CN108440547A - 一种罗丹明6g席夫碱类荧光探针及其制备与应用 - Google Patents

一种罗丹明6g席夫碱类荧光探针及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种罗丹明6G席夫碱类荧光探针及其制备与应用，本发明探针对Fe3+具有高效专一的选择性，可通过颜色变化和荧光变化来识别Fe3+，可以应用于环境水样中的Fe3+的可视化检测。本发明设计合成的荧光增强型探针Ⅳ1‑8的特色之处在于探针合成简单，产率较高，操作简便，并且对Fe3+的识别效果理想，将探针Ⅳ‑1负载于滤纸上制成探针试纸，可用于不同水样中不同浓度Fe3+的可视化检测，将来可将其进一步应用于环境或是生物系统中对Fe3+的检测应用。

Description

一种罗丹明6G席夫碱类荧光探针及其制备与应用
(一)技术领域
本发明涉及一种罗丹明6G席夫碱类荧光探针及其制备与应用。
(二)背景技术
罗丹明(Rhodamine)是一种邻苯二酚类荧光染料，从结构上来说它具有一个氧杂蒽环，分子具有刚性平面，稳定性好，且具有多个可修饰位点，受样品干扰性小；它荧光的最大发射位于500-700nm处即红色可见光区域，其摩尔吸光系数大，量子产率高。正是由于罗丹明优越的光物理性和光稳定性，它在激光染料、荧光标尺、染色剂；纳米聚合物的表面修饰、微粒的结构和动态研究、单分子成像和生物成像等方面应用相当广泛。
铁作为人体含量的必需微量元素，存在于多种蛋白质和酶中，是血红蛋白、血红素、许多酶和免疫系统化合物等的重要组成成分；参与氧的运输和储存，并-直接参与能量的释放；促进人体发育；增加对疾病的抵抗力；调节组织呼吸，防止疲劳。铁离子本身其实并不具有毒性，但如果摄入或误服过量的含铁物质时也可能导致铁中毒。而随着社会工业进展的加剧，环境中存在的铁离子含量随之增加，并通过各种途径进入人体，危害人类健康。因此，利用罗丹明6G为骨架，设计合成检测三价铁离子探针的研究有着非常重要的应用价值。
席夫碱类化合物(Schiff base)及其金属配合物在医学、催化、分析化学、腐蚀以及光致变色领域有着重要的应用。1931年，Pfeiffer等人首次报道了关于金属席夫碱配合物的合成与性质，之后这类化合物的研究得到了快速的发展并取得了一定成果，并应用于抗菌、抗病毒、抗肿瘤等生物活性方面，同时，席夫碱可以作为配体，用以鉴别金属离子和定量分析检测物中金属离子的含量，因此席夫碱类化合物作为荧光探针配体制备荧光探针在金属离子的检测中也逐渐被人们重视(南光明,刘德蓉.浅述希夫碱及其金属配合物的由来、产生机理、合成方法及展望[J].伊犁师范学院学报.2005,(3):58-59.)。
席夫碱反应是指醛酮与伯胺(R-NH2)生成含碳氮双键的亚胺的一类反应，这类反应时间较短、反应条件简单，易于操作。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种式(Ⅳ)所示的罗丹明6G-席夫碱类荧光探针及其制备与应用，利用芳香醛与罗丹明6G反应合成具有席夫碱配体的荧光增强型探针，用于三价铁离子的检测。本发明设计合成的荧光增强型探针的特色之处在于探针合成简单，产率较高，操作简便，并且对Fe3+的识别效果理想，将探针Ⅳ-1负载于滤纸上制成探针试纸，可用于不同水样中不同浓度Fe3+的可视化检测，将来可将其进一步应用于环境或是生物系统中对Fe3+的检测应用。同时，本发明探针方法测定三价铁离子浓度具有误差小、灵敏度高、准确度高等特点，尤其在低浓度的三价铁离子检测中，更显示出优越的灵敏度和准确度。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种式(Ⅳ)所示罗丹明6G席夫碱类荧光探针，
式(Ⅳ)中，R为下列之一：p-(CH3)2NC6H4、p-C6H5、p-O2NC6H4、p-NCC6H4、p-H3CC6H4、p-ClC6H4、p-FC6H4、p-OHCC6H4。
本发明还提供一种所述罗丹明6G席夫碱类荧光探针的制备方法，所述方法为：以式(II)所示化合物和式(III)所示化合物为原料，在有机溶剂中，60-100℃反应完全后，将反应液分离纯化，获得式(Ⅳ)所示罗丹明6G席夫碱类荧光探针；所述有机溶剂为乙醇；
式(III)中，R为下列之一：p-(CH3)2NC6H4、p-C6H5、p-O2NC6H4、p-NCC6H4、p-H3CC6H4、p-ClC6H4、p-FC6H4、p-OHCC6H4。
进一步，所述式(II)所示化合物与式(III)所示化合物投料物质的量之比为1:1.1，所述有机溶剂体积用量以式(II)所示化合物物质的量计为83.3mL/mmol。
进一步，反应液分离纯化的方法为：反应完全后，将反应液浓缩至干，然后加入水溶解，二氯甲烷进行萃取，取有机相，再用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压蒸干溶剂后进行薄层层析，以体积比1:50的CH3OH:CH2Cl2为展开剂，收集Rf值0.3-0.4的组分，获得式(Ⅳ)所示罗丹明6G席夫碱类荧光探针。
进一步，所述式(II)所示化合物按如下方法制备：以式(I)所示的化合物与水合肼为原料，在乙醇中，回流反应完全，反应液后处理，获得式(II)所示化合物；式(I)所示化合物与水合肼投料物质的量之比为1:10；甲醇体积用量以式(I)所示化合物物质的量计为20mL/mmol；
进一步，反应液后处理的方法为：反应完全后，将反应液浓缩至干，然后加入水溶解，二氯甲烷进行萃取，取有机相，再用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压蒸干溶剂后进行薄层层析，以体积比1:40的CH3OH:CH2Cl2为展开剂，收集Rf值0.3-0.4的组分，获得式(II)所示化合物。
本发明还提供一种所述罗丹明6G席夫碱类荧光探针在检测Fe3+中的应用。该类荧光探针可专一性、可视化性检测环境水样中的Fe3+，具体选出的最优探针为Ⅳ-1。
一方面，本发明所述罗丹明6G席夫碱类荧光探针在定性检测Fe3+中的应用，所述应用方法为：将待测样品加入含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM的PBS缓冲液中，再加入5μmol/mL罗丹明6G席夫碱类荧光探针乙腈溶液后(通常室温下，5-50min内即可发生颜色反应)，若有颜色变化，则待测样品中含有Fe3+。
另一方面，本发明所述罗丹明6G席夫碱类荧光探针在定量检测Fe3+中的应用，所述的应用为：将待测样品加入含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM的PBS缓冲液中，再加入5μmol/mL罗丹明6G席夫碱类荧光探针乙腈溶液后，在555nm处测定荧光值，根据Fe3+标准曲线，获得待测样品中Fe3+浓度；所述待测样品与PBS缓冲液体积比为1:1，所述待测样品与探针乙腈溶液体积比为10:1；所述Fe3+标准曲线是以Fe3+水溶液浓度为横坐标，以荧光值为纵坐标制成。
进一步，所述Fe3+标准曲线按如下方法制备：将浓度为0，0.01,0.05,0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4.0μmol/mL的Fe3+水溶液分别加入含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM的PBS缓冲液中，再加入5μmol/mL罗丹明6G类荧光探针乙腈溶液后，在555nm处测定荧光值，以Fe3+浓度为横坐标，以荧光值为纵坐标，获得Fe3+标准曲线；所述Fe3+水溶液与PBS缓冲液体积比为1:1，所述Fe3+水溶液与探针乙腈溶液体积比为10:1。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明成功的设计并合成了一种新型的如式(Ⅳ)所示的罗丹明6G席夫碱类探针；(2)本发明合成的探针对Fe3+具有高效专一的选择性，可通过颜色变化和荧光变化来识别Fe3+。(3)本发明通过研究罗丹明6G席夫碱类探针对金属离子的识别能力，并分析该类探针不同取代基芳香醛是否会对探针的荧光效果产生影响，分析其构效关系，发现探针Ⅳ-1中的二甲氨基官能团，可与C＝N键同时与Fe3+进行络合，形成配位键，增强了其对Fe3+的结合能力，探针Ⅳ-4的荧光强度较大应证了这一点；而苯环上存在的硝基基团、卤族系列基团会使其结合能力降低，从而使得荧光强度低于探针Ⅳ-1的强度。(4)本发明将合成的探针Ⅳ-1负载于滤纸上制成探针试纸，可以应用于环境水样中的Fe3+的可视化检测，将来可将其进一步应用于环境或是生物系统中对Fe3+的检测应用。(5)本发明设计合成的荧光增强型探针Ⅳ1-8的特色之处在于探针合成简单，产率较高，操作简便，并且对Fe3+的识别效果理想。
(四)附图说明
图1是本发明实施例11中的荧光探针化合物Ⅳ-1与Fe3+作用后溶液颜色变化(a：荧光下；b：肉眼可见，其中左侧均为荧光探针化合物Ⅳ-4溶液颜色变化，右侧均为化合物Ⅳ-4与Fe3+作用后溶液颜色变化)。
图2是本发明实施例11中的荧光探针化合物Ⅳ-1对各金属离子的紫外吸收谱图。a为紫外-可见吸收光谱，横坐标为波长(nm)，纵坐标为紫外吸收值OD值。b为各金属离子紫外吸收柱形图。
图3是本发明实施例11中的荧光探针化合物Ⅳ-1对各金属离子的荧光强度谱图。a为荧光强度谱图，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。b为各金属离子荧光强度柱形图。
图4是本发明实施例12中的荧光探针化合物Ⅳ-1的荧光强度以及Ⅳ-1+Fe3+离子络合物的荧光强度分别随pH变化的荧光发射图(555nm)。横坐标为pH，纵坐标为荧光强度。
图5是本发明实施例10中的荧光探针化合物Ⅳ-1～Ⅳ-8对Fe3+识别能力的荧光强度变化的荧光发射图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。
图6是本发明实施例13中的荧光探针化合物Ⅳ-1+Fe3+离子络合物的荧光强度分别随时间变化的荧光发射图(555nm)。横坐标为Time(min)，纵坐标为荧光强度。
图7是本发明实施例14中的荧光探针化合物Ⅳ-1+金属离子络合物与Ⅳ-1+Fe3++金属离子络合物的荧光强度比较柱状图(555nm)。横坐标为金属离子，纵坐标为荧光强度。
图8是本发明实施例15中的荧光探针化合物Ⅳ-1与不同浓度Fe3+(0-30倍量)的荧光强度变化图(a)和Fe3+的浓度与荧光强度的变化线性图(b)。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。
图9是本发明实施例15中的荧光探针化合物Ⅳ-1+Fe3+离子络合物的Job’s plot曲线图，横坐标为[Fe3+]/[Fe3+]+[Ⅳ-1]，纵坐标为紫外吸收值OD值。
图10是本发明实施例16中的荧光探针化合物Ⅳ-1与Fe3+的可逆性实验的荧光强度变化图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。
图11是本发明实施例16中的荧光探针化合物Ⅳ-1以及Ⅳ系列其他化合物与Fe3+的识别机理图。
图12是本发明实施例17中的荧光探针化合物Ⅳ-1负载的探针试纸识别环境水样中不同浓度Fe3+的溶液颜色可视变化图，图中从左到右Fe3+溶液浓度依次为0，0.0125，0.125，1.25，12.5mM。
(五)具体实施方式
本发明所述超纯水是指去离子水经过一次蒸馏得到的蒸馏水，所述室温为25-30℃。下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：化合物(II)的合成
称量NH2.NH2·H2O(100mmol，10.0eq，5g)溶于50mL的乙醇试剂(分析级)中，罗丹明6G(化合物I)(10mmol，1.0eq，4.79g)加入反应体系，完全溶解后溶液呈现红褐色，再补加50mL的乙醇，回流反应48h，反应过程有白色固体生成，并用TLC追踪检测。反应完全后用旋转蒸发仪蒸干溶剂，然后加入30mL水，二氯甲烷进行萃取(3×50mL)，合并有机相，再用饱和氯化钠水溶液洗涤(2×100mL)，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压蒸干溶剂后进行薄层层析(CH3OH:CH2Cl2＝1:40，v/v为展开剂)，收集Rf为0.3-0.4的组分，干燥，得到化合物(II)。
Compound II(白色固体，产率81％)MS(ESI):m/z＝431.2[M+H]+.mp＝265-267℃.1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.97(dd,J＝17.1,13.3Hz,1H),7.51–7.41(m,2H),7.07(dd,J＝11.9,7.2Hz,1H),6.43–6.35(m,2H),6.27(d,J＝14.1Hz,2H),3.57(s,4H),3.26–3.15(m,4H),2.04(d,J＝16.8Hz,1H),1.91(d,J＝12.2Hz,6H),1.32(t,J＝7.1Hz,6H),1.28–1.20(m,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ166.22,152.23,151.75,147.54,132.59,129.86,128.13,127.70,123.81,123.04,117.99,104.92,96.84,77.24,77.03,76.82,66.06,60.41,38.36,16.71,14.76,14.20.IRνmax(cm-1):3426.98,2973.58,2871.06,1687.31,1623.58,1515.35,1420.94,1345.08,1156.27,946.30,887.22,690.29.
实施例2：化合物(Ⅳ-1)的合成
化合物II(0.3mmol，1.0eq，0.128g)溶于25mL的乙醇(分析级)中，N2氛围下，加入化合物III-1(1.1eq，0.33mmol)。反应在80℃左右加热回流进行8-12h，反应过程有固体化合物产生，并用TLC追踪检测。反应完全后用旋转蒸发仪蒸干溶剂，然后加入30mL水，二氯甲烷进行萃取(3×50mL)，合并有机相，再用饱和氯化钠水溶液洗涤(2×100mL)，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压蒸干溶剂后进行薄层层析(CH3OH:CH2Cl2＝1:50，v/v为展开剂)，收集Rf为0.3-0.4的组分，干燥，即可得到目标产物Ⅳ-1。
CompoundⅣ-1(粉黄色固体，产率41％)MS(ESI):m/z＝562.3[M+H]+.1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.27(s,1H),8.08–7.92(m,1H),7.56–7.35(m,4H),7.12–6.98(m,1H),6.53(dd,J＝19.0,6.2Hz,2H),6.37(d,J＝15.0Hz,6H),3.47(d,J＝14.0Hz,3H),3.19(q,J＝7.0Hz,3H),2.94(d,J＝27.1Hz,6H),1.88(d,J＝38.2Hz,6H),1.38–1.05(m,6H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ164.89,152.45,152.24,151.50,151.12,147.54,147.46,133.06,128.99,128.96,128.11,127.73,123.51,123.22,123.04,117.97,111.48,106.53,96.77,77.29,77.08,76.86,65.70,50.86,40.23,38.38,16.71,14.78.IRνmax(cm-1):3405.18,2967.45,1699.31,1610.44,1517.20,1420.69,1370.09,1324.04,1217.99,1195.91,1013.44,820.99,731.30.
实施例3：化合物(Ⅳ-2)的合成
化合物II(0.3mmol，1.0eq，0.128g)溶于25mL的乙醇(分析级)中，N2氛围下，加入化合物III-2(1.1eq，0.33mmol)。其他同实施例2，得到目标产物Ⅳ-2。
CompoundⅣ-2(粉红色固体，产率40％)MS(ESI):m/z＝519.27[M+H]+.mp＝250-254℃.1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.44(s,1H),8.06–7.99(m,1H),7.56–7.48(m,2H),7.50–7.41(m,3H),7.12–7.01(m,1H),6.39(d,J＝7.0Hz,2H),6.34(s,2H),3.49(d,J＝8.4Hz,2H),3.25–3.11(m,5H),1.94–1.89(m,2H),1.86(s,6H),1.79(s,1H)1.31(q,J＝6.7Hz,6H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ166.23,165.18,152.30,152.25,151.77,151.27,147.56,146.46,135.19,133.48,132.61,129.87,129.63,128.80,128.27,128.25,128.15,127.72,127.55,123.82,123.75,123.43,123.05,118.01,106.27,104.93,96.85,96.75,77.27,77.06,76.85,66.07,65.84,38.38,16.73,16.71,14.76.IRνmax(cm-1):3440.32,2968.37,1721.13,1621.17,1518.68,1422.26,1266.63,1219.54,1011.91,890.61,763.17,694.19.
实施例4：化合物(Ⅳ-3)的合成
化合物II(0.3mmol，1.0eq，0.128g)溶于25mL的乙醇(分析级)中，N2氛围下，加入化合物III-3(1.1eq，0.33mmol)。其他同实施例2，得到目标产物Ⅳ-3。
CompoundⅣ-3(橘黄色固体，产率45％)MS(ESI):m/z＝564.26[M+H]+.mp＝260-263℃.1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.61(s,1H),8.20–7.91(m,3H),7.64(d,J＝8.7Hz,4H),7.59–7.41(m,1H),6.34(dd,J＝72.8,20.5Hz,4H),3.54(d,J＝45.3Hz,2H),3.32–3.13(m,5H),1.89(d,J＝25.8Hz,6H),1.63(s,1H),1.32(t,J＝7.1Hz,6H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ165.35,151.85,151.50,148.01,147.69,143.32,141.43,133.99,128.72,128.56,127.87,127.70,124.04,123.62,118.06,105.98,96.85,96.70,77.25,77.04,76.83,66.29,38.38,16.72,14.74.
IRνmax(cm-1):3427.68,2967.92,1693.37,1620.40,1516.56,1421.60,1342.52,1304.77,1266.48,1216.97,1157.87,1012.06,853.27,742.31.
实施例5：化合物(Ⅳ-4)的合成
化合物II(0.3mmol，1.0eq，0.128g)溶于25mL的乙醇(分析级)中，N2氛围下，加入化合物III-4(1.1eq，0.33mmol)。其他同实施例2，得到目标产物Ⅳ-4。
CompoundⅣ-4(粉黄色固体，产率50％)MS(ESI):m/z＝562.3[M+H]+.mp＝259-261℃.1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.53(s,1H),8.05(t,J＝16.8Hz,1H),7.59(d,J＝7.1Hz,2H),7.52(d,J＝7.3Hz,2H),7.09(d,J＝6.6Hz,1H),6.40(s,2H),6.27(d,J＝28.8Hz,2H),3.51(s,2H),3.21(s,6H),1.89(d,J＝30.8Hz,6H),1.74(d,J＝25.6Hz,2H),1.30(dd,J＝23.5,17.1Hz,6H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ165.34,151.93,151.44,147.67,143.81,139.59,133.94,132.08,131.99,128.68,128.53,128.35,127.85,127.73,127.69,123.99,123.59,118.83,118.07,112.38,105.95,96.68,77.28,77.07,76.86,66.19,38.38,16.86,16.74,14.74.IRνmax(cm-1):3428.87,2966.10,2224.69,1697.09,1621.10,1519.16,1421.84,1301.79,1218.15,1013.62,742.02,555.44.
实施例6：化合物(Ⅳ-5)的合成
化合物II(0.3mmol，1.0eq，0.128g)溶于25mL的乙醇(分析级)中，N2氛围下，加入化合物III-5(1.1eq，0.33mmol)。其他同实施例2，得到目标产物Ⅳ-5。
CompoundⅣ-5(淡紫色固体，产率45％)MS(ESI):m/z＝533.29[M+H]+.mp＝210-212℃.1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.38(s,1H),8.09–7.89(m,2H),7.53–7.35(m,5H),7.10–7.00(m,2H),6.45–6.16(m,6H),3.55(d,J＝35.6Hz,1H),3.21(p,J＝7.0Hz,2H),2.28(s,2H),1.92(s,3H),1.86(s,3H),1.65(s,3H),1.31(q,J＝7.0Hz,6H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ166.20,165.12,152.34,152.23,151.75,151.20,147.53,146.55,139.87,133.36,132.58,132.43,129.87,128.95,128.78,128.20,128.13,127.70,127.53,123.81,123.67,123.38,123.04,117.98,106.32,104.93,96.83,96.75,77.24,77.03,76.82,66.04,65.75,38.36,21.41,16.71,16.68,14.76.IRνmax(cm-1):3412.20,2968.27,1692.26,1621.72,1516.63,1466.43,1420.96,1345.95,1316.01,1270.18,1217.39,1157.87,1012.14,851.99,743.54.
实施例7化合物(Ⅳ-6)的合成
化合物II(0.3mmol，1.0eq，0.128g)溶于25mL的乙醇(分析级)中，N2氛围下，加入化合物III-6(1.1eq，0.33mmol)。其他同实施例2，得到目标产物Ⅳ-6。
CompoundⅣ-6(淡粉紫色固体，产率81％)MS(ESI):m/z＝547.27[M+H]+.mp＝320-323℃.1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.35(s,1H),8.06–7.95(m,1H),7.54–7.42(m,6H),7.08–6.93(m,1H),6.38(d,J＝5.8Hz,2H),6.27(d,J＝18.8Hz,2H),3.47(d,J＝28.4Hz,2H),3.19(d,J＝7.1Hz,4H),1.81(d,J＝26.6Hz,6H),1.58(s,2H),1.38–1.21(m,6H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ165.21,151.25,147.55,145.71,136.18,133.62,128.26,127.62,127.34,123.76,123.42,117.95,106.19,96.73,77.23,77.02,76.81,66.12,38.34,16.67,14.75.IRνmax(cm-1):3429.72,2965.95,1693.20,1621.15,1516.66,1421.80,1347.91,1309.80,1267.26,1217.33,1013.77,814.06,743.11.
实施例8化合物(Ⅳ-7)的合成
化合物II(0.3mmol，1.0eq，0.128g)溶于25mL的乙醇(分析级)中，N2氛围下，加入化合物III-7(1.1eq，0.33mmol)。其他同实施例2，得到目标产物Ⅳ-7。
CompoundⅣ-7(粉色固体，产率42％)MS(ESI):m/z＝553.23[M+H]+.mp＝261-265℃.1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.45(s,1H),8.09–7.96(m,1H),7.48(dd,J＝9.0,5.9Hz,2H),7.47–7.39(m,2H),7.21(d,J＝8.1Hz,2H),7.06(d,J＝6.8Hz,1H),6.46–6.36(m,2H),6.29(d,J＝32.3Hz,2H),3.48(s,2H),3.20(d,J＝6.8Hz,4H),1.97–1.82(m,6H),1.74(d,J＝19.3Hz,2H),1.43–1.23(m,6H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ165.20,152.13,151.34,147.59,145.13,135.40,133.75,133.60,128.79,128.67,128.50,128.36,127.71,123.82,123.46,118.02,106.18,96.73,77.27,77.06,76.85,65.97,38.38,16.71,14.75.IRνmax(cm-1):3429.02,2967.71,1696.67,1620.60,1516.01,1452.00,1309.30,1267.52,1217.14,1012.49,819.07,742.27.
实施例9化合物(Ⅳ-8)的合成
化合物II(0.3mmol，1.0eq，0.128g)溶于25mL的乙醇(分析级)中，N2氛围下，加入化合物III-8(1.1eq，0.33mmol)。其他同实施例2，得到目标产物Ⅳ-8。
CompoundⅣ-8(淡紫粉色固体，产率40％)MS(ESI):m/z＝537.26[M+H]+.mp＝261-264℃.1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.49(s,1H),8.13–7.96(m,1H),7.44(d,J＝59.6Hz,4H),7.06(d,J＝5.9Hz,1H),6.93(t,J＝8.1Hz,2H),6.40(s,2H),6.32(s,2H),3.48(s,2H),3.21(d,J＝5.6Hz,4H),1.89(d,J＝28.1Hz,6H),1.62(s,3H),1.31(t,J＝6.7Hz,6H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ165.12,164.47,152.10,151.35,147.56,145.47,133.49,131.48,129.34,129.28,128.92,128.32,127.74,123.79,123.41,117.99,115.39,115.25,106.29,96.73,77.24,77.03,76.82,65.94,38.38,16.71,14.76.IRνmax(cm-1):3402.60,2968.61,1700.17,1620.80,1511.47,1420.93,1384.71,1310.34,1274.70,1218.02,1152.99,1013.13,843.53,743.55.
实施例10化合物(Ⅳ-1)～(Ⅳ-8)的金属离子选择性
(1)探针溶液
准确称取实施例2-9制备的化合物(Ⅳ-1)～(Ⅳ-8)，用色谱级乙腈溶解定容，配制浓度为5μmol/mL的探针溶液，避光低温储存。
(2)金属离子母液的制备
分别称取无机盐MgSO4·7H2O、KCl、CuSO4·5H2O、FeCl3、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、Al(NO3)3·9H2O、CaCl2、NaCl、AgNO3、Pb(CH3COO)2·3H2O、Co(NO3)2·6H2O、BaCl2·2H2O、Zn(CH3COO)2·2H2O、NiSO4·6H2O、CrCl3·6H2O、LiCl2·H2O、HgCl2、RuCl3，转入10mL离心管中用超纯水定容至8mL，得到浓度为1.25mmol/mL的金属离子母液，分别对应离子为Mg2+、K+、Cu2+、Fe3+、Fe2+、Mn2+、Al3+、Ca2+、Na+、Ag+、Pb2+、Co2+、Ba2+、Zn2+、Ni2+、Cr3+、Li2+、Hg2+、Ru2+。避光低温储存。
(3)化合物(Ⅳ-1)～(Ⅳ-8)的金属离子选择性
室温下，含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM PBS缓冲液中，测定各探针分子(Ⅳ-1)～(Ⅳ-8)对Fe3+的选择性。
将步骤(2)中1.25mmol/mL的金属离子溶液用超纯水稀释至12.5μmol/mL后取100μL，加入含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM PBS缓冲液100μL，后加入步骤(1)中5μmol/mL探针乙腈溶液10μL后，测定其相应荧光性能变化，确定效果最好的荧光探针，结果见图5所示。
从图5可以看出在化合物Ⅳ-1～Ⅳ-8系列探针中，化合物Ⅳ-1对Fe3+的识别能力最强，化合物Ⅳ-3对Fe3+的识别能力最弱，这可能是因为席夫碱配体中苯环上的不同功能团产生的影响，探针Ⅳ-1中有二甲氨基官能团，可与C＝N键同时与Fe3+进行络合，形成配位键，增强了其对Fe3+的结合能力，探针Ⅳ-4的荧光强度较大应该也能说明这一点，而苯环上存在的硝基基团、卤族系列基团会使其结合能力降低，从而使得荧光强度低于探针Ⅳ-1的强度。
实施例11探针Ⅳ-1对Fe3+的选择性
室温下，含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM PBS缓冲液中，测定Ⅳ-1探针分子对金属离子的选择性。
将12.5μmol/mL Fe3+水溶液100μL，加入含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM PBS缓冲液100μL，后加入5μmol/mL探针(Ⅳ-1)乙腈溶液10μL后，测定其相应荧光性能变化。反应后溶液颜色变化，紫外吸收和荧光强度的变化，得到的相应的紫外吸收光谱和荧光发射光谱。分别如图1、图2、图3所示。
图中可以看出化合物Ⅳ-1对三价金属离子和Fe3+可产生较大的紫外吸收，特别是对Fe3+的紫外吸收强度最大。而在加入其他金属离子和没有加金属离子时，化合物Ⅳ-1溶液没有颜色，其紫外吸收光谱在535nm以上几乎没有吸收峰且化合物Ⅳ-1的荧光发射也很弱；加入Fe3+以后，化合物Ⅳ-1溶液变为粉红色，紫外-可见光谱在530nm处出现强的吸收峰，而且吸收强度增加了约7.4倍。因此，测定荧光光谱时，选择495nm为最适激发波长，化合物Ⅳ-1对Fe3+的选择性最好，在555nm处有强的荧光发射波长，而且荧光强度大幅度增强，增强了200倍，证明化合物Ⅳ-1的内酰胺环已经打开。同时在此条件下其他离子并没有引起明显的荧光强度变化，这说明化合物Ⅳ-1对Fe3+的选择性受到其他共存离子的干扰较弱，表现出对Fe3+的高效的选择性。
实施例12pH对探针Ⅳ-1的识别性能的影响
为了能够将探针Ⅳ-1应用在更复杂体系中，实验过程中考察了pH对Fe3+识别性能的影响。
室温下，利用含体积浓度50％乙腈的pH 3.5-12.0(3.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0)的PBS缓冲液测定探针Ⅳ-1和探针Ⅳ-1+Fe3+的荧光强度的变化。
将12.5μmol/mL Fe3+水溶液100μL，加入不同pH值含体积浓度50％乙腈的PBS缓冲液100μL，后加入5μmol/mL探针(Ⅳ-1)乙腈溶液10μL后，在555nm处测定其相应荧光值变化，同样条件下，用等量PBS缓冲液代替Fe3+离子溶液作为对照，如图4所示。
图4显示的是在不同pH值含体积浓度50％乙腈的PBS缓冲液中，探针Ⅳ-1溶液中没有Fe3+存在和有Fe3+存在时，以495nm为激发波长，记录发射波长555nm处的荧光强度的变化。从图中可以看出，没有Fe3+存在时，在pH为3.5到12.0之间没有观察到明显的荧光变化，说明探针本身对pH不敏感。当加入Fe3+后，在相同的pH范围内，探针Ⅳ-1对Fe3+响应有所不同，当pH<7.0时荧光强度较强，pH＝6.5时，荧光强度最强。当溶液为碱性时，Fe3+与探针的结合能力减弱，不再有明显的荧光。总的来说，探针能在一个较宽的pH范围内(pH3.5-8)实现对Fe3+的有效识别。所以光谱性能测试实验中，均选用含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mMPBS缓冲液作为溶剂体系。
实施例13探针化合物Ⅳ-1对Fe3+的时间响应
室温下，含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM PBS缓冲液中，测定探针分子Ⅳ-1对Fe3+的识别性能。
将12.5μmol/mL Fe3+水溶液100μL，加入含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM PBS缓冲液100μL，后加入5μmol/mL探针(Ⅳ-1)乙腈溶液10μL后，分别在120min内，每隔5min在555nm测定其相应荧光值随时间的变化，以确定作用时间的长短，结果见图6所示。
从图6中发现，化合物Ⅳ-1与Fe3+反应混合后立即即可产生荧光，随着时间增长所产生的荧光强度也随之增强，在38min后达到最大的荧光强度，且随时间增强，荧光强度稳定，并无明显的下降。这表明探针Ⅳ-1对Fe3+的识别具有快的响应以及长时间识别的稳定性。这种实时监测在实际应用中具有重要意义。因此，在之后的测试工作中每个样品都是加入金属离子放置30min后进行光谱测定的。
实施例14探针化合物Ⅳ-1对Fe3+的抗干扰性实验
室温下，含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM PBS缓冲液中，探针分子Ⅳ-1对Fe3+的识别性能。
将实施例10步骤(2)中1.25mmol/mL的金属离子母液用超纯水稀释至12.5μmol/mL后取100μL，加入含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM PBS缓冲液100μL，再加入实施例10步骤(1)中的5μmol/mL探针乙腈溶液(Ⅳ-1)10μL后，以不添加金属离子为对照，在555nm处测定荧光值，结果见图7中灰色柱。
在上述各个金属离子溶液中再加入12.5μmol/mL Fe3+水溶液100μL，在555nm处测定荧光值，结果见图7所示中黑色柱。通过两次测定荧光强度的比较得出其离子的存在对Fe3+的影响。
如图7所示，灰色的柱状是向化合物Ⅳ-1中加入Mg2+、K+、Cu2+、Fe2+、Mn2+、Al3+、Ca2+、Na+、Ag+、Pb2+、Co2+、Ba2+、Zn2+、Ni2+、Cr3+、Li2+、Hg2+、Ru2+以及PBS缓冲液，并没有引起强烈的荧光发射的变化，而在上述溶液基础上，再加入同样当量的Fe3+溶液后，可以看到荧光强度急剧增加(黑色柱状)，其中Ca2+、Ag+、Pb2+可以促进荧光增强，这可能是上述离子的加入导致罗丹明衍生物的平衡进一步向开环移动。总之，化合物Ⅳ-1对Fe3+的识别作用受到其他共存离子的干扰较小，因此，证明了探针Ⅳ-1对Fe3+有好的选择性。
实施例15探针Ⅳ-1对Fe3+的荧光滴定及络合比的测定
1)探针Ⅳ-1对Fe3+的滴定及拟合
室温下，向含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM PBS缓冲液中，加入5μmol/mL探针乙腈溶液(Ⅳ-1)10μL，进行Fe3+的滴定实验，即向其中滴定5μmol/mL Fe3+水溶液，每滴加完10μL测定溶液一次荧光发射光谱，到第30次10μL滴定完结束滴定，共测31次(即对探针(Ⅳ-1)进行Fe3+0-30.0倍量的滴定实验)，结果见图8中a所示。从图8中a可以看出，随着Fe3+浓度的增加，在555nm处荧光发射强度逐渐增强，当加入到10.0倍量左右的Fe3+后，反应基本达到饱和，溶液的荧光强度增强不明显。通过荧光强度随浓度的变化可以用来计算络合物的结合常数，假设Fe3+与化合物Ⅳ-1的结合比1:1，通过Origin软件按以下方程对化合物Ⅳ-1的荧光强度随Fe3+的浓度(此时Fe3+浓度为总溶液中的浓度值)的变化图进行非线性最小二乘法的拟合，可以得到一条平滑曲线(图8中b)，线性相关系数R值大于0.99，有力的证明了假设是成立的，Fe3+与化合物Ⅳ-1的结合比为1:1，同时计算出结合常数值是1.26×104M-1，结合常数说明了此络合物具有较好的稳定性。
公式(1)中，Y代表加入离子后的荧光强度；Y0代表有机化合物的荧光强度；Ylim代表加入离子后的荧光强度变化的极限值；CM代表所加金属离子的浓度；CL代表有机化合物的浓度；Ks为结合常数。
2)探针Ⅳ-1与Fe3+结合比的测定
为了进一步说明Ⅳ-1与Fe3+是1：1结合的，根据随Fe3+的摩尔分数增高与紫外吸收值的变化曲线作出Job’s plot曲线图(图9)。从图中可知，Ⅳ-1与Fe3+的总浓度是100μM，当Fe3+的摩尔分数为0.5时，荧光发射强度达到最大值，这说明Ⅳ-1与Fe3+的结合比是1:1，与上述非线性拟合是一致的。
3)Fe3+浓度与探针Ⅳ-1荧光强度变化关系的回归方程的确定
为了开发该探针的实际应用价值，进行了Fe3+浓度与探针Ⅳ-1荧光强度变化关系的回归方程的实验确定，具体实验方法为：将实施例10中1.25mmol/mL的Fe3+离子母液用超纯水稀释后使其浓度分别为0，0.01，0.05，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4μmol/mL，各取100μL，加入含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM PBS缓冲液100μL，再加入5μmol/mL探针乙腈溶液(Ⅳ-1)10μL后，在555nm测定荧光强度。根据所测Fe3+离子浓与其对应荧光强度数据的关系，得出以Fe3+浓度(μmol/mL)为自变量x、荧光强度为因变量y的回归方程y＝491.23+1418.729x。
实施例16探针Ⅳ-1对Fe3+的识别可逆性的测定
室温下，含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM PBS缓冲液100μL，12.5μmol/mLFe3+水溶液100μL，加入5μmol/mL探针Ⅳ-1乙腈溶液10μL后，检测荧光光谱，结果见图10中曲线a。再向其中加入过量的ETDA络合剂，观察荧光的变化情况，并再次测定荧光光谱，结果见图10中曲线b。最后再加入12.5μmol/mL的Fe3+水溶液100μL，再次观察荧光的变化情况，测定荧光光谱，结果见图10中曲线c。
在化合物Ⅳ-1与Fe3+溶液反应后，溶液由无色变为粉红色，测定此时的荧光强度值，在此溶液中加入过量EDTA后，溶液颜色变浅，至无色，再次测定此时荧光强度值。再加入相同当量的Fe3+后溶液再次变为粉红色，测定此时溶液荧光值，图中可知荧光减弱，这可能是因为溶液存在有过量的EDTA，其作为络合物也会与Fe3+络合，从而影响Fe3+与探针Ⅳ-1的络合能力再次测定的荧光值。这一现象这说明了化合物Ⅳ-1与Fe3+之间存在着配位作用，加入Fe3+使Ⅳ-1中内酰胺环打开，加入的EDTA可将Fe3+从探针体系中消除，说明探针Ⅳ-1对于Fe3+的识别过程是可逆的。具体荧光强度变化见图10。
根据Ⅳ-1与Fe3+之间的结合比为1:1，以及可逆性实验，以及不同探针中席夫碱配体中不同官能团对探针识别能力的影响，判断探针Ⅳ-1对Fe3+的识别机理如图11中(A)，而其他探针如图11中(B)所示。
实施例17探针Ⅳ-1试纸在检测水样中Fe3+浓度的应用
检测Fe3+的探针Ⅳ-1试纸的制备：裁剪3.0×5.0cm2的滤纸条，将其浸入到溶有探针Ⅳ-1(5.0μmol/mL)的乙腈溶液，待其浸润均匀后取出，晾干，用于不同水样中的不同浓度的Fe3+的可视化检测分析。
探针Ⅳ-1试纸在检测水样中Fe3+浓度：
将所取水样(河水)滴加在探针Ⅳ-1试纸上，试纸颜色没有产生明显的颜色变化，这说明了水样中的基本不含Fe3+，之后再向水样中加入不同浓度梯度Fe3+水溶液，再将其滴加在试纸上，观察试纸具体颜色变化。结果见图12，图中从左到右Fe3+溶液浓度依次为0，0.0125，0.125，1.25，12.5μmol/mL。
实施例18探针Ⅳ-1在定量检测水样中Fe3+浓度的应用
为了验证探针Ⅳ-1在检测水样中Fe3+的应用性能，分别用超纯水配制了1.1、0.8、0.5、0.2、0.1、0.05、0.01、0.005μmol/mL的Fe3+水溶液，作为待测样品。采用本发明探针方法和邻菲啰啉法测定来测定上述Fe3+溶液的浓度，具体操作如下：
(1)本发明探针方法测定Fe3+溶液的浓度
分别取100μL含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM PBS缓冲液，加入到100μL上述配制好的不同浓度的Fe3+水溶液中，再分别加入5μmol/mL探针乙腈溶液(Ⅳ-1)10μL后，在555nm处测定荧光强度。将测得的荧光值代入到实施例15得到的回归方程y＝491.23+1418.729x中，获得Fe3+浓度，见表1。
(2)邻菲啰啉法测定Fe3+溶液的浓度
a、乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH＝4.5)的配制：称取164g乙酸钠，溶于500mL超纯水中，加入84mL冰乙酸，用超纯水稀释到1000mL。
b、20g/L抗坏血酸溶液的配制：溶解10.0g抗坏血酸于200mL超纯水中，加入0.2g乙二胺四乙酸二钠(EDTA)和8.0mL甲酸，再用超纯水稀释到500mL，摇匀，贮存于棕色瓶中。
c、2.0g/L邻菲啰啉溶液的配制：称取2.0g邻菲啰啉，溶于800mL超纯水中，再用超纯水稀释到1000mL。
d、40.0g/L过硫酸钾溶液的配制：称取4.0g过硫酸钾，用超纯水溶解并定溶到100mL。
e、0.1mg/mL硫酸铁铵标准溶液I的配制：称取0.863g硫酸铁铵，置于200mL烧杯中，加入100mL超纯水，10mL浓硫酸，溶解后定溶到1000mL。
f、0.01mg/mL硫酸铁铵标准溶液II的配制：取1mL0.1mg/mL硫酸铁铵标准溶液I，稀释10倍，只限当日使用。
g、工作曲线的绘制：分别取0mL(空白)、1.00mL、2.00mL、4.00mL、6.00mL、8.00mL、10.00mL步骤f配制的硫酸铁铵标准溶液II于7个100mL容量瓶中，加超纯水至约40mL，加0.50mL硫酸溶液(水与质量浓度98％浓硫酸体积比为1：35配制)，pH值调到2，加3.0mL步骤b中配制的20g/L抗坏血酸溶液，10mL步骤a中配制的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，5mL步骤c中配制的邻菲啰啉溶液。用超纯水稀释至刻度，摇匀。室温下放置15分钟，用分光光度计于510nm处，以试剂空白调零测吸光度。以测得的吸光度为纵坐标，相对应的Fe3+量(μmol)为横坐标绘制得工作曲线y＝0.00064+0.37936x。
h、三价铁离子浓度的测定：取8mL待测样品到100mL容量瓶中，加超纯水至约40mL，用硫酸溶液(水与质量浓度98％浓硫酸体积比为1：35配制)将pH值调到2(必要时可用铵水调节)，加3.0mL步骤b中配制的20g/L抗坏血酸溶液，10mL步骤a中配制的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，5mL步骤c中配制的邻菲啰啉溶液。用超纯水稀释至刻度，摇匀。室温下放置15分钟，用分光光度计于510nm处，以试剂空白调零测吸光度，结果见表1。
以μmol/mL为单位铁离子的浓度C按下式计算：
C＝m/(55.8434*V)
m:以μg表示的铁离子的量；
V：以mL表示的试样体积。
表1探针Ⅳ-1在检测水样中Fe3+的应用
从上表1中，本发明探针方法测定三价铁离子浓度具有误差小、灵敏度高、准确度高等特点，尤其在低浓度的三价铁离子检测中，更显示出优越的灵敏度和准确度。

Claims (10)

1.一种式(Ⅳ)所示罗丹明6G席夫碱类荧光探针，
式(Ⅳ)中，R为下列之一：p-(CH3)2NC6H4、p-C6H5、p-O2NC6H4、p-NCC6H4、p-H3CC6H4、p-ClC6H4、p-FC6H4、p-OHCC6H4。
2.一种权利要求1所述罗丹明6G席夫碱类荧光探针的制备方法，其特征在于所述方法为：以式(II)所示化合物和式(III)所示化合物为原料，在有机溶剂中，60-100℃反应完全后，将反应液分离纯化，获得式(Ⅳ)所示罗丹明6G席夫碱类荧光探针；所述有机溶剂为乙醇；
式(III)中，R为下列之一：p-(CH3)2NC6H4、p-C6H5、p-O2NC6H4、p-NCC6H4、p-H3CC6H4、p-ClC6H4、p-FC6H4、p-OHCC6H4。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述式(II)所示化合物与式(III)所示化合物投料物质的量之比为1:1.1，所述有机溶剂体积用量以式(II)所示化合物物质的量计为83.3ml/mmol。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于反应液分离纯化的方法为：反应完全后，将反应液浓缩至干，然后加入水溶解，二氯甲烷进行萃取，取有机相，再用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压蒸干溶剂后进行薄层层析，以体积比1:50的CH3OH:CH2Cl2为展开剂，收集Rf值0.3-0.4的组分，获得式(Ⅳ)所示罗丹明6G席夫碱类荧光探针。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述式(II)所示化合物按如下方法制备：以式(I)所示的化合物与水合肼为原料，在乙醇中，回流反应完全，反应液后处理，获得式(II)所示化合物；式(I)所示化合物与水合肼投料物质的量之比为1:10；甲醇体积用量以式(I)所示化合物物质的量计为20ml/mmol；
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于反应液后处理的方法为：反应完全后，将反应液浓缩至干，然后加入水溶解，二氯甲烷进行萃取，取有机相，再用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压蒸干溶剂后进行薄层层析，以体积比1:40的CH3OH:CH2Cl2为展开剂，收集Rf值0.3-0.4的组分，获得式(II)所示化合物。
7.一种权利要求1所述罗丹明6G席夫碱类荧光探针在检测Fe3+中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述应用方法为：将待测样品加入含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM的PBS缓冲液中，再加入5μmol/mL罗丹明6G席夫碱类荧光探针乙腈溶液后，若有颜色变化，则待测样品中含有Fe3+。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的应用为：将待测样品加入含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM的PBS缓冲液中，再加入5μmol/mL罗丹明6G席夫碱类荧光探针乙腈溶液后，在555nm处测定荧光值，根据Fe3+标准曲线，获得待测样品中Fe3+浓度；所述待测样品与PBS缓冲液体积比为1:1，所述待测样品与探针乙腈溶液体积比为10:1；所述Fe3+标准曲线是以Fe3+水溶液浓度为横坐标，以荧光值为纵坐标制成。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述Fe3+标准曲线按如下方法制备：将浓度为0，0.01，0.05，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4μmol/mL的Fe3+水溶液分别加入含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM的PBS缓冲液中，再加入5μmol/mL罗丹明6G类荧光探针乙腈溶液后，在555nm处测定荧光值，以Fe3+浓度为横坐标，以荧光值为纵坐标，获得Fe3+标准曲线；所述Fe3+水溶液与PBS缓冲液体积比为1:1，所述Fe3+水溶液与探针乙腈溶液体积比为10:1。
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