CN103740360A - 荧光比率法检测次氯酸的荧光探针及其制备方法 - Google Patents

Abstract

荧光比率法检测次氯酸的荧光探针及其制备方法，涉及一种荧光检测方法。在容器中按质量比加入1份7-二乙胺基-4-甲基香豆素，以20～60份重蒸苯溶解；再加入1～3份Lawesson’s reagent，反应物在氮气氛下搅拌加热回流反应4～6h；冷却至室温，旋转蒸发抽干有机溶剂；再加入10～20份乙酸乙脂，搅拌5～10min使反应过量的Lawession试剂析出（白色固体），倾出溶液，减压除去溶剂；反复操作3次；产物在真空干燥器放置48h以上，得黄色纯固体产物荧光比率法检测次氯酸的荧光探针。

Description

荧光比率法检测次氯酸的荧光探针及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种荧光检测方法，尤其是涉及一种将硫代香豆素作为荧光探针应用于检测细胞内产生的活性氧物种次氯酸(HClO)的荧光比率法检测次氯酸的荧光探针及其制备方法。

背景技术

活性氧是生物体产生的一系列化学性质活泼、氧化能力强的含氧物质的总称。活性氧不仅包括一些自由基,如羟自由基(·OH)、超氧阴离子(O₂ ^-·)、过氧自由基(ROO·)等，也包括一些非自由基,如过氧化氢(H₂O₂)、单线态氧(¹O₂)和次氯酸(HOCl)等。

与其他的活性氧物种不同，HClO在人们的日常生活中随处可见。例如，次氯酸钠在160多年前便被人们用作消毒剂的主要有效成分。而生物体内源性HClO由髓过氧化物酶（MPO）介导产生，是一种重要的功能强大的氧化剂，在生理状态下发挥抗微生物效应，起到保护机体的作用。最近的研究表明，HClO还是天然的适应性免疫佐剂。然而，在特定条件下,假如MPO催化反应所产生的HClO过量,超过局部抗氧化剂的防御反应时,将导致氧化应激和氧化性组织损伤。已证实，过量HClO引起的氧化应激与白血病、肾炎、小血管炎、肿瘤及动脉粥样硬化等多种疾病相关，其中，HClO与动脉粥样硬化疾病的相关性是人们近年来的研究热点。

基于HClO在生理、病理过程的重要作用，发展高性能的HClO荧光探针，为进一步研究其在生物学过程中的分子和细胞事件提供探测工具，为疾病的发病机制、诊断及干预的研究提供可靠信息，具有重要意义。

目前，已报到的次氯酸荧光探针在应用中大都基于单波长发射的荧光信号变化（通常是增强）[J.Am.Chem.Soc.,2007,129,7313.；Org.Lett.,2009,11,(4),859.；Chem.Biol.,2007,14,1221.]，这些荧光探针在对细胞内目标物进行定性、定位以及示踪等方面很好地满足了人们的要求。然而，随着研究的深入，人们更希望进一步获得生物微环境系统中有关目标物的定量信息。

荧光强度是一个相对的度量单位，要获得关于被分析物的定量的数据，就需要对在实验过程中影响荧光强度的各种参素中除被分析物的浓度以外的其它参数进行校正。在桌面实验的荧光的测试中，上述问题可以简单地通过已计量好的标准样建立的标准工作曲线来进行校正而加以解决。但是对于单细胞内的微系统检测而言，通常的单发射波长探针却是无法实现的。例如，我们无法知道探针分子在不同细胞中的具体分布，又如，影响探针荧光强度的其它因素，如随着照射时间产生的光致变性和光漂白等，存在差异性。因而需要在每个测量点上均建立一个标准函数，而这是很难做到的。显然，通常的单波长发射的荧光探针仅依赖于一个信息通道内的荧光强度的变化，很难在微环境中实现准确的定量测量。

因此，如果我们要得到细胞微环境中被分析物的定量信息，就需要建立另外一套方法，也就是让每个探针在分子水平上建立内部的标尺，使之都具有自动校准功能。这意味着需要在原有的发射波长信号通道(λ1)以外，引入第二个发射波长信号通道(λ2),通过双波长荧光信号的比值的测量，则能够减少或消除若干因素的变化对荧光强度测量的影响，包括探针浓度、激发光的光路长度、激发强度和检测效率等，以及人工假象包括光漂白、探针渗漏、细胞厚度、探针在细胞内（区室化作用引起）或不同细胞群之间（负载效率差异造成）的不均匀分布等，从而获得准确定量的信息，该方法称为荧光比率法。

迄今为止，涉及HClO的荧光比率探针研究报道甚少[Chem.Eur.J.2009,15,2305-2309.]。

发明内容

本发明的目的在于针对已报道的细胞内次氯酸（HClO）荧光探针存在的不足，提供一种高灵敏、高选择性的荧光比率法检测次氯酸的荧光探针及其制备方法。

所述荧光比率法检测次氯酸的荧光探针的结构式为：

所述荧光比率法检测次氯酸的荧光探针的合成路线为：

所述荧光比率法检测次氯酸的荧光探针的制备方法，其具体步骤如下：

在容器中按质量比加入1份7-二乙胺基-4-甲基香豆素，以20～60份重蒸苯溶解；再加入1～3份Lawesson’s reagent，反应物在氮气氛下搅拌加热回流反应4～6h；冷却至室温，旋转蒸发抽干有机溶剂；再加入10～20份乙酸乙脂，搅拌5～10min使反应过量的Lawession试剂析出（白色固体），倾出溶液，减压除去溶剂；反复操作3次；产物在真空干燥器放置48h以上，得黄色纯固体产物荧光比率法检测次氯酸的荧光探针。

本发明所述荧光比率法检测次氯酸的荧光探针对次氯酸亦具有高灵敏的荧光响应特性，将其应用于细胞中次氯酸检测的荧光比率检测，选择性高。而荧光比率法检测次氯酸的荧光探针本身光稳定性强、无光照自氧化、对目标物响应迅速、与目标物结合的产物抗光漂白能力强，细胞渗透性好，无细胞毒性。检测目标物次氯酸灵敏度高，专一性强，细胞中其他活性氧均不干扰检测。

本发明是在中性条件下，探针与次氯酸作用后，发生脱硫作用，探针又转化为7-二乙胺基-4-甲基香豆素：

其中，探针最大发射波长位于533nm，而7-二乙胺基-4-甲基香豆素的最大发射波长位于467nm；故探针与次氯酸作用后，其荧光最大发射波长蓝移了66nm，体现出一种双波长荧光响应特性。

本发明基于次氯酸的脱硫作用，以硫原子替代7-二乙胺基-4-甲基香豆素结构中的羰基氧原子，合成的硫代香豆素分子探针成功地实现了对水中次氯酸的高灵敏荧光比率检测。

本发明提供一种基于基于次氯酸的脱硫作用机制而设计的一类对HClO具有比率光学响应的探针分子。不同于文献报道的是，该类荧光探针与HClO发生特异性作用后，能够同时产生两个不同荧光发射波长的转变，大大拓展了其潜在的使用范围。其性能在以下实施例和附图中给予详细说明。

附图说明

图1为pH7.4（Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲体系,DMSO/H₂O=1/99,v/v，以下均同)，探针浓度为10μmol/L条件下，不同浓度HClO存在时的吸收光谱变化（HClO浓度依次为：0,6,8,10,12,16,20,24μmol/L）。在图1中，横坐标为波长（nm），纵坐标为吸光度。

图2为pH7.4，探针浓度为10μmol/L条件下，不同浓度HClO存在时的荧光光谱变化（HClO浓度依次为：0,6,8,10,12,16,20,24μmol/L）。在图2中，横坐标为波长（nm），纵坐标为相对荧光强度；激发波长为402nm。

图3为pH7.4，探针浓度为10μmol/L条件下，不同种类的活性氧（浓度均为3.5μmol/L）分别单独存在下的荧光比率响应。在图3中，横坐标为活性氧物种，纵坐标为体系在467nm、533nm处的荧光强度的比率值（I₄₆₇/I₅₃₃）。

图4为pH7.4，浓度为10μmol/L的探针本身（曲线1）以及浓度为10.0μmol/LHClO与探针共存下（曲线1+NaClO）以激发光持续照射时各自的荧光强度变化情况。在图4中，横坐标为照射时间（s），纵坐标为相对荧光强度。

图5为pH7.4，探针浓度为10μmol/L条件下，在不同浓度范围的HClO存在下的荧光比率工作曲线图。在图5中，横坐标为次氯酸浓度（分别为μmol/L单位及0.01μmol/L单位），纵坐标为纵坐标为荧光比率值（I₄₆₇/I₅₃₃）。

图6为本发明所提供的次氯酸荧光比率探针分别在不同浓度存在下细胞存活百分率（活细胞数/总细胞数×100%，均为三个复孔平均值）。在图6中，横坐标为探针浓度（μmol/L，以负对数表示，-logC），其分布范围为0.5～50μmol/L，纵坐标为细胞存活数（%）。

图7为探针对人嗜中性粒细胞中HClO荧光成像图。图7A与图7B：MPO抑制前；图7C：图7A与图7B的叠加图。图7D与图7E：MPO抑制后。图7F：图7D与图7E的叠加图。在图7中，标尺为10μm。

图8为探针对人嗜中性粒细胞中HClO作用后，细胞悬浮液的荧光光谱图。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1：探针的制备方法：

于50mL圆底烧瓶中，加入7-二甲胺基4-甲基香豆素(0.5g，2.2mmol)，用20mL干燥苯将其溶解完全。然后加入Lawesson试剂(1.7g,4.4mmol)，搅拌，氮气氛下加热回流6h。冷却后减压除去溶剂，得黄色粘稠物。加入约10mL乙酸乙脂，搅拌5min使反应过量的Lawession试剂析出（白色固体），倾出溶液，减压除去溶剂。反复操作3次。产物在真空干燥器放置48h，得黄色纯固体产物（产率75%）。

产物的表征

ESI-MS:C₁₄H₁₇NOS,m/z:248.0(M+1)⁺。

核磁共振谱（¹H、¹³C NMR）表征数据如下：

¹H NMR(CDCl₃):δ1.202（t,J=6.8,6H,NCH₂CH₃），2.271(s,3H,CH₃),3.412(q,J=10Hz,4H,NCH₂CH₃),6.636(d,J=9.2Hz,1H),6.664(d,J=9.2Hz,1H,ArH),6.886(s,1H,ArH),7.421(d,J=9.2Hz,1H,ArH)。

¹³C NMR(CDCl₃):δ12.428,17.864,44.949,97.117,110.238,111.157,123.556,125.693,146.338,150.952,158.889,196.893。

本发明所述用于荧光比率检测细胞内次氯酸的荧光探针的化学性能说明如下。

一、在体外水溶液中荧光探针的化学性能测试：

（一）测试液的配制步骤：

探针以DMSO配制成1.0×10^-3mol/L储备液。

在10mL的刻度试管中，依次加入2.0mL浓度为0.2mol/L的pH7.40的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄冲液，一定量的标准HClO溶液（事先以分光光度法准确标定(参见文献：Dazda M.andMargerum D.W.Inorg.Chem.1994,33,118.），以3次蒸馏水稀释至刻度。摇匀。加入一定体积的1.0×10^-3mol/L探针储备液，再次摇匀。立即进行光谱测定。

如上操作，不加入HClO或其他活性氧之溶液，为空白试液的配制。

（二）水溶液中的荧光探针光谱特性及性能。以下结合图例说明。

由图1显示，探针自身位于468nm处有一最大吸收峰，NaClO的加入导致468nm处吸收峰下降，同时在383nm处出现一新的吸收峰；随着NaClO浓度的增大，468nm处的吸收峰不断减弱而383nm处的吸收峰持续增强，并在402nm处出现等吸收点。

由图2显示，探针自身位于533nm处有一荧光发射峰，NaClO的加入导致533nm处荧光峰下降，同时在467nm处出现一新的荧光发射峰；随着NaClO浓度的增大，533nm处的荧光峰不断减弱而467nm处的荧光峰持续增强，并在515nm处出现等发射点。

图3为pH7.4，探针浓度为1.0×10^-5mol/L条件下不同种类的活性氧分别单独存在下的在467nm、533nm处的荧光强度的比率值（I₄₆₇/I₅₃₃）。不同种类的活性氧物种分别是：过氧化氢（H₂O₂）,单态氧（¹O₂）,一氧化氮（NO）,超氧阴离子自由基（O₂ ^·-）,超氧亚硝基阴离子（ONOO^-）,羟基自由基（·OH），它们的浓度分别均为3.5μmol/L。实验表明，唯有NaClO与探针的反应导致体系的荧光强度的比率值（I₄₆₇/I₅₃₃）显著增强，这表明探针分子对NaClO具有高度的选择性荧光比率响应。

图4为pH7.4，考察了探针及其与NaClO的反应产物以各自的最大激发波长（468nm、383nm）光持续照射500s时间内各自在最大发射波长（533nm、467nm）处的荧光强度变化。由图4可见：探针及其反应产物光稳定性强，探针对目标物NaClO的荧光响应迅速，与NaClO的反应几乎在瞬间完成。以上现象表明，本发明提供的荧光探针具备如下优越的化学性能：光稳定性强、无光照自氧化；对目标物响应迅速；目标物结合的产物抗光漂白现象能力强。

图5为探针浓度为10μmol/L的pH7.4Na₂HPO₄-NaH₂PO₄的缓冲溶液中，体系的双波长荧光强度的比率值与NaClO浓度的相关性。如图5(a)所示，体系的荧光强度比率值与NaClO浓度在0.01～12μmol/L的范围内有良好的线性关系。图5(b)为工作曲线在1.0×10^-8～3.0×10^-7mol/L的NaClO浓度范围内的局部放大图。表明该传感体系具有高度的灵敏性和极宽的线性范围（多达三个数量级），显示优异的检测性能。

二，细胞实验

（一）探针的细胞毒性实验

以PBS稀释1.0×10^-3mol/L的探针储备液至不同浓度梯度。移取浓度6×10⁵个/mL的中性粒细胞液至96孔板，每孔180μL，共6组18孔。每组（n=3）分别移入上述不同浓度梯度的探针溶液各20μL，使探针终浓度分别为0.5，1.0，5.0，10.0，50.0，100μmol/L，同时以PBS作空白试验（n=3）。96孔板置于CO₂培养箱中37℃下孵育4h。取出后重悬细胞，加入20μL0.4%台盼蓝溶液。以40倍显微镜计算镜下各皿的细胞总数及染色细胞总数。细胞存活总数=细胞总数－染色细胞总数。细胞存活百分比（Viable Cells%）以下式计算，其中加药实验及空白实验均为3个复孔平均值。

Viable Cells%=加药细胞存活总数/空白试验细胞存活总数×100%

图6为本发明所提供的探针分别在不同浓度存在下细胞存活百分比（活细胞数/空白实验活细胞数×100%，均为3个复孔平均值）。由图6可见，在0.5～50μmol/L浓度范围的探针存在下，细胞的存活率均大于90%，表明探针无明显的细胞毒性。

（二）荧光探针检测细胞内HClO的性能测试

1.细胞的预处理步骤

细胞中HClO仅由髓过氧化物酶（MPO）催化细胞中过氧化氢（H₂O₂）氧化氯离子（Cl-）产生。MPO在血液中噬中性粒细胞中大量表达，因而本实验以人血噬中性粒细胞为细胞模型。

健康志愿者抗凝鲜血数毫升，以中性粒细胞分离液梯度密度法分离得噬中性粒细胞。

2.探针对细胞中HClO检测的荧光成像实验

实验步骤：

以RPMI1640培养液调整中性粒细胞浓度为6×10⁵个/mL；6个细胞培养皿各加入上述细胞液0.5mL后，分未清除、清除两组（n=3），清除组各皿分别加入溶解于PBS溶液的次氯酸清除剂对胺基苯甲酸溶液(PABA,100μmol/L)0.5mL,未清除组各皿加入0.5mLPBS。孵育3h后，以上6皿各加入以PBS稀释的探针溶液(2.0×10^-5mol/L)1.0mL，孵育20min。分别以372nm、490nm激发，10倍目镜、40倍物镜共聚焦荧光成像。

探针应用于人中性粒细胞中HClO的共聚焦荧光显微成像结果见图7。图7A、B分别为以372nm、490nm这两个波长的激发光同时激发未与HClO的清除剂PABA孵育的细胞的成像图，C为A、B的叠加图；图7D、E分别为以372nm、490nm这两个波长的激发光同时激发经与HClO的清除剂PABA孵育了的细胞的成像图，F为D、E的叠加图。

以490nm激发的细胞呈探针所发射之绿色荧光(A、D)，以372nm激发的细胞呈探针反应产物所发射之蓝色荧光(B、E)，而在叠加图C、F中的第三种颜色—蓝绿色为同一细胞中共存的探针及其反应产物所发射荧光的混合色。由图C、F可知，在HClO的特异性清除剂PABA存在下，与C比较，F中呈蓝、绿色荧光的细胞数之比显著减小，表明了探针对细胞环境中HClO的特异性荧光识别；由图B、E可见，即使在100μmol/L次氯酸清除剂PABA存在下，细胞仍然呈明亮的蓝色荧光，表明探针对细胞内源性HClO的高灵敏荧光响应。

将上述培养皿中的细胞重悬后转移至比色皿中进行光谱测定，见图8。如图8所示，在不存在次氯酸清除剂PABA下，细胞中的次氯酸含量较高，故体现的是短波的荧光发射；而在次氯酸清除剂PABA作用下下，细胞中的次氯酸含量有所减少，故短波的荧光发射也相应减小，而长波荧光发射相应增强。该图记录的是在有无HClO清除剂PABA存在下的两种细胞群的荧光行为的统计结果，可在另一侧面看出探针在细胞微环境中对HClO的选择性比率识别行为。

Claims (3)

1.荧光比率法检测次氯酸的荧光探针，其特征在于其结构式为：

2.如权利要求1所述荧光比率法检测次氯酸的荧光探针的合成路线如下：

3.如权利要求1所述荧光比率法检测次氯酸的荧光探针的制备方法，其特征在于具体步骤如下：

在容器中按质量比加入1份7-二乙胺基-4-甲基香豆素，以20～60份重蒸苯溶解；再加入1～3份Lawesson’s reagent，反应物在氮气氛下搅拌加热回流反应4～6h；冷却至室温，旋转蒸发抽干有机溶剂；再加入10～20份乙酸乙脂，搅拌5～10min使反应过量的Lawession试剂析出（白色固体），倾出溶液，减压除去溶剂；反复操作3次；产物在真空干燥器放置48h以上，得黄色纯固体产物荧光比率法检测次氯酸的荧光探针。

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