CN104177341A - 一种检测二价铜离子的化合物及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测二价铜离子的化合物及其制备与应用，所述化合物为香豆素衍生物：7-(二乙胺基)香豆素-3-（N-8-喹啉）-甲酰胺（DQCC）；该化合物由7-(二乙胺基)香豆素-3-羧酸和8-氨基喹啉在含有O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯和N,N-二异丙基乙胺的DMF溶液中反应制得；可利用该化合物对Cu2+进行检测。本发明化合物的制备反应条件简单，处理步骤方便，易于生产；其应用方法采用紫外-可见分光光度法或荧光分光光度法进行检测，对二价铜离子显示出了高灵敏度、高选择性及操作简便、肉眼容易观测等优点，在系统的实验条件的调试下，可以实现环境及生物样品中铜离子的检测。
Description
技术领域
本发明属于具体涉及一种检测二价铜离子的化合物及其制备与应用。
背景技术
铜是生物体中基本的微量元素之一，在不同的生理过程如线粒体的呼吸、铁的吸收及超氧化歧化酶和酪氨酸酶等的氧化还原过程中作为催化辅助因子起着重要作用。人体内如果铜元素缺乏会导致生长和代谢的紊乱，但生物体内摄入过量的铜也会产生毒性，从而引起一些严重的神经退行性疾病，包括门克斯和威尔逊疾病、阿尔茨海默氏症、肌萎缩性侧索硬化症、朊毒体病等。此外，由于人类长期大量的过度使用，铜已成为环境中的一种重要污染物。因此，定量检测铜离子，尤其对于跟踪其在环境和生命活动中的作用具有重要意义。
目前，很多方法如电化学法、原子吸收光谱法、分光光度法、荧光法、电感耦合等离子体原子发射光谱法等方法都被用于检测铜离子的浓度，而荧光分析法具有检测灵敏度高（可实现单分子检测）、选择性好、成本低、易操作等优点，因此备受人们关注。其中，香豆素类中的荧光基团具有较高的荧光量，在产率、光量子稳定性、Stokes位移较大等优点，被广泛用来设计荧光探针。本发明通过对香豆素进行结构改造，合成出具有全新化学结构的香豆素衍生物，其对二价铜离子显示出了高灵敏度、高选择性及操作简便、肉眼容易观测等优点，能用于环境及生物样品中铜离子的定量检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测二价铜离子的化合物及其制备与应用，其合成体系简单、操作方便，检测时选择性高、灵敏度高、生物相容性好，适用于环境及生物样品中铜离子的定量检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测二价铜离子的化合物为香豆素衍生物，其化学名称为：7-(二乙胺基)香豆素-3-（N-8-喹啉）-甲酰胺（DQCC），结构式为：
。
所述检测二价铜离子的化合物的制备方法，是将7-(二乙胺基)香豆素-3-羧酸和8-氨基喹啉按摩尔比1:1溶解在DMF中，冰浴下加入与7-(二乙胺基)香豆素-3-羧酸等摩尔的O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU）和其2倍摩尔的N,N-二异丙基乙胺（DIPEA），常温反应16小时后，用乙酸乙酯和水萃取，取有机相浓缩，过硅胶柱即得。其合成路线为：
。
所述检测二价铜离子的化合物可利用紫外-可见分光光度法或荧光分光光度法对环境及生物样品中Cu2+进行定量检测。
所述紫外-可见分光光度法具体包括如下步骤：
1）配制pH=7.4、浓度为20 mM的HEPES缓冲溶液，并用DMSO配制2 mM的化合物溶液；
2）将20 μL的化合物溶液加入到5 mL离心管中，分别加入0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 μL浓度为2 mM的Cu2+溶液，再加入HEPES缓冲溶液使终体积为2 mL，混合后加入到紫外比色皿中，在紫外-可见分光光度仪上测定446 nm波长处对应的吸收值，随着铜离子浓度的增加，446 nm波长处对应的吸收值下降；然后以Cu2+浓度为横坐标，以吸收值为纵坐标绘制Cu2+浓度的标准工作曲线，并得出线性回归方程；
3）将20 μL的化合物溶液加入到5 mL离心管中，加入一定体积的待测样品溶液，再加入HEPES缓冲溶液使终体积为2 mL，混合后加入到紫外比色皿中，在紫外-可见分光光度仪上测定446 nm波长处对应的吸收值，将此吸收值带入步骤2）的线性回归方程，求得待测样品中Cu2+的浓度。
所述荧光分光光度法具有包括如下步骤：
1）配制pH=7.4、浓度为20 mM的HEPES缓冲溶液，并用DMSO配制2 mM的化合物溶液；
2）将20 μL的化合物溶液加入到5 mL离心管中，分别加入0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 μL浓度为2 mM的Cu2+溶液，再加入HEPES缓冲溶液使终体积为2 mL，混合后加入到荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上以442nm作为激发波长，测定566 nm波长处对应的荧光值，然后以Cu2+浓度为横坐标，以荧光值为纵坐标绘制Cu2+浓度的标准工作曲线，并得出线性回归方程；
3）将20 μL的化合物溶液加入到5 mL离心管中，加入一定体积的待测样品溶液，再加入HEPES缓冲溶液使终体积为2 mL，混合后加入到荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上以442nm作为激发波长，测定566 nm波长处对应的荧光值，将此荧光值带入步骤2）的线性回归方程，求得待测样品中Cu2+的浓度。
所述检测二价铜离子的化合物还可用于细胞中Cu2+的定性检测。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
（1）本发明合成反应条件简单，处理步骤方便，易于生产。
（2）利用本发明化合物测定二价铜离子，可显示出较高的灵敏性和选择性；其过程简便，只需借助紫外分光光度计或荧光分光光度计，且成本低廉，适用于环境及生物样品中铜离子的定量检测。
（3）本发明化合物还能对细胞内是否含有铜离子进行定性测定。
附图说明
图1为实施例2采用紫外-可见分光光度法测得的Cu2+浓度标准工作曲线。
图2为实施例3采用荧光分光光度法测得的Cu2+浓度标准工作曲线。
图3为实施例4采用紫外-可见分光光度法测定DQCC与不同金属离子作用的紫外光谱图。
图4为实施例5采用荧光分光光度法测定DQCC与不同金属离子作用的荧光发射光谱图。
图5为实施例6细胞内铜离子检测的荧光显微视图。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1
化合物的合成：将7-(二乙胺基)香豆素-3-羧酸（约60 mg）和8-氨基喹啉（约33 mg）按摩尔比1:1溶解在1 mL（DMF）中，冰浴下加入104 mg O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU）和60 mg N,N-二异丙基乙胺（DIPEA），常温反应16小时后，用100 mL乙酸乙酯和30 mL水萃取，取有机相浓缩，过硅胶柱，即得7-(二乙胺基)香豆素-3-（N-8-喹啉）-甲酰胺（DQCC）
，产率为79%。
DQCC的表征：
1H NMR (400 MHz，CDCl3) δ：12.77 (s，1H)，8.99-9.00 (m，2H)，8.85 (s，1H)，8.16 (d，1H，J=8.0 Hz)，7.53-7.59 (m，2H)，7.45-7.49 (m，2H)，6.67 (d，1H，J=8.0 Hz)，6.55 (s，1H)，3.47 (q，2H，J=8.0 Hz)，1.26 (t，3H，J=8.0 Hz)。
13C NMR (100 MHz，DMSO-d 6 ) δ：161.7，161.0，157.6，152.8，149.1，148.4，138.5，136.5，135.1，131.9，127.9，127.0，122.1，121.9，116.8，110.3，109.2，108.0，95.9，44.4，12.3。
HRMS (ESI) calcd for C23H22N3O3：388.1656 (M+H)+。found 388.1657。
实施例2
采用紫外-可见分光光度法对Cu2+进行检测，具体包括以下步骤：
1）配制pH=7.4、浓度为20 mM的HEPES缓冲溶液，并用DMSO配制浓度为2 mM的DQCC溶液；
2）将20 μL的DQCC溶液加入到5 mL离心管中，分别加入0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 μL浓度为2 mM的Cu2+溶液，再加入HEPES缓冲溶液使终体积为2 mL，混合后加入到紫外比色皿中，在紫外-可见分光光度仪上测定446 nm波长处对应的吸收值；然后以Cu2+浓度为横坐标，以吸收值为纵坐标绘制Cu2+浓度的标准工作曲线（如图1），并得出线性回归方程为y=0.0013x+0.122，R2=0.9982（Cu2+浓度范围为0-20μM）；
3）将20 μL的DQCC溶液加入到5 mL离心管中，加入一定体积的待测样品溶液，再加入HEPES缓冲溶液使终体积为2 mL，混合后加入到紫外比色皿中，在紫外-可见分光光度仪上测定446 nm波长处对应的吸收值，将此吸收值带入步骤2）的线性回归方程，即可求得待测样品中Cu2+的浓度。
实施例3
采用荧光分光光度法对Cu2+进行检测，具有包括如下步骤：
1）配制pH=7.4、浓度为20 mM的HEPES缓冲溶液，并用DMSO配制浓度为2 mM的DQCC溶液；
2）将20 μL的DQCC溶液加入到5 mL离心管中，分别加入0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 μL浓度为2 mM的Cu2+溶液，再加入HEPES缓冲溶液使终体积为2 mL，混合后加入到荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上以442nm作为激发波长，测定566 nm波长处对应的荧光值；然后以Cu2+浓度为横坐标，以荧光值为纵坐标绘制Cu2+浓度的标准工作曲线（如图2），并得出线性回归方程为y=-1829.5x+33167，R2=0.9971（Cu2+浓度范围为0–12μM）；
3）将20 μL的DQCC溶液加入到5 mL离心管中，加入一定体积的待测样品溶液，再加入HEPES缓冲溶液使终体积为2 mL，混合后加入到荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上以442nm作为激发波长，测定566 nm波长处对应的荧光值，将此荧光值带入步骤2）的线性回归方程，即可求得待测样品中Cu2+的浓度。
实施例4
采用紫外-可见分光光度法对不同金属离子进行检测：
1）配制pH=7.4、浓度为20 mM的HEPES缓冲溶液，并用DMSO配制浓度为2 mM的DQCC溶液；
2）用蒸馏水配制浓度为20 mM的Na+、Ca2+、Mg2+、K+、Ni2+、Fe2+、Co2+、Hg2+、Ag+、Cu2+、Cd2+溶液；将20 μL的DQCC溶液加入到5 mL离心管中，加入各种离子溶液的体积为20 μL，再加入HEPES缓冲溶液使终体积为2 mL，混合后加入到紫外比色皿中，在紫外-可见分光光度仪上以不同波长的进行扫描，其紫外光谱图如图3；
3）将检测后的样品溶液分别装入试剂瓶中，用肉眼观察即可看出仅有含Cu2+的样品溶液为黄色，含其余金属离子的样品溶液呈米黄色。
从以上结果可知，本发明DQCC对Cu2+具有很好的选择性，适用于Cu2+的检测。
实施例5
采用荧光分光光度法对不同金属离子进行检测：
1）配制pH=7.4、浓度为20 mM的HEPES缓冲溶液，并用DMSO配制浓度为2 mM的DQCC溶液；
2）用蒸馏水配制浓度为20 mM的Na+、Ca2+、Mg2+、K+、Ni2+、Fe2+、Co2+、Hg2+、Ag+、Cu2+、Cd2+溶液；将20 μL的DQCC溶液加入到5 mL离心管中，加入各种离子溶液的体积为20 μL，再加入HEPES缓冲溶液使终体积为2 mL，混合后加入到荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上，以442nm作为激发波长，在不同波长下进行测定，其荧光发射光谱图如图4。
从以上结果可知，本发明DQCC对Cu2+具有很好的选择性，适用于Cu2+的检测。
实施例6
以人宫颈癌细胞系Hela细胞为测试细胞系（细胞购自中国科学院上海生命科学研究所细胞资源中心）。
细胞培养方法：取出液氮中冻存的Hela细胞，在37℃的温水中解冻，将细胞悬液移入15 ml离心管中，加5 ml DMEM完全培养液，轻轻吹打均匀，置于离心机中，3000 rpm离心5 min，弃去上清液，加入2 ml DMEM完全培养液，轻轻吹打均匀，将细胞悬液加入培养皿中，补加6 ml DMEM完全培养液，将培养皿置于5% CO2、37℃培养箱中培养。
荧光成像：将Hela细胞以1×105个/孔的密度接种到24孔培养板中，培养24 h后将培养液更换为新鲜血清培养液，加入10 μM DQCC溶液，孵育2 h后，一半数量培养孔中加入100 μM Cu2+，另一半数量培养孔中不加Cu2+作为对照，再孵育30 min，吸弃孔中溶液，用PBS洗涤3遍，用荧光显微镜观察细胞内的荧光。
图5为细胞内铜离子检测的荧光显微视图，由于DQCC与Cu2+反应可使荧光明显减弱，通过与未加Cu2+的细胞进行比对，利用荧光显微视图中的荧光图及重叠图可明确判断细胞中是否含有铜离子。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (6)
1. 一种检测二价铜离子的化合物，其特征在于：所述化合物为香豆素衍生物，其化学名称为：7-(二乙胺基)香豆素-3-（N-8-喹啉）-甲酰胺，结构式为：
。
2. 一种如权利要求1所述检测二价铜离子的化合物的制备方法，其特征在于：将7-(二乙胺基)香豆素-3-羧酸和8-氨基喹啉按摩尔比1:1溶解在DMF中，冰浴下加入与7-(二乙胺基)香豆素-3-羧酸等摩尔的O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯和其2倍摩尔的N,N-二异丙基乙胺，常温反应16小时后，用乙酸乙酯和水萃取，取有机相浓缩，过硅胶柱即得。
3. 一种如权利要求1所述检测二价铜离子的化合物的应用，其特征在于：采用紫外-可见分光光度法或荧光分光光度法对环境及生物样品中Cu2+进行定量检测。
4. 根据权利要求3所述检测二价铜离子的化合物的应用，其特征在于：所述紫外-可见分光光度法具体包括如下步骤：
1）配制pH=7.4、浓度为20 mM的HEPES缓冲溶液，并用DMSO配制2 mM的化合物溶液；
2）将20 μL的化合物溶液加入到5 mL离心管中，分别加入0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 μL浓度为2 mM的Cu2+溶液，再加入HEPES缓冲溶液使终体积为2 mL，混合后加入到紫外比色皿中，在紫外-可见分光光度仪上测定446 nm波长处对应的吸收值，然后以Cu2+浓度为横坐标，以吸收值为纵坐标绘制Cu2+浓度的标准工作曲线，并得出线性回归方程；
3）将20 μL的化合物溶液加入到5 mL离心管中，加入一定体积的待测样品溶液，再加入HEPES缓冲溶液使终体积为2 mL，混合后加入到紫外比色皿中，在紫外-可见分光光度仪上测定446 nm波长处对应的吸收值，将此吸收值带入步骤2）的线性回归方程，求得待测样品中Cu2+的浓度。
5. 根据权利要求3所述检测二价铜离子的化合物的应用，其特征在于：所述荧光分光光度法具有包括如下步骤：
1）配制pH=7.4、浓度为20 mM的HEPES缓冲溶液，并用DMSO配制2 mM的化合物溶液；
2）将20 μL的化合物溶液加入到5 mL离心管中，分别加入0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 μL浓度为2 mM的Cu2+溶液，再加入HEPES缓冲溶液使终体积为2 mL，混合后加入到荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上以442nm作为激发波长，测定566 nm波长处对应的荧光值，然后以Cu2+浓度为横坐标，以荧光值为纵坐标绘制Cu2+浓度的标准工作曲线，并得出线性回归方程；
3）将20 μL的化合物溶液加入到5 mL离心管中，加入一定体积的待测样品溶液，再加入HEPES缓冲溶液使终体积为2 mL，混合后加入到荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上以442nm作为激发波长，测定566 nm波长处对应的荧光值，将此荧光值带入步骤2）的线性回归方程，求得待测样品中Cu2+的浓度。
6. 一种如权利要求1所述检测二价铜离子的化合物的应用，其特征在于：用于细胞中Cu2+的定性检测。
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