、Lys、Met、Ser、Tyr,0.5mM)，阳离子(Al3+、Ca2 +、Cu2+、Mg2+、Na+,0.5mM)，阴离子(Cl-、Br、SO4 2、S2-,0.5mM)，其他生物硫醇(Cys、Hcy,0.5mM)，GSH(7mM)测定波长为630nm处的荧光强度。由图6可以看出，除了加入Cys和GSH，荧光强度有大约20倍和100倍的增强，其他分析物几乎没有引起荧光强度的变化。进一步做Cys在浓度为0、20、50、100、200和500μM六个浓度下的荧光光谱图。如图7所示，在Cys浓度为0～50μM，荧光强度几乎没有变化，当Cys浓度为100～500μM，荧光强度大概有10～20倍的变化，然而细胞中的Cys的含量低于100μM，因此它对细胞中GSH的检测产生的影响可以忽略不计，该探针表现出一定的选择性。此外，对加入其它分析物和GSH与单纯只加入GSH，在波长为630nm下的荧光强度进行了对比，发现加入其他分析物之后，其荧光强度与单纯只加入GSH之后，变化不明显(图8)，说明了本发明的小分子荧光探针具有较好的抗干扰能力。结合选择性和抗干扰实验，进一步表明该探针可以用来定量检测细胞中的GSH。
实施例4
氧杂蒽类荧光探针的在波长为630nm处的荧光强度随溶液pH值的变化：观察溶液pH值对本发明的荧光探针进行GSH检测时的荧光强度变化。研究的pH范围为3～10，荧光探针浓度为5μM，GSH的浓度为7mM。如图9所示，随着pH的增加，探针本身在630nm处的荧光强度几乎不变，说明pH对探针本身没有多大影响。但当加入GSH后，在pH为3～5时，荧光强度增加较慢。在pH为5～7，荧光强度增加较大。在pH为7～10时，荧光强度增加又较慢。可见，在pH为7.4时，荧光强度几乎增加到了最大值，适合该探针检测细胞中的GSH。
实施例5
氧杂蒽类荧光探针在波长为630nm处的荧光强度随时间的变化：选取荧光探针浓度为5μM，GSH的浓度为7mM，测试溶剂为PBS：CH3CN＝8:2，pH＝7.4的混合溶剂，来考察630nm处荧光强度随时间的变化。如图10所示，随着时间的增加，荧光强度也逐渐增强。30分钟后，荧光强度达到了最大强度，随着时间的继续增加，其荧光强度几乎不变，选取30分钟作为响应时间。正好使得小分子探针可以充分进入细胞与GSH进行作用，进行GSH的定量检测。
实施例6
氧杂蒽类荧光探针的细胞毒性：
为了考察本发明的探针是否适合于细胞中GSH检测，采用MTT法测试探针浓度为0、5、10、15、20、50μM等5个浓度下对人类宫颈癌细胞Hela细胞的毒性。如图11所示，加入0-20μM的探针作用24小时后，细胞的存活率高达90％以上，甚至在50μM时，细胞存活率高达85％以上。由此可见，本发明的荧光探针可以应用于检测活细胞中的GSH，并且毒性较小。
实施例7
氧杂蒽类荧光探针在Hela细胞中对GSH的荧光成像：
将Hela细胞进行了三组处理：第一组直接加入最终浓度为2.5μM荧光探针；第二组先加入GSH的前体NAC(2mM)，再加入探针；第三组先加入GSH清除剂NEM，再加入探针。如图12所示，第一组加入荧光探针时，细胞中明显的红色荧光；第二组细胞中也有明显的红色荧光，且荧光强度比第一组强，表明外加的生成的GSH与探针发生了作用。第三组细胞在加入NEM清除GSH后，再加入荧光探针，细胞中几乎没有荧光。其中，A图为第一组的眀场和荧光成像图，B图为第二组的眀场和荧光成像图，C图为第三组的眀场和荧光图。综上所述，本发明的小分子探针可以在活细胞中对GSH进行荧光成像。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种氧杂蒽类荧光探针，其特征在于，具有通式(I)的化学结构：
Figure FDA0003546630210000011
2.一种根据权利要求1所述氧杂蒽类荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
Figure FDA0003546630210000012
步骤一：将4-二乙氨基酮酸和6-氨基-1,2,3,4-四氢-1-萘酮加入到甲基磺酸中，90～120℃下反应3～5小时，冷却至室温后加入到盛有冰块的容器中，滴加高氯酸，过滤，干燥，得通式(III)的化合物；
步骤二：将所述通式(III)的化合物溶解于无水甲醇中，在冰水浴下滴加浓硫酸，加热回流，分离提纯，得通式(II)的化合物；
步骤三：将所述通式(II)的化合物和无水碳酸钾溶于无水乙腈中，滴加溶于无水乙腈的2,4-二硝基苯磺酰氯溶液，室温下搅拌3～9小时，分离提纯，得具有通式(I)的化学结构的化合物，即所述氧杂蒽类荧光探针。
3.根据权利要求2所述的一种氧杂蒽类荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤一所述4-二乙氨基酮酸与所述6-氨基-1,2,3,4-四氢-1-萘酮的摩尔比为1.1∶1，在100℃下，反应时间为4小时。
4.根据权利要求2所述的一种氧杂蒽类荧光探针的制备方法，其特征在于：
步骤二所述通式(III)的化合物：浓硫酸＝1mmol：1.8mL，加热回流24小时。
5.根据权利要求2所述的一种氧杂蒽类荧光探针的制备方法，其特征在于：
步骤二所述分离提纯为蒸除甲醇，以二氯甲烷：乙醇＝10～25：1v/v为淋洗液，使用柱层析提纯。
6.根据权利要求2所述的一种氧杂蒽类荧光探针的制备方法，其特征在于：
步骤三所述通式(II)的化合物：碳酸钾：2,4-二硝基苯磺酰氯的摩尔比为1∶6∶2，搅拌时间为6小时。
7.根据权利要求2所述的一种氧杂蒽类荧光探针的制备方法，其特征在于：
步骤三所述分离提纯为蒸除无水乙腈，用二氯甲烷溶解，用1mol/L的盐酸、饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥。
8.根据权利要求2所述的一种氧杂蒽类荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤三所述分离提纯为以二氯甲烷：乙醇＝20～50：1v/v为淋洗液，使用柱层析提纯。
9.一种根据权利要求1所述氧杂蒽类荧光探针的应用，其特征在于：通式(I)的化合物在制备作为谷胱甘肽检测的荧光探针中的应用。
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