JP6275256B2 - ボロンジピロメテン蛍光プローブ、その製造方法及び応用 - Google Patents
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Description
下記一般式Iで表される構造を有するボロンジピロメテン蛍光プローブ。
(1)水溶液において蛍光を殆ど発しないため、検出過程においてバックグラウンド蛍光による影響が低減する。
(2)感度が高く、ナノモル濃度の次亜塩素酸/次亜塩素酸イオンの存在下でも蛍光が顕著に強くなり、かつ蛍光強度が次亜塩素酸の濃度と良好な直線性関係を示す。
(3)選択性が良好であり、その他の活性酸素、例えば、H2O2、・OHなどに対しては殆ど応答しない。
(4)応答が迅速であり、次亜塩素酸を加えると、数秒間以内に蛍光強度が平衡状態になる。
(5)pH4.0〜9.0の範囲において、次亜塩素酸に対する検出結果が正確であり、pHの影響を受けにくい。
(6)合成が簡便で、製品を得やすい。
本明細書に使用される用語「アルキル基」には、直鎖状アルキル基および分岐状アルキル基が含まれるが、単一のアルキル基、例えば「プロピル基」を言及する場合、直鎖状アルキル基のみを意味し、単一の分岐状アルキル基、例えば「イソプロピル基」を言及する場合、分岐状アルキル基のみを意味する。例えば、「C1〜4のアルキル基」には、メチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基およびt-ブチル基などが含まれる。このような規則は、本明細書に使用されるその他の官能基にも適用する。
蛍光プローブ化合物BClOの合成
次亜塩素酸イオンに対する蛍光プローブ化合物BClOの蛍光滴定実験
1μMのプローブ化合物BClOをPBS緩衝液(染料の助溶剤として10%容量比のアルコールを含む。pH=7.4)に加え、次亜塩素酸イオンの濃度がそれぞれ0、1、2、3、4、5、6、7μMになるように、徐々に次亜塩素酸ナトリウム溶液を加え、応答する蛍光強度を記録した。励起波長を480nmとした。測定結果は、図1aおよび図1bに示す。図からわかるように、プローブ化合物の最大発光ピーク505nmにおける蛍光強度は、次亜塩素酸ナトリウム濃度の増加に伴って徐々に増加し、次亜塩素酸ナトリウムの濃度が5μMである時に飽和する。
次亜塩素酸イオンに対する蛍光プローブ化合物BClOの吸収滴定実験
1μMのプローブ化合物BClOをPBS緩衝液(染料の助溶剤として10%容量比のアルコールを含む。pH=7.4)に加え、次亜塩素酸イオンの濃度がそれぞれ0、1、2、3、4、5、6、7μMになるように、徐々に次亜塩素酸ナトリウム溶液を加え、吸収強度を記録した。測定結果は図2に示す。図からわかるように、プローブ化合物の吸収スペクトルは、次亜塩素酸ナトリウム濃度の増加に伴っても殆ど変化しない。
次亜塩素酸イオンに対する蛍光プローブ化合物BClOの選択性実験
上記合成された化合物BClOを用いて、次亜塩素酸イオンおよび活性酸素に対する選択性を評価した。1μMの化合物BClOを、5μMの次亜塩素酸イオンまたは10μMのその他の活性酸素(H2O2、O2 −、TBHP、HO・、TBO・、1O2、NO・)を含有するPBS緩衝液(染料の助溶剤として10%容量比のアルコールを含む。pH=7.4)に加え、励起波長を480nmとし、発光波長を505nmとし、それぞれの蛍光強度を記録した。測定結果は図3に示す。図からわかるように、蛍光プローブ化合物BClOは、次亜塩素酸ナトリウムに対する選択性が非常に高く、5μMの次亜塩素酸ナトリウムでは蛍光強度が顕著に増加する(100倍)が、その他の活性酸素が添加されても蛍光強度が殆ど変化しない。
次亜塩素酸イオンに対する蛍光プローブ化合物BClOの検出感度
上記合成された化合物BClOを用いて、ナノモルレベル濃度の次亜塩素酸イオンに対する応答を評価した。化合物BClO(1μM)を、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10nM各濃度の次亜塩素酸ナトリウムを含有するPBS緩衝液(染料の助溶剤として10%容量比のアルコールを含む。pH=7.4)に加え、480nmで励起し、蛍光スペクトルおよび505nmにおける蛍光強度を記録した。測定結果は図4に示す。図からわかるように、蛍光プローブ化合物BClOは、次亜塩素酸イオンの濃度が0〜10nMの範囲において蛍光強度が顕著に増加し、且つ蛍光強度が次亜塩素酸ナトリウムの濃度と良好な直線性関係を示す(R2=0.99724)。従って、蛍光プローブ化合物BClOは、低濃度の次亜塩素酸ナトリウムの検出にも応用できる。3σ/kにより算出した検出限界が0.56nMであった。
次亜塩素酸イオンに対するプローブ化合物BClOの応答時間測定
図5は、次亜塩素酸イオンに対するプローブ化合物BClOの時間関数を示す図である。プローブ化合物BClOの濃度を1μMとし、測定システムをPBS緩衝液(染料の助溶剤として10%容量比のアルコールを含む。pH=7.4)とし、励起波長を480nmとし、BClOの505nmにおける経時的蛍光強度を記録した。図5からわかるように、BClOは次亜塩素酸イオンに対する応答が非常に迅速であり、1秒以内に平衡に達する。横軸に時間(秒)、縦軸に蛍光強度を表示する。
プローブ化合物BClOによる次亜塩素酸イオンの検出に対するpHの影響に関する研究
上記合成された化合物BClOを用いて、pHに対する応答を評価した。化合物BClO(1μM)を含有するPBS緩衝液(染料の助溶剤として10%容量比のアルコールを含む)を約pH4.0に調整し、励起波長を480nmとし、プローブの蛍光強度および5μMの次亜塩素酸ナトリウムを加えた後の蛍光強度を測定した。その後、塩基溶液を加え、約pH9.0へ徐々に増加し、それぞれの蛍光強度変化を記録した。測定結果は図6に示す。図からわかるように、pH4.0〜9.0の範囲において、pHの変化が蛍光プローブ化合物BClO自身の蛍光発光および次亜塩素酸ナトリウムを加えた後の蛍光発光にはほぼ影響を与えない。従って、プローブ化合物BClOはこのpH範囲において次亜塩素酸イオンの検出に用いられる。横軸にpH、縦軸に蛍光強度を表示する。実験では、NaOH(1M)またはHCl(1M)を用いてpHを調整した。
プローブ化合物BClOによる、MCF−7細胞における各濃度の次亜塩素酸イオンの検出に関する研究
MCF−7細胞を10%のFCS(invitrogen)を含有するDEME(invitrogen)で培養した。共焦点蛍光イメージング実験を行う前日、細胞を専用の細胞共焦点培養皿に播種した。翌日、その中に1μMのプローブ化合物BClOを加え、37℃、5%CO2の条件下で20分間インキュベーションした後、リン酸緩衝液で3回洗浄し、共焦点イメージングを行った。同様の条件で、さらに3μMまたは5μMの次亜塩素酸ナトリウムを加え、直ちに共焦点イメージングを行った。
プローブ化合物BClOによる、Raw264.7細胞における内因性次亜塩素酸の検出に関する研究
Raw264.7細胞を10%のFCS(invitrogen)を含有するDEME(invitrogen)で培養した。共焦点蛍光イメージング実験を行う前日、細胞を専用の細胞共焦点培養皿に播種した。翌日、その中に1μMのプローブ化合物BClOを加え、37℃、5%CO2の条件下で20分間インキュベーションした後、リン酸緩衝液で3回洗浄し、共焦点イメージングを行った。同様の条件で、Raw264.7細胞を1μg/mLのLPS(リポ多糖)と12時間インキュベーションし、さらに1μg/mLのPMA(ホルボールミリステート酢酸塩)と1時間インキュベーションした後、1μMのプローブ化合物BClOを加え、37℃、5%CO2の条件下で20分間インキュベーションした。その後、リン酸緩衝液で3回洗浄し、共焦点イメージングを行った。
Claims (9)
- 前記R1及びR3は、それぞれ独立にHおよびメチル基からなる群より選ばれるものである請求項1に記載のボロンジピロメテン蛍光プローブ。
- 前記R1及びR3は、いずれもメチル基である請求項2に記載のボロンジピロメテン蛍光プローブ。
- 前記R2は、水素原子またはエチル基である請求項1〜3のいずれか一項に記載のボロンジピロメテン蛍光プローブ。
- 前記R2は、水素原子である請求項4に記載のボロンジピロメテン蛍光プローブ。
- 前記一般式IIで表される構造を有する化合物と塩化アクリルを3:1のモル比で反応させる請求項6に記載の製造方法。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載のボロンジピロメテン蛍光プローブを用いて、次亜塩素酸イオンを検出する方法。
- 前記ボロンジピロメテン蛍光プローブを用いて、生細胞における次亜塩素酸イオンを検出する請求項8に記載の方法。
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