CN104804728A - 一种荧光增强型苯硫酚荧光探针的制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可以用于荧光检测苯硫酚的新型化合物，具体涉及一种新型荧光探针的制备方法及其应用，属于化学分析检测技术领域。其分子结构式如下：该荧光探针选择性好，抗干扰能力强，灵敏度高，可用于生物或环境样品中的苯硫酚的荧光检测，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及的是化学分析检测技术领域，具体涉及一种新型的苯硫酚荧光探针的制备方法以及该荧光探针在检测苯硫酚方面的应用。
背景技术
苯硫酚为无色液体，具有特殊臭味，主要作为医药、农药等有机合成的中间体。人体吸入后会引起支气管痉挛、水肿及化学性肺炎，严重时会导致死亡。所以开发便捷快速检测苯硫酚的方法对环境及人类健康具有至关重要的意义。荧光探针检测法具有操作简便、易于实现实时原位检测、高灵敏度和高选择性的优点，受到了研究者的广泛关注。目前开发苯硫酚荧光探针的一大挑战在于探针能否选择性区分苯硫酚与脂肪硫醇，并且长波发射的荧光探针用于细胞内荧光检测时，不仅可以减少对生物样品的破坏，还能够减小背景荧光干扰，所以，开发长波长、高选择性的苯硫酚荧光探针对实现生物体内目标检测具有重要价值。
发明内容
本发明目的之一是提供一种合成简单、反应条件温和、成本较低的荧光探针合成方法；目的之二是提供一种灵敏度高、选择性好，抗干扰能力强，能够实现荧光法检测苯硫酚的荧光探针。
本发明使用荧光法检测苯硫酚，以喹喔啉衍生物为荧光团，以2，4-二硝基苯醚为苯硫酚的识别基团。
本发明解决问题采取的技术方案为，一种荧光检测苯硫酚荧光探针，其分子结构式为，该荧光探针的合成路线如下，
具体制备方法包括以下步骤：1)将4-甲氧基-2硝基苯胺和10％Pd/C溶于甲醇中，用氩气充分换气三次后通入氢气，升温至60℃反应12h，反应结束后，冷却至室温，抽滤，除去催化剂，用旋转除去溶剂，得到棕色液体即为化合物6。2)将化合物6溶于乙腈中，加入乙二醛溶液，升温至60℃反应6h。反应结束后冷却，旋转除去溶剂得到棕色固体即为化合物5。3)将化合物5溶于甲苯中，将反应液冷却至0℃。向冷却的溶液中缓慢加入硼氢化钠，得到的棕黄色溶液继续搅拌10min。将醋酸缓慢滴加到体系中，并保持反应液温度在5-10℃之间，滴加完毕后继续反应1h。升温至回流，反应5h。反应结束后，冷却至室温，向反应液中加入去离子水。有机层(甲苯)与水层分开，有机层用无水硫酸钠干燥，水层用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋转除去溶剂，得到棕黄色油状液体即为化合物4，无需纯化，直接用于下一步反应。4)氩气保护下，将DMF冷却至5℃，在滴加三氯氧磷，继续反应15min后，加入化合物4。将反应液升温至70-80℃，继续反应4h。反应结束后，将反应液倒入冰水中，用冷的15％的氢氧化钠溶液进行中和，然后，反应液用乙酸乙酯萃取，有机层用无水硫酸钠干燥。除去溶剂，柱层析纯化得到黄色液体即为化合物3。5)氩气保护下，将铝粉加入乙腈中，室温搅拌。向其中缓慢加入碘，加入完毕后，将化合物3溶于乙腈中，滴加入体系，滴加完毕后，升温至回流继续反应12h。反应终止，降温，将反应液倒入冰水中，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋转除去溶剂，柱层析纯化得到黄色液体即为化合物2。6)将化合物2、2，4-二硝基氟苯溶于DMF中，再加入一滴哌啶，然后加入K2CO3，加热至70℃反应3h，停止反应冷却至室温，将其倒入50mL水中，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋干得粗产品，最终经柱层析分离得到化合物1。7)将化合物1、丙二腈溶于乙醇和二氯甲烷混合溶剂中,加入少量哌啶，室温搅拌3h，停止反应，将反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，柱层析分离得到探针分子。在本说明书的实施例中更详细地说明了该探针的合成和检测方法。
本发明的荧光分子探针使用方法如下，将探针分子溶解在含有30％乙腈、1mmol CTAB、pH为7.4的HEPES缓冲溶液中，室温下进行测试。当加入苯硫酚时，由于2,4-二硝基苯醚基团可以在苯硫酚的诱导下发生的裂解，使荧光得以恢复。探针分子与苯硫酚作用原理如下，
本发明的苯硫酚荧光探针的具体特征如下：探针分子无明显发射峰，但与苯硫酚作用后，探针分子在626nm处出现明显的发射峰，荧光强度增强了50倍以上。
本发明所述的探针分子合成简单，成本较低，对苯硫酚的选择性好、抗干扰能力强、响应速度快使得该荧光探针在生物化学，环境科学等领域具有实际的应用价值。
附图说明
图1为本发明荧光探针的选择性，荧光探针(10-5mol/L)在HEPES缓冲溶液(20mM，VDMSO/VHEPES＝3/7，pH＝7.4，1mmol CTAB)中，与2倍当量的不同分析物作用后的荧光光谱，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。
图2为本发明荧光探针的抗干扰能力，苯硫酚与2倍当量的其他分析物共存，与荧光探针10-5mol/L)在缓冲溶液(20mM，VDMSO/VHEPES＝3/7，pH＝7.4，1mmol CTAB)中作用后626nm处的荧光强度比值(I/I0)柱状图。其中23种分析物分别为：1，对甲酚；2，3-巯基丙酸；3，2-巯基乙醇；4，半胱氨酸；5，谷甘胱肽；6，同型半胱氨酸；7，甘氨酸；8，丙氨酸；9，氯化钠；10，碘化钠；11，溴化钠；12，氟化钠；13，亚硝酸钠；14，叠氮化钠；15，硫酸钠；16，硫代硫酸钠；17，亚硫酸钠；18，磷酸钠；19，氯化钾；20，氯化镁；21，氯化钙；22，氯化锌；23，硫化钠。
图3为本发明的荧光探针(10-5mol/L)在HEPES缓冲溶液(20mM，VDMSO/VHEPES＝3/7，pH＝7.4，1mmol CTAB)中，与不同浓度苯硫酚作用后的荧光光谱变化，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。
图4为本发明的荧光探针(10-5mol/L)在HEPES缓冲溶液(20mM，VDMSO/VHEPES＝3/7，pH＝7.4，1mmol CTAB)中，与苯硫酚浓度的线性关系，横坐标为苯硫酚浓度，纵坐标为荧光强度。
图5为本发明的荧光探针(10-5mol/L)在HEPES缓冲溶液(20mM，VDMSO/VHEPES＝3/7，pH＝7.4，1mmol CTAB)中，与苯硫酚作用过程中荧光强度随时间的变化，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度。
图6为本发明的荧光探针(10-5mol/L)在不同pH值缓冲溶液中，与苯硫酚作用前后的荧光强度，横坐标为pH，纵坐标为荧光强度。
具体实施方式
实施例1：化合物6的合成
称取4-甲氧基-2硝基苯胺(16.8g，0.1mol)和10％Pd/C于500mL圆底单颈烧瓶中，加入200mL甲醇溶解，用氩气充分换气三次后通入氢气，升温至60℃反应12h，反应结束后，冷却至室温，抽滤，除去催化剂，用旋转除去溶剂，得到棕色液体即为化合物6。
实施例2：化合物5的合成
将化合物6溶于350mL乙腈溶液中，加入乙二醛溶液(40％，32mL，2.6mol)，升温至60℃反应6h。反应结束后冷却，旋转除去溶剂得到棕色固体即为化合物5。产量：13.6g。产率：85％。m.p.58-60℃。
实施例3：化合物4的合成
称取化合物5(5.5g，0.034mmol)于500mL圆底单颈烧瓶中，加入150mL甲苯溶解，将反应液冷却至0℃。向冷却的溶液中缓慢加入硼氢化钠(13.2g，0.35mol)，得到的棕黄色溶液继续搅拌10min。将醋酸(57.3mL，1mol)缓慢滴加到上述溶液中，并保持反应液温度在5-10℃之间，滴加完毕后继续反应1h。升温至回流，反应5h。反应结束后，冷却至室温，向反应液中加入去离子水250mL。有机层(甲苯)与水层分开，有机层用无水硫酸钠干燥，水层用乙酸乙酯150mL萃取，无水硫酸钠干燥，旋转除去溶剂，得到棕黄色油状液体6.35g，即为化合物4，无需纯化，直接用于下一步反应。
实施例4：化合物3的合成
氩气保护下，100mL圆底单颈烧瓶中加入DMF(10.1mL，0.13mol)，冷却至5℃，向上述溶液中滴加三氯氧磷(8.0mL，0.09mol)，继续反应15min后，将化合物4(11.0g，0.05mol)加入到上述反应液中。将反应液升温至70-80℃，继续反应4h。反应结束后，将反应液倒入冰水中，用冷的15％的氢氧化钠溶液进行中和，然后，反应液用乙酸乙酯萃取(4×100mL)，有机层用无水硫酸钠干燥。除去溶剂，柱层析纯化(V石油醚/V乙酸乙酯＝3/1)得到黄色液体即为化合物3。产量：9.67g。产率：78％。化合物3表征如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.12(s,1H),6.45(s,1H),6.0(s,1H),3.89(s,3H),3.56–3.51(m,2H),3.41(q,J＝6.9Hz,2H),3.33(q,J＝6.9Hz,2H),3.17–3.12(m,2H),1.24(t,J＝6.9Hz,3H),1.16(t,J＝6.9Hz,3H).
实施例5：化合物2的合成
氩气保护下，100mL圆底单颈烧瓶中，加入铝粉(0.84g，0.029mol)于30mL乙腈溶液中，室温搅拌。向上述溶液中缓慢加入碘(9.14g，0.037mol)，加入完毕后，将化合物3(6g，0.024mol)溶于10mL乙腈中，滴加到上述溶液中，滴加完毕后，升温至回流继续反应12h。反应终止，降温，将反应液倒入200mL冰水中，乙酸乙酯萃取(4×100mL)，无水硫酸钠干燥，旋转除去溶剂，柱层析纯化(V石油醚/V乙酸乙酯＝3/1)得到黄色液体即为化合物2.产量：3.37g。产率：60％。化合物2的表征如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.20(s,1H),7.0(s,1H),6.0(s,1H),3.93(s,3H),3.54–3.49(m,2H),3.41(q,J＝6.9Hz,2H),3.31(q,J＝6.9Hz,2H),3.18–3.13(m,2H),1.23(t,J＝6.9Hz,3H),1.16(t,J＝6.9Hz,3H).
实施例6：化合物1的合成
将化合物2(116.6mg，0.5mmol)、2，4-二硝基氟苯(120.1mg，0.64mol)溶于10mL DMF中，再加入一滴哌啶，然后加入K2CO3(87.1mg，0.63mmol)，加热至70℃反应3h，停止反应冷却至室温，将其倒入50mL水中，用乙酸乙酯萃取(15mL×4),无水硫酸钠干燥，旋干得粗产品，最终经柱层析分离得到化合物1，淋洗剂：V石油醚/V乙酸乙酯＝4/1，产物为棕色固体，产率：78％。化合物1表征如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.84(s,1H),8.87(d,J＝1.7Hz,1H),8.30(dd,J＝9.3,2.7Hz,1H),7.10–7.04(m,1H),7.01(s,1H),6.16(s,1H),3.56(d,J＝4.4Hz,2H),3.43–3.36(m,4H),3.31(s,2H),1.23(t,3H),1.19(t,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ185.6,157.5,149.6,142.8,141.1,138.7,133.0,128.9,122.1,117.6,116.3,108.8,100.9,47.3,45.9,45.4,44.5,10.7,10.0.
实施例7：探针分子的合成
将化合物1(0.0735g，0.18mmol)、丙二腈(0.0119mg，0.18mmol)溶于10mL乙醇和二氯甲烷混合溶剂中(V乙醇/V二氯甲烷＝8/2),在加入15μL哌啶，室温搅拌3h，停止反应，将反应液倒入100mL水中，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，柱层析分离得到探针分子，淋洗剂：V石油醚/V乙酸乙酯＝1/1，产物为红棕色固体，产量35mg，产率43％。探针分子表征如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.90(d,J＝2.7Hz,1H),8.37(dd,J＝9.2,2.7Hz,1H),7.67(s,1H),7.60(s,1H),7.01(d,J＝9.2Hz,1H),6.13(s,1H),3.70–3.53(m,2H),3.41(m,J＝21.2,7.1Hz,4H),3.36–3.32(m,2H),1.28(t,J＝7.1Hz,3H),1.19(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ156.2,149.1,148.8,143.7,141.7,139.2,132.9,129.0,122.3,118.0,115.6,115.0,111.8,106.8,100.3,72.7,47.6,46.1,45.7,44.2,10.9,9.8.
实施例5：本发明苯硫酚荧光探针的性能测试
将探针溶于缓冲溶液(20mM，VDMSO/VHEPES＝3/7，pH＝7.4，1mmol CTAB)中配制成10-5mol/L的溶液，向溶液中加入2倍当量的对甲酚，3-巯基丙酸，2-巯基乙醇，半胱氨酸，谷甘胱肽，同型半胱氨酸，甘氨酸，丙氨酸，氯化钠，碘化钠，溴化钠，氟化钠，亚硝酸钠，叠氮化钠，硫酸钠，硫代硫酸钠，亚硫酸钠，磷酸钠，氯化钾，氯化镁，氯化钙，氯化锌，硫化钠后没有明显的荧光变化，加入2倍当量的苯硫酚后引起了极为明显的荧光变化，该荧光探针对苯硫酚表现出高灵敏度、高选择性的识别。当苯硫酚分别与干扰物质对甲酚，3-巯基丙酸，2-巯基乙醇，半胱氨酸，谷甘胱肽，同型半胱氨酸，甘氨酸，丙氨酸，氯化钠，碘化钠，溴化钠，氟化钠，亚硝酸钠，叠氮化钠，硫酸钠，硫代硫酸钠，亚硫酸钠，磷酸钠，氯化钾，氯化镁，氯化钙，氯化锌，硫化钠共存时，探针不受干扰因素的影响，表现出来很好的抗干扰能力。探针分子在pH为6至10的范围内都可以对苯硫酚选择性识别。
实施例6：本发明苯硫酚荧光探针的实际应用
配制一系列10-5mol/L探针的缓冲溶液(20mM，VDMSO/VHEPES＝3/7，pH＝7.4，1mmol CTAB)，分别加入0-30μM的苯硫酚，完全反应后，测得的626nm处的荧光强度与苯硫酚浓度在0-14μM的范围内具有良好的线性，线性相关系数R＝0.99978，检出限为0.23μM。
Claims (3)
1.一种苯硫酚荧光探针，其结构为：
2.如权利要求1所述的苯硫酚荧光探针的制备方法，其特征在于按以下步骤进行制备：
(a)将4-甲氧基-2硝基苯胺和10％Pd/C溶于甲醇中，用氩气充分换气三次后通入氢气，升温至60℃反应12h，反应结束后，冷却至室温，抽滤，除去催化剂，用旋转除去溶剂，得到棕色液体为化合物6。
(b)将上一步所得化合物6溶于乙腈中，加入乙二醛溶液，升温至60℃反应6h。反应结束后冷却，旋转除去溶剂得到棕色固体即为化合物5。
(c)将上步所得化合物5溶于甲苯中，将反应液冷却至0℃。向冷却的溶液中缓慢加入硼氢化钠，得到的棕黄色溶液继续搅拌10min。将醋酸缓慢滴加到体系中，并保持反应液温度在5-10℃之间，滴加完毕后继续反应1h。升温至回流，反应5h。反应结束后，冷却至室温，向反应液中加入去离子水。有机层(甲苯)与水层分开，有机层用无水硫酸钠干燥，水层用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋转除去溶剂，得到棕黄色油状液体即为化合物4，无需纯化，直接用于下一步反应。
(d)氩气保护下，将DMF冷却至5℃，在滴加三氯氧磷，继续反应15min后，加入化合物4。将反应液升温至70-80℃，继续反应4h。反应结束后，将反应液倒入冰水中，用冷的15％的氢氧化钠溶液进行中和，然后，反应液用乙酸乙酯萃取，有机层用无水硫酸钠干燥。除去溶剂，柱层析纯化得到黄色液体即为化合物3。
(e)氩气保护下，将铝粉加入乙腈中，室温搅拌。向其中缓慢加入碘，加入完毕后，将化合物3溶于乙腈中，滴加入体系，滴加完毕后，升温至回流继续反应12h。反应终止，降温，将反应液倒入冰水中，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋转除去溶剂，柱层析纯化得到黄色液体即为化合物2。
(f)将化合物2、2，4-二硝基氟苯溶于DMF中，再加入一滴哌啶，然后加入K2CO3，加热至70℃反应3h，停止反应冷却至室温，将其倒入50mL水中，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋干得粗产品，最终经柱层析分离得到化合物1。
(g)将化合物1、丙二腈溶于乙醇和二氯甲烷混合的溶剂中,加入少量哌啶，室温搅拌 3h，停止反应，将反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，柱层析分离得到探针分子。
3.根据权利要求1所述的苯硫酚荧光探针的用途，其特征在于该苯硫酚荧光探针能够用于环境或生物样品中苯硫酚的荧光检测和分析。
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