CN104893712A

CN104893712A - 一种新型高选择性二价铜离子荧光探针及其制备方法与生物应用

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Publication number: CN104893712A
Application number: CN201510267309.1A
Authority: CN
Inventors: 林伟英; 刘克印; 尚慧明; 刘勇
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2015-05-22
Filing date: 2015-05-22
Publication date: 2015-09-09
Anticipated expiration: 2035-05-22
Also published as: CN104893712B

Abstract

本发明公开了一种新型高选择性二价铜离子荧光探针及其制备方法与生物应用，所述荧光探针的结构如式(I)所示。本发明还公开了荧光探针的制备方法和应用。本发明的荧光探针能够在水体系中选择性检测二价铜离子，在二价铜离子存在时，探针溶液由无色变成深色，荧光有显著增强。本发明所述的荧光探针的特性对检测环境中和生物体内的重金属离子含量有突出优点，并在生物荧光标记及生物成像领域有潜在的应用价值。

Description

一种新型高选择性二价铜离子荧光探针及其制备方法与生物应用

技术领域

本发明涉及一种高选择性识别金属铜离子的荧光探针及其制备方法与生物应用，该荧光探针能够在水体系中专一识别二价铜离子，属于有机小分子荧光探针领域。

背景技术

铜元素是自然界中存在的一种重要的金属化学元素，它的化学符号为Cu，电子排布方式为：1s²2s²2p⁶3s²3p⁶3d¹⁰4s¹。铜元素广泛分布于地壳、海洋中，铜元素在地壳中的含量约为0.01％，在有些铜矿中含量能够达到3％-5％。

铜元素也是人体必需的微量元素之一，血液中铜的含量约为1.0-1.5mg。铜的杀菌作用很早就被人们研究，有些铜化合物还具有抗癌功能。生物体铜离子缺乏会引起贫血、骨和动脉异常、甚至脑障碍等，铜元素在体内含量升高会引起肝脏疾病、腹泻、呕吐、运动障碍和知觉神经障碍。因此在环境中和生物体中检测铜离子的含量具有极大的应用价值。

目前铜离子的检测方法主要有电化学方法(Electrochemical Method)、元素分析(EA)及等离子体-质谱(ICP-MS)等方法，然而这些检测方法的样品制备过程比较复杂，检测过程对样品损伤较大，而且无法实现对生物体的在线分析，因此，上述检测方法的应用领域受到限制。荧光分析方法是一类新兴的检测方法，具有检测方法快速方便、检测信号灵敏、检测限低、能够实现对生物体的在线分析等优点，在对环境及生物体中二价铜离子的检测方面具有重要应用前景。

目前的铜离子荧光探针仍存在探针的种类较少、检测信号不够灵敏等缺点，目前开发的荧光探针主要是可见光荧光探针，缺乏近红外发光的荧光探针，生物应用价值不高。基于上述问题，开发新型铜离子荧光探针，在水体系及生物环境中检测二价铜离子具有重要的研究价值。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种新型高选择性二价铜离子荧光探针及其制备方法与生物应用。

本发明的技术方案如下：

一种新型高选择性二价铜离子荧光探针，具有式(I)所示的结构：

根据本发明，式(I)所示的化合物名称为((2-氨基-6'-(二甲基氨基)-3-氧代-2'，3'-二氢螺[异二氢吲哚-1,9'-呫吨]-4'(1'氢)-亚基)甲基)苯甲腈，简称CSNNH2。

根据本发明，上述新型高选择性二价铜离子荧光探针的制备方法，包括步骤如下：

(1)将化合物1与对氰基苯甲醛在酸性环境中，于40-70℃反应，得到化合物2；

(2)将化合物2在缩合剂催化下与水合肼室温下发生缩合反应，得到式(I)所示化合物。

上述式(I)所示化合物的反应路线如下：

根据本发明制备方法，优选的，步骤(1)中所述的化合物1与对氰基苯甲醛的摩尔比为1：1-3；

优选的，酸性环境所用的酸为醋酸、醋酸酐、甲磺酸，每毫摩尔化合物1所用酸的体积为10-20ml；

优选的，化合物1与对氰基苯甲醛的反应时间为2-20h。

根据本发明，优选的，步骤(1)中所述的化合物1按如下步骤制备得到：

按摩尔比为1：(1-1.5)将间N-二乙胺基氨基苯酚与邻苯二甲酸酐溶解于苯中，于50-70℃反应20-30h，得白色固体；将白色固体加入到环己酮和98wt％浓硫酸的混合溶液中，于45-55℃反应2-12h，将固体用用乙醇重结晶得到化合物1。

根据本发明所述的化合物1的制备方法，优选的，每毫摩尔间N-二乙胺基氨基苯酚中苯用量为10-70mL；

优选的，环己酮和98wt％浓硫酸的混合溶液中，环己酮和浓硫酸的体积比为6：(20-200)。

根据本发明，优选的，步骤(1)中反应完成后，还包括分离提纯步骤，具体如下：

将反应完成后的溶液，旋转蒸馏除去溶剂，将固体用二氯甲烷溶解，用二氯甲烷与甲醇的混合溶剂过柱层析分离，得到化合物2。

根据本发明制备方法，优选的，步骤(2)中每毫摩尔化合物2水合肼的用量为1-5ml；

优选的，所述的缩合剂为BOP(苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐)、1-羟基苯并三氮唑、氮-二环己基碳二酰亚胺；

优选的，化合物2与缩合剂的摩尔用量为之比为1：1-5；

优选的，化合物2与水合肼的反应时间为2-20h。

根据本发明，上述新型高选择性二价铜离子荧光探针应用于水体系、有机溶剂体系或生物体中二价铜离子的检测。以荧光增强、颜色发生明显改变的方式检测二价铜离子。

本发明中，上述新型高选择性二价铜离子荧光探针在水体系、有机溶剂体系或生物体中能够高选择性识别二价铜离子，该探针本身的荧光比较微弱、加入到水或有机溶剂后所得溶液没有颜色，当与二价铜离子作用后，溶液的荧光显著增强、颜色加深。

本发明的有益效果：

1、本发明的二价铜离子荧光探针对二价铜离子检测的选择性高，检测灵敏，而且现象明显，便于识别。

2、本发明二价铜离子荧光探针的制备方法简单。

附图说明

图1为本发明实验例1中不同浓度二价铜离子条件下的荧光光谱；其中最下面的曲线为不加入二价铜离子条件下的荧光曲线，曲线从下往上二价铜离子的浓度依次增加，最上面的曲线为浓度是7.5当量(eq)时二价铜离子的荧光曲线。

图2为本发明实验例2中二价铜离子的荧光强度随时间的变化。

图3为本发明实验例3中加入不同金属离子之后的荧光强度变化的对比图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。

实施例中所用原料，如无特殊说明均为常规市购产品。

实施例中所用的化合物1按如下步骤制备得到：

间N-二乙胺基苯酚(0.50g,3.03mmol)与邻苯二甲酸酐(0.49g,3.33mmol)在180mL苯中60℃反应24小时得到白色固体，再将白色固体加入到20mL含有6ml环己酮的98wt％浓硫酸中，50℃反应3小时，固体用乙醇重结晶得到化合物1(0.22g,0.45mmol)。

实施例1、

反应路线如下：

制备过程，包括步骤如下：

(1)将化合物1(0.377g,1.0mmol)与对氰基苯甲醛(0.157g,1.2mmol)在20ml醋酸中，于50℃反应12h，得到深色溶液，旋转蒸馏除去溶剂，固体用二氯甲烷溶解，用二氯甲烷与甲醇混合溶剂过柱层析分离，得到化合物2；收率：50％。¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.96(d,J＝7.2,1H),7.65(m,3H),7.56(t,J＝7.2,1H),7.48(d,J＝8.4,1H),7.37(s,1H),7.23(d,J＝7.6,1H),6.50(d,J＝8.8,1H),6.38(m,2H),3.36(q,J＝6.4,4H),2.65(m,2H),2.07(m,1H),1.63(m,4H),1.17(t,J＝6.8,2H).¹³C NMR(101MHz,CDCl3)δ169.94,152.38,152.09,149.39,146.29,142.08,134.56,133.47,131.95,129.98,129.38,128.59,127.52,125.04,123.45,119.00,110.20,109.77,108.93,104.61,97.18,44.44,29.70,27.25,22.99,22.32,12.55.

(2)将化合物2(0.20g,0.41mmol)与5.0ml水合肼在两当量缩合剂BOP作用下，室温下反应10h，得到探针分子CSNNH2(0.061g,0.12mmol)，收率：30％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃₎δ7.91(d,J＝7.2,1H),7.66(d,J＝8.4,2H),7.52(m,2H),7.48(m,2H),7.33(s,1H),7.21(d,J＝7.2,2H),6.40(s,1H),6.35(m,2H),3.78(s,2H),3.34(q,J＝6.4,4H),2.69(m,2H),1.78(m,1H),1.58(m,5H),1.17(t,J＝6.8,2H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ166.52,152.82,149.16,148.87,146.75,142.26,133.47,132.58,131.95,129.94,128.58,127.65,123.40,123.14,122.52,119.07,110.01,108.66,103.41,97.72,44.36,27.52,22.87,22.51,12.61.

实施例2、

如实施例1所述的新型高选择性二价铜离子荧光探针的制备方法，不同的是：

步骤(1)中所述的氰基苯甲醛用量为3mmol，将醋酸替换为醋酸酐，酸的用量为20mL，反应温度为60℃，反应时间为12h。

步骤(2)中水合肼的用量为3mL。

实施例3、

步骤(1)中所述的氰基苯甲醛用量为1mmol，将醋酸替换为甲磺酸，酸的用量为10mL，反应温度为50℃，反应时间为10h。

步骤(2)中水合肼的用量为2mL。

实验例1、荧光探针与二价铜离子的滴定实验

在Hepes缓冲液与乙腈体积比例为1:1的混合溶剂中，加入初始浓度为1mM的荧光探针，使得溶液中荧光探针的浓度为10μM。然后，依次加入不同量的初始浓度为5mM的二价铜离子，使得溶液中二价铜离子的浓度分别为1.25μM、2.5μM、5μM、7.5μM、10μM、12.5μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM、62.5μM、75μM，不加入二价铜离子作为对照，静置2小时使铜离子与荧光探针充分反应。

用荧光光谱仪测试不同二价铜离子条件下的荧光光谱，激发波长为530nm，发射波长为650nm，检测波长为663nm，结果如图1所示。由图1可知，随着二价铜离子的浓度增加，在663nm波长下的荧光强度逐渐增强，说明荧光探针能够对二价铜离子进行响应。

实验例2、荧光探针检测二价铜离子的荧光强度随时间变化

如实验例1所述，测试浓度为75μM的二价铜离子的荧光强度随时间的变化，激发波长为530nm，发射波长为650nm，检测波长为663nm，结果如图2所示。由图2可知，加入二价铜离子之后溶液的荧光强度逐渐增加，当作用2小时后，反应完全，荧光信号达到饱和。

实验例3、荧光探针检测二价铜离子的选择性测试

如实验例1所述，在同样测试条件下，向溶液中加入过量的其它金属离子，测试加入不同金属离子之后的荧光光谱，激发波长为530nm，发射波长为650nm，检测波长为666nm，结果如图3所示。由图3可知，常见的二价金属离子如二价铅、二价汞、二价钯、二价铁等，荧光强度只有二价铜离子变化明显，其他金属离子不对检测结果产生干扰，可以证明该荧光探针对二价铜离子具有较高的选择性。

Claims

1.一种新型高选择性二价铜离子荧光探针，具有式(I)所示的结构：

2.一种权利要求1所述的新型高选择性二价铜离子荧光探针的制备方法，反应路线如下：

包括步骤如下：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的化合物1与对氰基苯甲醛的摩尔比为1：1-3。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中酸性环境所用的酸为醋酸、醋酸酐、甲磺酸，每毫摩尔化合物1所用酸的体积为10-20ml；化合物1与对氰基苯甲醛的反应时间为2-20h。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的化合物1按如下步骤制备得到：

6.根据权利要求5所述的化合物1的制备方法，其特征在于，每毫摩尔间N-二乙胺基氨基苯酚中苯用量为10-70mL；

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中反应完成后，还包括分离提纯步骤，具体如下：

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中每毫摩尔化合物2水合肼的用量为1-5ml；

优选的，所述的缩合剂为BOP(苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐)、1-羟基苯并三氮唑、氮-二环己基碳二酰亚胺。

9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中化合物2与缩合剂的摩尔用量为之比为1：1-5；化合物2与水合肼的反应时间为2-20h。

10.权利要求1所述的新型高选择性二价铜离子荧光探针应用于水体系、有机溶剂体系或生物体中二价铜离子的检测。