CN106525805B - 一种荧光检测次氯酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种荧光检测次氯酸的方法，将市售的7‑(二乙氨基)‑2‑氧代‑2H‑色烯‑3‑甲醛(7‑(diethylamino)‑2‑oxo‑2H‑chromene‑3‑carbaldehyde)作为检测ClO‑的一种荧光试剂，在pH为7.4的PBS缓冲溶液中，利用ClO‑的氧化性，将化合物中醛基氧化成羧基来定量地检测ClO‑的含量。这种检测方法灵敏度高，检测限低，检测过程简便。

Description

一种荧光检测次氯酸的方法
技术领域
本发明涉及次氯酸荧光检测分析技术，具体涉及一种荧光检测次氯酸的方法。
背景技术
次氯酸(HOCl)作为活性氧(包括氧离子、过氧化物和含氧自由基等)的一种，在生物体内主要分布于白细胞中，由髓过氧化物酶(MPO)催化H2O2和氯离子反应而生成。在正常的生理pH值下，HOCl部分离解成ClO-，在体内发挥着抗菌性能，但是过量的次氯酸会导致各种各样的疾病，包括心血管疾病、神经损伤、关节炎、和癌症等。此外，次氯酸盐也被广泛用于漂白剂和消毒剂，其浓度范围在10-5到10-2mol/L之间。由于次氯酸在环境和生物样品中广泛的存在(例如自来水和细胞中)，以至于检测样品中次氯酸根的含量成为了众多科研人员的兴趣所在。
发明内容：
本发明的目的是提供一种荧光检测次氯酸的方法。本发明使用市售的试剂，通过荧光光谱仪实现次氯酸的快速检测，此外也可用于细胞成像。
本文中所用的化合物是7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-甲醛。它的结构式为：
本发明提供一种荧光检测次氯酸的方法，步骤为：
(1)配制溶液：配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液；用DMSO配制2mM的7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-甲醛探针溶液；用去离子水配制浓度为13.4mM的ClO-溶液；
(2)按体积比2000:10，分别将2000μL pH 7.4的PBS缓冲溶液和10μL 2mM7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-甲醛的DMSO溶液加到荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着不同浓度的ClO-加入，484nm的荧光强度逐渐减弱；
(3)分别将2000μL pH 7.4的PBS缓冲溶液和10μL 2mM7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-甲醛的DMSO溶液加到另外的荧光比色皿中，分别再加入不同体积的13.4mM ClO-溶液：0、0.3、0.6、1.1、1.6、2.1、2.6、3.1、3.6、4.1、4.6、5.1、5.6μL，在荧光分光光度仪上测定484nm对应的荧光强度F：3134、3059、3007、2961、2841、2720、2547、2473、2367、2276、2088、1915、1810，以ClO-浓度为横坐标，以相对荧光强度F0-F为纵坐标绘制图，F0＝3134，得到ClO-浓度的工作曲线，线性回归方程为：F0-F＝35.170c-41.684，c的单位为μM，测量时的激发波长为289nm；
(4)2000μL pH 7.4的PBS溶液和10μL 2mM7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-甲醛的DMSO溶液加到干净的荧光比色皿中，用微量进样器吸取V ul待测样品溶液，加入到此荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，将测得的荧光强度代入(3)的线性回归方程，得到浓度c，待测样品C待测样＝2000uL×c×10-6/VuL,即可求得NaClO的浓度。
与现有检测技术相比，本发明具有如下优点和效果：本发明使用市售的试剂，通过荧光光谱手段即可实现对次氯酸的快速检测和细胞成像。该检测方法操作简单、可视化程度高(荧光前后变化明显)。
附图说明：
图1实施例1探针与ClO-作用的荧光发射图
图2实施例2测定探针与ClO-作用的工作曲线
图3实施例3细胞成像图
具体实施方式：
实施例1
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液；并用DMSO配制2mM的探针溶液；配制浓度为13.4mM的ClO-溶液；分别取2000μL的PBS(pH 7.4)溶液及10μL的2mM探针的DMSO溶液加到干净的荧光比色皿中，用微量进样器分别加入不同体积的13.4mM的ClO-溶液到相应的比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着不同浓度的ClO-加入，482nm处荧光强度逐渐减弱。荧光发射图(见图1)。
实施例2
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液；用DMSO配制2mM的探针溶液；配制浓度为13.4mM的ClO-溶液；分别将2000μL pH 7.4的PBS溶液和10μL 2mM探针的DMSO溶液加到干净的荧光比色皿中，分别再加入不同体积的13.4mM ClO-溶液：0、0.3、0.6、1.1、1.6、2.1、2.6、3.1、3.6、4.1、4.6、5.1、5.6μL，在荧光分光光度仪上测定484nm对应的荧光强度F：3134、3059、3007、2961、2841、2720、2547、2473、2367、2276、2088、1915、1810，以ClO-浓度为横坐标，以相对荧光强度F0-F为纵坐标绘制图，F0＝3134，得到ClO-浓度的工作曲线(见图2)，线性回归方程为：F0-F＝35.170c-41.684，c的单位为μM，测量时的激发波长为289nm。
实施例3
用DMSO配制2mM的探针溶液；用去离子水配制浓度为13.4mM的ClO-溶液；将2.0μM探针的DMSO溶液加入RAW264.7巨噬细胞培养液中于37℃下孵育30分钟后，用徕卡DMi8荧光倒置显微镜来拍摄其明场(见图3中a)和暗场(见图3中b)，将相应的明场图和暗场图叠加之后得到相应的叠加图片(见图3中c)；将2.0μM探针的DMSO溶液加入RAW264.7巨噬细胞培养液中于37℃下孵育30分钟后，将31.4μM的外源ClO-加入其中于37℃下再孵育30分钟，用徕卡DMi8荧光倒置显微镜来拍摄其明场(见图3中d)和暗场(见图3中e)，将相应的明场图和暗场图叠加之后得到相应的叠加图片(见图3中f)。

Claims (1)

1.一种荧光检测ClO-的方法，其特征在于，步骤为：
(1)配制溶液：配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液；用DMSO配制2mM的7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-甲醛探针溶液；用去离子水配制浓度为13.4mM的ClO-溶液；
(2)按体积比2000:10，分别将2000μL pH 7.4的PBS缓冲溶液和10μL 2mM7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-甲醛的DMSO溶液加到荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着不同浓度的ClO-加入，484nm的荧光强度逐渐减弱；
(3)分别将2000μL pH 7.4的PBS缓冲溶液和10μL 2mM7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-甲醛的DMSO溶液加到另外的荧光比色皿中，分别再加入不同体积的13.4mM ClO-溶液：0、0.3、0.6、1.1、1.6、2.1、2.6、3.1、3.6、4.1、4.6、5.1、5.6μL，在荧光分光光度仪上测定484nm对应的荧光强度F：3134、3059、3007、2961、2841、2720、2547、2473、2367、2276、2088、1915、1810，以ClO-浓度为横坐标，以相对荧光强度F0-F为纵坐标绘制图，F0＝3134，得到ClO-浓度的工作曲线，线性回归方程为：F0-F＝35.170c-41.684，c的单位为μM，测量时的激发波长为289nm；
(4)2000μL pH 7.4的PBS溶液和10μL 2mM7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-甲醛的DMSO溶液加到干净的荧光比色皿中，用微量进样器吸取V ul待测样品溶液，加入到此荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，将测得的荧光强度代入步骤(3)的线性回归方程，得到浓度c，待测样品C待测样＝2000uL×c×10-6/VuL,即可求得NaClO的浓度。
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次氯酸荧光探针的研究进展;王延宝等;《有机化学》;20160318;第36卷;第1539-1554页

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