CN103983765B - 一种荧光检测三价铁离子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于香豆素衍生物(分子式:C14H5NO3)定量检测三价铁离子的荧光检测方法,香豆素衍生物7-二乙氨基香豆素-4-甲醛根据文献合成。具体是在pH为7.0的HEPES缓冲溶液中,利用Fe3+与7-二乙氨基香豆素-4-甲醛结构中两个羰基进行配位,发生荧光淬灭,实现三价铁离子的检测。该检测方法对三价铁离子显示了高的灵敏性和选择性,检测试剂廉价、过程简便、灵敏、快速,检测结果准确。此外,共焦荧光图像进一步表明该探针可以用来识别活细胞内的Fe3+。
Description
技术领域
本发明涉及三价铁离子的检测技术,具体属于一种以7-二乙氨基香豆素-4-甲醛为荧光试剂,快速、定量荧光检测三价铁离子的方法。
背景技术
铁元素是一种非常重要的微量元素,具有重要的生物学意义。例如铁元素是大脑中最丰富的过渡金属元素,大脑组织利用他作为酶的重要组成成分参与氧气的传递和代谢;铁元素也是许多金属蛋白不可缺少的组分;铁元素还是许多酶的催化剂参与有氧代谢和电子转移等等。另外,人体内的铁元素是构成血红蛋白,肌红蛋白的原料,而且还是维持人体正常生命活动最重要的一些酶的组分,与能量代谢关系密切。同时,铁离子的转运,储存以及平衡都与有机体紧密相关,铁离子的缺乏和过量都会导致各种各样的机体功能紊乱。因此,准确检测铁离子对有效诊断某些疾病显得非常重要。在目前已知的检测铁离子的方法中,由于荧光分析法有快速响应和高灵敏度的特点,荧光探针被广泛研究。
近几年来,人们开始关注设计合成对Fe3+具有特异性响应的荧光探针,并合成了几类有机荧光探针,具有代表性的主要有:香豆素类,罗丹明类,荧光素类,荧光染料BODIPY,萘腙衍生物,本探针化合物与Fe3+作用后,荧光强度显著降低,其他一些常见金属阳离子几乎没有显著地荧光响应。因此本发明可以作为选择性检测生物体内Fe3+的荧光探针,也可用于荧光标记细胞内Fe3+,为临床医学中相关疾病的诊断提供帮助。
发明内容
本发明的目的在于提供一种定量检测三价铁离子的荧光检测方法,该方法灵敏度高、选择性好、廉价、方便。
本发明根据文献合成香豆素衍生物7-二乙氨基香豆素-4-甲醛,并将此作为荧光试剂用于Fe3+的检测。7-二乙氨基香豆素-4-甲醛的结构式及合成方法如下如下:
结构式:
合成步骤:
(1)在二甲苯溶液中,加入SeO2和7-二乙氨基-4-甲基香豆素(2.06g,8.9mmol)。开动搅拌,反应混合物加热回流反应3h。
(2)待棕色混合物冷却至室温,再加入另一份SeO2,该体系继续回流反应3h。用丙酮溶解深棕色残油,过滤掉固体。
(3)在己烷:丙酮(4:1)溶液体系中通过柱色谱法浓缩净化得到深黄色固体。分离纯化得620mg7-二乙氨基香豆素-4-甲醛,收率为28%。
本发明提供的一种定量检测三价铁离子的荧光检测方法,步骤为:
(1)配制pH=7.0浓度为10mM的HEPES缓冲溶液,并用乙腈配制1mM的7-二乙氨基香豆素-4-甲醛探针储备液;
(2)按体积比1000:1将HEPES缓冲溶液和7-二乙氨基香豆素-4-甲醛探针储备液加到干净的荧光比色皿中,在荧光分光光度仪上检测,随着待测样的加入,494nm处的荧光强度逐渐减弱;
(3)用蒸馏水配制10mM的Fe3+溶液,把2000μL的HEPES缓冲溶液和2μL7-二乙氨基香豆素-4-甲醛探针储备液加到荧光比色皿中,每隔10s加入1μL Fe3+进行荧光滴定实验,共加18μL,以Fe3+浓度为横坐标,以相对荧光强度F0-F为纵坐标绘制图,得到Fe3+浓度的工作曲线,线性回归方程为:△F=0.7597c+1.8785,c的单位为10-6mol/L。
(4)将HEPES缓冲溶液2000μL和7-二乙氨基香豆素-4-甲醛探针储备液2μL加到干净的荧光比色皿中,用移液枪吸取VμL待测样品溶液,加入到干净的荧光比色皿中,在荧光分光光度计上检测,将测得的荧光强度代入步骤(3)的线性回归方程,得到浓度c=2000μL×c×10-6/VμL,即可求得Fe3+的浓度。
经实验验证,其它金属阳离子不干扰体系对Fe3+的测定。所以,香豆素衍生物7-二乙氨基香豆素-4-甲醛可作为荧光试剂在检测三价铁离子中的应用。
与现有技术相比,本发明作为选择性检测生物体内Fe3+的荧光探针有如下优点:探针化合物与Fe3+作用后,荧光强度显著降低,其他一些常见金属阳离子几乎没有荧光响应。
附图说明:
图1实施例2Fe3+对7-二乙氨基香豆素-4-甲醛化合物荧光滴定
图2实施例37-二乙氨基香豆素-4-甲醛化合物与各种金属阳离子的荧光柱状图
图3实施例47-二乙氨基香豆素-4-甲醛荧光探针检测Fe3+的工作曲线
图4实施例5细胞成像图
具体实施方式
实施例1香豆素衍生物7-二乙氨基香豆素-4-甲醛的制备
7-羟基香豆素-4-甲醛根据文献合成,其合成路线:
在二甲苯溶液中,加入SeO2和7-二乙氨基-4-甲基香豆素(2.06g,8.9mmol)。开动搅拌,反应混合物加热回流反应3h。待棕色混合物冷却至室温,再加入另一份SeO2,该体系继续回流反应3h。用丙酮溶解深棕色残油,过滤掉固体。在己烷:丙酮(4:1)溶液体系中通过柱色谱法浓缩净化得到深黄色固体。分离纯化得620mg7-二乙氨基香豆素-4-甲醛,收率为28%。
7-二乙氨基香豆素-4-甲醛用1H NMR、13C NMR表征,结果如下:
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ9.984(s,1H),8.258(d,J=9.3Hz,1H),6.584(d,J=9.3Hz,1H),3.393(q,J=6.6Hz,4H),1.183(t,J=6.6Hz,6H)
13C NMR(75MHz,CDCl3):δ193.47,162.77,158.24,151.88,144.73,127.90,118.16,110.38,104.55,98.42,45.69,13.34
实施例2Fe3+对7-二乙氨基香豆素-4-甲醛化合物荧光滴定
在的荧光比色皿中,用移液枪向含7-二乙氨基香豆素-4-甲醛的2mL HEPES缓冲液(pH=7.0)体系中每隔10s加入1μL Fe3+进行荧光滴定实验,共加18μL。在荧光分光光度仪上检测,随着待测样的加入,494nm处的荧光强度逐渐减弱。仪器参数:激发波长和发射波长的狭缝宽度分别为10.0nm、10.0nm,在水溶液中,荧光探针溶液的最大激发波长为:λex为396nm和最大荧光发射波长为:λem为494nm。
实施例37-二乙氨基香豆素-4-甲醛化合物对多种金属阳离子的荧光柱状图
在比色皿中加入2mL pH=7.0的HEPES缓冲液和21μL7-二乙氨基香豆素-4-甲醛的荧光储备液,再分别加入其它的金属离子(Cu2+、Cu+、Fe2+、Mn2+、Mg2+、Hg2+、Pb2+、Zn2+、Cr3+、Bi3+、Ag+、Co2+、Ni2+、K+、Na+、Cd2+、La3+),使其最终浓度为1.8mM,再加入Fe3+,使其最终浓度为90μM,分别测其荧光光谱,绘制不同金属阳离子对应494nm荧光强度的柱状图,见图2。经试验证明,其它金属阳离子不干扰体系对Fe3+的检测。
实施例47-二乙氨基香豆素-4-甲醛荧光探针检测Fe3+的工作曲线
用蒸馏水配制10mM的Fe3+溶液,把2mL的HEPES缓冲溶液和2μL7-二乙氨基香豆素-4-甲醛探针储备液加到荧光比色皿中,每隔10s加入1μL Fe3+进行荧光滴定实验,共加18μL。以Fe3+浓度为横坐标,以相对荧光强度F0-F为纵坐标绘制图,得到Fe3+浓度的工作曲线,线性回归方程为:△F=0.7597c+1.8785,c的单位为10-6mol/L。
实施例5细胞成像图
用乙腈配置2mM的7-二乙氨基香豆素-4-甲醛的乙腈溶液,将其加入肝癌细胞(HepG2细胞)培养液中,使其浓度为10μM,与肝癌细胞在37℃下反应30分钟,在激光共聚焦荧光成像仪上用405nm的激光激发,收集450~550nm的荧光信号,体系在荧光共聚焦成像仪下显示了强的蓝色荧光;将7-二乙氨基香豆素-4-甲醛的乙腈溶液加入肝癌细胞培养液中,使其浓度为10μM,与肝癌细胞在37℃下反应30分钟,再加入Fe3+,使其浓度为20μM,37℃下,反应30分钟,体系在荧光共聚焦成像仪下没有荧光发射:即先进入细胞的7-二乙氨基香豆素-4-甲醛与随后进入细胞的Fe3+作用,使其荧光淬灭。图4为荧光共聚焦成像仪下与7-二乙氨基香豆素-4-甲醛作用后的细胞a(显示蓝色荧光),以及与7-二乙氨基香豆素-4-甲醛作用再与外源的Fe3+作用的细胞b成像图(不显示荧光)。
Claims (2)
1.香豆素衍生物7-二乙氨基香豆素-4-甲醛作为荧光试剂在检测三价铁离子中的应用。
2.一种荧光检测三价铁离子的方法:其特征在于,步骤为:
(1)配制pH=7.0浓度为10mM的HEPES缓冲溶液,并用乙腈配制1mM的7-二乙氨基香豆素-4-甲醛探针储备液;
(2)按体积比1000:1将HEPES缓冲溶液和7-二乙氨基香豆素-4-甲醛探针储备液加到干净的荧光比色皿中,在荧光分光光度仪上检测,随着待测样的加入,494nm处的荧光强度逐渐减弱;
(3)用蒸馏水配制10mM的Fe3+溶液,把2000μL的HEPES缓冲溶液和2μL 7-二乙氨基香豆素-4-甲醛探针储备液加到荧光比色皿中,每隔10s加入1μL Fe3+进行荧光滴定实验,共加18μL,以Fe3+浓度为横坐标,以相对荧光强度F0-F为纵坐标绘制图,得到Fe3+浓度的工作曲线,线性回归方程为:△F=0.7597c+1.8785,c的单位为10-6mol/L;
(4)将HEPES缓冲溶液2000μL和7-二乙氨基香豆素-4-甲醛探针储备液2μL加到干净的荧光比色皿中,用移液枪吸取VμL待测样品溶液,加入到干净的荧光比色皿中,在荧光分光光度计上检测,将测得的荧光强度代入步骤(3)的线性回归方程,得到待测样品溶液Fe3+浓度=2000μL×c×10-6/VμL,即可求得Fe3+的浓度。
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