CN108440548B - 一种含酰肼基团的罗丹明6g类荧光探针及其制备与应用 - Google Patents

一种含酰肼基团的罗丹明6g类荧光探针及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含酰肼基团的罗丹明6G类荧光探针及其制备与应用，本发明探针对Cu2+具有高效专一的选择性，可通过颜色变化和荧光变化来识别Cu2+，可以应用于环境水样中的Cu2+的可视化检测。

Description

一种含酰肼基团的罗丹明6G类荧光探针及其制备与应用
(一)技术领域
本发明涉及一种含酰肼基团的罗丹明6G类荧光探针及其制备与应用。
(二)背景技术
罗丹明(Rhodamine)是一种邻苯二酚类荧光染料，从结构上来说它具有一个氧杂蒽环，分子具有刚性平面，稳定性好，且具有多个可修饰位点，受样品干扰性小；它荧光的最大发射位于500-700nm处即红色可见光区域，其摩尔吸光系数大，量子产率高。正是由于罗丹明优越的光物理性和光稳定性，它在激光染料、荧光标尺、染色剂；纳米聚合物的表面修饰、微粒的结构和动态研究、单分子成像和生物成像等方面应用相当广泛。
铜是人体含量的必需微量元素，在生物体内对血液、中枢神经和免疫系统，头发、皮肤和骨骼组织以及脑子和肝、心等内脏的发育和功能有重要影响，活化血红蛋白的形成，促进铁的吸收和利用，在传递电子、弹性蛋白的合成、结缔组织的代谢、嘌呤代谢、磷脂及神经组织形成方面有重要意义。所以开发一种能检测铜离子的探针是非常必要的。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种式(Ⅶ)或式(VIII)所示的一种含酰肼基团的罗丹明6G类荧光探针，利用羧酸与罗丹明6G酰肼反应合成酰肼基团荧光增强型探针，用于二价铜离子的检测。本发明设计合成的荧光增强型探针的特色之处在于探针合成简单，操作简便，并且对Cu2+的识别效果理想，将探针VIII-1负载于滤纸上制成探针试纸，可用于不同水样中不同浓度Cu2+的可视化检测，将来可将其进一步应用于环境或是生物系统中对Cu2+的检测应用。另外，本发明所用的二价铜离子的检测方法误差小，灵敏度高、准确度高等特点，尤其在检测低浓度的二价铜离子方面，更显示出优越的灵敏度和准确度。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种含酰肼基团的罗丹明6G类荧光探针，所述荧光探针为式(Ⅶ)或式(VIII)所示；
Figure GDA0002501753790000021
式(Ⅶ)中，R1为
Figure GDA0002501753790000022
式(VIII)中，R2为下列之一：
Figure GDA0002501753790000023
CH＝CH。
本发明提供一种所述式(Ⅷ)所示含酰肼基团的罗丹明6G类荧光探针的制备方法，所述方法为下列之一：(1)式(Ⅷ)中R2为
Figure GDA0002501753790000024
时，所述方法为：冰水浴中，酰氯化合物(IV-1)溶于二甲基甲酰胺中，搅拌溶解，制成11.4mmol/L酰氯化合物(IV-1)溶液；用体积比3:2的吡啶和二甲基甲酰胺混合液溶解化合物(II)，待其完全溶解后，转入恒压滴定漏斗并将其滴加到酰氯化合物(IV-1)溶液中，之后撤去冰浴，进行常温反应完全后，加入水终止反应，二氯甲烷萃取，有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压蒸干溶剂，以体积比1:30的CH3OH:CH2Cl2薄层层析，收集Rf＝0.3-0.4的组分，得到式(Ⅷ)所示化合物；所述酰氯化合物(IV-1)与化合物(II)物质的量之比为1:2.2；所述酰氯化合物(IV-1)溶液中二甲基甲酰胺与吡啶和二甲基甲酰胺混合液体积比为1:1；
Figure GDA0002501753790000025
(2)式(Ⅷ)中R2为
Figure GDA0002501753790000031
或CH＝CH，所述方法为：冰浴中，将式(II)所示化合物与二甲基甲酰胺、EDC·HCl和HOBt混合，搅拌溶解，加入式(III-2)或式(III-3)所示化合物，室温反应完全，将反应液过滤，滤液蒸干溶剂后，以体积比1:20的CH3OH:CH2Cl2进行薄层层析，收集Rf值0.4-0.5的组分，干燥，获得式(Ⅷ)所示化合物；式(II)所示化合物与二甲基甲酰胺、EDC·HCl和HOBt物质的量之比为1:1.25:1.25，所述式(II)所示化合物与式(III-2)或式(III-3)所示化合物物质的量之比为1:0.42；
Figure GDA0002501753790000032
本发明还提供一种所述式(Ⅶ)所示含酰肼基团的罗丹明6G类荧光探针的制备方法，所述方法为：冰浴中，式(II)化合物溶于二氯甲烷中，依次加入三乙胺、4-二甲氨基吡啶，搅拌溶解后，加入式(Ⅵ)所示化合物，待其完全溶解后，撤去冰浴，室温反应完全，将反应液过滤，滤液蒸去溶剂后，以体积比1:20CH3OH:CH2Cl2为展开剂进行薄层层析，收集Rf为0.3-0.4的组分，干燥，获得式(Ⅶ)所示含酰肼基团的罗丹明6G类荧光探针；所述式(Ⅵ)所示与三乙胺、4-二甲氨基吡啶、式(II)化合物化合物物质的量之比为1:1.5:1.5:1.25；所述二氯甲烷体积用量以式(II)化合物物质的量计为150ml/mmol；
Figure GDA0002501753790000033
此外，本发明提供一种所述含酰肼基团的罗丹明6G类荧光探针在检测Cu2+中的应用。
一方面，本发明所述含酰肼基团的罗丹明6G类荧光探针在定性检测Cu2+中的应用为：将待测样品加入含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM的PBS缓冲液中，再加入5μmol/mL含酰肼基团的罗丹明6G类荧光探针乙腈溶液后，若有颜色产生，则待测样品中含有Cu2+。
另一方面，本发明所述含酰肼基团的罗丹明6G类荧光探针在定量检测Cu2+中的应用为为：将待测样品加入含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM的PBS缓冲液中，再加入5μmol/mL含酰肼基团的罗丹明6G类荧光探针乙腈溶液后，在560nm处测定荧光值，根据Cu2+标准曲线，获得待测样品中Cu2+浓度；所述待测样品与PBS缓冲液体积比为1:1，所述待测样品与探针乙腈溶液体积比为10:1；所述Cu2+标准曲线是以Cu2+水溶液浓度为横坐标，以荧光值为纵坐标制成。
进一步，所述Cu2+标准曲线按如下方法制备：将浓度为0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5μmol/mL的Cu2+水溶液分别加入含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM的PBS缓冲液中，再加入5μmol/mL含酰肼基团的6G类荧光探针乙腈溶液后，在560nm处测定荧光值，以Cu2+浓度为横坐标，以荧光值为纵坐标，获得Cu2+标准曲线；所述Cu2+水溶液与PBS缓冲液体积比为1:1，所述Cu2+水溶液与探针乙腈溶液体积比为10:1。
进一步，所述式(II)所示化合物按如下方法制备：以式(I)所示的化合物与水合肼(NH2.NH2·H2O)为原料，在乙醇中，回流反应完全，反应完全后，反应液用旋转蒸发仪蒸干溶剂，然后加入水，二氯甲烷进行萃取(3×50mL)，合并有机相，再用饱和氯化钠水溶液洗涤(2×100mL)，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压蒸干溶剂后进行薄层层析(CH3OH:CH2Cl2＝1:40，v/v为展开剂)，收集Rf为0.3-0.4的组分，干燥，获得式(II)所示化合物；式(I)所示化合物与水合肼投料物质的量之比为1:10；乙醇体积用量以式(I)所示化合物物质的量计为10ml/mmol；
Figure GDA0002501753790000041
进一步，所述化合物(III-2)的合成方法为：
Figure GDA0002501753790000051
将化合物(Ⅴ-2)溶于的2M的NaOH水溶液中，加入四氢呋喃(THF)使其更好的溶解，加热回流反应完全后，将反应液减压蒸去THF，剩余水溶液加入二氯甲烷甲萃取，静置分层后，向水相加入甲酸析出全部固体物，用乙酸乙酯萃取两次(40mL×2)，合并有机相，减压旋蒸除去所有溶剂，得到固体粘稠物，烘干，即可得到化合物III-2；所述2M的NaOH水溶液体积用量以化合物(Ⅴ-2)物质的量计为20ml/mmol；所述THF体积用量以化合物(Ⅴ-2)物质的量计为10ml/mmol，甲酸与化合物(Ⅴ-2)物质的量之比为50:1。
进一步，所述化合物(IV-1)的合成
Figure GDA0002501753790000052
将化合物(III-1)溶于的SOCl2中，在80℃加热回流6-8h，冷凝管上方安装无水氯化钙吸收装置并连接尾气吸收装置(碱液+缓冲瓶)，反应过程用TLC追踪检测。待反应完全后减压旋蒸除去所有溶剂，得到黄色固体IV-1；所述SOCl2体积用量以化合物(III-1)物质的量计为5ml/mmol。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明成功的设计并合成了一种新型的如式(Ⅶ)、(Ⅷ)所示的含酰肼基团的罗丹明6g类荧光探针；(2)本发明合成的探针对Cu2+具有高效专一的选择性，可通过颜色变化和荧光变化来识别Cu2+。(3)本发明成功的设计并合成的一种新型的式(Ⅶ)、(Ⅷ)所示的含酰肼基团的罗丹明6g类荧光探针，以及其对金属离子的识别能力，并分析该类探针不同取代基芳香醛是否会对探针的荧光效果产生影响，分析其构效关系，因为化合物Ⅷ-1中包含的2,2＇-联喹啉-4,4＇-二甲酸配体有利用探针对Cu2+的络合，形成配位键，增强了其对Cu2+的结合能力，而化合物Ⅷ-2和Ⅶ中则不具有这种配体功能，因此与Cu2+的结合能力弱，荧光增强不明显。(4)本发明将合成的探针Ⅷ-1负载于滤纸上制成探针试纸，可以应用于环境水样中的Cu2+的可视化检测。本章设计合成的荧光增强型探针Ⅷ-1的特色之处在于利用联喹啉酸作为喹啉酸的衍生物可用Cu2+的检测这一特点，促进罗丹明6g的内酰胺环开环，与Cu2+产生络合反应，形成配位键，产生荧光，将该探针负载于滤纸上，制成探针试纸，用于不同水样中的不同浓度的Cu2+可视化检测，将来可进一步将其用于环境和生物体中的Cu2+检测应用。
(四)附图说明
图1是本发明实施例10中的荧光探针化合物Ⅷ-1与Cu2+作用后溶液颜色变化(a：荧光下；b：肉眼可见，其中左侧均为荧光探针化合物Ⅷ-1溶液颜色变化，右侧均为化合物Ⅷ-1与Cu2+作用后溶液颜色变化)。
图2是本发明实施例10中的荧光探针化合物Ⅷ-1对各金属离子的紫外吸收谱图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为紫外吸收值OD值。
图3是本发明实施例10的荧光探针化合物Ⅷ-1对各金属离子的荧光强度谱图。a为紫外-可见吸收光谱，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。b为各金属离子560nm处紫外吸收柱形图。
图4是本发明实施例11的荧光探针化合物Ⅷ-1的荧光强度以及Ⅷ-1+Cu2+离子络合物的荧光强度分别随pH变化的荧光发射图(560nm)。横坐标为pH，纵坐标为荧光强度。
图5是本发明实施例9的荧光探针化合物Ⅷ1-3、Ⅶ对Cu2+识别能力的荧光强度变化的荧光发射图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。
图6是本发明实施例12的荧光探针化合物Ⅷ-1+Cu2+离子络合物的荧光强度分别随时间变化的荧光发射图(555nm)。横坐标为Time(min)，纵坐标为荧光强度。
图7是本发明实施例13的荧光探针化合物Ⅷ-1+金属离子络合物与Ⅷ-1+Cu2++金属离子络合物的荧光强度的荧光发射比较柱状图(560nm)。横坐标为金属离子，纵坐标为荧光强度。
图8是本发明实施例14的荧光探针化合物Ⅷ-1与不同浓度Cu2+(0-30倍量)的荧光强度变化图(插图：Cu2+的浓度与荧光强度的变化线性图)。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。
图9是本发明实施例14的荧光探针化合物Ⅷ-1+Cu2+离子络合物的Job’s plot曲线图，横坐标为[Cu2+]/[Cu2+]+[Ⅷ-1]，纵坐标为紫外吸收值OD值。
图10是本发明实施例15的荧光探针化合物Ⅷ-1与Cu2+的可逆性实验的荧光强度变化图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。
图11是本发明实施例15的荧光探针化合物Ⅷ-1与Cu2+的识别机理图。
图12是本发明实施例16的荧光探针化合物Ⅷ-1负载的探针试纸识别环境水样中不同浓度Cu2+的溶液颜色可视变化图，图中从左到右Cu2+溶液浓度依次为0，0.0125，0.125，1.25，12.5mM。
图13本发明反应流程示意图。
(五)具体实施方式
本发明所述超纯水是指去离子水经过一次蒸馏得到的蒸馏水，所述室温为25-30℃。下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：化合物(II)的合成
Figure GDA0002501753790000071
称量NH2.NH2·H2O(100mmol，10.0eq，5g)溶于50mL的乙醇试剂(分析级)中，罗丹明6G(化合物I)(10mmol，1.0eq，4.79g)加入反应体系，完全溶解后溶液呈现红褐色，再补加50mL的乙醇，回流反应48h，反应过程有白色固体生成，并用TLC追踪检测。反应完全后用旋转蒸发仪蒸干溶剂，然后加入30mL水，二氯甲烷进行萃取(3×50mL)，合并有机相，再用饱和氯化钠水溶液洗涤(2×100mL)，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压蒸干溶剂后进行薄层层析(CH3OH:CH2Cl2＝1:40，v/v为展开剂)，收集Rf为0.3-0.4的组分，干燥，得到化合物(II)。
Compound II(白色固体，产率81％)MS(ESI):m/z＝431.2[M+H]+.mp＝265-267℃.1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.97(dd,J＝17.1,13.3Hz,1H),7.51-7.41(m,2H),7.07(dd,J＝11.9,7.2Hz,1H),6.43-6.35(m,2H),6.27(d,J＝14.1Hz,2H),3.57(s,4H),3.26-3.15(m,4H),2.04(d,J＝16.8Hz,1H),1.91(d,J＝12.2Hz,6H),1.32(t,J＝7.1Hz,6H),1.28–1.20(m,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ166.22,152.23,151.75,147.54,132.59,129.86,128.13,127.70,123.81,123.04,117.99,104.92,96.84,77.24,77.03,76.82,66.06,60.41,38.36,16.71,14.76,14.20.IRνmax(cm-1):3426.98,2973.58,2871.06,1687.31,1623.58,1515.35,1420.94,1345.08,1156.27,946.30,887.22,690.29.
实施例3：化合物(III-2)的合成
Figure GDA0002501753790000081
市售化合物(Ⅴ-2)(5mmol)溶于100mL的2M的NaOH水溶液中，加入50mL THF使其更好的溶解，反应加热回流36h，反应过程用TLC追踪检测。待反应完全后减压蒸去THF，剩余水溶液加入50mL二氯甲烷甲萃取，静置分层后，向水相加入250mmol甲酸，此时有固体物全部析出，用乙酸乙酯萃取两次(40mL×2)。合并有机相，减压旋蒸除去所有溶剂，得到固体粘稠物，烘干，即可得到化合物III-2。产率80％。
实施例4：化合物(IV-1)的合成
Figure GDA0002501753790000082
市售化合物(III-1)(10mmol，3.44g)溶于50mL的SOCl2中，反应在80℃加热回流6-8h，冷凝管上方安装无水氯化钙吸收装置并连接尾气吸收装置(碱液+缓冲瓶)，反应过程用TLC追踪检测。待反应完全后减压旋蒸除去所有溶剂，得到黄色固体IV-1。产率85％。
实施例5：化合物(Ⅷ-1)的合成
Figure GDA0002501753790000083
冰水浴中，酰氯化合物IV-1(0.57mmol，1.0eq，0.218g)溶于50mL的二甲基甲酰胺(DMF)试剂(分析级)中，使其搅拌溶解(安装好无水氯化钙和尾气吸收装置)，待用。用30mL吡啶和20mL DMF试剂(分析级)溶解0.54g化合物(II)(1.26mmol，2.2eq)，待其完全溶解后，转入恒压滴定漏斗并将其滴加到上述溶解好的酰氯化合物IV-1溶液中，之后撤去冰浴，进行常温反应。反应过程用TLC跟踪检测。反应完全后加入50mL水终止反应，二氯甲烷进行萃取(3×100mL)，合并有机相，再用饱和氯化钠水溶液洗涤(2×100mL)，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压蒸干溶剂，薄层层析法分离纯化(CH3OH:CH2Cl2＝1:30，v/v为展开剂，Rf＝0.3-0.4)，得到目标产物Ⅷ-1。
CompoundⅧ-1(红色固体，产率45％)MS(ESI):m/z＝1164.50[M+H]+.mp：240-241℃.1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.06-7.96(m,4H),7.65-7.46(m,12H),7.15(t,J＝13.8Hz,2H),6.38-6.31(m,6H),6.23(s,6H),3.21(d,J＝6.8Hz,8H),1.98-1.87(s,12H),1.37-1.28(m,12H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ166.67,165.52,162.56,152.37,150.88,147.90,133.97,128.83,128.74,128.68,128.39,127.62,124.53,123.71,118.22,103.74,96.81,96.35,77.24,77.03,76.81,66.79,38.30,36.50,31.44,16.74,16.68,14.73,14.69,1.02.IRmax(cm-1):3434.29,2967.29,2863.11,1733.93,1691.13,1621.34,1518.00,1421.75,1272.74,1159.85,1089.15,1014.18,883.72,740.73,617.96.
实施例6：化合物(Ⅷ-2)的合成
Figure GDA0002501753790000091
冰水浴中，化合物(II)(0.1mmol，2.4eq，0.043g)溶于15mL的DMF试剂中，依次加入EDC·HCl(0.125mmol，3.0eq，23.96mg)、HOBt(0.125mmol，3.0eq，16.88mg)，搅拌溶解后，加入化合物(III-2)(0.042mmol，1.0eq，15.56mg)，待其完全溶解后，撤去冰浴，反应在30℃左右进行24h。反应过程用TLC追踪检测。反应完全后过滤，滤液蒸去溶剂后用薄层层析法分离纯化(CH3OH:CH2Cl2＝1:20，v/v为展开剂)，收集Rf为0.4-0.5的组分，干燥，得到目标化合物(Ⅷ-2)。
CompoundⅧ-2(粉红色固体，产率40％)MS(ESI):m/z＝1193.46[M+H]+.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.03(s,2H),7.99-7.91(m,4H),7.50-7.41(m,8H),7.10-7.01(m,4H),6.37(s,7H),6.30(s,7H),3.94(d,J＝2.5Hz,4H),3.27–3.18(m,8H),1.92(d,J＝6.8Hz,12H),1.32(dd,J＝23.6,16.5Hz,12H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ166.20,152.24,151.75,147.54,132.57,129.87,128.78,128.12,127.69,123.81,123.03,117.98,104.96,96.85,96.58,77.28,77.03,76.78,66.06,38.36,16.69,14.76.IRmax(cm-1):3440.51,2964.26,2869.32,1703.28,1637.03,1621.35,1467.87,1349.30,1200.36,1015.15,938.90,811.22,741.81.
实施例7：化合物(Ⅷ-3)的合成
Figure GDA0002501753790000101
只需将化合物(III-2)换成化合物(III-3)，其他操作同实施例6，科得到目标化合物(Ⅷ-3)。
CompoundⅧ-3(粉红色固体，产率41％)MS(ESI):m/z＝936.43[M+H]+.mp＝242-243℃.1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.11-7.86(m,2H),7.57-7.39(m,4H),7.14-6.96(m,2H),6.39(s,4H),6.26(s,4H),3.64-3.45(m,8H),3.22(q,J＝7.1Hz,8H),2.01-1.84(m,12H),1.45-1.24(m,12H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ166.22,152.24,151.76,147.55,132.60,129.86,128.14,127.70,123.82,123.05,118.00,104.92,96.84,77.27,77.06,76.84,66.06,38.37,16.72,14.77.IRmax(cm-1):3427.47,2972.52,2871.46,1688.02,1623.57,1465.38,1268.76,1097.66,1009.89,946.06,886.95,744.22.
实施例8：化合物(Ⅶ)的合成
Figure GDA0002501753790000102
冰水浴中，化合物(II)(0.1mmol，1.25eq，0.043g)溶于15mL的二氯甲烷(DCM)试剂中，依次加入三乙胺(0.12mmol，1.5eq，12.14mg)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)(0.15mmol，1.5eq，14.65mg)，搅拌溶解后，加入化合物(Ⅵ)(0.08mmol，1.0eq，8mg)，待其完全溶解后，撤去冰水浴，反应在30℃左右进行24h。反应过程用TLC追踪检测。反应完全后过滤，滤液蒸去溶剂后用薄层层析法分离纯化(CH3OH:CH2Cl2＝1:20，v/v为展开剂)，收集Rf为0.3-0.4的组分，干燥，得到目标产物化合物(Ⅶ)。
CompoundⅦ(白色固体，产率41％)MS(ESI):m/z＝577.24[M+H]+.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.43-8.28(m,1H),7.78(t,J＝18.1Hz,2H),7.61(d,J＝7.2Hz,2H),7.57-7.51(m,1H),7.47(dd,J＝16.3,9.2Hz,2H),7.40(t,J＝7.5Hz,2H),3.84(s,4H),3.17(q,J＝7.3Hz,4H),1.43-1.20(m,12H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ166.21,152.23,151.75,147.53,132.59,129.86,128.13,127.69,123.81,123.04,117.99,104.91,96.83,77.25,77.04,76.82,66.05,38.36,16.71,16.66,14.76.IRmax(cm-1):3437.71,1563.95,1489.55,1384.54,1303.06,1147.11,1035.15,849.87,762.52,683.17,649.36.
实施例9各探针化合物对Cu2+识别能力的确定
(1)探针母液的制备
将实施例5-8制备的探针分子粉末(Ⅷ-1)～(Ⅷ-3)和Ⅶ用色谱级乙腈溶解定容，配制浓度为5μmol/mL的探针乙腈溶液，避光低温储存。
(2)金属离子母液的制备
分别取下列无机盐MgSO4·7H2O、KCl、CuSO4·5H2O、FeCl3、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、Al(NO3)3·9H2O、CaCl2、NaCl、AgNO3、Pb(CH3COO)2·3H2O、Co(NO3)2·6H2O、BaCl2·2H2O、Zn(CH3COO)2·2H2O、NiSO4·6H2O、CrCl3·6H2O、LiCl2·H2O、HgCl2、RuCl3，转入10mL离心管中用超纯水定容至8mL，得到浓度为1.25mmol/mL的金属离子母液，分别对应离子为Mg2+、K+、Cu2+、Fe3+、Fe2+、Mn2+、Al3+、Ca2+、Na+、Ag+、Pb2+、Co2+、Ba2+、Zn2+、Ni2+、Cr3+、Li2+、Hg2+、Ru2+。避光低温储存。
(3)各探针化合物对Cu2+识别能力的确定
室温下，含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM PBS缓冲液中，测定各探针分子对Cu2+的选择性。
将步骤(2)中的1.25mmol/mL的金属离子母液稀释至12.5μmol/mL后取100μL，加入含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM PBS缓冲液100μL，后加入步骤(1)中的5μmol/mL探针乙腈溶液10μL后，测定其相应荧光性能变化，确定效果最好的荧光探针，结果见图5所示。
从图5可以看出在化合物Ⅷ-1～Ⅷ-3、Ⅶ系列探针中，化合物Ⅷ-1对Cu2+的识别能力最强，化合物Ⅷ-2和Ⅶ对Cu2+的几乎没有识别能力，这可能是因为化合物Ⅷ-1中包含的2,2＇-联喹啉-4,4＇-二甲酸配体有利用探针对Cu2+的络合，形成配位键，增强了其对Cu2+的结合能力，而化合物Ⅷ-2和Ⅶ中则不具有这种配体功能，因此与Cu2+的结合能力弱，荧光增强不明显。
实施例10化合物Ⅷ-1的金属离子选择性
室温下，含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM PBS缓冲液，测定Ⅷ-1探针分子对金属离子的选择性。
将12.5μmol/mL Cu2+水溶液100μL，加入含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM PBS缓冲液100μL，后加入5μmol/mL探针Ⅷ-1乙腈溶液10μL后，测定其相应荧光性能变化。反应后溶液颜色变化，紫外吸收和荧光强度的变化，得到的相应的紫外吸收光谱和荧光发射光谱。分别如图1、图2、图3所示。
从紫外吸收谱图2可以看出化合物Ⅷ-1对Cu2+有最大的紫外吸收，在535nm处有最大的紫外吸收峰，吸收强度增加了约8倍，反应液颜色由无色变为红色，在加入其他二价金属离子和没有加金属离子时，化合物Ⅷ-1溶液没有颜色，紫外吸收光谱在535nm处几乎没有吸收峰而且荧光发射也很弱。根据紫外吸收强度，在测定荧光光谱时，选择535nm为最适激发波长，化合物Ⅷ-1对Cu2+的选择性最好，在560nm处有强的荧光发射波长，而且荧光强度大幅度增强，增强了200倍(图3)，证明化合物的内酰胺环已经打开。同时在此条件下除了三价金属离子外其他金属离子并没有引起明显的荧光强度变化，但三价金属离子荧光强度较小，这说明化合物VIII-1对Cu2+的选择性受到其他共存离子的干扰较弱，表现出对Cu2+的高效的选择性。
实施例11pH对探针Ⅷ-1的识别性能的影响
为了能够将探针Ⅷ-1应用在更复杂体系中，实验过程中考察了pH对Cu2+识别性能的影响。室温下，pH3.5-12.0(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0)范围内含体积浓度50％乙腈的10mM PBS缓冲液中的探针Ⅷ-1和探针Ⅷ-1+Cu2+的荧光强度的变化。
将12.5μmol/mLCu2+水溶液100μL，加入pH3.5-12.0、含体积浓度50％乙腈的10mMPBS缓冲液100μL，后加入5μmol/mL探针Ⅷ-1乙腈溶液10μL后，在560nm处测定其相应荧光值变化，结果见图4所示。
图4显示的是不同pH条件下探针Ⅷ-1溶液中没有Cu2+存在和有Cu2+存在时，以535nm为激发波长，记录发射波长560nm处的荧光强度的变化。从图中可以看出，没有Cu2+存在时，在pH为3.5到12.0之间没有观察到明显的荧光变化，说明探针Ⅷ-1本身对pH不敏感。当加入Cu2+后，在相同的pH范围内，探针对Cu2+响应有所不同，当pH<7.0时荧光强度较强，pH＝6.5时，荧光强度最强。当溶液为碱性时，Cu2+与探针Ⅷ-1的结合能力减弱，特别是当pH值达到10以上后，溶液不再有明显的荧光强度。总的来说，探针能在一个较宽的pH范围内(pH3.5-10)实现对Cu2+的有效识别。所以在接下来的探针性能试验中，选用含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mMPBS缓冲液作为溶剂体系。
实施例12探针化合物Ⅷ-1对Cu2+的时间响应
室温下，含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM PBS缓冲液的溶剂体系中，测定探针分子Ⅷ-1对Cu2+的识别性能。
将12.5μmol/mLCu2+水溶液100μL，加入含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM PBS缓冲液100μL，后加入5μmol/mL探针Ⅷ-1乙腈溶液10μL后，在560nm处测定其相应荧光值随时间的变化，以确定作用时间的长短，结果见图6所示。
从图6中发现，化合物Ⅷ-1与Cu2+反应混合后立即可产生荧光，荧光强度增强100倍左右，随着时间增长所产生的荧光强度也随之增强，在115min后达到最大的荧光强度，荧光强度增大200倍，之后荧光强度稳定，无明显的下降趋势。这表明探针Ⅷ-1对Cu2+的识别具有快的响应以及长时间识别的稳定性。这种实时监测在实际应用中具有重要意义。因此，在之后的测试工作中每个样品都是加入金属离子放置2h后进行光谱测定的。
实施例13探针化合物Ⅷ-1对Cu2+的抗干扰性实验
室温下，含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM PBS缓冲液中，探针分子Ⅷ-1对Cu2+的识别性能。
将实施例9步骤(2)中1.25mmol/mL的金属离子母液用超纯水稀释至12.5μmol/mL后取100μL，加入含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM PBS缓冲液100μL，再加入5μmol/mL探针乙腈溶液(Ⅷ-1)10μL后，以不含金属离子作为对照，测定560nm处荧光值，结果见图7中灰色柱。
再在上述各个金属离子溶液中加入12.5μmol/mL Cu2+溶液100μL，测定560nm处荧光值，结果见图7中黑色柱。通过两次测定荧光强度的比较得出其离子的存在对Cu2+的影响。
如图7所示，灰色柱状说明了三价金属离子会对探针是识别能力产生一定的干扰。而在上述溶液基础上，再加入同样当量的Cu2+溶液后，可以看到荧光强度急剧增加(黑色柱状)，其中Al3+、Cr3+、Fe3+可以促进荧光增强，这可能是上述离子的加入导致罗丹明衍生物的平衡进一步向开环移动，其他二价金属离子对Cu2+的干扰影响较小。总体来说，探针Ⅷ-1对Cu2+的识别作用受其他共存离子的干扰较小，因此，证明了探针Ⅷ-1对Cu2+的识别有较好的选择性。
实施例14探针VIII-1对Cu2+的荧光滴定及络合比的测定
1)探针VIII-1对Cu2+的滴定及拟合
室温下，向含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM PBS缓冲液中，加入5μmol/mL探针乙腈溶液(VIII-1)10μL，进行Cu2+的滴定实验，即向其中滴定5μmol/mL Cu2+水溶液，每滴加完10μL测定溶液一次荧光发射光谱，到第30次10μL滴定完结束滴定，共测31次(即对探针(VIII-1)进行Cu2+0-30.0倍量的滴定实验)，结果见图8所示。
从图8中可以看出，随着Cu2+浓度的增加，在560nm处荧光发射强度逐渐增强，当加入到20.0倍量左右的Cu2+后，反应基本达到饱和，溶液的荧光强度增强不明显。通过荧光强度随浓度的变化可以用来计算络合物的结合常数，假设Cu2+与化合物VIII-1的结合比1:2，通过Origin软件按以下方程对化合物VIII-1的荧光强度随Cu2+的浓度(此时Cu2+浓度为总溶液中的浓度值)的变化图进行非线性最小二乘法的拟合，可以得到一条平滑曲线(图8中b)，线性相关系数R值大于0.99，有力的证明了假设是成立的，Cu2+与化合物8aVIII-1的结合比为1：2，同时计算出结合常数值是8.6×105M-1，结合常数如此大说明了此络合物具有较好的稳定性。
Figure GDA0002501753790000141
公式(1)中，F代表加入离子后的荧光强度；F0代表有机化合物的荧光强度；Fmax代表加入离子后的荧光强度变化的极限值；[Cu2+]代表所加金属离子的浓度；K为结合常数。
2)探针VIII-1与Cu2+结合比的测定
为了进一步说明VIII-1与Cu2+是1:2结合的，根据随Cu2+的摩尔分数增高与紫外吸收值的变化曲线作出Job’s plot曲线图(图9)。从图中可知，Ⅷ-1与Cu2+的总浓度是100μM，当Cu2+的摩尔分数为0.6时，荧光发射强度达到最大值，这说明Ⅷ-1与Cu2+的结合比是1:2，与上述非线性拟合是一致的。
3)Cu2+浓度与探针Ⅷ-1荧光强度变化关系的回归方程的确定
为了开发该探针的实际应用价值，进行了Cu2+浓度与探针Ⅷ-1荧光强度变化关系的回归方程的实验确定，具体实验方法为：将实施例9中1.25mmol/mL的Cu2+离子母液用超纯水稀释后使其浓度分别为0，0.01,0.05,0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5.0μmol/mL，各取100μL，加入含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM PBS缓冲液100μL，再加入5μmol/mL探针乙腈溶液(Ⅷ-1)10μL后，在560nm测定荧光强度。根据所测Cu2+离子浓与其对应荧光强度数据的关系，得出以Cu2+浓度(μmol/mL)为自变量x、荧光强度为因变量y的回归方程y＝3155.8892+5891.81x。
实施例15探针VIII-1对Cu2+的识别可逆性的测定
室温下，含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM PBS缓冲液100μL，加入12.5μmol/mLCu2+水溶液100μL，加入5μmol/mL探针VIII-1乙腈溶液10μL后，待反应产生荧光后，检测荧光光谱，结果见图10中曲线a；再加入等量的ETDA络合剂，观察反应荧光的变化情况，检测荧光光谱，结果见图10中曲线b；最后再加入12.5μmol/mLCu2+水溶液100μL，观察反应荧光的变化情况，检测荧光光谱，结果见图10中曲线c。
在化合物VIII-1与Cu2+溶液反应后，溶液由无色变为红色，测定此时的荧光强度值，在此溶液中加入与Cu2+溶液等当量EDTA后，溶液颜色变浅，至无色，后会缓慢增强，这可能是因为Ⅷ-1与Cu2+络合和Ⅷ-1与EDTA络合处于动态平衡，再次测定此时荧光强度值，所得荧光下降强度不大。再加入相同当量的Cu2+溶液再次变为粉红色，测定此时溶液荧光值，此时荧光强度比初始更强，可能是因为此时促进VIII-1与Cu2+的进一步络合(见图10)。这一现象这说明了化合物VIII-1与Cu2+之间存在着配位作用，加入Cu2+使VIII-1中内酰胺环打开，加入的EDTA可将Cu2+从探针体系中消除，说明探针VIII-1对于Cu2+的识别过程是可逆的。
根据VIII-1对Cu2+之间的结合比为1:2，以及可逆性实验，判断探针VIII-1对Cu2+的识别机理如图11所示。
实施例16探针VIII-1试纸在检测水样中Cu2+浓度的应用
检测Cu2+的探针Ⅷ-1试纸的制备：裁剪3.0×5.0cm2的滤纸条，将其浸入到溶有探针Ⅷ-1(5.0mM)的乙腈溶液，待其浸润均匀后取出，晾干，用于不同水样中的不同浓度的Cu2+的可视化检测分析。
探针Ⅷ-1试纸在检测水样中Cu2+浓度：
将所取水样(河水)中滴加在探针VIII-1试纸上，试纸颜色没有产生明显的颜色变化，这说明了水样中的基本不含Cu2+，之后再向水样中加入不同浓度梯度Cu2+溶液，再将其滴加在试纸上，观察试纸具体颜色变化。结果见图12，图中从左到右Cu2+溶液浓度依次为0，0.0125，0.125，1.25，12.5μmol/mL。
实施例17探针Ⅷ-1在定量检测水样中Cu2+浓度的应用
为了验证探针Ⅷ-1在检测水样中Cu2+的应用性能，分别用超纯水配制了1.8、1.6、1.3、1.0、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001μmol/mL的Cu2+水溶液，作为待测样品。采用本发明探针方法和PAN为指示剂EDTA络合法测定来测定上述Cu2+溶液的浓度，具体操作如下：
(1)本发明探针方法测定Cu2+溶液的浓度分别取100μL含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM PBS缓冲液，分别加入到100μL上述配制好的不同浓度的Cu2+水溶液中，再分别加入5μmol/mL探针乙腈溶液(Ⅷ-1)10μL后，在560nm处测定荧光强度。将测得的荧光值代入到实施例14得到的回归方程y＝3155.8892+5891.81x中，获得Cu2+浓度，见表1。
(2)PAN为指示剂EDTA络合法测定Cu2+溶液的浓度
PAN：1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚；EDTA:乙二胺四乙酸二钠。
a、0.01mmol/mL EDTA标准液配制：取3.7224g EDTA固体，加入超纯水加热溶解，待冷却后定容至1000mL，摇匀备用。
b、1％PAN(乙醇溶液)指示剂的配制：将0.1克PAN溶于100毫升乙醇中摇匀备用。
c、二价铜离子的测定：移取1mL待测水样于300mL锥形瓶中，加入超纯水50mL，PAN指示剂3-5滴，用EDTA标准溶液滴定至绿色为终点，记下所消耗的体积V。
d、二价铜离子的计算：
Cu2+(μmol/mL)＝CEDTA×1000×V/V0
式中，CEDTA：EDTA标准溶液的浓度(mmol/mL)；V：消耗EDTA标准溶液的体积(mL)；V0：待测水样的体积(mL)。
测定结果见表1。
表1探针Ⅷ-1在检测水样中Cu2+的应用
Figure GDA0002501753790000161
Figure GDA0002501753790000171
从上表1中，本发明所用的二价铜离子的检测方法绝对误差小，灵敏度高、准确度高等特点，尤其在检测低浓度的二价铜离子方面，更显示出优越的灵敏度和准确度。

Claims (8)

1.一种含酰肼基团的罗丹明6G类荧光探针，其特征在于所述荧光探针为式(Ⅷ)所示；
Figure FDA0002713161650000011
式(Ⅷ)中，R2为下列之一：
Figure FDA0002713161650000012
CH＝CH。
2.一种权利要求1所述式(Ⅷ)所示含酰肼基团的罗丹明6G类荧光探针的制备方法，其特征在于所述方法为下列之一：(1)式(Ⅷ)中R2为
Figure FDA0002713161650000013
时，所述方法为：冰水浴中，酰氯化合物(Ⅳ-1)溶于二甲基甲酰胺中，搅拌溶解，制成11.4mmol/L酰氯化合物(Ⅳ-1)溶液；用体积比3:2的吡啶和二甲基甲酰胺混合液溶解化合物(II)，待其完全溶解后，转入恒压滴定漏斗并将其滴加到酰氯化合物(Ⅳ-1)溶液中，之后撤去冰浴，进行常温反应完全后，加入水终止反应，二氯甲烷萃取，有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压蒸干溶剂，以体积比1:30的CH3OH:CH2Cl2薄层层析，收集Rf＝0.3-0.4的组分，得到式(Ⅷ)所示化合物；
Figure FDA0002713161650000014
(2)式(Ⅷ)中R2为CH＝CH，所述方法为：冰浴中，将式(II)所示化合物与二甲基甲酰胺、EDC·HCl和HOBt混合，搅拌溶解，加入式(III-3)所示化合物，室温反应完全，将反应液过滤，滤液蒸干溶剂后，以体积比1:20的CH3OH:CH2Cl2进行薄层层析，收集Rf值0.4-0.5的组分，干燥，获得式(Ⅷ)所示化合物；
Figure FDA0002713161650000021
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(1)所述酰氯化合物(Ⅳ-1)与化合物(II)物质的量之比为1:2.2；所述酰氯化合物(Ⅳ-1)溶液中二甲基甲酰胺与吡啶和二甲基甲酰胺混合液体积比为1:1。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(2)所述式(II)所示化合物与二甲基甲酰胺、EDC·HCl和HOBt物质的量之比为1:1.25:1.25，所述式(II)所示化合物与式(III-3)所示化合物物质的量之比为1:0.42。
5.一种权利要求1所述含酰肼基团的罗丹明6G类荧光探针在检测水样中Cu2+的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用为：将待测样品加入含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM的PBS缓冲液中，再加入5μmol/mL含酰肼基团的罗丹明6G类荧光探针乙腈溶液后，若有颜色产生，则待测样品中含有Cu2+。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用为：将待测样品加入含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM的PBS缓冲液中，再加入5μmol/mL含酰肼基团的罗丹明6G类荧光探针乙腈溶液后，在560nm处测定荧光值，根据Cu2+标准曲线，获得待测样品中Cu2+浓度；所述待测样品与PBS缓冲液体积比为1:1，所述待测样品与探针乙腈溶液体积比为10:1；所述Cu2+标准曲线是以Cu2+水溶液浓度为横坐标，以荧光值为纵坐标制成。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述Cu2+标准曲线按如下方法制备：将浓度为0，0.01，0.05，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5.0μmol/mL的Cu2+水溶液分别加入含体积浓度50％乙腈的pH＝6.5、10mM的PBS缓冲液中，再加入5μmol/mL含酰肼基团的6G类荧光探针乙腈溶液后，在560nm处测定荧光值，以Cu2+浓度为横坐标，以荧光值为纵坐标，获得Cu2+标准曲线；所述Cu2+水溶液与PBS缓冲液体积比为1:1，所述Cu2+水溶液与探针乙腈溶液体积比为10:1。
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