CN103436253A - 一种检测亚铁离子的罗丹明荧光探针及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测Fe²⁺的罗丹明荧光探针及其制备方法。制备方法包括：将罗丹明6G与水合肼在乙醇中回流反应生成罗丹明酰肼，再与2,6-二乙酰基吡啶在乙醇中回流反应，通过中性三氧化铝柱色谱纯化，得到罗丹明酰腙基乙酰基吡啶荧光探针；本发明的荧光探针合成产率高，反应时间快，选择性高，对Fe²⁺具有高度专一性，可在pH=7.4的生理环境条件下工作，具有应用于生物荧光成像的前景。

Description

一种检测亚铁离子的罗丹明荧光探针及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种检测亚铁离子Fe²⁺的罗丹明荧光探针及其制备方法，属于荧光探针及其制备方法技术领域。

背景技术

由于痕量铁在生物和环境因素中起着越来越重要的作用而备受关注^[1-4]。铁在生物学上的主要功能是提供氧化还原电势，这便于铁在许多生化反应中能在Fe²⁺和Fe³⁺的状态间相互转化^[5]。身体内高浓度的铁离子会提高得某种疾病或组织功能性障碍的概率。机体含铁量的紊乱也会提高某些机能障碍的发生率，例如，代谢性贫血，肝肾损伤，糖尿病，心力衰竭和神经变性疾病^[5-7]。因此，一个简便快捷地分析生物样品中铁的方法在生物学、医学问题上发挥重要影响。在过去的几十年间，Fe^3+[8-14]和Fe^2+[15-18]荧光探针的研究还是相对较少的。因此，对铁离子具有高度选择性和灵敏度的新型荧光探针的发展前景仍旧是个巨大的挑战同时也带来更多回报。

另一方面，具有“Turn-on”结构的罗丹明荧光探针因其简便性，检测限低，特异性识别能力和完美的光谱特性等性质在近几年日益受到科研工作者们的关注^[19-22]。罗丹明的各种衍生物在螺环和开环结构间达到一个平衡，这两种结构分别表示非荧光状态（“关”信号）和强荧光状态（“开”信号）。在“Turn-on”反应中，一些决定性因素可能影响着探针转变程度，比如能和探针结合的质子和金属离子（Hg²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺等）导致开环结构的形成使得荧光加强(550-600nm)。加强的荧光探针能有效的克服许多缺陷，例如较高的背景干扰和低灵敏度。迄今，在面向应用功能方面十分缺乏合适的铁荧光指示剂。一些受体常常用来模拟铁色素或结合铁的物质的机制，然而，因为铁离子的顺磁特性能使荧光猝灭常作为指示信号^[23-24]。凭借其高灵敏度、快速空间立体分析和较少的细胞损伤，使用强化的荧光探针的光学细胞成像技术也许是观察细胞内铁含量的最佳选择^[25]。最好的探针是能透过细胞膜在可见范围内或是相较生物体内其他丰富的阳离子对于目标铁元素有高度选择性且耗能低的同时表现出快速可逆的荧光强度变化。然而，在许多报道的文献中铁元素荧光探针是基于荧光淬灭机制^{[17，23，26]}，但它并不适用于活体细胞铁元素的荧光成像。基于荧光加强的罗丹明荧光探针理论上能避免上述提到的大部分缺陷。所以基于罗丹明的“Turn-on”荧光探针构想是一个理想的体系模型。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种检测Fe²⁺的罗丹明荧光探针，它能用于活体细胞内Fe²⁺的跟踪和检测；目的之二在于提供该探针的制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种检测亚铁离子的罗丹明荧光探针，命名为罗丹明酰腙基乙酰基吡啶荧光探针，所述罗丹明酰腙基乙酰基吡啶荧光探针的结构式如下所示：

上述一种检测亚铁离子的罗丹明荧光探针的制备方法，其制备流程如下：

将制得的罗丹明酰肼与2,6-二乙酰基吡啶在乙醇或甲醇中回流反应，通过中性三氧化铝柱色谱纯化，得到罗丹明酰腙基乙酰基吡啶荧光探针。

具体制备步骤包括：

步骤一：罗丹明酰肼的制备

以等摩尔量的罗丹明6G与80%水合肼为原料，溶解于甲醇溶剂或乙醇溶剂中，加热回流至反应充分，冷却后过滤得深红色粗产品，干燥后采用DMC/甲醇=10/1硅胶柱分离纯化得红色产物即罗丹明酰肼，备用；

步骤二：罗丹明酰腙基乙酰基吡啶荧光探针的制备

以步骤一得到的罗丹明酰肼与2，6-二乙酰基吡啶作为原料，溶解于甲醇溶剂或乙醇溶剂中，并滴入甲酸，混合溶液加热回流至反应充分，冷却后减压除去溶剂，用二氯甲烷/甲醇=30/1为洗脱剂，中性三氧化铝柱分离纯化得白色粉末即罗丹明酰腙基乙酰基吡啶荧光探针，探针的结构式如下：

在步骤一罗丹明酰肼的制备过程中，所述加热回流是指将混合溶液在80～90℃油浴下回流4～5小时；

在步骤二罗丹明酰腙基乙酰基吡啶荧光探针的制备过程中，所述罗丹明酰肼的摩尔量小于等于2，6-二乙酰基吡啶的摩尔量；

在步骤二罗丹明酰腙基乙酰基吡啶荧光探针的制备过程中，所述甲酸的滴入量以摩尔比计，为罗丹明酰肼与2，6-二乙酰基吡啶总量的3%～5%；

在步骤二罗丹明酰腙基乙酰基吡啶荧光探针的制备过程中，所述混合溶液加热回流至反应充分是指混合溶液在80～90℃油浴下回流48小时。

罗丹明酰腙基乙酰基吡啶荧光探针应用于活体细胞亚铁离子的荧光检测。

本发明的荧光探针合成产率高，反应时间快，选择性高，对亚铁离子Fe²⁺具有高度专一性，可在pH=7.4的生理环境条件下工作，具有应用于生物荧光成像的前景。

附图说明

图1：探针的合成路线图。

图2：在不同的pH条件下，探针和含有Fe²⁺的探针在557nm波长处的荧光强度变化，激发波长490nm。

图3：在20mM Pbs缓冲溶液(pH7.4)中，探针(5μM)对金属离子的响应，激发波长490nm。

图4：在20mM Pbs缓冲溶液(pH7.4)中，探针(5μM)对各种金属离子(5μM)的响应(红色)，探针(5μM)对各种金属离子(5μM)+Fe²⁺(5μM)的荧光响应（绿色），激发波长490nm。

图5（a）：在20mM Pbs缓冲溶液(pH7.4)中，Job’s plot曲线，探针和Fe²⁺的总量为30μM。

图5（b）：在20mM Pbs缓冲溶液(pH7.4)中，探针对Fe²⁺的线性响应关系，其中Fe²⁺的浓度范围为2μM-24μM。激发波长490nm。

图6：在Fe²⁺存在下，探针与Fe²⁺形成2:1的超分子复合物，采取开环的机理。

图7（a）：共聚焦显微成像技术跟踪探针在巨噬细胞RAW264.7中的应用；细胞用20μM的探针在37℃哺育30分钟后成像。

图7（b）：共聚焦显微成像技术跟踪探针在巨噬细胞RAW264.7中的应用；将图（a）细胞继续用20μM的Fe²⁺哺育30分钟（37℃）后成像。

图7（c）：共聚焦显微成像技术跟踪探针在巨噬细胞RAW264.7中的应用；将Fe²⁺哺育后的细胞亮视野成像。488nm激发。

具体实施方式

以下参照附图，给出本发明的具体实施方式，用来对本发明的构成进行进一步说明。

本实施例的技术方案如下：

一、实验部分

试剂和材料：所有试剂来自国药集团化学试剂有限公司

1、罗丹明酰肼的制备

在50ml烧瓶中加入罗丹明6G（4.79g，0.01mol），5ml80%水合肼，30ml甲醇，混合溶液在80-90℃油浴下回流4-5h，冷却后过滤得深红色粗产品，干燥后采用DMC/甲醇=10/1硅胶柱分离纯化得红色产物罗丹明酰肼，产率90%，备用。

2、罗丹明酰腙基乙酰基吡啶荧光探针

在50ml烧瓶中加入罗丹明酰肼（1.40g，0.003mol），2，6-二乙酰基吡啶（0.50g，0.003mol），2滴甲酸和30ml乙醇，混合溶液在80-90℃油浴下回流48h后，冷却，减压除去溶剂，用二氯甲烷/甲醇=30/1为洗脱剂，中性三氧化铝柱分离纯化得白色粉末罗丹明酰腙基乙酰基吡啶荧光探针约1.2g，产率：76%，低温避光保存备用。

M.p.=254～256℃,IR(KBr pellet cm^-1):3384(s),2966(m),2924(m),2856(m),1685(s),1622(s),1512(s),1417(s),1361(s),1271(s),1200(s),1161(m),1007(m),862(m),818(m),739(m).¹H NMR(400MHz,DMSO)δ7.96(d,J=1.9Hz,2H),7.89(dd,J=5.7,2.7Hz,1H),7.76(dd,J=7.1,2.0Hz,1H),7.59(s,2H),7.10(dd,J=5.7,2.5Hz,1H),6.26(d,J=15.9Hz,4H),5.04(s,2H),3.11(dd,J=7.0,5.6Hz,4H),2.65(s,3H),2.35(s,3H),1.89(s,6H),1.20(t,J=7.1Hz,6H).¹³C NMR(400MHz,DMSO)δ199.4,168.4,159.9,153.9,152.5,152.0,151.7,148.0,138.7,133.5,130.2,129.1,127.8,124.7,124.3,123.3,122.7,118.4,105.7,96.0,67.0,37.9,25.9,17.5,14.6.ESI-MS:m/z Calcd573.2742,found574.2832[M+1]⁺.Anal.Calcd.for C₃₅H₃₅N₅O₃:C73.27,H6.14,N12.20;Found:C73.76,H6.32,N12.04.

3、溶液的配制：

（1）0.1M的PBS缓冲溶液的配置：称取0.27g磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，1.42g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)，8g氯化钠(NaCl)，0.2g氯化钾(KCl)，加800ml蒸馏水，充分搅拌溶解，滴加稀盐酸调节pH至7.4，然后加水稀释至1L，高温高压灭菌后室温保存。

（2）探针溶液的配制：用10%的二甲基亚砜、20%的乙醇、70%的蒸馏水配制成0.1mM浓度的探针溶液，常温避光保存。

（3）各种金属离子溶液的配制：Fe³⁺,Al³⁺,Mg²⁺,Ca²⁺,Cr²⁺溶液由他们的盐酸盐制备。Ag⁺、Co²⁺,Ni²⁺,Cu²⁺,Hg²⁺,Mn²⁺和Pb²⁺溶液由相应的高氯酸盐制备。Zn²⁺,Fe²⁺,Cu²⁺溶液由他们的硫酸盐制备。分别称取一定量的金属盐，溶于100ml蒸馏水中，配制成10^-5mol/L的溶液，避光保存备用。

4、荧光测试方法：不同浓度的金属离子溶液加入到含有PBS缓冲液(2.0ml,0.1M,pH=7.4)和探针(1.0ml,0.1mM)的10ml比色管中。用二次蒸馏水稀释之后，在测试之前充分混合静置10分钟。所有的检测物的吸收峰波长设置为490nm。所有荧光检测条件为在室温下配备有氙灯和1.0cm厚度石英杯的WGY-10型荧光分光光度计。

5、结构表征：红外检测样品制成KBr的颗粒，由Perkin-Elmer公司1600傅立叶变换红外光谱仪制成在400-4000cm^-1范围内的光谱图。元素分析使用的是Perkin-Elmer公司2400型分析仪。核磁共振图谱由AM-400光谱仪绘制。化学位移是对比TMS得出。

6、细胞成像实验：RAW264.7巨噬细胞在常规1640培养液（10%的胎牛血清、2g/L的NaHCO₃、100U/ml青霉素、100μg/ml的链霉素）中培养。调整细胞密度是1.0×10⁶cell/ml。将细胞传代到放到无菌盖玻片的培养皿中，然后将其置于37℃，5%CO₂/95%的空气MCO-15AC(SANYO)培养箱中放置12小时，使其贴壁生长获取贴壁的RAW264.7巨噬细胞用于细胞成像研究。将细胞计数后直接接种到96孔板中，置于二氧化碳培养箱中培育4小时，然后在孔板中加入20μM探针培养30分钟（37℃）后成像，然后将探针哺育后的细胞中加入20μM的Fe²⁺溶液，继续培养30分钟后成像。荧光共聚焦显微成像用德国LEICA TCS SPE来完成，488nm激发。成像前用20mM的PBS(pH7.4)缓冲溶液清洗三次，以洗去未贴壁的细胞和背景中的探针，然后进行细胞成像。

二、结果分析

1、探针的结构分析

将罗丹明6G与水合肼在甲醇溶剂或乙醇溶剂中回流反应生成罗丹明酰肼，再与2,6-二乙酰基吡啶在乙醇中回流反应，通过中性三氧化铝柱色谱纯化，得到罗丹明酰腙基乙酰基吡啶荧光探针；通过¹H NMR、¹³C NMR、红外、质谱、元素分析证实其结构。所测荧光数据均在20mM的PBS(pH7.4)缓冲系统下进行。

2、探针对pH的响应研究

本研究中，我们研究了探针在不同pH缓冲液下的荧光强度。如图2，在PH<6的范围内随着酸度的增加，颜色发生明显的变化。表明这是开环结构。在490nm的激发下，pH6.0～8.0范围内，于557nm波长处发现了微弱的荧光。这说明在这个范围内更易形成螺环结构，而加入Fe²⁺后，探针变为开环形式，荧光增强，在pH6.0～8.0范围内，荧光基本处于稳定。相对于单纯的探针的发光，荧光强度增加了60倍，说明在生物环境的pH条件下，探针对Fe²⁺的响应不受环境pH值得影响，并且探针本身发射的光可忽略不计。也就是说，探针在生理环境下能正常工作。当pH值小于6时，荧光强度不仅随着金属离子协同而增强，同时随着PH值减小也会增大。

3、探针对不同金属离子的响应研究

如图2，我们研究了探针在生理环境下(20mM PBS buffer,pH7.4)的光谱特征。在490nm的激发下，探针在557nm处的强度最大。加入相同浓度的Fe²⁺立即在557nm处的粉色溶液产生强荧光信号。含有Fe²⁺的探针荧光增强了60倍，这都归因于罗丹明结构的离域呫吨部分，实现了强荧光状态（“开”信号）。^[27]

有趣的是，向探针的无色溶液中加入Fe²⁺迅速产生橘黄色的荧光，然而除Hg²⁺（仅仅有微弱的影响）以外的其他离子，如Mg²⁺,Ca²⁺,Co²⁺,Cu²⁺,Fe²⁺,Mn²⁺,Ni²⁺,Pb²⁺,Zn²⁺,Cu²⁺,Al³⁺和Cr³⁺，无产生明显变化。最重要的是Fe³⁺无干扰，这个有趣的特征表明探针能作为Fe²⁺的选择性荧光探针而不受Fe³⁺的干扰。

为了检验方法的选择性，我们单独检测了其他金属离子对Fe²⁺的影响。在相同的条件下，得出含Fe²⁺和其他阳离子(5μM)的探针的荧光图谱（图3）。此对比试验说明探针对于Fe²⁺的灵敏度几乎不受同时存在的其他金属离子的影响。

另外，Job’s plot工作图分析显示拐点为0.5，表明探针和Fe²⁺是按2:1混合的溶液（图4），在2μM-24μM(R=0.9983)范围内有良好的线性关系，回归方程为F=3.3364[Fe²⁺](μM)+0.1273，检出限是40nM（如图5）。

4、探针对Fe²⁺离子的响应机理分析

基于罗丹明复合物在螺环（“关”信号）和开环（“开”信号）结构之间的平衡而建立的“Turn-on”式荧光探针是一种理想模型。金属阳离子通过结合或不可逆化学反应导致螺环的开环，结果出现粉红色和橘黄色荧光^[19-22]。上面的研究显示，探针与离子2:1的混合物是最佳配比，这也许归因于开环机制。图6中，来自两个探针的两组{O₂N₂}与Fe²⁺离子配位，形成金属复合物，已经满足Fe²⁺的饱和配位数（Fe²⁺通常是六价配位数）。可以解释探针对Fe²⁺的荧光响应的原因。

5、共聚焦显微成像技术跟踪探针在巨噬细胞RAW264.7中的应用。

“turn-on”型荧光探针是基于荧光增强机制，适用于活体细胞铁元素的荧光成像。“turn-on”型荧光探针凭借其高灵敏度、快速空间立体分析和较少的细胞损伤，使用强化的荧光探针的光学细胞成像技术也许是观察细胞内铁含量的最佳选择。探针能透过细胞膜在可见范围内或是相较生物体内其他丰富的阳离子对于目标铁元素有高度选择性。所以基于罗丹明的“Turn-on”荧光探针构想是一个理想的体系模型。本探针的生物适应性研究已经开展，选择巨噬细胞RAW264.7细胞为研究对象，共聚焦显微成像技术跟踪。首先，细胞用20μM的探针在37℃哺育30分钟后成像几乎看不到细胞形状。然后，将上述细胞继续用20μM的Fe²⁺哺育30分钟（37℃）后成像能够看到很完好的细胞，说明探针穿过细胞壁进入细胞内部，并与加入的Fe²⁺结合，显示橘黄色的荧光，488nm激发光下，得到清楚的、完好的细胞成像。并且，细胞亮视野成像显示细胞完好。结果显示，在实验条件和实验时间内，探针应用于巨噬细胞RAW264.7中对Fe²⁺的响应研究实验是成功的。进一步说明，所合成的探针具有很好的生物适应性，能够作为一个检测活细胞内Fe²⁺的功能荧光探针。

参考文献

[1]B.D’Autreaux,N.P.Tucker,R.Dixon,S.Spiro,Nature437(2005)769-772.

[2]J.W.Lee,J.D.Helmann,Nature440(2006)363-367.

[3]Z.Yang,M.-Y.She,B.Yin,J.-H.Cui,Y.-Z.Zhang,W.Sun,J.-L.Li,Z.Shi.J.Org.Chem.77(2012)1143-1147.

[4]Y.-M.Yang,Q.Zhao,W.Feng,F.-Y.Li,Chem.Rev.113(2013)192-270.

[5]A.S.Dornelles,V.A.Garcia,M.N.de Lima,G.Vedana,L.A.Alcalde,M.R.Bogo,N.Schroeder,Neurochem.Res.35(2010)564-571.

[6]C.Brugnara,Clin.Chem.49(2003)1573-1578.

[7]R.R.Crichton,D.T.Dexter,R.J.Ward,Coord.Chem.Rev.252(2008)1189-1199.

[8]Y.Xiang,A.Tong,Org.Lett.8(2006)1549-1552.

[9]A.J.Weerasinghe,C.Schmiesing,S.Varaganti,G.Ramakrishna,E.Sinn,J.PHys.Chem.B114(2010)9413-9419.

[10]J.L.Bricks,A.Kovalchuk,C.Trieflinger,M.Nofz,M.Buschel,A.I.Tolmachev,J.Daub,K.Rurack,J.Am.Chem.Soc.127(2005)13522-13529.

[11]S.Ghosh,R.Chakrabarty,P.S.Mukherjee,Inorg.Chem.48(2009)549-556.

[12]H.Weizman,O.Ardon,B.Mester,J.Libman,O.Dwir,Y.Hadar,Y.Chen,A.Shanzer,J.Am.Chem.Soc.118(1996)12368-12375.

[13]J.P.Sumner,R.Kopelman,Analyst130(2005)528-533.

[14]X.-B.Zhang,G.Cheng,W.-J.Zhang,G.Shen,R.-Q.Yu,Talanta71(2007)171-177.

[15]P.Li,L.-B.Fang,H.Zhou,W.Zhang,X.Wang,N.Li,H.-B.Zhong,B.Tang,Chem.Eur.J.17(2011)10520-10523.

[16]S.Epsztejn,O.Kakhlon,H.Glickstein,W.Breuer,Z.I.Cabantchik,Anal.Biochem248(1997)31-40.

[17]K.Zheng,C.-Y.Lai,L.-P.He,F.Li,Sci China Chem.53(2010)1398-1405.

[18]R.I.Stefan and S.G.Bairu,Anal.Chem.75(2003)5394-5398.

[19]W.-S.Zhang,B.Tang,X.Liu,Y.-Y.Liu,K.-H.Xu,J.-P.Ma,L.-L.Tong,G.-W.Yang,Analyst134(2009)367-371.

[20]F.-B.Yu,W.-S.Zhang,P.Li,Y.-L.Xing,L.-L.Tong,J.-P.Ma,B.Tang,Analyst134(2009)1826-1833.

[21]W.Huang,C.-X.Song,C.He,G.-J.Lv,X.-Y.Hu,X.Zhu,C.-Y.Duan,Inorg.Chem.48(2009)5061-5072.

[22]X.F.Yang,X.Q.Guo,Y.B.Zhao,Talanta57(2002)883-890.

[23]J.A.Ho,H.-C.Chang,W.-T.Su,Anal.Chem.84(2012)3246-3253.

[24]J.L.Bricks,A.Kovalchuk,C.Trieflinger,M.Nofz,M.Büschel,A.I.Tolmachev,J.Daub,K.Rurack,J.Am.Chem.Soc.127(2005)13522-13529.

[25]Z.-X.Han,X.-B.Zhang,Z.Li,Y.-J.Gong,X.-Y.Wu,Z.Jin,C.-M.He,L.-X.Jian,J.Zhang,G.-L.Shen,R.-Q.Yu,Anal.Chem.82(2010)3108-3113.

[26]R.-G.Peng,F.Wang,Y.-W.Sha,Molecules12(2007)1191-1201.

[27]N.O.Mchedlov-Petrossyan,Pure Appl.Chem.80(2008)1459-1510.

Claims (8)

1.一种检测亚铁离子的罗丹明荧光探针，命名为罗丹明酰腙基乙酰基吡啶荧光探针，所述罗丹明酰腙基乙酰基吡啶荧光探针的结构式如下所示：

2.一种检测亚铁离子的罗丹明荧光探针的制备方法，其特征在于制备流程如下：

将罗丹明酰肼与2,6-二乙酰基吡啶在乙醇或甲醇中回流反应，通过中性三氧化铝柱色谱纯化，得到罗丹明酰腙基乙酰基吡啶荧光探针。

3.如权利要求2所述一种检测亚铁离子的罗丹明荧光探针的制备方法，其特征在于具体制备步骤包括：

步骤一：罗丹明酰肼的制备

以等摩尔量的罗丹明6G与80%水合肼为原料，溶解于甲醇溶剂或乙醇溶剂中，加热回流至反应充分，冷却后过滤得深红色粗产品，干燥后采用DMC/甲醇=10/1硅胶柱分离纯化得红色产物即罗丹明酰肼，备用；

步骤二：罗丹明酰腙基乙酰基吡啶荧光探针的制备

以步骤一得到的罗丹明酰肼与2，6-二乙酰基吡啶作为原料，溶解于甲醇溶剂或乙醇溶剂中，并滴入甲酸，混合溶液加热回流至反应充分，冷却后减压除去溶剂，用二氯甲烷/甲醇=30/1为洗脱剂，中性三氧化铝柱分离纯化得白色粉末即罗丹明酰腙基乙酰基吡啶荧光探针，探针的结构式如下：

4.如权利要求3所述一种检测亚铁离子的罗丹明荧光探针的制备方法，其特征在于

在步骤一罗丹明酰肼的制备过程中，所述加热回流是指将混合溶液在80～90℃油浴下回流4～5小时。

5.如权利要求3所述一种检测亚铁离子的罗丹明荧光探针的制备方法，其特征在于

在步骤二罗丹明酰腙基乙酰基吡啶荧光探针的制备过程中，所述罗丹明酰肼的摩尔量小于等于2，6-二乙酰基吡啶的摩尔量。

6.如权利要求3所述一种检测亚铁离子的罗丹明荧光探针的制备方法，其特征在于

在步骤二罗丹明酰腙基乙酰基吡啶荧光探针的制备过程中，所述甲酸的滴入量以摩尔比计，为罗丹明酰肼与2，6-二乙酰基吡啶总量的3%～5%。

7.如权利要求3所述一种检测亚铁离子的罗丹明荧光探针的制备方法，其特征在于

在步骤二罗丹明酰腙基乙酰基吡啶荧光探针的制备过程中，所述混合溶液加热回流至反应充分是指混合溶液在80～90℃油浴下回流48小时。

8.罗丹明酰腙基乙酰基吡啶荧光探针应用于活体细胞亚铁离子的荧光检测。

Images