CN1944540A - 生物分析用近红外氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一类新型的苯乙烯基取代的氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料，这类染料是由氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料与苯甲醛类化合物反应而形成。单苯乙烯基取代的部分染料(含胺基)的吸收和发射光谱进入了近红外的区域；而双苯乙烯基取代染料的吸收和发射光谱普遍进入了近红外区域。当染料结构中的R2中有任何一个基团或者全部都为氨基时，染料受到光激发后或发生分子内的电荷转移现象(ICT)，而ICT现象可以被质子完全抑制，使光谱波长变短，荧光量子产率急剧升高，因此该类分子可以作为pH探针来用于测试酸碱度，也可以基于ICT现象设计合成高灵敏的离子探针和糖探针。
Description
技术领域
本发明属于生物荧光分析技术领域所用的荧光染料。
背景技术
荧光分析技术是目前最重要的生物分析检测手段之一，它在DNA测序、药物代谢分析以及细胞内组织成分的测定等方面获得了广泛而深入的应用。荧光染料是荧光分析系统的重要组成部分，它的性质将影响甚至决定整个荧光检测的灵敏度和实用价值，不同的荧光染料即便是应用在同种物质分析过程中，其检测结果却可能有着较大的差异，这主要取决于荧光染料本身的物理化学性质。一个性能优异、适合荧光分析应用的荧光染料通常要具备以下的主要特征：
一、荧光量子产率较高，最好应该大于0.5。荧光量子产率高将有助于提高检测的灵敏度，使检测极限维持在较低浓度的水平。荧光量子产率的高低是衡量一个荧光染料优秀与否的最重要因素之一。
二、染料的最大吸收和发射波长应该较长，最好不要小于500nm。因为生物体内存在很多的有机共轭小分子，例如嘌呤、嘧啶、各种氨基酸，蛋白质分子等，他们在紫外区域都有吸收和发射光谱，如果荧光染料的吸收波长在紫外或者较短波长区域，将会降低荧光探针的灵敏度，并且某些干扰分子的自发荧光会掩盖探针的发射光谱，使检测的结果容易出现偏差。另外，紫外激发光照射在生物组织内而造成的散射光也对荧光的检测灵敏度也构成了很大障碍。
三、荧光染料应该具有较高的稳定性。无论是在光照下、酸碱条件下，还是在较高温度下，染料的化学性质应该稳定：不会发生严重的光氧化现象，不会在酸碱条件有较小改变的状况下光谱发生较大的波动，当然也不应该在稍高的温度下导致染料分子迅速的分解。
四、染料分子应该具有较好的细胞穿透能力和细胞内的溶解能力，这样以便能够设计出在细胞适合应用的荧光探针。染料分子既要有一定的油溶性又要有一定的水溶性，油溶性是为了便于穿透细胞膜，水溶性是为了有助于在细胞内很好的分散。染料分子的这两种性质可以通过引入合适的亲水性或者亲油性基团来调节。
五、染料基团对生物体应该没有或者仅有极小的毒害。荧光探针只对特定的靶标发生作用，而不应该由于自身结构的原因而对细胞内其它活性组织产生破坏作用，这样就失去了荧光探针的生物应用价值。而作为荧光探针重要组成部分的荧光团当然对细胞的毒害作用要小，尽量不要干扰细胞的活性。
纵观目前使用比较多的罗丹明类、荧光素类、香豆素类、芘类、萘酰亚胺类和菁类等荧光染料，它们的光谱除了菁类，大部分都处在紫外可见区，而生物样品自身在这个区域有很强的吸收，荧光检测时会显现出一定强度的自发荧光，造成强的荧光背景，从而极大地降低了检测的灵敏度。只有在长波长或者近红外区(600-1000nm)，荧光分析技术才能在组织细胞体内得到较为充分的应用，因而长波长和近红外荧光染料近年来受到了广泛的重视。但是，目前开发的近红外的菁染料仍然有致命的缺点：光稳定性差，荧光寿命短，荧光量子产率低，在溶液中常出现积聚等。因此，研究开发出更多的具有良好荧光光谱性能的新型荧光染料，仍然是荧光分析技术发展的关键和核心。
氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料是近些年涌现出来的具有优良光物理性能的生物分析用荧光染料之一。这类染料具有非常好的光稳定性、很高的量子产率(甚至在水中量子产率也能达到0.9以上)、较高的摩尔消光系数、能够有效地穿透细胞膜进入到细胞内部，而且对细胞基本没有毒性。因此该类染料被用于设计高灵敏度的荧光探针来探测金属离子、蛋白质，还被应用到合成DNA探针等领域，体现除了其他染料所不具备的优势和特色。然而，这些应用成果绝大部分是以光谱波长在500nm附近的短波长氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料作为信号传递的荧光团，这样就使得检测的结果容易受到细胞内各组分的干扰，降低检测的灵敏度。近几年有许多学者致力于开发长波长和近红外的氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料，目的就是为了使更多的近红外优秀染料应用到生物分析领域。
Kevin Burgess等人在氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料母体的3位和5位同时引入苯基和萘基使染料的光谱波长发生了红移，但是红移的程度并不理想，普遍红移了50nm左右[BurghartA.，Kim H.，Welch M.B.，Thoresen L. H.，Reibenspies J.and K.Burgess，3，5-Diaryl-4，4-difluoro-4-bora-3a，4a-diaza-s-indacene(BODIPY)Dyes：Synthesis，Spectroscopic，Electrochemical，and Structural Properties.J.Org.Chem.1999，64，7813-7819]，这说明苯基和萘基与染料母体并没有很好的共轭，而是存在一定角度，萘基取代的染料的晶体结构也证明了这一点。为了增强染料分子的刚性，Kevin Burgess等人又设计了让共轭杂环吡咯与酰氯反应生成新的染料[Chen，J.；Burghart，A.；Derecskei-Kovacs，A.and Burgess，K.，4，4-Difluoro-4-bora-3a，4a-diaza-s-indacene(BODIPY)Dyes Modified for Extended Conjugationand Restricted Bond Rotations.J.Org.Chem.2000，65，2900-2906.]，结果是光谱红移了近120nm，分子平面性的提高促使了这种光谱红移的发生，但是量子产率不高，维持在0.4以下。Erick M.Carreira等人依旧使用共轭杂环吡咯作为反应底物，并且在母体染料的1、7位同时再引进两个苯环，合成了氮杂的氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料[Zhao，W.and Carreira，E.M.Conformationally Restricted Aza-Bodipy：A Highly Fluorescent，Stable，Near-Infrared-AbsorbingDye.Angew.Chem.Int.Ed.2005，44，1677-1679.]，吸收光谱到达了740nm，遗憾的是量子产率低于0.3，合成步骤非常繁琐。因此，采用较为容易的方法合成光物理性能优异的氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料成为荧光分析领域的迫切需要。
发明内容
本发明的目的是将苯乙烯取代基引入到氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料母体中，设计合成出适用于生物荧光标示的结构新颖、性能优良的近红外氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料作为研究目标。
第一、本发明首先设计合成了单苯乙烯取代的氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料，使染料的光谱红移了60nm以上，含有氨基的染料荧光发射波长达到700nm以上，达到了近红外区域，荧光量子产率普遍达到0.8以上。
第二、本发明接着以单苯乙烯取代的氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料为基础，设计合成了双苯乙烯取代的氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料，使染料的光谱红移了120nm以上，吸收和发射光谱均达到625nm以上，特别是含有氨基的染料荧光发射波长达到800nm以上，进入了近红外区域，荧光量子产率普遍达到0.8以上。
第三、本发明通过典型化合物单晶结构揭示了苯乙烯取代氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料光谱红移的根本原因是苯乙烯基团与染料母体芳环呈良好的共轭状态，形成了大的π-π键共轭体系。
第四、本发明阐述了芳醛与氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料3、5位甲基加成消除反应的机理和影响因素，阐述了反应条件和分子结构的关系，为染料合成方法的改进和提高指明了方向。
第五、本发明研究了含有氨基的近红外氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料的ICT现象，通过质子的作用可以将ICT过程彻底的抑制，整个质子化过程可逆，使得该类染料可以作为pH探针来应用，另外还可以设计基于ICT机理的比例荧光探针。
本发明的近红外氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料的结构通式为I：
式中r1、r2、r6、r7为C1～18的烷基、环烷基、苯基、萘基；r3、r5中至少一个为反式苯乙烯类基团I’，r8为R1、R2或R3；r9～13为R2或R3；R2为R3、O-R3，S-R3或NR4R5；R3为(CH2)nR6、(CH2)mO(CH2)pR6、(CHR7CH2O)q(CH2)rR6或环己基；其中，n、m、p、q、r＝0-18；R4、R5为相同或不同的R3；R6＝H、Cl、Br、I、CN、NO2、SO3R8、CO2R8、NCS或N-琥珀酰亚胺酯I”；R7＝H、C1-18烷基或环己基；R8＝H或M；M＝Na、K或N(R9R10R11R12)；R9、R10、R11、R12＝H、C1-18烷基、环己基或(CH2)qOR7。
上述结构通式I中染料的优选结构为通式结构II或III：
通式中：R1’＝R2或R3；R2、R3的含义与结构通式I中的定义相同；III式中的R2可相同或不相同。
1、染料的合成
苯乙烯基取代的系列BODIPY染料I、II、III的合成是基于染料母体上3位和5位的甲基上所具有的一定酸性。甲基上的氢在碱性条件下容易以质子的形式脱除，形成碳负离子活性中间体，这就是母体染料具有进一步反应活性的根本原因。由母体染料与苯甲醛系列化合物反应生成染料I的反应机理下图所示。整个反应可以分为四个步骤：
第一步、母体染料在有机强碱(例如本反应中所使用的哌啶等)的作用下，3位或者5位的甲基上的氢以质子的形式被碱夺去，形成碳负离子活性中间体。
第二步、苯甲醛羰基上的亲电性的碳原子进攻碳负离子中间体，同时碳氧双键被打开，发生亲电加成反应。
第三步、碳负离子上的负电荷转移到氧原子上，形成更稳定的氧负离子。
第四步、在高温和季铵盐的共同作用下，氧负离子和一个氢原子脱去，生成碳碳双键，新化合物I生成，并且新生成一分子的水。
3位或者5位的甲基中的一个反应可制得化合物II，两个甲基都参与反应则可得到III，但第二个甲基的取代需要更长的反应时间。合成反应式举例如：
结合反应的机理，我们得到影响反应的主要因素有以下几个：
第一、碳负离子的稳定性对反应的影响。母体化合物中的8位苯环取代基的对位基团R1’对碳负离子的稳定性有相当的影响，如果R1’为较强的吸电子基团(例如硝基、氰基等)则会使碳负离子的稳定性有较大的提高。表1以生成系列化合物II为例说明R1’、R2对反应产率的影响，从表中可以看出由于R1’的不同使IIa和IId的产率相差一倍。
表1不同取代基的I系列化合物的合成基本条件和收率
| 染料 | R1’ | R2 | 温度/℃ | 时间/小时 | 产率 |
| IIaIIbIIcIIdIIeIIf | 甲基甲基甲基氰基氰基氰基 | 甲基甲氧基二甲氨基甲基甲氧基二甲氨基 | 120120100120120100 | 121261085 | 5％7％40％10％15％42％ |
第二、氧负离子脱除的难易程度对反应的影响。苯甲醛类反应底物对于反应的影响主要体现在醛上的取代基R2对于碳负离子脱去的影响方面，如果R2为强的给电子基团，例如：N，N-二甲氨基等，则氧负离子容易脱去，双键快速形成。
第三、有机碱的强弱，温度等其它因素的影响。反应中用到的有机碱为强碱，碱性较强则容易生成碳负离子。温度对反应的影响主要体现在最后一步脱水形成碳碳双键的速度和效率上，消除反应通常在较高的温度下进行，尤其当R1’是中性或者供电基团，并且R2是中性基团的时候，反应要求的温度较高。表1还列出了II系列化合物的反应温度和反应时间，从中可以看出上述关系。
第四、化合物II的取代基对合成化合物III的影响。化合物III是在化合物II的基础上与另一分子的苯甲醛反应得到的，因此，化合物II的取代基对合成III仍然有较大的影响。R1’对反应的影响与合成化合物II一致，吸电基团有利于反应进行；R2对合成III的影响与合成化合物II的过程恰恰相反，吸电性的R2有利于生成III的反应的进行，供电性的R2则对反应不利。这从根本上还是由碳负离子形成的难易程度来决定的。表2列出了系列化合物III的基本反应条件，可以看出III的产率总体上超过II，但是反应时间要略长，反应温度稍高。以IIc、IIf这两个含二甲氨基的染料出发合成的III系列染料的产率相对较低，这说明碳负离子形成较为困难这一原因成为这些目标化合物产率较低的决定性因素。
表2不同取代基的III系列化合物的合成基本条件和收率
| 染料 | R1 | R2 | R3 | 温度/℃ | 时间/小时 | 产率 |
| IIIaIIIbIIIcIIIdIIIeIIIfIIIgIIIhIIIiIIIj | 甲基甲基甲基甲基甲基氰基氰基氰基氰基氰基 | 甲基甲氧基二甲氨基二甲氨基二甲氨基甲基甲氧基二甲氨基二甲氨基二甲氨基 | 甲基甲氧基二甲氨基甲基甲氧基甲基甲氧基二甲氨基甲基甲氧基 | 120120120120120120120120120120 | 12121212121212121212 | 20％25％15％13％16％33％35％22％21％18％ |
2、染料的晶体结构
我们可以清楚的从图1中看到IIIb的晶体结构，两个苯乙烯双键都是反式构型，与BODIPY母体结构形成了大的共轭体系，这是促使II、III系列染料光谱红移的最重要原因。8位的苯基所在的平面与BODIPY平面之间的二面角是79.5°。经过仔细观察和计算还发现，两个苯乙烯基团所在的平面和BODIPY母体结构并不是共处在一个平面上，而是分布在BODIPY母体结构平面的两侧，从图1中的b图来看呈剪刀状，两个苯乙烯平面之间的二面角是18.1°，另外，图1a中还标明了一些重要的原子间的距离，长度单位是。由F-B-F这三个原子所构成的平面与BODIPY平面是相互垂直的。
3、染料的光谱特征
II系列染料的光谱性质：
我们选取典型的II系列染料的光谱数据，并将其列于表3中，IIa、IIb、IId、IIe为不含有胺基的染料，在极性差别较大的溶剂中，光谱的变化较小，吸收和发射光谱的波动在15nm左右，尤其是对吸收光谱的影响更小一些。光谱相对于母体染料大约红移了65nm左右。这四个染料斯托克斯位移(Stokes Shift)相对不大，不超过20nm。四个荧光化合物的荧光量子产率都很高，均大于0.8，在极性较小的正己烷中的量子产率甚至达到了1.0，这是氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料中罕见的高量子产率染料。
而IIc、IIf是含有氨基的染料，在极性不同的溶剂中染料的光谱出现明显的巨大差异，随着溶剂极性的增加染料的吸收光谱红移较小，约为10nm左右，但是荧光光谱红移90nm以上，斯托克斯位移也增大到100nm左右，染料的吸收和发射光谱均进入了近红外区域。同时，染料的荧光量子产率也随着溶剂极性的增加而显著降低，例如：IIc在正己烷中的量子产率为0.95，而在极性较大的二甲基甲酰胺(DMF)中量子产率降低到0.12。这是典型的分子内电荷转移现象(ICT)，由于胺基的存在导致染料在光激发后氨基氮原子上的一个电子发生迁移，从而淬灭了染料的荧光，并伴随着光谱的红移现象发生。
图2显示了染料母体(图中第一组曲线)与染料IIb(图中第二组曲线)在四氢呋喃(THF)中的吸收和荧光光谱图。从图中可以看出，相对与母体染料，IIb在紫外区的吸收(340nm处)明显要强于母体染料，这说明引入苯乙烯基团后，染料可以被激发到第二激发态S2状态。
图3显示了含有氨基的染料IIc在不同溶剂中的荧光光谱，随着溶剂极性的增加不仅荧光光谱波长变长，而且光谱的峰宽显著加大，这也是ICT现象的重要特征。
表3不同溶剂中IIa-f的光物理性质
| 染料 | 溶剂 | λ(abs)/nm | λ(em)/nm | Stokes Shift | ε/105M-1m-1 | Φf ** |
| 母体(R1’＝CH3) | THF | 499 | 508 | 9 | 0.62 | 0.65 |
| IIaIIbIIcIIdIIeIIf | DMFTHFHexaneDMFTHFHexaneDMFTHFHexaneDMFTHFHexaneDMFTHFHexaneDMFTHFHexane | 565562559570569570605600593572568566574575573620615610 | 575570566584581582698661607583577573593591587723689626 | 108714121293611411971916141017416 | 0.680.720.780.890.930.950.850.88n.d.*0.800.820.860.920.981.060.941.03n.d.* | 0.870.941.00.900.920.950.120.550.950.860.930.980.810.850.910.130.580.92 |
*由于溶解度较差而未能计算出准确数据。
**料荧光量子产率的参比染料为罗丹明B的乙醇溶液(Φf＝0.49)。
III系列染料的光谱性质
我们选取典型的III系列染料的光谱数据，并将其列于表4中，III系列染料分子由于多引进了一个苯乙烯基团，因此光谱波长更加红移，当R2、R3为供电基团时更加剧了光谱红移的趋势，使染料的吸收和发射光谱均进入了近红外区域。荧光化合物IIIa、IIIb、IIIf、IIIg由于不含有对溶剂极性敏感的氨基，其光谱性质非常稳定，在不同溶剂中的差异在15nm以内，斯托克斯位移也小于20nm。摩尔消光系数的规律与II系列化合物类似，荧光量子产率依然非常高，均大于0.84。
除了以上四个III系列染料以外，其余的III系列染料均含有一个或者两个氨基，它们的光谱性质会随着溶剂极性的变化而发生很大的改变。与只有一个苯乙烯取代基的染料IIc和IIf相比较，含有两个氨基的染料IIIc、IIIh的光谱对于溶剂的的敏感性不仅体现在荧光光谱的红移，而且体现在吸收光谱也存在着较大的红移现象。只含有一个氨基的III系列染料IIId、IIIe、IIIi、IIIj光谱波长比双氨基的染料要短，由于是不对称的染料，所以在强极性的溶剂中斯托克斯位移比染料IIIc、IIIh略大一些。受ICT现象的的影响，含有氨基的III系列染料的荧光量子产率随溶剂极性的增大而迅速降低。
图4显示了染料IIIb在四氢呋喃中的吸收和发射光谱，从图中我们可以发现除了IIIb比IIb在长波长可见光区的光谱更加红移之外，对比图2还可以观察到IIIb在紫外吸收区域的最大吸收波长比IIb也要红移28nm，而且IIIb在紫外吸收区域的吸收强度比IIb要大得多，这说明系列染料III更容易被激发到S2激发态，而且紫外区激发的量子产率比II系列染料要高很多。
图5比较了染料IIIc在极性差异较大的两种溶剂(左边为在正己烷中、右边为在二甲基甲酰胺中)中的吸收和发射光谱，我们可以看到，溶剂极性增大后染料的吸收和荧光光谱产生了明显的红移，而且峰宽加大，这是ICT现象的典型表现。
表4不同溶剂中IIIa-j的光物理性质
| 染料 | 溶剂 | λ(abs)nm | λ(em)nm | Stokes Shift | ε105M-1m-1 | Φf ** |
| IIIaIIIbIIIcIIIdIIIeIIIfIIIgIIIhIIIi | DMFTHFHexaneDMFTHFHexaneDMFTHFHexaneDMFTHFHexaneDMFTHFHexaneDMFTHFHexaneDMFTHFHexaneDMFTHFHexaneDMFTHFHexane | 631629625643640635705693676671665656678669660640638632652650649726714682690681661 | 641638633659651642771743689748715669738715674656652643670666661802788699770748677 | 109816117665013775013684214161411181612767417806716 | 0.720.770.841.201.231.301.211.25n.d.*0.830.900.970.951.031.100.780.860891.281.311.321.31n.d.*1.301.211.251.27 | 0.850.951.00.880.910.990.0230.130.650.150.570.910.100.510.710.840.920.970.840.880.930.090.460.650.130.550.74 |
| IIIj | DMFTHFHexane | 698686665 | 776750679 | 786414 | 1.301.291.31 | 0.110.490.53 |
*由于溶解度较差而未能计算出准确数据。
**料荧光量子产率的参比染料为IR-125的DMSO溶液(Φf＝0.13)。
4、质子对含氨基染料ICT现象的影响
在水溶液中，含有氨基的荧光染料由于受到ICT效应的影响而无法释放出荧光，即荧光被淬灭。然而我们可以通过氨基的质子化而终止ICT过程的发生，从而使染料重新强烈的释放出荧光。下面以含有双氨基的染料IIIc为例说明质子对ICT现象的抑制作用。
图6所显示的是化合物IIIc在质子的作用下吸收和发射光谱的变化情况，当pH值从7.5下降到3.5时IIIc的吸收光谱有大约15nm的红移，整个过程中伴有吸收光谱强度的小范围波动，这个过程是单氨基被质子化的过程。然而在许多ICT现象中，一旦氨基被质子化，光谱就会出现明显的蓝移，例如化合物IIIc的质子化过程中，吸收光谱蓝移了54nm(参见图7)。IIIc单氨基被质子化后，会形成一个长距离的推拉电子系统，未被质子化的氨基充当推电子体，而被质子化的氨基作为拉电子体，通常这种推拉电子体系的形成会造成化合物光谱的红移(参见图8)。当继续酸化IIIc时，染料光谱性质发生了非常大的变化，主要体现在：当pH值降低到0.5时，双氨基完全被质子化，740、515和440nm处的吸收峰减弱甚至消失(图6中a所示)，而在340和619nm处出现了新的尖锐的强吸收峰(图6中b所示)。与此同时染料的荧光光谱也从检测不到的状态改变为627nm处出现强荧光发射峰。双氨基被质子化后染料的吸收和发射光谱形状与IIIa的光谱非常相似，这证明了双氨基染料的ICT效应完全被质子抑制(参见图9)。
附图说明
图1-a、1-b为染料IIIb从不同角度观察到的单晶衍射结构图
图2为母体染料和染料IIb在四氢呋喃中的吸收和发射光谱，横坐标为波长(nm)，纵坐标左边为吸收值，右边为发射强度。
图3为染料IIc在不同极性的溶剂中的荧光发射光谱，从左到右分别为在正己烷、四氢呋喃、二甲基甲酰胺中的荧光光谱。横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度。
图4为染料IIIb在四氢呋喃中的吸收和发射光谱，横坐标为波长(nm)，纵坐标左边为吸收值，右边为荧光发射强度。
图5为染料IIIc在正己烷和二甲基甲酰胺中的吸收和发射光谱，图5-a为在正己烷中，图5-b为在二甲基甲酰胺中。横坐标为波长(nm)，纵坐标左边为吸收值，右边为荧光发射强度。
图6为染料IIIc在不同pH值下的吸收和发射光谱，图6-a为吸收光谱的变化，横坐标为波长(nm)，纵坐标为吸收值；图6-b为荧光光谱的变化，横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度。
图7为染料IIc在不同pH值下的吸收光谱，横坐标为波长(nm)，纵坐标为吸收值。
图8a为染料IIIc单氨基被质子化过程中受光激发而发生分子内电荷转移的示意图；图8b为染料IIIc单氨基被质子化过程中吸收光谱的变化，横坐标为波长(nm)，纵坐标为吸收值。
图9-a为染料IIIa在水中的吸收和发射光谱，图9-b为IIIc双氨基被质子化后的吸收和发射光谱，横坐标为波长(nm)，纵坐标左边为吸收值，右边为荧光发射强度。
具体实施方式
实施例1
中间体2，4-二甲基吡咯的合成路线：
取120ml乙酰乙酸乙酯和400ml冰醋酸，加入1000ml三口烧瓶中，温度控制在25℃以下，机械搅拌。再称100g亚硝酸钠溶解到120ml的水中配成水溶液，用滴液漏斗将其慢慢滴加到上述混和液中，4小时滴加完毕，然后温度控制在室温，搅拌5小时。称136g锌粉，将上述反应液温度加热到60℃，逐渐加入锌粉，同时量取136ml乙酰乙酸乙酯用滴液漏斗慢慢滴加至三口烧瓶中，两小时内滴加完毕，反应放热，产生红色的二氧化氮气体，同时反应液内出现絮状固体，固体逐渐增多，最后完全搅不动，将反应混合物放在布氏漏斗中抽滤，得到滤饼，干燥后得到中间体2，4-二甲基-3，5-二酯基吡咯，称量得90g，产率40％。
称取40g上述含有酯基的中间产物，再称20g KOH固体，量取300ml水。将上述三种原料加入500ml三口烧瓶中，混匀，油浴逐渐加热至160℃，四小时后反应完毕，冷却。该步为脱羧反应，产生大量的二氧化碳。反应完毕后，冷却，待温度降为常温时，倒出其中的液体，然后用乙醚洗固体三次，合并混合液，分液后取上层液体，下层溶液是水，再用乙醚萃取三次，混合萃取液后旋转蒸发掉其中的乙醚。然后水蒸气蒸馏，蒸出液中仍含有水分，再分液后用无水K2CO3干燥，得无色液体2，4-二甲基吡咯14.6g，产率92％。
实施例2
R1’为甲基的母体染料合成及表征：
该母体染料的合成可以在一锅反应中连续进行到底，中间产物可以不必分离提纯。操作步骤如下：取500mL单口瓶，将2mmol 2，4-二甲基吡咯和1mmol对甲基苯甲醛溶解在200mL二氯甲烷中，用氩气置换烧瓶中的空气，并用氩气鼓泡的方法将溶液中的空气赶出，然后滴入一滴三氟乙酸左催化剂，反应系统在氩气保护下持续搅拌，反应温度为室温(25℃)。2小时后终止反应，用0.1mol/L的NaOH溶液100mL将反应液洗涤两遍，然后用无水硫酸钠干燥有机层，在氩气保护条件下将溶剂二氯甲烷全部蒸出，然后再加入20mL甲苯将蒸干的残渣溶解，1mmol四氯苯醌作为氧化剂加入反应混合物中，10分钟后将8mmol三氟化硼乙醚溶液和8mmol三乙胺同时加入到反应体系中，持续搅拌2小时后采用硅胶柱分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂的配比为二氯甲烷/正己烷＝2∶1，产率为30％。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.394(s，6H，CH3)，2.426(s，3H，CH3)，2.546(s，6H，CH3)，5.964(s，2H，CH)，7.144(d，2H，CHJ＝19Hz)，7.286(d，2H，CH J＝19Hz).13C NMR(400MHz，CDCl3)：155.385，143.354，142.337，138.989，132.112，131.778，129.949，127.937，121.250，21.574，14.720，14.599.MS(EI)：360[M+Na]+
实施例3
化合物IIa的合成：
0.1mmol(约33.8mg)干燥的母体化合物(实施例2的产物)加入到25ml圆底烧瓶中，用10ml无水的邻二氯苯全部溶解，加入干燥的分子筛5粒，用微量进样器滴加0.12mmol(约14.4mg)蒸馏提纯过的对甲基苯甲醛，最后再加入0.1ml哌啶作催化剂。整个反应体系在氩气保护的条件下搅拌均匀，加热至120℃持续反应10小时，每隔3小时用TLC薄层色谱跟踪反应的进行情况，在365nm紫外灯下观察荧光强度，直到没有更多的产物出现为止。将反应体系渐渐冷却至室温，反应混合物用50ml二氯甲烷稀释，用40ml水分两次洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，旋转蒸发浓缩后准备硅胶柱分离。用正己烷∶乙酸乙酯＝100∶1的洗脱液将混合物分离，Ia在柱上呈粉红色带状，先于原料洗脱下来，并具有强烈的黄色荧光。浓缩洗脱液后得到紫色的固体，用正己烷∶乙酸乙酯＝10∶1的混合溶液重结晶，得到带有青铜金属光泽的晶体2.2mg，产率5％。熔点：165～166℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.410(s，3H，CH3)，1.444(s，3H，CH3)，2.365(s，3H，CH3)，2.435(s，3H，CH3)，2.591(s，3H，CH3)，5.992(s，1H，CH)，6.588(s，1H，CH)，7.172(d，2H，CH)，7.177(d，2H，CH)，7.222(d，1H，CH)，7.295(d，2H，J＝19Hz)，7.495(d，2H，CH，J＝21Hz)，7.653(d，1H，CH，J＝40Hz).13C NMR(400MHz，CDCl3)：155.181，153.025，142.929，142.716，139.263，139.004，136.257，134.002，133.152，132.233，129.933，129.653，128.188，127.626，121.341，118.418，117.591，21.605，14.879，14.652.HRMS：[M+Na]+ calculated：463.2133，measured：463.2149。
实施例4
化合物IIIa的合成：
0.1mmol(约44mg)干燥的IIa加入到25ml圆底烧瓶中，用10ml无水的邻二氯苯全部溶解，再用微量进样器滴加0.12mmol(约14.4mg)蒸馏提纯过的对甲基苯甲醛，加入0.1ml新蒸馏的哌啶作催化剂，最后加入干燥的分子筛5粒。整个反应体系在氩气保护的条件下搅拌均匀，加热至130℃持续反应10小时，每隔3小时用TLC薄层色谱跟踪反应的进行情况，在365nm紫外灯下观察红色的荧光强度，直到没有更多的新产物出现为止。将反应体系渐渐冷却至室温，反应混合物用50ml二氯甲烷稀释，用40ml水分两次洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，旋转蒸发浓缩后准备硅胶柱分离。用正己烷∶乙酸乙酯＝100∶1的洗脱液将混合物分离，5a在柱上呈蓝色带状，先于原料洗脱下来，并具有强烈的红色荧光。浓缩洗脱液后得到蓝色的固体，用正己烷∶乙酸乙酯＝10∶1的混合溶液重结晶，得到绿色带有青铜金属光泽的晶体10.8mg，产率25％。熔点：239～240℃。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.460(s，6H，CH3)，2.385(s，3H，CH3)，2.445(s，6H，CH3)，6.621(s，2H，CH)，7.194(d，2H，CH)，7.212(d，4H，CH)，7.245(d，2H，CH)，7.304(d，2H，CH J＝20Hz)，7.538(d，4H，CH J＝20Hz)，7.721(d，2H，CH J＝41Hz).13C NMR(400MHz，CDCl3)：152.774，142.238，139.270，139.004，136.241，134.124，133.638，132.340，129.911，129.691，128.461，127.702，118.608，117.773，21.650，14.902.HRMS：[M+Na]+calculated：565.2603，measured：565.2589。
实施例5
IIf的合成：
含有氰基的母体染料的合成类似于实施例2的合成；IIf的具体合成步骤类似IIa的合成。qf为棕色晶体，带有铜金属光泽，产率：42％。熔点178～179℃。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.817(d，2H，CH，J＝20Hz)，7.530(d，2H，CH，J＝21Hz)，7.501(d，2H，CH，J＝20Hz)，7.473(d，1H，CH)，7.216(d，1H，CH)，6.753(d，2H，CH)，6.621(s，1H，CH)，5.988(s，1H，CH)，3.045(s，6H，CH3)，2.588(s，3H，CH3)，1.397(s，3H，CH3)，1.352(s，3H，CH3)。
实施例6
化合物IIIi的合成：
IIIi是以IIf为起始原料同对甲基苯甲醛反应而得到的不对称的染料，当然也可以通过IId与N，N-二甲氨基苯甲醛反应而制得，这里为了方便起见采用前一种合成方法，具体合成步骤参见IIIa的合成。IIIi为暗绿色带有铜金属光泽的晶体，产率21％。熔点：大于300℃。1HNMR(400MHz，CDCl3)：δ7.826(d，2H，CH，J＝20Hz)，7.706(d，2H，CH，J＝43Hz)，7.587(d，2H，CH，J＝21Hz)，7.536(d，2H，CH，J＝18Hz)，7.526(d，2H，CH)，7.232(d，2H，CH)，7.215(d，2H，CH，J＝19Hz)，6.861(d，2H，CH)，6.651(s，1H，CH)，6.629(s，1H，CH)，3.075(s，3H，CH3)，2.389(s，3H，CH3)，1.410(s，6H，CH3).MS(EI)：583[M+H]+。
Claims (2)
1.一种用于生物荧光分析的近红外氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料，其特征在于该荧光染料具有如下结构通式I：
式中r1、r2、r6、r7为C1-18的烷基、环烷基、苯基、萘基；r3、r5中至少有一个为反式苯乙烯类基团I’，r8为R1、R2或R3；r9～13为R2或R3；R2为R3、O-R3，S-R3或NR4R5；R3为(CH2)nR6、(CH2)mO(CH2)pR6、(CHR7CH2O)q(CH2)rR6或环己基；其中，n、m、p、q、r＝0-18；R4、R5为相同或不同的R3；R6＝H、Cl、Br、I、CN、NO2、SO3R8、CO2R8、NCS或N-琥珀酰亚胺酯I”；R7＝H、C1-18烷基或环己基；R8＝H或M；M＝Na、K或N(R9R10R11R12)；R9、R10、R11、R12＝H、C1-18烷基、环己基或(CH2)qOR7。
2.按照权利要求1所述的近红外氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料，其特征在于染料I的优选结构为通式结构II或III：
通式中：R1’＝R2或R3；R2、R3的含义同权利要求1；III式中的R2相同或不相同。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Open date: 20070411 |