CN105542754A - 一种黄酮基荧光分子探针及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种黄酮基荧光分子探针及其制备方法与应用，其具有如下通式I所示的结构：I其中：R1为H或CH3；R2为CH3，CH2CH3或(CH2)3CH3。与传统方法相比，本发明的黄酮染料的黄酮基荧光分子探针是一个方便、快捷、高灵敏度与高选择性的检测方式，不仅可以对重金属污染水源进行分析，也可以在生物体系中得到应用，能够方便、快捷、高灵敏度与高选择性的检测活细胞中游离铜离子。

Description

一种黄酮基荧光分子探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及荧光分子探针技术领域，尤其涉及一种黄酮基荧光分子探针及其制备方法与应用。
背景技术
铜离子是人体不可缺少的微量元素之一，是生物体新陈代谢中极其重要的催化辅因子，同时对基因表达、蛋白质折叠、神经系统功能化等生化进程起到关键作用。然而，人体中铜离子的含量也有严格的标准，过多过少都会对人体的各项机能造成危害。人体内铜离子失调与许多疾病密切关联，例如曼克氏症、阿森海默氏症、威尔逊氏症、肠胃功能紊乱、以及肾脏疾病。随着人类工业化进程的快速推进，铜作为一种极其重要的工业原料被广泛的使用，然而，由铜离子引起的环境的污染问题也日益突出。据报道，水中含铜量达到0.002mg/L就会对鱼类产生毒性。铜离子引起的水污染不仅破坏环境，更会严重危害人类及其他动植物的健康，因此开发优良的铜离子探针具有重要意义。
迄今为止，人们已提出了多种铜离子检测方法，如电感耦合等离子体原子发射光谱法、原子吸收光谱、电化学方法等。然而，这些方法大多需要复杂的电器仪表，繁琐的样品制备过程，并且极易受样品背景（杂质、浮游生物、其它金属离子等）干扰。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种黄酮基荧光分子探针及其制备方法与应用，旨在解决现有铜离子检测方法需要复杂的电器仪表，繁琐的样品制备过程，并且极易受样品背景干扰的问题。
本发明的技术方案如下：
一种黄酮基荧光分子探针，其中，具有如下通式I所示的结构：
I
其中：R1为H或CH3；R2为CH3，CH2CH3或(CH2)3CH3。
一种如上所述的黄酮基荧光分子探针的制备方法，其中，包括步骤：
（1）、将摩尔比为1:1~1:3的对丙酰胺基临羟基苯乙酮和含R2取代基的苯甲醛加入乙醇中，然后滴加入10~50毫升的氢氧化钠溶液，滴加完毕后室温搅拌10~48小时；将反应液冷却，缓慢滴加10~30毫升的双氧水溶液，室温搅拌3~10小时，用稀盐酸中和，将沉淀过滤干燥，获得中间体A；
（2）、按摩尔比为1:3~1:10加入中间体A和碳酸钾，再加入10~20毫升的丙酮溶液，在冰水浴下，滴入硫酸甲酯，硫酸甲酯与碳酸钾的摩尔比为1:1~1:3，室温搅拌10~48小时，加入30~60毫升的水淬灭反应，经过萃取，干燥和柱色谱分离，得到中间体B；
（3）、将10~30毫摩尔中间体B溶解入甲醇中，加入20~50毫升的盐酸，50~80℃下加热4~10小时，冷却，中和，置于室温中，收集得到沉淀物，沉淀物重结晶，得到中间体C；
（4）、按1:5~1:10的摩尔比向反应瓶中加入中间体C和含R1取代基的溴甲基吡啶，再依次加入摩尔比为10:1~3:1碳酸钾和碘化钾，最后加入10~30毫升的干燥DMF，反应在60~100℃下搅拌10~48小时，待反应结束后，反应液经析出、萃取、洗涤、干燥得到粗产物，经柱色谱分离得到通式Ⅰ的化合物。
所述的黄酮基荧光分子探针的制备方法，其中，所述步骤（1）中，所述对丙酰胺基临羟基苯乙酮和含R2取代基的苯甲醛的摩尔比为1:1。
所述的黄酮基荧光分子探针的制备方法，其中，所述步骤（2）中，中间体A、碳酸钾和硫酸甲酯的摩尔比为1:3:3。
所述的黄酮基荧光分子探针的制备方法，其中，所述步骤（3）中，中间体B的摩尔量为10毫摩尔，盐酸的加入量为20毫升，加热时间为4个小时。
所述的黄酮基荧光分子探针的制备方法，其中，所述步骤（4）中，中间体C、含R1取代基的溴甲基吡啶、碳酸钾和碘化钾的摩尔比为1:10:10:1。
一种如上所述的黄酮基荧光分子探针的应用，其中，将所述黄酮基荧光分子探针用于检测活细胞中游离铜离子。
有益效果：与传统方法相比，本发明的黄酮染料的黄酮基荧光分子探针是一个方便、快捷、高灵敏度与高选择性的检测方式，不仅可以对重金属污染水源进行分析，也可以在生物体系中得到应用。
附图说明
图1为本发明实施例1中黄酮染料DPA-FL的紫外-可见吸收光谱图。
图2为本发明实施例1中黄酮染料DPA-FL的铜离子滴定示意图。
图3为本发明实施例1中黄酮染料DPA-FL的离子选择性示意图。
图4为本发明实施例1中黄酮染料DPA-FL对人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）的毒性实验结果图。
图5a~5d为本发明实施例1中黄酮染料DPA-FL对活的人类脐静脉内皮细胞中的游离铜离子的荧光成像结果图。
具体实施方式
本发明提供一种黄酮基荧光分子探针及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种黄酮基荧光分子探针，其中，具有如下通式I所示的结构：
I
其中：R1为H或CH3；R2为CH3，CH2CH3或(CH2)3CH3。其中，上述通式I所示的结构中包含如下所示的吡啶配体单元II和黄酮基发光单元III。
、。
吡啶配体单元II为含吡啶的配体结构，其能够选择性的与酮离子配合；黄酮基发光单元III由黄酮染料构成，其荧光光谱具有较大的斯托克斯位移，而且具有很低的细胞毒性和良好的细胞相容性，是黄酮基荧光分子探针的发光单元。与传统方法相比，本发明的黄酮染料的黄酮基荧光分子探针是一个方便、快捷、高灵敏度与高选择性的检测方式，不仅可以对重金属污染水源进行分析，也可以在生物体系中得到应用。
基于上述黄酮基荧光分子探针，本发明提供一种如上所述的黄酮基荧光分子探针的制备方法，其包括步骤：
（1）、将摩尔比为1:1~1:3的对丙酰胺基临羟基苯乙酮和含R2取代基的苯甲醛加入乙醇中，然后滴加入10~50毫升的氢氧化钠溶液，滴加完毕后室温搅拌10~48小时；将反应液冷却，缓慢滴加10~30毫升的双氧水溶液，室温搅拌3~10小时，用稀盐酸中和，将沉淀过滤干燥，获得中间体A；
优选地，所述步骤（1）中，所述对丙酰胺基临羟基苯乙酮和含R2取代基的苯甲醛的摩尔比为1:1。
例如，将摩尔比为1:1的对丙酰胺基临羟基苯乙酮和含R2取代基的苯甲醛加入50mL乙醇中，然后滴加入20毫升的质量分数为30%氢氧化钠溶液，滴加完毕后室温搅拌48小时；将反应液用冷却水冷却，缓慢滴加20毫升质量分数为30%双氧水溶液，室温搅拌10小时，用稀盐酸中和，将沉淀过滤干燥，获得中间体A。
（2）、按摩尔比为1:3~1:10加入中间体A和碳酸钾，再加入10~20毫升的丙酮溶液，在冰水浴下，滴入硫酸甲酯，硫酸甲酯与碳酸钾的摩尔比为1:1~1:3，室温搅拌10~48小时，加入30~60毫升的水淬灭反应，经过萃取，干燥和柱色谱分离，得到中间体B；
优选地，所述步骤（2）中，中间体A、碳酸钾和硫酸甲酯的摩尔比为1:3:3。
例如，按摩尔比为1:3加入中间体A和碳酸钾，再加入20毫升的丙酮溶液，在冰水浴下，滴入硫酸甲酯，硫酸甲酯与碳酸钾的摩尔比为1:1，室温搅拌48小时，加入50毫升的水淬灭反应，经过萃取，干燥和柱色谱分离，得到中间体B。
（3）、将10~30毫摩尔中间体B溶解入甲醇中，加入20~50毫升的盐酸，50~80℃下加热4~10小时，冷却，中和，置于室温中，收集得到沉淀物，沉淀物重结晶，得到中间体C；
优选地，所述步骤（3）中，中间体B的摩尔量为10毫摩尔，盐酸的加入量为20毫升，加热时间为4小时。
例如，将10毫摩尔中间体B溶解入10毫升甲醇中，加入20毫升的盐酸，70℃下加热4小时，冷却，中和，置于室温中，收集得到沉淀物，沉淀物在乙醇中重结晶，得到中间体C。
（4）、按1:5~1:10的摩尔比向反应瓶中加入中间体C和含R1取代基的溴甲基吡啶，再依次加入摩尔比为10:1~3:1碳酸钾和碘化钾，最后加入10~30毫升的干燥DMF，反应在60~100℃下搅拌10~48小时，待反应结束后，反应液经析出、萃取、洗涤、干燥得到粗产物，经柱色谱分离得到通式Ⅰ的化合物；
。
优选地，所述步骤（4）中，中间体C、含R1取代基的溴甲基吡啶、碳酸钾和碘化钾的摩尔比为1:10:10:1。
例如，按1:10的摩尔比向反应瓶中加入中间体C和含R1取代基的溴甲基吡啶，再依次加入摩尔比为10:1碳酸钾和碘化钾，最后加入20毫升的干燥DMF，反应在80℃下搅拌48小时，待反应结束后，反应液经析出、萃取、洗涤、干燥得到粗产物，经柱色谱分离得到通式Ⅰ的化合物。
基于上述黄酮基荧光分子探针，本发明提供一种如上所述的黄酮基荧光分子探针的应用，其中，将所述黄酮基荧光分子探针用于检测活细胞中游离铜离子。本发明的黄酮基荧光分子探针结构中包含吡啶配体单元II和黄酮基发光单元III。其中，吡啶配体单元II为含吡啶的配体结构，其能够选择性的与酮离子配合；黄酮基发光单元III由黄酮染料构成，其荧光光谱具有较大的斯托克斯位移，而且具有很低的细胞毒性和良好的细胞相容性，是黄酮基荧光分子探针的发光单元。本发明所述黄酮基荧光分子探针可用于荧光检测活细胞中游离铜离子。与传统方法相比，本发明的黄酮染料的黄酮基荧光分子探针是一个方便、快捷、高灵敏度与高选择性的检测方式，不仅可以对重金属污染水源进行分析，也可以在生物体系中得到应用，能够方便、快捷、高灵敏度与高选择性的检测活细胞中游离铜离子。
下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明。下述实施例中，如无特殊说明，所有试剂和生物材料均可由常规方法制备或由商业途径购得。
实施例1
1）、N-乙基黄酮染料(DPA-FL)的合成
按1：10的摩尔比向反应瓶中加入10mmol已合成的N-乙基中间体C和100mmol溴甲基吡啶，再依次加入100mmol碳酸钾和10mmol碘化钾，最后加入20毫升的干燥DMF，反应在80摄氏度下搅拌48小时，待反应结束后，反应液经析出、萃取、洗涤、干燥得到粗产物，经柱色谱分离（洗脱剂为甲醇：二氯甲烷＝1：9）得到N-乙基黄酮染料(DPA-FL)，产率为24%；
2）、DPA-FL的光谱测试
a、染料母液配制：
将1mmol的DPA-FL加入1mL的色谱纯DMSO，在超声下充分溶解，制得1mM浓度的DPA-FL母液，将该母液转移至棕色玻璃瓶内，密封冷藏。
取20微升的母液加入石英比色皿中，加入2mLDMSO与水的混合溶液(DMSO:水＝9:1，0.1mM的磷酸缓冲溶液，pH=7.4)，如图1所示，分别测定该溶液的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱。
b、铜离子滴定实验：
取20微升的母液加入石英比色皿中，加入2mLDMSO与水的混合溶液(DMSO:水＝9:1，0.1mM的磷酸缓冲溶液，pH=7.4)，分别滴加0-30微升的1mM浓度的硝酸铜溶液，如图2所示，荧光强度随着铜离子浓度的增加而减弱，具有良好的响应性。
c、离子选择性实验：
取20微升的母液加入石英比色皿中，加入2mLDMSO与水的混合溶液(DMSO:水＝9:1，0.1mM的磷酸缓冲溶液，pH=7.4)，分别滴加20微升的1mM浓度的硝酸锌、硝酸铁、硝酸铅、硝酸铝、硝酸镉和硝酸铜溶液，如图3所示，探针分子的荧光只对铜离子响应，其他过渡金属离子没有对荧光产生干扰，表明DPA-FL能够选择性检测铜离子。
3）、DPA-FL的生物应用
a、细胞毒性实验：
采用经典的MTT方法，将104cell/cm2密度的人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）在12孔板培养皿培养24小时，然后滴加入不同剂量（0、1、2、3、4、和5μM）的DPA-FL继续培养24小时，最后按照MTT吸收率的方法计算细胞存活率。从图4可以看出，DPA-FL在工作浓度下不会对细胞产生明显的毒性。
b、细胞成像实验：
结合图5a、5b、5c和5d所示，将5μM的DPA-FL滴入人类脐静脉内皮细胞的培养液中，37度下培养半小时，用荧光显微镜可以观测到荧光染料成功的将细胞染色，如图5b。
在细胞染色后，在细胞培养液中加入10μM的铜离子，37度下培养半小时，荧光显微镜可以观测到被铜离子培养过的细胞的荧光强度明显低于未被铜离子培养过的细胞的荧光强度，如图5d，说明该DPA-FL荧光染料可以检测活细胞内游离铜离子的浓度。
综上所述，本发明的一种黄酮基荧光分子探针及其制备方法与应用，与传统方法相比，本发明的黄酮染料的黄酮基荧光分子探针是一个方便、快捷、高灵敏度与高选择性的检测方式，不仅可以对重金属污染水源进行分析，也可以在生物体系中得到应用，能够方便、快捷、高灵敏度与高选择性的检测活细胞中游离铜离子。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (7)

1.一种黄酮基荧光分子探针，其特征在于，具有如下通式I所示的结构：
I
其中：R1为H或CH3；R2为CH3，CH2CH3或(CH2)3CH3。
2.一种如权利要求1所述的黄酮基荧光分子探针的制备方法，其特征在于，包括步骤：
（1）、将摩尔比为1:1~1:3的对丙酰胺基临羟基苯乙酮和含R2取代基的苯甲醛加入乙醇中，然后滴加入10~50毫升的氢氧化钠溶液，滴加完毕后室温搅拌10~48小时；将反应液冷却，缓慢滴加10~30毫升的双氧水溶液，室温搅拌3~10小时，用稀盐酸中和，将沉淀过滤干燥，获得中间体A；
（2）、按摩尔比为1:3~1:10加入中间体A和碳酸钾，再加入10~20毫升的丙酮溶液，在冰水浴下，滴入硫酸甲酯，硫酸甲酯与碳酸钾的摩尔比为1:1~1:3，室温搅拌10~48小时，加入30~60毫升的水淬灭反应，经过萃取，干燥和柱色谱分离，得到中间体B；
（3）、将10~30毫摩尔中间体B溶解入甲醇中，加入20~50毫升的盐酸，50~80℃下加热4~10小时，冷却，中和，置于室温中，收集得到沉淀物，沉淀物重结晶，得到中间体C；
（4）、按1:5~1:10的摩尔比向反应瓶中加入中间体C和含R1取代基的溴甲基吡啶，再依次加入摩尔比为10:1~3:1碳酸钾和碘化钾，最后加入10~30毫升的干燥DMF，反应在60~100℃下搅拌10~48小时，待反应结束后，反应液经析出、萃取、洗涤、干燥得到粗产物，经柱色谱分离得到通式Ⅰ的化合物。
3.根据权利要求2所述的黄酮基荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述对丙酰胺基临羟基苯乙酮和含R2取代基的苯甲醛的摩尔比为1:1。
4.根据权利要求2所述的黄酮基荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，中间体A、碳酸钾和硫酸甲酯的摩尔比为1:3:3。
5.根据权利要求2所述的黄酮基荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，中间体B的摩尔量为10毫摩尔，盐酸的加入量为20毫升，加热时间为4小时。
6.根据权利要求2所述的黄酮基荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，中间体C、含R1取代基的溴甲基吡啶、碳酸钾和碘化钾的摩尔比为1:10:10:1。
7.一种如权利要求1所述的黄酮基荧光分子探针的应用，其特征在于，将所述黄酮基荧光分子探针用于检测活细胞中游离铜离子。
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