CN110305100A - 一种近红外聚硫化氢荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种近红外聚硫化氢荧光探针及其制备方法和应用，属于化学及分析检测领域。本发明提供的检测聚硫化氢的近红外荧光探针NIR‑CPS，具有较大的斯托克斯位移(100nm)，选择性好、灵敏度高、检测限低(18nM)及良好生物相容性的优点。在PBS缓冲液中，荧光强度与聚硫化氢浓度呈现良好的线性关系，说明探针适合定量检测聚硫化氢；探针NIR‑CPS还实现了MCF‑7细胞中聚硫化氢的荧光成像；更重要的是，探针NIR‑CPS也实现了活体水平由脂多糖诱导产生的内源性聚硫化氢的灵敏检测，且响应较快，荧光强度较稳定。
Description
技术领域
本发明属于化学及分析检测领域，具体涉及一种检测生物体内聚硫化氢的近红外荧光探针及其制备方法和用途。
背景技术
硫烷硫类化合物(sulfane sulfur)是指具有六价电子但不带电荷的S0，它主要包括过硫化物(persulfides，RSSH)、聚硫化氢(hydrogen polysulfides，H2Sn，n>1)、聚硫化物(polysulfides，RSSnSR)及蛋白结合的元素硫(S8)等。其中，硫化氢(Hydrogen sulfide，H2S)是人体内重要的气体信号分子，它可以影响神经递质的传递，调节血管舒张、胰岛素分泌、促进结肠蠕动并具有抗炎作用等；对心脏和神经具有保护作用，是有效的神经调节物质。硫化氢的异常生成与代谢与多种疾病密切相关，如阿尔茨海默症、帕金森症、糖尿病及肿瘤等疾病。尽管硫化氢的研究报道众多，但其分子机制尚未完全阐明。
聚硫化氢(hydrogen polysulfides，H2Sn)是硫化氢的直接氧化形式。在生物体内，H2S与H2Sn可以共存，并可以共同调节硫(S)的氧化还原平衡，二者在生物活性和信号通路方面存在着串联关系(cross talk)。聚硫化氢具有促进细胞信号转导、细胞保护、抗氧化、抗炎、抗癌的作用。有研究表明，在硫化氢相关的生理过程中，聚硫化氢发挥了重要作用，参与了硫巯基化修饰蛋白的过程，可能是(至少部分是)实际的信号转导分子。因此，实现对于聚硫化氢的准确检测，是阐明聚硫化氢如何调控与硫化氢相关的生理作用，硫化氢与聚硫化氢之间的串联机制的重要前提。
荧光探针(fluorescent probe)在化学传感、光学材料及生物检测和识别等领域得到了广泛的应用。荧光探针成像技术现已成为高空间分辨率、实时、无创的显示生物体内活性物质的有效检测工具。荧光探针主要分为UV/可见光区荧光探针、近红外荧光探针。UV/可见光容易被生物分子(如水和血红蛋白)吸收，易分散，因而它的组织穿透能力有限，并且该区域组织也有较强的自发荧光，这使得检测的生物背景荧光较高。因此，UV/可见光区荧光探针不适用于深层组织、器官和活体水平的荧光成像。
近红外(Near-infrared,NIR)波长范围在650-900nm。与UV/可见光荧光探针相比较，近红外荧光探针在生物成像方面具有诸多优势:(1)活体组织在此区间内具有较低的组织吸收系数，从而使其具有较强的穿透性，有利于深层组织成像；(2)组织在此区间内自发荧光较少，避免了生物背景对荧光信号的干扰；(3)大多数生物体具有吸收近红外光的能力，因此它对组织、细胞和活体动物的光损害较小。因此，近红外荧光探针具有信噪比高、样本穿透性强和成像分辨率高的优势，更加适用于活体成像。
目前，聚硫化氢检测领域更加迫切需要具有如下特性的探针：(1)在复杂的生物体中存在各种活性硫化物(RSS)，比如硫化氢、谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)以及无机硫化物等，都会干扰检测，给检测带来困难，因此我们需要提高探针的选择性，以保证探针可在复杂生物样本中能够快速、精准的识别聚硫化氢。(2)虽然目前检测聚硫化氢的荧光探针已有着较高的灵敏度，但在生理条件下聚硫化氢的含量很低，并且是动态变化的。因此，迫切需要进一步提高探针的检测灵敏度。(3)近红外荧光探针具有较高的组织穿透能力，适用于活体小鼠体内的聚硫化氢荧光成像，但目前仍然缺少检测活体水平内源性聚硫化氢的荧光探针。(4)目前，已报道的聚硫化氢荧光探针的斯托克斯位移大部分较小，这容易导致荧光自淬灭，以及由激发散射效应引起的检测误差。而拥有较大斯托克斯位移的探针，因其激发光谱与发生光谱分离度较好，能有效地减少由自发吸收和自发荧光引起的检测误差。因此，迫切需要开发灵敏度高、具有较大斯托克斯位移的近红外聚硫化氢荧光探针。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种近红外荧光探针，该探针能够定量的检测聚硫化氢，检测限可达18nM，表明该探针具有较高的检测灵敏度和选择性；该探针的斯托克斯位移可达100nm，可避免因斯托克斯位移小造成的荧光淬灭和灵敏度降低的问题。
本发明的另一目的是提供一种上述近红外荧光探针的制备方法。
本发明的又一发明目的是提供上述近红外荧光探针在聚硫化氢检测中的应用。
本发明的技术方案如下：
一种近红外荧光探针，其探针的结构式如下所示：
本发明近红外聚硫化氢荧光探针NIR-CPS的设计如下：(1)荧光母核：以具有大斯托克斯位移的近红外型长沙类似物(NIR-COH)为荧光母体。目前，已报道的聚硫化氢荧光探针的斯托克斯位移较小。斯托克斯位移较小，不仅会引起荧光淬灭，而且激发光和散射光会严重影响检测的准确性。而本发明设计的探针NIR-CPS斯托克斯位移可达100nm，有效的避免了因斯托克斯位移小造成的荧光淬灭和灵敏度降低的问题。(2)识别基团：以2-氟-5-硝基苯甲酸酯为聚硫化氢识别基团。由于2-氟-5硝基苯甲酸酯可与H2Sn发生反应，而其他生物硫醇只能进行一次亲核取代反应，无法发生分子内环化反应以释放出荧光母核，因此2-氟-5-硝基苯甲酸酯对H2Sn具有较好的选择性。
荧光探针NIR-CPS识别聚硫化氢的原理：由于H2Sn具有亲核性和亲电性，因此H2Sn会与探针NIR-CPS形成过硫化物中间体，随后裸露的巯基进攻羰基，发生亲核反应，进行分子内环化，从而释放出荧光母核，具体如下所示：
为了验证探针NIR-CPS与聚硫化氢的反应原理：将NIR-CPS与四硫化二钠在37℃PBS缓冲溶液中孵育20min，发现NIR-CPS与Na2S4的反应产生了红色荧光物质，经1H NMR，HRMS证实红色荧光物质是荧光母核NIR-COH。
识别聚硫化氢的荧光探针NIR-CPS的合成路线如下：
进一步识别聚硫化氢的荧光探针NIR-CPS，包括以下步骤：
第一步：在浓硫酸和高氯酸存在的条件下，4-二乙氨基酮酸和环己酮进行反应，制备化合物Ⅰ；
第二步：2-氟-5-硝基苯甲酸与二氯亚砜进行反应，制备2-氟-5-硝基苯甲酰氯；
第三步：在三乙胺存在的条件下，2-氟-5-硝基苯甲酰氯与对羟基苯甲醛进行反应，制备化合物Ⅱ；
第四步：在哌啶存在的条件下，化合物Ⅰ与化合物Ⅱ进行反应，制备化合物NIR-CPS。
进一步识别聚硫化氢的荧光探针NIR-CPS更进一步详细的制备方法如下：以4-二乙氨基酮酸为原料，在浓硫酸和高氯酸作用下，与环己酮反应得到化合物Ⅰ。2-氟-5-硝基苯甲酸与二氯亚砜进行反应，制备2-氟-5-硝基苯甲酰氯，在三乙胺存在的条件下，再与对羟基苯甲醛进行反应，制备化合物Ⅱ。在哌啶存在的条件下，化合物Ⅰ与化合物Ⅱ进行反应，制备化合物NIR-CPS，合成路线如下：
在一种优选方案中，在第一步中，4-二乙氨基酮酸与环己酮的摩尔比为1:2～6，优选为1:2.5～3.5，在不影响本发明效果的情况下，可以进一步优选为1:3.1。
在一种更优选方案中，4-二乙氨基酮酸与浓硫酸的摩尔比为1:50～100，优选为1:70～85，例如1:79。
进一步地，4-二乙氨基酮酸与高氯酸的摩尔比为1:4～12，优选为1:6～8，在不影响本发明效果的情况下，可以进一步优选为1:6.8。
进一步地，反应的温度为70～120℃；可以再优选为80～100℃，例如90℃。
进一步地，反应时间为1～10h，可以再优选为1～6h，例如2h。
在第二步中，本发明采用2-氟-5-硝基苯甲酸与二氯亚砜进行反应，制备2-氟-5-硝基苯甲酰氯，在一种优选方案中，2-氟-5-硝基苯甲酸与二氯亚砜的质量体积比为1:30～60g/ml，优选为1:35～45g/ml，更优选为1:40g/ml。
进一步地，反应的温度为70～100℃；可以再优选为70～90℃，例如80℃。
进一步地，反应时间为3～9h，可以再优选为4～7h，例如5h。
在第三步中，在三乙胺存在的条件下，本发明采用2-氟-5-硝基苯甲酰氯与对羟基苯甲醛进行反应，制备化合物Ⅱ；在一种优选方案中，对羟基苯甲醛与2-氟-5-硝基苯甲酰氯的摩尔比为1:0.8～2.5，优选为1:1.0～2.0，在不影响本发明效果的情况下，可以进一步优选为1:1.2。
进一步地，对羟基苯甲醛与三乙胺的摩尔比为1:0.8～2.5，优选为1:1.0～2.0，例如1:1.2。
在一种更优选方案中，对羟基苯甲醛、三乙胺与2-氟-5-硝基苯甲酰氯在冰浴的条件下反应20～60min(例如30min)后，再升温至室温反应0.5～2h(例如1h)，制备化合物Ⅱ。
本发明采用化合物Ⅰ与化合物Ⅱ进行反应，制备化合物NIR-CPS。
在一种优选方案中，化合物Ⅰ与化合物Ⅱ的摩尔比为1:1.5～3.0，优选为1:1.5～2.5，更优选为1:1.9。
进一步地，化合物Ⅰ与哌啶的摩尔比为1:0.1～0.2，优选为1:0.1～0.16，更优选为1:0.12。
本发明制备的近红外荧光探针可以用于定量检测聚硫化氢，特别用于细胞和动物活体水平的聚硫化氢检测。
采用本发明的技术方案，优势如下:
本发明提供的识别聚硫化氢的荧光探针NIR-CPS，具有较大的斯托克斯位移(100nm)，选择性好、灵敏度高、检测限低(18nM)及良好生物相容性的优点。
在PBS缓冲液中，荧光强度与聚硫化氢浓度呈现良好的线性关系，说明探针适合定量检测聚硫化氢；探针NIR-CPS还实现了MCF-7细胞中聚硫化氢的荧光成像；更重要的是，探针NIR-CPS也实现了活体水平由脂多糖诱导产生的内源性聚硫化氢的灵敏检测，且响应较快，荧光强度较稳定。
本发明制备的探针NIR-CPS是可视化和定量检测细胞、活体中聚硫化氢水平的有效工具，进一步为H2Sn在生物体内的生理病理机制以及信号转导途径提供一种可视化、无创的检测方法，对于揭示人体内聚硫化氢的生理病理机制具有重要意义。
附图说明
图1化合物Ⅱ的1H NMR图谱；
图2化合物Ⅱ的13C NMR图谱；
图3化合物NIR-CPS的1H NMR图谱；
图4是化合物NIR-CPS的13C NMR图谱；
图5化合物NIR-CPS的高分辨质谱；
图6化合物NIR-COH的1H NMR图谱；
图7化合物NIR-COH的高分辨质谱；
图8化合物NIR-CPS与Na2S4反应产物的1H NMR图谱；
图9化合物NIR-CPS与Na2S4反应产物的高分辨质谱；
图10荧光探针NIR-CPS与Na2S4反应的荧光光谱与紫外光谱；(A)NIR-COH,NIR-CPS+Na2S4和NIR-CPS在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4，1％DMSO,包含1mM CTAB)中的荧光图谱；(B)NIR-COH,NIR-CPS+Na2S4和NIR-CPS在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4,1％DMSO,包含1mM CTAB)中的紫外吸收光谱；
图11荧光探针NIR-CPS与Na2S4反应的荧光响应；NIR-CPS(10μM)与不同浓度Na2S4(0,0.5,1,2,4,6,8,10,15,20,25,30,35,40,60,80,100,200and 300μM)在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4,1％DMSO，包含1mM CTAB)中37℃孵育30min的荧光图谱；数据以mean±SD表示(n＝3)；
图12荧光探针NIR-CPS与不同浓度Na2S4反应的荧光强度变化；(A)NIR-CPS(10μM)与不同浓度Na2S4(0-300μM)在PBS缓冲液孵育后，在670nm处的荧光强度变化；(B)荧光强度与不同浓度Sec(0-20μM)的线性关系；数据以mean±SD表示(n＝3)；
图13荧光探针NIR-CPS与Na2S4反应的时间；(A)NIR-CPS(10μM)与Na2S4(100μM)在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4,1％DMSO，包含1mM CTAB)中37℃孵育不同时间(0,1,2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,30and 60min)的荧光图谱；(B)NIR-CPS(10μM)与Na2S4(100μM)在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4,1％DMSO，包含1mM CTAB)中37℃孵育(0,1,2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,30and 60min)的荧光强度与时间变化的关系；数据以mean±SD表示(n＝3)；
图14pH对荧光探针NIR-CPS与Na2S4反应的影响；(A)NIR-CPS(10μM)与Na2S4(100μM)在不同pH缓冲液(20mM,pH＝4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.4,7.5,8.0,8.5,9.0,1％DMSO，包含1mM CTAB)中37℃孵育30min的荧光图谱；(B)NIR-CPS(10μM)与Na2S4(100μM)在不同pH缓冲液(20mM,pH＝4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.4,7.5,8.0,8.5and 9.0,1％DMSO，包含1mM CTAB)中37℃孵育30min的荧光强度与pH变化的关系；数据以mean±SD表示(n＝3)；
图15荧光探针NIR-CPS对聚硫化氢的选择性；(A)NIR-CPS(10μM)与Na2S4(100μM)、Na2S2(100μM)和各种活性硫化物(Na2S 20μM；1mM Cys；1mM GSH；1mM CysSSCys；100μM Hcy；10mM GSH；1mM GSSG；500μM S8；500μM Na2S2O3；500μM Na2SO3；500μM Na2SO4；1mM Cys-polysulfide；100μM CH3SSSCH3)在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4,1％DMSO，包含1mM CTAB)中37℃孵育30min的荧光图谱；(B)NIR-CPS(10μM)与Na2S4(100μM)、Na2S2(100μM)和各种活性硫化物在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4,1％DMSO，包含1mM CTAB)中37℃孵育30min的荧光响应.图中的短柱代表加入硫化物，但没有孵育Sec(100μM)产生的荧光强度，图中的长柱代表共同孵育硫化物与Sec(100μM)产生的荧光强度.1.blank+Na2S4(100μM)；2.blank+Na2S2(100μM)；3.Na2S(20μM)+Na2S4(100μM)；4.Cys(1mM)+Na2S4(100μM)；5.GSH(1mM)+Na2S4(100μM)；6.CysSSCys(1mM)+Na2S4(100μM)；7.Hcy(100μM)+Na2S4(100μM)；8.GSH(10mM)+Na2S4(100μM)；9.GSSG(1mM)+Na2S4(100μM)；10.S8(500μM)+Na2S4(100μM)；11.Na2S2O3(500μM)+Na2S4(100μM)；12.Na2SO3(500μM)+Na2S4(100μM)；13.Na2SO4(500μM)+Na2S4(100μM)；14.Cys-polysulfide(1mM)+Na2S4(100μM)；15.CH3SSSCH3(100μM)+Na2S4(100μM)；数据以mean±SD表示(n＝3)；
图16荧光探针NIR-CPS对聚硫化氢的选择性；(A)NIR-CPS(10μM)与Na2S4(100μM)、Na2S2(100μM)和各种活性氧(H2O2,ClO-,tBuOOH,·OH,1O2,O2-,100μM)，各种活性氮种类(NO2 -,ONOO-,NO,NO3 -,100μM)在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4,1％DMSO，包含1mM CTAB)中37℃孵育30min的荧光图谱；(B)NIR-CPS(10μM)与Na2S4(100μM)、Na2S2(100μM)和各种活性氧和氮种类在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4,1％DMSO，包含1mM CTAB)中37℃孵育30min的荧光响应；图中的短柱代表加入活性氧，但没有孵育Sec(100μM)产生的荧光强度，图中的长柱代表共同孵育活性氧与Sec(100μM)产生的荧光强度.1.blank+Na2S4(100μM)；2.blank+Na2S2(100μM)；3.H2O2(100μM)+Na2S4(100μM)；4.OCl-(100μM)+Na2S4(100μM)；5.tBuOOH(100μM)+Na2S4(100μM)；6.·OH(100μM)+Na2S4(100μM)；7.1O2(100μM)+Na2S4(100μM)；8.O2-(100μM)+Na2S4(100μM)；9.NO2 -(100μM)+Na2S4(100μM)；10.ONOO-(100μM)+Na2S4(100μM)；11NO(100μM)+Na2S4(100μM)；12.NO3 -(100μM)+Na2S4(100μM)；数据以mean±SD表示(n＝3)；
图17荧光探针NIR-CPS对聚硫化氢的选择性；(A)NIR-CPS(10μM)与Na2S4(100μM)、Na2S2(100μM)和各种无机盐离子(Na+,K+,Cu2+,Ca2+,Mg2+,Zn2+,Fe3+,Fe2+,CO3 2-,HCO3 -,Cl-,Br-,I-,HPO4 2-,H2PO4 -,1mM)在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4,1％DMSO，包含1mM CTAB)中37℃孵育30min的荧光图谱；(B)NIR-CPS(10μM)与Na2S4(100μM)、Na2S2(100μM)和各种无机盐离子在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4,1％DMSO，包含1mM CTAB)中37℃孵育30min的荧光响应；图中的短柱代表加入无机盐离子活性氧，但没有孵育Sec(100μM)产生的荧光强度，图中的长柱代表共同孵育无机盐离子与Sec(100μM)产生的荧光强度.1.blank+Na2S4(100μM)；2.blank+Na2S4(100μM)；3.Na+(1mM)+Na2S4(100μM)；4.K+(1mM)+Na2S4(100μM)；5.Cu2+(1mM)+Na2S4(100μM)；6.Ca2+(1mM)+Na2S4(100μM)；7.Mg2+(1mM)+Na2S4(100μM)；8.Zn2+(1mM)+Na2S4(100μM)；9.Fe3+(1mM)+Na2S4(100μM)；10.Fe2+(1mM)+Na2S4(100μM)；11.CO3 2-(1mM)+Na2S4(100μM)；12.HCO3 -(1mM)+Na2S4(100μM)；13.Cl-(1mM)+Na2S4(100μM)；14.Br-(1mM)+Na2S4(100μM)；15.I-(1mM)+Na2S4(100μM)；16.HPO4 2-(1mM)+Na2S4(100μM)；17.H2PO4 -(1mM)+Na2S4(100μM)；数据以mean±SD表示(n＝3)；
图18荧光探针NIR-CPS对细胞存活率的影响；MCF-7细胞与不同浓度NIR-CPS(0μM,5μM,10μM,20μM,50μM,100μM)孵育24h细胞的存活率；数据以mean±SD表示(n＝3)；
图19荧光探针NIR-CPS检测聚硫化氢的细胞荧光成像；MCF-7细胞未经任何处理(A)；细胞与NIR-CPS(10μM)在37℃孵育20min(B)；细胞先与N-ethylmaleimide(NMM,1mM)孵育1h，再与探针NIR-CPS(10μM)孵育20min(C)；细胞与探针NIR-CPS(10μM)孵育20min，然后继续孵育Na2S4(20μM)20min(D)；细胞与探针NIR-CPS(10μM)孵育20min，然后继续孵育Na2S4(10μM)20min(E)；上述各组细胞的平均荧光强度(F)；数据以mean±SD表示(n＝3)；Scalebars＝10μm.#p<0.001vs.(A)column.
图20图18中细胞明场图；其中，图19中A,B,C,D和E分别对应图18中A,B,C,D和E；
图21荧光探针NIR-CPS检测内源性聚硫化氢的细胞荧光成像；MCF-7细胞与LPS(1μg/mL)孵育16h，然后继续与探针NIR-CPS(10μM)20min(A)；细胞与DL-propargylglycine(PAG,200μM)孵育30min，再与LPS(1μg/mL)孵育16h，然后再加入探针NIR-CPS(10μM)孵育20min(B)；上述各组细胞的平均荧光强度(C).Scale bars＝10μm.数据以mean±SD表示(n＝3).#p<0.001vs.(B)column；
图22图20中细胞的明场成像；其中，图21中A和B分别对应图20中A和B；
图23荧光探针NIR-CPS检测小鼠体内聚硫化氢；小鼠腹腔注射探针NIR-CPS作为对照组(2mM,100μL DMSO)(A)；小鼠腹腔注射探针NIR-CPS(2mM,100μL DMSO)15min，然后腹腔注射0.2equiv.Na2S4(0.4mM,100μL saline)(B)；小鼠腹腔注射探针NIR-CPS(2mM,100μLDMSO)15min，然后腹腔注射2equiv.Na2S4(4mM,100μL saline)(C).小鼠腹腔注射探针NIR-CPS(2mM,100μL DMSO)15min，然后腹腔注射4equiv.Na2S4(8mM,100μL saline)(D).小鼠腹腔注射LPS(10μg/mL,100μL in 1：9DMSO/saline v/v)for 24h，然后腹腔NIR-CPS(2mM,100μL DMSO)(E).小鼠腹腔注射DL-propargylglycine(2mM,100μL in saline)30min后，然后注射LPS(10μg/mL,100μL in1：9DMSO/saline v/v)24h，然后腹腔NIR-CPS(2mM,100μLDMSO)(F).定量表示上述各组小鼠腹部的荧光强度(G).数据以mean±SD表示(n＝3).#P<0.001vs.Group A；图中，右上方colour bar的具体数值从上到下依次是：800、735、670、540、475、410、345、280、215、150。
图24内源性聚硫化氢的荧光成像随时间变化情况；小鼠腹腔注射LPS(10μg/mL,100μL in saline)24h后，然后腹腔注射探针NIR-CPS(2mM,100μL DMSO)，之后在不同时间成像(0min,1min,5min,10min,15min,20min,25min,30min,35min,40min).定量表示上述小鼠腹部的荧光强度.数据以mean±SD表示(n＝3)，图中，右上方colour bar的具体数值从上到下依次是：800、735、670、540、475、410、345、280、215、150。
具体实施方式
通过以下实施例并结合附图对本发明的近红外聚硫化氢荧光探针作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。
一、实施方法
1、材料与仪器
LPS(lipopolysaccharide from Escherichia coli 026B6)；MTT细胞增殖/毒性检测试剂盒(Biosharp公司)；Gibco DMEM高糖培养基(美国Life Technologies公司)；Gibco胎牛血清(美国Life Technologies公司)；青霉素(100μg/mL)和链霉素(100μg/mL)(美国Life Technologies公司)；薄层色谱使用GF254硅胶板(250μm)，柱层析使用300-400目的硅胶(青岛海洋化工)；其余试剂都是国产分析纯。
细胞：
种属和品系：人乳腺癌MCF-7细胞株。
实验动物：
种属和品系：健康雄性昆明小鼠，体重20-25g。来源：徐州医科大学实验动物中心。
仪器：
ECZ-400S核磁共振仪(日本JEOL公司)；FV1000激光共聚焦扫描显微镜(Olympus，日本)；F4600荧光分光光度计(Hitachi，日本)；LB983NightOWL II小动物活体成像仪(德国BERTHOLD公司)；YRT-3型熔点测定仪(天津市天大天发科技有限公司)；ABI Q-star Elite高分辨质谱仪(美国应用生物系统公司)；二氧化碳培养箱(美国Thermo FisherScientific公司)；酶标仪(Clinibio公司Thermo Fisher Scientific,Finland)；自动双纯水蒸馏器(美国Millipore公司)；超净工作台(苏州净化设备有限公司)；PB-21型pH计(德国Sartorius公司)；PharmaSpec UV-2401PC紫外分光光度计(日本Shimadzu公司)；SHB-IIIS循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；RTC basic磁力搅拌器(德国IKA公司)。
2、溶液的配制
探针溶液的配制：NIR-CPS(6.47mg，0.01mmol)溶解于二甲亚砜(10mL)中，得到1mM的探针溶液。探针溶液需要低温避光保存。
Na2S4储备液的配制：向含1mM十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，Hexadecyl trimethylammonium Bromide)(3.64mg，0.01mmol)的20mM PBS(10mL，pH＝7.4)溶液中通氮气15min。在氮气条件下，将Na2S4(17.42mg，0.1mmol)溶于上述溶液中，得到10mM的Na2S4储备液，将其稀释成1.0mM-100μM的溶液备用。Na2S4储备液需要现用现配。
Na2S2储备液的配制(Na2S2作为H2S2的来源，按文献制备方法：InorganicChemistry,2003,42,12,3712-3714)：向含1mM CTAB(3.64mg，0.01mmol)的20mM PBS(10mL，pH＝7.4)溶液中通氮气15min。在氮气条件下，将Na2S2(11.01mg，0.1mmol)溶于上述溶液中，得到10mM Na2S2的储备液，将其稀释成1.0mM-100μM的溶液备用。Na2S2储备液需要现用现配。
Na2S(作为H2S的来源)储备液的配制：向含5mg EDTA的蒸馏水(10mL，pH＝7.4)中通氮气15min。在氮气条件下，将Na2S·9H2O(24.0mg，0.1mmol)溶于溶液中，得到10mM Na2S储备液，将其稀释成1.0mM-100μM的溶液备用。Na2S·9H2O储备液需要现用现配。
L-半胱氨酸(L-Cys)储备液的配制：Cys(12.1mg，0.1mmol)溶于含1mM CTAB(3.64mg，0.01mmol)的20mM PBS(10mL，pH＝7.4)溶液(10mL)中得到10.0mM的储备液，将储备液稀释成1.0mM和100μM的溶液备用。
高半胱氨酸(Hcy)储备液的配制：Hcy(13.50mg，0.1mmol)溶于含1mM CTAB(3.64mg，0.01mmol)的20mM PBS(10mL，pH＝7.4)中得到10.0mM的储备液，将储备液稀释成1.0mM和100μM的溶液备用。
谷胱甘肽(GSH)储备液的配制：GSH(30.70mg，0.1mmol)溶于含1mM CTAB(3.64mg，0.01mmol)的10mM PBS(10mL，pH＝7.4)中得到10.0mM储备液，将储备液稀释成1.0mM的溶液备用。
Cys-polysulfide,GSSG,CysSSCys,CH3SSSCH3,S8,Na2S2O3,NaHSO3,Na2SO3,Na2SO4储备液配制方法同上。Cys-polysulfide按文献方法配制。
H2O2,ClO-,tBuOOH,.OH,1O2,O2-,NO2 -,ONOO-,NO,NO3 -,Na+,K+,Cu2+,Ca2+,Mg2+,Zn2+,Fe3 +,Fe2+,CO3 2-,HCO3 -,Cl-,Br-,I-,HPO4 2-,H2PO4 -都以双蒸水做溶剂。.OH通过FeII(EDTA)与H2O2之间的Fenton反应获得。NO从3-(氨基丙基)-1-3-羟基-3-异丙基-2-氧代-1-三氮烯(NOC-5,50μmol/ml)产生。NO2 -由NaNO2产生。
3、探针NIR-CPS识别H2Sn的原理
NIR-CPS(64.70mg，0.10mmol)溶于DMSO(15mL)中，加入溶有Na2S4(348mg，2.0mmol)的PBS缓冲液(30mL，20.0mM，pH＝7.4)，在37℃反应20min。乙酸乙酯(3×10mL)萃取，减压浓缩，将产物进行提取分离，通过1H NMR和HRMS确认反应产物，从而确认探针NIR-CPS与H2Sn的反应原理。
4、荧光光谱的测定
将探针NIR-CPS用溶剂(DMSO)溶解，加入石英比色皿中。将探针用20.0mM的磷酸盐缓冲液进行稀释，加入四硫化二钠或二硫化二钠(以Na2S4或Na2S2作为H2Sn来源)，孵育，测定其荧光强度。每组数据至少平行三次，结果以mean±SD表示。
测试条件：荧光测量实验均在室温下用日立F4600荧光分光光度计测定。激发波长为570nm，激发狭缝宽度10nm，发射狭缝宽度10nm，扫描速度1200nm/min，发射光谱范围在600-850nm。光电倍增管的电压设为1000V。
5、检测限的测定
探针NIR-CPS自身的荧光强度测定10次，计算10次测定的荧光强度的标准偏差，再将探针与Na2S4(0-20μM)反应，得到Na2S4浓度与荧光强度的线性方程。检测限的计算公式为：3σ/k。k代表荧光强度与Na2S4浓度线性方程的斜率，σ代表空白样的标准偏差。
6、紫外光谱的测定
UV吸收光谱是使用Shimadzu PharmaSpec UV-2401PC紫外-可见分光光度计测定的。探针加入石英比色皿中，加入10mM磷酸盐缓冲液将其稀释后，加入Na2S4孵育，测定其吸收光谱，每个数据至少平行测定3次，结果以mean±SD表示。
7、细胞毒性的测定
探针及探针与Na2S4反应后的产物对细胞生长的抑制作用是通过MTT法测定的。将细胞接种于96孔板上，密度为50,000细胞/孔，细胞在5％CO2，37℃条件下培养。细胞与不同浓度的化合物孵育24h。以培养基中没有添加化合物的细胞作为对照。24h后，向每个孔中加入20μL的MTT染料(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazoliumbromide,5mg/mL in phosphate buffered saline)，继续37℃孵育4h。接着将剩余的MTT溶液除去，每孔加入150μL的DMSO溶解甲瓒晶体，用摇床震荡10min后，用酶标仪(ELX808IU,Bio-tek Instruments Inc,USA)测定570nm处的吸光度。每个样本至少有三个复孔，至少测定三次。采用Huber and Koella方法计算IC50值。
8、细胞水平荧光成像
将MCF-7细胞(来自中国科学院细胞库)接种于细胞培养液(DMEM，含有10％的小牛血清、青霉素/链霉素(100μg/mL)，于37℃、5％CO2培养箱中培养。细胞生长到对数生长期时，用胰酶消化，制成细胞悬液接种到共聚焦皿中。36h后，细胞贴壁张开。
对照组：将探针NIR-CPS(终浓度10μM，in 10μL DMSO)与MCF-7孵育20min。外源性H2Sn成像组：将探针NIR-CPS(终浓度10μM，in 10μL DMSO)与MCF-7细胞孵育20min，然后加入不同浓度Na2S4(10μM，20μM，in 10μL生理盐水)孵育20min。内源性H2Sn成像组：将MCF-7细胞与脂多糖(LPS，1μg/mL，in 10μL生理盐水)孵育16h后，再与探针NIR-CPS(10μM，in 10μLDMSO)孵育20min。抑制剂组：将MCF-7细胞与NMM(1mM，in 10μL生理盐水)孵育1h后，再与探针NIR-CPS(10μM，in 10μL DMSO)孵育20min。将MCF-7细胞与PAG(200μM，in 10μL生理盐水)孵育30min后，再与LPS(1μg/mL，in 10μL生理盐水)孵育16h，最后与探针NIR-CPS(10μM，in10μL DMSO)孵育20min。成像前，缓和的用PBS缓冲液冲洗三次。采用Olympus FV1000激光共聚焦显微镜(60×油镜)进行拍照。激发波长570nm，发射波长670nm。采用Olympus软件(FV10-ASW)进行分析。所有数据均以mean±SD表示(n＝3)。
9、活体水平荧光成像
实验选用雄性昆明小鼠，体重20-25g。小鼠腹腔注射10％水合氯醛(350mg/kg，i.p.)进行麻醉。清理腹部皮毛，随机进行分组。小鼠腹腔注射探针NIR-CPS(2mM，100μLDMSO)作为对照组。外源性H2Sn成像组：腹腔注射探针NIR-CPS(2mM，100μL DMSO)，15min后，腹腔分别注射0.2、2、4当量的Na2S4(0.4mM，100μL生理盐水；4mM,100μL生理盐水；8mM,100μL生理盐水)。内源性H2Sn成像：腹腔注射LPS(10μg/mL，100μL in 1:9DMSO–生理盐水)，24h后，腹腔注射探针NIR-CPS(2mM，100μL DMSO)。抑制剂组：腹腔注射DL-炔丙基甘氨酸(2mM，100μL生理盐水)，30min后，腹腔注射LPS(10μg/mL，100μL in 1:9DMSO–生理盐水)，24h后，再腹腔注射探针(2mM，100μL DMSO)。采用Night OWL IILB 983小动物活体成像仪进行成像。成像条件：激发485nm，发射680nm。采用indiGO软件进行图像和数据分析。所有数据均以mean±SD表示(n＝3)。
10、数据处理
数据以均数±标准差(Mean±SD)表示，使用SPSS 16.0软件进行统计分析。多组间比较采用完全随机设计的单因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05表示差异有统计学意义。
二、实施例
实施例1
化合物Ⅰ的制备：冰浴条件下，将环己酮(508μL，4.92mmol)缓慢滴加到浓硫酸(6.7mL，125.05mmol)中，分批加入4-二乙氨基酮酸(0.5g，1.59mmol)。混合溶液在90℃下反应2h，冷却至室温，倒入冰水中。缓慢加入高氯酸(620μL，10.86mmol)，析出红色固体，抽滤，水洗涤(3×20mL)，得到化合物369.81mg，产率为48.9％。TLC(silica，CH2Cl2:CH3OH，20:1v/v)：Rf＝0.4。
实施例2
2-氟-5-硝基苯甲酰氯的制备：将2-氟-5-硝基苯甲酸(0.5g，2.70mmol)溶于二氯亚砜(20mL)中，80℃回流反应5h。减压蒸馏得到固体0.49mg，产率90.7％。TLC(silica，CH2Cl2:CH3OH，20:1v/v)：Rf＝0.5。
实施例3
化合物Ⅱ的制备：将对羟基苯甲醛(0.2g，1.64mmol)溶于干燥的二氯甲烷(20mL)中，加入三乙胺(274.1μL，1.97mmol)搅拌至溶液澄清。将2-氟-5-硝基苯甲酰氯(0.4g，1.97mmol)溶于干燥的二氯甲烷(10mL)中，冰浴条件下，逐滴滴加至上述溶液中，反应30min后升至室温反应1h。反应完毕后，减压浓缩，去除二氯甲烷，残留物用水洗涤(30mL)，二氯甲烷萃取(3×20mL)，得到粗品。粗品用乙酸乙酯(20mL)进行重结晶，得到片状晶体0.36g，产率75.1％。TLC(silica，PE:EA，5:1v/v)：Rf＝0.5。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ10.04(s,1H),9.01(dd,J＝6.0,J＝2.8Hz,1H),8.49-8.53(m,1H),7.98-8.01(m,2H),7.40–7.46(m,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)：δ190.82,166.90,164.12,160.05,154.71,134.68,131.47,130.72,130.59,128.70,128.68,122.37,119.06,118.96.
实施例4
荧光探针NIR-CPS的制备：将化合物Ⅰ(0.2g，0.42mmol)和化合物Ⅱ(0.23g，0.80mmol)溶于无水乙醇(15mL)中，加入哌啶(5.2μL，0.05mmol)，回流反应6h。反应完毕后，减压浓缩除去乙醇，残留物用水洗涤(30mL)，二氯甲烷萃取(5×20mL)，得到粗品。粗品通过柱层析(CH2Cl2:CH3OH，50:1v/v)纯化得到紫色固体50mg，产率15.9％。TLC(silica，CH2Cl2:CH3OH，10:1v/v)：Rf＝0.4。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ9.03(dd,J＝5.6,2.8Hz,1H),8.48-8.52(m,,1H),7.96(d,J＝7.6Hz,1H),7.65(t,J＝7.2Hz,1H),7.56(t,J＝7.6Hz,1H),7.40-7.48(m,4H),7.23-7.25(m,1H),7.28(s,1H),6.35-6.51(m,3H),3.36(q,J＝6.8Hz,J＝14.0Hz,4H),2.64-2.83(m,2H),2.05-2.09(m,2H),1.60-1.70(m,2H),1.18(t,J＝7.2Hz,6H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)：δ170.14,166.86,164.15,160.72,152.59,152.29,149.41,148.96,146.83,144.05,135.80,134.60,131.30,130.76,130.35,130.25,129.36,128.66,127.64,125.06,124.10,123.58,121.22,118.964,118.72,108.84,108.41,104.80,97.31,44.52,27.24,23.11,22.48,12.65.HRMS(ESI+):(M)+calcd.for C38H32FN2O7,647.2118；found,647.2190.
实施例5
荧光母核NIR-COH的制备：将化合物Ⅰ(200.00mg，0.42mmol)和对羟基苯甲醛(77.90mg，0.64mmol)溶于无水乙醇(15mL)中，加入哌啶(5.2μL，0.05mmol)，回流反应5h后，减压浓缩除去乙醇，残留物用水洗涤(40mL)，二氯甲烷萃取(3×20mL)，得到粗品。粗品通过柱层析(CH2Cl2:CH3OH，50:1v/v)纯化得到黑色固体145mg，产率59.5％。TLC(silica，CH2Cl2:CH3OH，10:1v/v)：Rf＝0.4。1H NMR(400MHz,CD3OD)：δ8.18-8.20(m,1H),8.11(s,1H),7.64-7.73(m,2H),7.56(d,J＝8.8Hz,2H),7.21-7.24(m,1H),7.18(t,J＝2.0Hz,1H),7.09-7.15(m,2H)6.89(d,J＝8.8Hz,2H),3.67(q,J＝7.2Hz,J＝14.4Hz,4H),2.93-2.97(m,2H),2.40-2.44(m,2H),1.78-1.85(m,2H),1.29(t,J＝7.2Hz,6H).HRMS(ESI+):(M+)calcd.forC31H30NO4,480.2169；found,480.2170.
化学反应过程如下所示：
三、效果验证
1、荧光探针NIR-CPS与聚硫化氢反应的荧光光谱
1.1荧光探针NIR-CPS与Na2S4反应的荧光光谱与紫外光谱
首先，我们先检测探针NIR-CPS与Na2S4反应后的荧光光谱与UV光谱发生的变化。从图10可知，探针NIR-CPS本身没有荧光，与Na2S4(100μM)反应后产生明亮的红色荧光，其最大发射波长为670nm。这与荧光母核NIR-COH的荧光光谱一致。探针NIR-CPS在552nm处有最大紫外吸收峰，与Na2S4反应完后最大紫外吸收峰在570nm，与NIR-COH的紫外吸收光谱一致。探针NIR-CPS的斯托克斯位移可达100nm，其斯托克斯位移值大于大部分已报道的聚硫化氢荧光探针。拥有较大斯托克斯位移的探针，因其激发光谱与发生光谱分离度较好，能有效地减少由自发吸收和自发荧光引起的检测误差。
1.2荧光探针NIR-CPS与Na2S4反应的线性关系以及检测限
为了考察探针NIR-CPS是否适用于生物样本中聚硫化氢的定量检测，NIR-CPS与不同浓度的Na2S4(0-300μM)孵育，探讨荧光强度与Na2S4浓度之间的关系。探针NIR-CPS与Na2S4反应的的荧光光谱如图11所示，未加入Na2S4之前，探针几乎无荧光；而当探针NIR-CPS与不同浓度的Na2S4(0-300μM)孵育后，在670nm处的荧光强度随着Na2S4浓度的增强而逐渐增强(20倍)。NIR-CPS与Na2S4的反应比例为1:10时，荧光强度达到峰值，反应趋于饱和，并且Na2S4在0-20μM范围内与荧光强度呈现出良好的线性关系(如图12所示)。在PBS缓冲液中，探针NIR-CPS检测聚硫化氢的检测限为18nM，其检测灵敏度高于已报道的大部分荧光探针。上述结果显示探针NIR-CPS具有较好的检测灵敏度，能够定量检测复杂生物体内聚硫化氢水平。
1.3荧光探针NIR-CPS与Na2S4的反应时间
如图13所示，探针NIR-CPS与Na2S4反应的荧光强度在20min左右达到峰值，说明20min左右反应完全。此外，荧光强度较稳定，反应时间延长至60min，荧光强度未见减弱。
1.4荧光探针NIR-CPS与Na2S4反应pH的影响
为了探究pH对探针NIR-CPS检测聚硫化氢的影响，将探针与Na2S4在不同pH的PBS缓冲液中进行孵育。探针在pH 4.0-7.5范围荧光响应较高，但在pH 8.0-9.0范围内荧光强度逐渐下降。NIR-COH的pKa为7.6。因此，化合物在酚和酚盐形式上存在pH依赖性。在pH4.0-7.5范围内以苯酚形式存在，显示出较高的荧光响应。而在pH 8.0-9.0范围内以酚盐的形式存在，导致荧光响应减弱。上述结果表明，探针NIR-CPS适用于生理条件下(pH 7.4)聚硫化氢的定量检测(如图14所示)。
1.5荧光探针NIR-CPS检测Na2S4的选择性
由于生物体内环境的复杂性，探针需要有高的选择性，来实现对聚硫化氢的精准检测。如图15所示，探针NIR-CPS与Na2S4、Na2S2孵育会产生较强的荧光响应，但与其他活性硫物质(RSS,包括Na2S,Cys,GSH,CysSSCys,Hcy,GSSG,S8,S2O3 2-,SO3 2-,SO4 2-,Cys-polysulfide,CH3SSSCH3)均不能引起探针的荧光响应。随后我们进一步通过竞争性实验来验证探针在活性硫存在条件下，是否影响探针NIR-CPS与Na2S4的荧光响应，结果表明探针与活性硫(RSS)一起孵育时，并不影响探针NIR-CPS与Na2S4的荧光响应。在孵育过程中不加Na2S2或Na2S4，探针均没有荧光响应。上述实验表明，在活性硫物质中探针NIR-CPS可以选择性识别Na2S2或Na2S4，不受其他活性硫物质的干扰。如图16和17所示，探针与活性氧(ROS,包括H2O2,ClO-,tBuOOH,.OH,1O2,O2-,NO2 -,ONOO-,NO,NO3 -)、无机盐离子(包括Na-,K+,Cu2+,Mg2+,Zn2+,Fe3 +,Fe2+,CO3 2-,HCO3 -,Cl-,Br-,I-,HPO4 2-,H2PO4 -)孵育，均未见荧光响应。由上述结果可知，探针NIR-CPS可以选择性识别Na2S2或Na2S4，不受其他活性物质的干扰。
2、细胞水平聚硫化氢荧光成像
在细胞成像之前，需要进行MTT测定以评估探针对细胞的毒性。本申请以人乳腺癌MCF-7为检测的细胞株。如图18所示，不同浓度的探针(0μM，5μM，10μM，15μM，20μM)与MCF-7细胞孵育24h，细胞存活率仍在90％以上，说明探针NIR-CPS毒性很低，而且在10μM浓度下，不会影响细胞的正常形态。
考察NIR-CPS能否实现聚硫化氢的细胞荧光成像，结果如图19所示，细胞不做任何处理，没有荧光响应(如图19，A)。将探针NIR-CPS与细胞在37℃下孵育20min，可见微弱的红色荧光(如图19，B)。将细胞提前1h给予N-甲基马来酰亚胺(NMM,H2Sn清除剂)后，再与探针孵育，几乎未见荧光响应(如图19，C)。说明图19(B)中的微弱红色荧光是由生理浓度的内源性聚硫化氢引起的，探针NIR-CPS可检测生理水平内源性的H2Sn，具有较高的检测灵敏度。随后，将探针与细胞孵育20min后，给予不同浓度的Na2S4(20μM，10μM)，可观察到明亮的红色荧光(如图19，D，E)，而且荧光强度随着Na2S4浓度增加而增强(如图19，F)。综上所述，探针NIR-CPS可以检测生理浓度的内源性H2Sn以及不同水平的外源性H2Sn。图20是图19中细胞的明场成像；其中，图20中A,B,C,D和E分别对应图19中A,B,C,D和E，由图20可知，细胞在整个拍摄过程中形态良好。
在NIR-CPS能够识别细胞中外源性聚硫化氢的基础上，继续考察NIR-CPS能否实现细胞内源性聚硫化氢的荧光成像。胱硫醚γ-裂解酶(CSE)是内源性聚硫化氢的合成酶。脂多糖(LPS)可诱导CSE mRNA表达上调，从而促进内源性H2Sn的产生。因此，将LPS与细胞孵育，以此来诱导内源性聚硫化氢的产生。细胞与LPS孵育16h后，再与探针NIR-CPS孵育，可见明亮的红色荧光(如图21，A)。随后，将细胞用DL-炔丙基甘氨酸(PAG；CSE酶抑制剂)孵育30min，与LPS孵育16h，再与探针孵育，荧光强度显著降低(如图21，B)。结果表明，探针NIR-CPS能够实现细胞内内源性H2Sn的荧光成像。图22是图21中细胞的明场成像；其中，图22中A和B分别对应图21中A和B，由图22可知，细胞在整个拍摄过程中形态良好。
3、活体水平聚硫化氢荧光成像
本申请进一步研究了探针NIR-CPS在小鼠体内进行H2Sn检测的可行性。将昆明小鼠随机分组。对照组：小鼠腹腔注射探针NIR-CPS。第二、三组腹腔注射探针后，再腹腔注射不同浓度的Na2S4。第四组腹腔注射LPS，然后腹腔注射探针。第五组先腹腔注射DL-炔丙基甘氨酸(PAG，CSE抑制剂)，再腹腔分别注射LPS和探针。使用Night OWL IILB983小动物活体成像系统进行荧光成像。实验结果表明，只注射探针的小鼠，几乎未见荧光(如图23，A)。与对照组相比较，腹腔注射不同浓度的Na2S4(0.2，2和4倍当量)后，可见荧光强度显著增加(3.2，6.5，10.2倍)(如图23，B，C，D)，而且荧光强度随着Na2S4浓度增加而增强(如图23，G)。这说明探针NIR-CPS可以检测小鼠体内不同浓度的外源性聚硫化氢。腹腔注射LPS的小鼠，其腹部也可见非常明亮的荧光信号(5.5倍)(如图23，E)。当小鼠腹腔注射DL-炔丙基甘氨酸(PAG)，再注射探针后，荧光强度显著降低(如图23，F)。由此说明，图23(E)中的明亮荧光是由LPS诱导的内源性聚硫化氢引起的荧光信号。说明探针NIR-CPS具有较高的检测灵敏度，可以检测活体水平内源性聚硫化氢。
本申请又继续考察了内源性聚硫化氢与探针反应时间对荧光强度的影响。小鼠腹腔注射LPS，24h后腹腔注射探针NIR-CPS，并于不同时间点(0,1,5,10,15,20,25,30,35,40min)记录荧光图像(如图24所示)。实验结果表明，1min左右即可见明亮的荧光，且荧光强度随时间逐渐增强，20min到达峰值后，荧光强度趋于稳定的状态。说明在活体水平，探针NIR-CPS与聚硫化氢反应较快，且荧光信号稳定，有利于活体水平的聚硫化氢检测。
综上所述，本发明提供的识别聚硫化氢的荧光探针NIR-CPS，具有较大的斯托克斯位移(100nm)，选择性好、灵敏度高、检测限低(18nM)及良好生物相容性等优点。
本发明制备的探针NIR-CPS在PBS缓冲液中，荧光强度与聚硫化氢浓度呈现良好的线性关系，说明探针适合定量检测聚硫化氢；探针NIR-CPS还实现了MCF-7细胞中聚硫化氢的荧光成像；更重要的是，探针NIR-CPS也实现了活体水平由脂多糖诱导产生的内源性聚硫化氢的灵敏检测，且响应较快，荧光强度较稳定。
本发明制备的探针NIR-CPS是可视化和定量检测细胞、活体中聚硫化氢水平的有效工具，进一步为H2Sn在生物体内的生理病理机制以及信号转导途径提供一种可视化、无创的检测方法，对于揭示人体内聚硫化氢的生理病理机制具有重要意义。
Claims (10)
1.一种近红外荧光探针，其探针的结构式如下所示：
2.一种权利要求1所述的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
第一步：在浓硫酸和高氯酸存在的条件下，4-二乙氨基酮酸和环己酮进行反应，制备化合物Ⅰ；
第二步：2-氟-5-硝基苯甲酸与二氯亚砜进行反应，制备2-氟-5-硝基苯甲酰氯；
第三步：在三乙胺存在的条件下，2-氟-5-硝基苯甲酰氯与对羟基苯甲醛进行反应，制备化合物Ⅱ；
第四步：在哌啶存在的条件下，化合物Ⅰ与化合物Ⅱ进行反应，制备化合物NIR-CPS。
4.根据权利要求3所述的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，在第一步中，4-二乙氨基酮酸与环己酮的摩尔比为1:2～6，优选为1:2.5～3.5，更优选为1:3.1；反应的温度为70～120℃，优选为80～100℃，更优选为90℃；反应时间为1～10h，优选为1.5～2.5h，更优选为2h；4-二乙氨基酮酸与浓硫酸的摩尔比为1:50～100，优选为1:70～85，更优选为1:79；4-二乙氨基酮酸与高氯酸的摩尔比为1:4～12，优选为1:6～8，更优选为1:6.8。
5.根据权利要求3所述的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，在第二步中，2-氟-5-硝基苯甲酸与二氯亚砜的质量体积比为1:30～60g/ml，优选为1:35～45g/ml，更优选为1:40g/ml；反应的温度为70～100℃，优选为70～90℃，更优选为80℃；反应时间为3～9h，优选为4～7h，更优选为5h。
6.根据权利要求3所述的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，在第三步中，对羟基苯甲醛与2-氟-5-硝基苯甲酰氯的摩尔比为1:0.8～2.5，优选为1:1.0～2.0，更优选为1:1.2；对羟基苯甲醛与三乙胺的摩尔比为1:0.8～2.5，优选为1:1.0～2.0，更优选为1:1.2。
7.根据权利要求3或6所述的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，在第三步中，对羟基苯甲醛、三乙胺与2-氟-5-硝基苯甲酰氯在冰浴的条件下反应20～60min后，再升温至室温反应0.5～2h，制备化合物Ⅱ。
8.根据权利要求3所述的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，化合物Ⅰ与化合物Ⅱ的摩尔比为1:1.5～3.0，优选为1:1.5～2.5，更优选为1:1.9；化合物Ⅰ与哌啶的摩尔比为1:0.1～0.2，优选为1:0.1～0.16，更优选为1:0.12。
9.权利要求1所述的近红外荧光探针作为检测聚硫化氢的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的近红外荧光探针在细胞和动物活体水平检测聚硫化氢的应用。
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2019
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