CN103305621B - 非诊断目的的fret原理的5-羟甲基胞嘧啶的荧光检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种非诊断目的的FRET原理的5-羟甲基胞嘧啶的荧光检测方法，包括如下步骤：先用高钌酸钾将DNA中的5-羟甲基胞嘧啶氧化成5醛基胞嘧啶；再用带荧光的BODIPY化合物与DNA中的5醛基胞嘧啶反应；最后加入阳离子荧光聚合物，通过荧光检测来定量DNA中5羟甲基胞嘧啶的含量。该检测方法具有简单快速，成本较低的优点。
Description
技术领域
本发明涉及非诊断目的的DNA中5羟甲基胞嘧啶的荧光检测方法。
背景技术
表观遗传学被定义为研究基因表达水平(量变)信息的遗传。DNA甲基化及其去甲基化过程是表观遗传学的主要形式。
DNA甲基化与肿瘤有极大的关系。DNA异常甲基化发生频率高的分子可作为临床监控病程和评估疗效的较好指标。同时，DNA异常甲基化发生频率高的分子也有望成为肿瘤早期诊断的肿瘤标志物。且在癌症防治上,可防止癌变早期基因组稳定性的发生,从而减少肿瘤易感性突变的可能,达到癌症的早期预防。同时DNA去甲基化过程做为与DNA甲基化息息相关的过程，在表观遗传学方面有极其重大的意义。DNA去甲基化过程现在研究主要有两种途径，第一个是DNA中的5甲基胞嘧啶经过TET酶的氧化形成5-羟甲基胞嘧啶，而5-羟甲基胞嘧啶经过脱氨基过程后可以形成5-羟甲基尿嘧啶后经过碱基修复过程即可达到去甲基化的目的。第二种是DNA中的5-甲基胞嘧啶经过TET酶的氧化形成5-羟甲基胞嘧啶后进一步氧化形成5-醛基胞嘧啶后氧化形成5-羧基胞嘧啶。而5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶将醛基和羧基脱去后能形成胞嘧啶。故5-羟甲基胞嘧啶在DNA的去甲基化过程中起着很重要的作用。
现有的5-羟甲基胞嘧啶的检测方法主要有质谱法、基因组测序法，科学家用质谱法在胚胎干细胞中检测到5-羟甲基胞嘧啶，该方法检出下限很低，精确度很高，但是仪器较为昂贵且步骤较为繁琐。此外科学家运用基因组测序法分析了5-羟甲基胞嘧啶在胚胎干细胞基因组中的分布并分析了5-羟甲基胞嘧啶与基因转录的关系。目前基因组测序的方法分为高钌酸钾氧化法和糖基转移酶法。
然而这些方法检测5-羟甲基胞嘧啶的精确度较为繁琐且昂贵。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单、快速的5-羟甲基胞嘧啶的检测方法，FRET原理的5-羟甲基胞嘧啶的荧光检测方法，包括如下步骤：
(1)用高钌酸钾将DNA中的5羟甲基胞嘧啶氧化成5醛基胞嘧啶；
(2)用带荧光的BODIPY化合物与DNA中的5醛基胞嘧啶反应：以回香胺为催化剂，在pH＝5-7的醋酸铵缓冲溶液中带荧光的BODIPY化合物与含醛基的DNA在25-40℃条件下反应12-24h，用氯仿萃取产物；
(3)加入阳离子荧光聚合物，通过荧光检测来定量DNA中5羟甲基胞嘧啶的含量：将阳离子荧光聚合物加入到步骤(2)中的产物中，震荡离心，以380nm为发射波长，通过检测荧光强度来定量5羟甲基胞嘧啶的含量。
所述带荧光的BODIPY化合物的结构式为：
上述物质的合成方法：以对氯甲基苯磺酰氯，2,4-二甲基吡咯，乙醚合三氟化硼，羟基邻苯二甲酰亚胺，及水合肼等化合物为原料经过3步反应制备，合成路线如下：
带荧光的BODIPY化合物的制备方法具体为：对氯甲基苯磺酰氯、2,4-二甲基吡咯以1:2的比例在氩气的保护下以二氯甲烷为溶剂室温搅拌12h，后加入三乙胺室温搅拌1小时，再加入乙醚合三氟化硼搅拌1h，旋干溶剂过硅胶柱分离产物；将所得产物溶解于DMF中，加入2倍量的羟基邻苯二甲酰亚胺，三倍量的碳酸钾，等量的碘化钾在70℃的条件下回流12h，后将溶剂旋干，过硅胶柱分离产物；将所得产物溶于甲醇，加入过量水合肼，用氯仿萃取，蒸干溶剂。
该物质是荧光量子产率很高的BODIPY，该化合物含有羟胺基团故可以和醛基胞嘧啶的醛基形成亚胺键。该荧光物质的最大吸收在488nm，最大发射在518nm。
所述阳离子荧光聚合物的结构式为：
上述物质的合成方法为：
以2,7-二溴-9,9(6-溴己基)芴，苯二硼酸，三甲胺水溶液等为原料经两步反应制备。反应路线如下：
该阳离子荧光聚合物的制备方法具体为：2,7-二溴-9,9(6-溴己基)芴、苯二硼酸的比例为1:10，再加入1％的氯化钯和12倍碳酸钾做催化剂，以水和四氢呋喃(比例为1：2)作溶剂，80℃反应24h，旋干溶剂，用氯仿萃取，旋干，用氯仿、甲醇混合溶剂重结晶得黄色中间产物；将该中间产物溶于THF，加入三甲胺溶液，搅拌24h，旋干，用甲醇和乙醚多次洗涤，得灰色粉末为阳离子荧光聚合物。
该阳离子聚合物由于它们的集光性质和与带负电荷的DNA的静电作用力，它常与肽核酸以FRET原理为基础检测相关核酸。
FRET即荧光能量共振转移(fluorescence resonance energy transfer)是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多，而受体发射的荧光却大大增强。本发明中阳离子荧光聚合物与DNA结合，而带荧光的BODIPY化合物的羟胺基团与DNA上的5-醛基胞嘧啶反应，这样阳离子荧光聚合物与带荧光的BODIPY化合物的距离能在10nm的范围以内，从而在激发阳离子荧光聚合物后会有较强的FRET荧光产生。
合成上述两个化合物后以FRET原理对DNA中的5-羟甲基胞嘧啶进行荧光检测。
本发明是以FRET原理为基础通过荧光的方法检测合成DNA及基因中5羟甲基胞嘧啶含量。该方法有效地消除了荧光小分子化合物的荧光背景，同时通过FRET产生的荧光可以较为灵敏的检测到胚胎干细胞中微量的5羟基胞嘧啶。该检测方法具有简单快速，成本较低的优点。
附图说明
图1为以FRET为原理检测合成的DNA中醛基含量的荧光图；
图2为以FRET为原理检测合成的DNA中醛基含量的荧光强度线性图；
图3为通过高钌酸钾氧化和线性关系检测Hela细胞中的5羟甲基胞嘧啶的含量。
具体实施方式
以下以具体实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不限制本发明的内容。
实施例1：带荧光的BODIPY化合物的合成：
将5.7g2,4-二甲基吡咯(60mmol)溶于120ml的二氯甲烷中，在氩气的保护下将5.67g对氯甲基苯磺酰氯(30mmol)滴入到搅拌的2,4-二甲基吡咯溶液中，室温搅拌12h后，加入20ml的三乙胺反应1小时。后旋干，过硅胶柱，得带荧光的BODIPY化合物的中间体A，产率27％。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm):7.51(d,J＝6.6Hz,2H),7.26(d,J＝6.6Hz,2H),5.97(s,2H),4.65(s,2H),2.54(s,6H),1.37(s,6H)；13C NMR(75MHz,CDCl3)δ:155.58,142.96,140.88,138.54,134.98,131.24,129.20,128.33,121.27,45.53,14.52,14.40.HRMS(ESI)calcd forC20H21*BClF2N2[M+H]+:373.1449；found:373.1452。
将3g带荧光的BODIPY化合物的中间体A(8mmol)溶于50ml的DMF中，依次加入羟基邻苯二甲酰亚胺(2.61g,16mmol),K2CO3(3.3g,24mmol),KI(133mg,0.8mmol)，在70℃下反应12h。得到中间产物B。产率为18％。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm):7.75(d,J＝6.2Hz,4H),7.64(d,J＝7.5Hz,2H),7.28(d,J＝7.5Hz,2H),5.94(s,2H),5.29(s,2H),2.52(s,6H),1.27(s,6H)；13CNMR(75MHz,CDCl3)δ:163.31,155.55,142.96,136.07,134.48,130.82,128.59,128.17,123.42,121.23,78.86,14.49,14.37.HRMS(MALDI)calcd forC28H24*BF2N3O3[M+H]+:498.1910；found:498.1918。
将中间体B溶于0.5ml甲醇溶液中，加入2滴水合肼反应1h，再加入0.5ml的水溶液和0.5ml的氯仿。取氯仿层，离心浓缩，即可得到最终产物。
实施例2：阳离子荧光聚合物的合成：
将325mg 2,7-二溴-9,9(6-溴己基)芴(0.5mmol)，82.9mg 1,4-苯二硼酸(5mmol)，7mg二氯化钯，溶于3ml 2M的碳酸钾溶液和四氢呋喃的混合溶液中，在80℃条件下反应24h。反应产溶液加入氯仿萃取，旋干。加入氯仿和甲醇(1:100)重结晶。得中间产物C。产率为70％。1H NMR(300MHz,CDCl3,ppm):δ7.8(m,5H),7.7-7.6(m,4H),7.5(m,1H),3.3(t,4H),2.1(m,4H),1.7(m,4H),1.3-1.2(m,8H),0.8(m,4H).Mw:2203g/mol；Mn:1072g/mol；PDI:2.05.
将200mg化合物C溶于5ml的THF，加入2ml三甲胺溶液，搅拌24h，旋干，用甲醇和乙醚多次洗涤。得灰色粉末为阳离子荧光聚合物。产率为51％。1HNMR(300MHz,CD3OD,ppm)：δ7.9-7.8(m,10H)，3.2(t,4H)，3.0(s,18H)，2.3(br,4H)，1.6(br,4H)，1.2(br,8H)，0.8(br,4H)。
实施例3：以FRET原理为基础通过荧光的方法检测合成DNA及基因中5羟甲基胞嘧啶含量。
取1.5ml的EP管，向里面加入75μl的水溶液，10μl的pH＝5-7的醋酸铵的缓冲溶液，10ul的回香胺溶液(1M的DMSO溶液)，4μl的BODIPY荧光化合物(1mm的DMSO溶液)，和1μl的含醛基胞嘧啶的DNA或基因组DNA,25-40℃反应12-24h，用氯仿萃取三遍。再加入1ul的阳离子荧光聚合物(1mm的水溶液)。震荡，离心。用380nm的激发波长激发。先通过合成的DNA做出醛基胞嘧啶的荧光图，如图1所示，与醛基含量的线形图，如图2所示；再通过检测氧化Hela细胞基因的荧光含量来定量基因中羟甲基胞嘧啶的含量，如图3所示。测得Hela细胞基因中的羟甲基胞嘧啶含量为0.012％。
本发明通过以FRET原理为基础通过荧光的方法检测DNA中羟甲基胞嘧啶的含量。
Claims (1)
1.非诊断目的的FRET原理的5-羟甲基胞嘧啶的荧光检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)用高钌酸钾将DNA中的5羟甲基胞嘧啶氧化成5醛基胞嘧啶；
(2)用带荧光的BODIPY化合物与DNA中的5醛基胞嘧啶反应：以回香胺为催化剂，在pH＝5的醋酸铵缓冲溶液中带荧光的BODIPY化合物与含醛基的DNA在37℃条件下反应12h，用氯仿萃取产物，所述带荧光的BODIPY化合物的结构式为
(3)加入阳离子荧光聚合物，通过荧光检测来定量DNA中5羟甲基胞嘧啶的含量：将阳离子荧光聚合物加入到步骤(2)中的产物中，震荡离心，以380nm为发射波长，通过检测荧光强度来定量5羟甲基胞嘧啶的含量，所述阳离子荧光聚合物的结构式为
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