CN107602600A - 氨基取代氮杂氟硼二吡咯近红外pH荧光探针及其制法和用途 - Google Patents

Abstract

一个基于胺基取代氮杂氟硼二吡咯近红外化合物，结构如下：本发明与现有技术相比，其显著优点是：首次合成对位氮二乙基取代的氮杂氟硼二吡咯近红外化合物，胺基的引入可以使氮杂氟硼二吡咯吸收光谱显著红移，其更有利于在生物方面的应用。该光敏剂被氢离子质子化后，紫外吸收光谱发生显著变化，溶液颜色由紫色变为蓝色。同时，光诱导过程会选择性的降低，荧光发射增强。因此，化合物NEt₂‑aza‑BODIPY具有对氢离子高选择性的裸眼显色识别以及荧光识别的用途。本发明公开了其制法。

Description

氨基取代氮杂氟硼二吡咯近红外pH荧光探针及其制法和用途

技术领域

本发明涉及近红外吸收pH荧光探针，具体地说，涉及胺基取代氮杂氟硼二吡咯(氮杂-BODIPY)近红外吸收材料及其制法和用途。

背景技术

在环境分析、化学反应过程控制、生物医学等方面，pH是一个重要参数，pH值的测定具有十分重要的意义。目前，pH测定方法主要有指示剂法、玻璃电极法、光学传感器法等。相比于其他pH测定方法，基于光学信号变化而建立的pH探针测定方法由于具有灵敏度高、选择性好、反应时间短的优点而得到广泛的关注。目前，已经报道了一些pH荧光探针，但大多数pH荧光分子探针检测范围宽，这就降低了探针的灵敏度。目前，对于低pH范围内(pH <4)的荧光探针却鲜有报道。[参见：史学芳、郭萍、胡灵敏、刘丽娟、石倩、端君君、徐木花、王小琴，9-芴-N’-(罗丹明6G-酰肼)pH荧光分子探针及其制备方法与用途[P].中国，CN103242329 A，1992.]因此，制备具有低检测范围、较高灵敏度的pH荧光探针具有重要的意义。

近红外荧光染料由于其独特的性能而成为近年来研究的热点，已广泛地应用于各种领域。在近红外区域内，生物组织吸收和散射最小，[参见：(a)Aubin，J.E.Autofluorescence of viable cultured mammaliancells.J.Histochem.Cytochem.，1979，27，36-43.12.(b)Weisleder，R.A clearer visionfor in vivo imaging.Nat.biothchnol.，2001，19，316-317.]因此能极大地提高光子的组织穿透能力和避免自发荧光干扰的影响，降低对生物体的光伤害。[参见：(a)Wu，X.M.，etal.In vivo and in situ tracking cancer chemotherapy by highly photostable NIRfluorescent theranostic prodrug.J.Am.Chem.Soc.，2014，136，3579-3588.(b)Wu，X.M.；Chang S.；Sun X.R.，et al.Constructing NIR silica-cyanine hybrid nanocompositefor bioimaging in vivo：a breakthrough in photo-stability and brightfluorescence with large Stokes shift.Chem.Sci.，2013，4，1221-1228.]另外，能够吸收近红外光的干扰物质少，使用此类光学探针可有效避开背景干扰。因此，基于近红外吸收的优点，近红外材料在能源、生物和环境等方面具有广阔的应用前景。

由于近红外染料具有卓越的光物理性质，该类染料在近年来引起了科学家的广泛关注。其中，氮杂-BODIPY，结构类似于BODIPY，是近十年来发展起来的一类新型近红外荧光化合物，一直备受科学家们的青睐。这主要是因为这类化合物具有优越的光物理性质：1.在近红外区域高的摩尔吸光系数和荧光量子产量；2.光谱性质对外界环境不敏感；3.相当高的光稳定性和化学稳定性；4.易溶于各种极性的溶剂；5.结构易修饰，可以合成得到一系列功能不同的光敏剂；6.荧光光谱半峰宽较窄，作为荧光标示时有很好的灵敏度[参见：(a)Loudet A.，Burgess K.BODIPY dyes and their derivatives：syntheses andspectroscopic properties.Chem.Rev.，2007，107，4891-4932.(b)Kiloran J.，Allen，L.，Gallagher J.F.，Gallagher W.M.，et al.Synthesis of BF₂ chelates oftetraarylazadipyrromethenes and evidence for their photodynamic therapeuticbehavior.Chem.Commun.，2002，17，1862-1863.(c)Bouit P.A.，Kamada K.，Eeneyrou P.，et al.Two-photo absorption-related properties of functionalized BODIPY dyesin the infrared range up to telecommunication wavelengths.Adv.Mater.，2009，21，1151-1154.]。

基于氮杂-BODIPY的优点，本发明中选用氮杂-BODIPY作为研究对象，4-(N，N-二乙基胺基)作为质子的响应基团，在氮杂-BODIPY的苯环上引入4-(N，N-二乙基胺基基团设计合成了一个低pH响应范围的氮杂氟硼吡咯近红外光敏剂。荧光团与胺基识别体单元之间存在着光诱导电子转移，对荧光有非常强的淬灭作用，一旦识别体与客体质子相结合，光诱导电子转移作用受到抑制，甚至被完全阻断，荧光团就会发射荧光，因此表现出pH敏感性。另外，该探针在氢离子作用下吸收光谱蓝移，颜色发生显著变化。因此，该光敏剂可以对氢离子具有荧光识别和裸眼显色的用途。

发明内容

在本发明中，我们巧妙地将4-(N，N-二乙基胺基引入氮杂氟硼二吡咯的对位，设计合成了pH响应型的氮杂氟硼二吡咯近红外吸收材料。本发明为我们提供一种可以荧光和裸眼识别于一体的pH探针及其制备方法和用途。

本发明涉及技术方案如下：

一个基于胺基取代氮杂氟硼二吡咯近红外化合物，它有如下结构：

上述化合物的制备方法如下：

一种制备上述氮杂氟硼二吡咯近红外化合物的方法，它包括下列步骤：

步骤1、在100mL圆底烧瓶中，加入1eq的4-N，N-二乙氨基-苯乙酮和1eq的苯甲醛于10mL乙醇溶剂中，缓慢滴加10％NaOH水溶液(2.5eq)，反应5小时结束，减压抽滤，水洗至中性，冷乙醇洗涤，抽干得黄色产品1a；

步骤2、取1eq的1a于50mL圆底烧瓶中，加入5eq的硝基甲烷、5eq的乙二胺和30mL甲醇溶剂，65℃回流12小时，反应结束后反应混合物用蒸馏水和乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥有机层，减压旋蒸除去溶剂，干燥得到产物2a；

步骤3、取1eq的2a于50mL两颈圆底烧瓶中，加入5eq的乙酸铵，氮气保护下于30mL正丁醇中加热回流24h，反应结束冷却至室温，过滤，用冷乙醇洗涤，干燥得到深蓝色固体3a；

步骤4、在50mL两颈烧瓶中，加入1eq的3a，10mL重蒸二氯甲烷溶液，20eq的三乙胺和20eq三氟化硼乙醚溶液，氮气保护下室温反应24小时，反应混合物用蒸馏水、饱和食盐水依次洗涤，然后无水硫酸钠干燥，减压浓缩，用100-140目硅胶装柱分离，用1∶1v/v的CH₂Cl₂/hexane的展开剂进行硅胶柱层析分离，得到目标化合物NEt₂-aza-BODIPY。

用¹H-NMR、UV-Vis、Fluorescence spectral、MALDI-TOF MASS表征并证实了该光敏剂的结构。

本发明的有益效果：

本发明与现有技术相比，其显著优点是：首次合成对位氮二乙基取代的氮杂氟硼二吡咯近红外化合物，胺基的引入可以使氮杂氟硼二吡咯吸收光谱显著红移，成功红移到840nm近红外区域，其更有利于在生物方面的应用。该光敏剂被氢离子质子化后，紫外吸收光谱发生显著变化，溶液颜色由紫色变为蓝色。同时，光诱导过程会选择性的降低，荧光发射增强。因此，化合物NEt₂-aza-BODIPY具有对氢离子高选择性的裸眼显色识别以及荧光识别的双重用途。另外，与现有pH荧光探针相比，该探针具有较低的pH响应范围，适合于测定pKa较大的酸性物质，而具有该性质的pH荧光探针报道甚少。不仅如此，该荧光分子探针在检测氢离子时不受Fe²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Cr²⁺、Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Al³⁺、、Zn²⁺、Ba²⁺等金属离子的干扰，因此，该荧光探针具有选择性较高的优点。

附图说明

图1为本发明中光敏剂NEt₂-aza-BODIPY在二氯甲烷溶剂中的紫外吸收光谱

图2为本发明中光敏剂NEt₂-aza-BODIPY紫外吸收光谱随pH变化；

图3为本发明中光敏剂NEt₂-aza-BODIPY空白(a)和在pH＝2.50条件下颜色(b)；

图4为本发明中光敏剂NEt₂-aza-BODIPY荧光发射光谱随pH变化；

图5为本发明中光敏剂NEt₂-aza-BODIPY在酸(pH＝2.50)和不同金属离子存在下荧光强度

具体实施方式

检测所用仪器为：BrukerARX500型核磁共振仪(TMS为内标，氘代CDCl₃为溶剂)，美国Bruker Daltonics AutoflexII质谱工作站和LCQ电喷雾质谱仪(ESI-MS，ThermoFinnigan)，岛津UV-1700型紫外-可见分光光度计(扫描范围300-1100nm，狭缝宽度2.0nm)，日立F-4600荧光分光光度计。PHS-25(数显)酸度计。

实施例1.化合物1a的合成：

在100mL圆底烧瓶中，加入10mmol 4-N，N-二乙氨基-苯乙酮和10mmol苯甲醛于10mL乙醇溶剂中，缓慢滴加(10mL)10％NaOH水溶液，反应5小时结束，减压抽滤，水洗至中性，少量冷乙醇洗，抽干得黄色产品1a.1a：¹H NMR(500MHz，CDCl₃，δ)：7.98(d，J＝7.5Hz，2H，)，7.70(d，J＝13Hz，2H，)，7.48-7.58(m，5H，Ar H)，6.68(d，J＝5.5Hz，2H，)，3.44(q，J＝6Hz，4H，CH₂)，1.22(t，J＝6Hz，6H，CH₃).ESI-MS(m/z)：[M+Na]⁺calcd for C₁₉H₂₁NONa302.16；Found，302.58.

实施例2.化合物2a的合成：

取(4mmol)1a于50mL圆底烧瓶中，20mmol硝基甲烷和20mmol二乙胺，30mL甲醇溶剂，60℃回流12小时，反应结束后反应混合物用蒸馏水和乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥有机层，减压旋蒸除去溶剂，干燥得到产物2a。周金风、楚纯洁；第一发明人身份证号码：41102319840416708

2a：¹H NMR(500MHz，CDCl₃，δ)：7.79(d，J＝9.0Hz，2H，Ar H)，7.44(d，J＝8.5Hz，2H，Ar H)，7.17(d，J＝8.5Hz，2H，Ar H)，6.58(d，J＝9.0Hz，2H，Ar H)，4.81-4.85(m，1H，CH)，4.62-4.66(m，1H，CH)，4.10-4.21(m，1H，CH)，3.42(q，J＝7.0Hz，4H，CH₂)，1.20(t，J＝6Hz，6H，CH₃).ESI-MS(m/z)：[M+Na]⁺calcd for C₂₀H₂₄N₂O₃Na，363.17；Found，363.51.

实施例3.化合物3a的合成：

取(3mmol)2a于50mL两颈圆底烧瓶中，加入(75mmol)乙酸铵，氮气保护下于30mL正丁醇中加热回流24h，反应结束冷却至室温，过滤，用冷乙醇洗涤，干燥得到深蓝色固体3a.3a：¹H NMR(500MHz，CDCl₃，δ)：7.92(d，J＝8.5Hz，4H，Ar H)，7.79(d，J＝8.5Hz，4H，ArH)，7.52(d，J＝8.0Hz，4H，Ar H)，7.07(d，J＝8.0Hz，4H，Ar H)，6.78(d，J＝8.5Hz，4H，ArH)，3.48(q，J＝7.0Hz，8H，CH₂)，1.26(t，J＝7.0Hz，12H，CH₃).MALDI-TOF(m/z)：calcd forC₄₀H₄₁N₅，591.79；Found，591.71.

实施例4.化合物NEt₂-aza-BODIPY的合成：

50mL两颈烧瓶中，加入(0.15mmol)的3a，10mL重蒸二氯甲烷溶液，3mmol三乙胺和3mmol三氟化硼乙醚溶液，氮气保护下室温反应24小时，反应混合物用蒸馏水、饱和食盐水依次洗涤，然后无水硫酸钠干燥，减压浓缩，用100-140目硅胶装柱分离，用CH₂Cl₂/hexane(1∶1)的展开剂进行硅胶柱层析分离，得到目标化合物NEt₂-aza-BODIPY.NEt₂-aza-BODIPY：¹HNMR(500MHz，CDCl₃，δ)：8.10(d，J＝8.0Hz，4H，Ar H)，7.91(d，J＝10.5Hz，4H，Ar H)，7.56(d，J＝10.5Hz，4H，Ar H)，6.63-6.84(m，8H)，3.24-3.71(m，4H，CH₂)，1.25(t，J＝7.5Hz，12H，CH₃).MALDI-TOF(m/z)：calcd for C₄₀H₄₀BF₂N₅，639.59；found，639.89.

实施例5.应用

取一定量的光敏剂NEt₂-aza-BODIPY溶解在四氢呋喃溶剂(THF)中，加入非离子型表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油(CrEL)超声，蒸干THF，然后将其扩散到PBS缓冲溶液中，制得NEt₂-aza-BODIPY水溶液探针，将其配置成一定溶度的母体溶液。该水溶性探针用于紫外、荧光光谱测试以及应用分析。

NEt₂-aza-BODIPY的紫外吸收光谱如图1所示，结果表明NEt₂-aza-BODIPY在近红外区域具有较强的摩尔吸光系数，最大吸收峰位于854nm。

NEt₂-aza-BODIPY在不同pH条件下紫外吸收光谱和荧光光谱变化如图2和图3所示。具体操作：首先配置1.0×10^-4mol/LNEt₂-aza-BODIPY母体水溶液，取1mL1.0×10^-4mol/LNEt₂-aza-BODIPY母体溶液于10mL容量瓶中，再加入不同体积的HCl溶液，加水稀释至刻度，然后用pH计测定每个溶液的pH值，最后测定不同pH条件下溶液的紫外吸收光谱和荧光光谱变化。实验结果表明，随着pH的减小，即氢离子溶度的增加，854nm吸收峰值依次降低，778nm吸收峰值依次升高。根据pH条件下溶液的紫外吸收光谱变化值得到该探针的pKa为2.7。同时，随着pH的降低，溶液颜色发生显著的变化，由紫红色渐变为蓝色(图4)，因此说明该探针具有裸眼识别能力。从荧光光谱图中可以看到，随着氢离子浓度的增大，荧光强度急剧增大，说明NEt₂-aza-BODIPY探针具有荧光识别氢离子的能力。

NEt₂-aza-BODIPY具有较强的抗干扰能力。具体操作：取1mL1.0×10^-4mol/LNEt₂-aza-BODIPY母体溶液于10mL容量瓶中，在该容量瓶中分别加入一定量的HCl和金属离子，然后稀释至刻度，在相同的测定条件下测试其荧光光谱。实验结果表明，除氢离子外，其他金属离子均不产生荧光增强信号，因此说明该荧光探针识别氢离子时抗干扰能力强。

利用NEt₂-aza-BODIPY测定烟酸的浓度。烟酸又称作维生素B3，是人体中必需的13种维生素之一，如果人体缺乏烟酸会引起头痛、耳鸣、腹泻等症状，但是摄入过多也会产生一定的副作用，如皮肤瘙痒、葡萄糖耐受性减损等，因此，在临床上烟酸含量的测定具有重要的意义。目前关于烟酸的测定方法主要有高效液相色谱法、酸碱滴定法，而紫外吸收光谱法和荧光分光光度法报道甚少。本发明专利中利用NEt₂-aza-BODIPY探针监测烟酸制剂中烟酸含量时，溶液颜色发生明显变化，由紫红色转变为蓝色。另外根据其紫外吸收值和荧光强度可计算得到烟酸浓度。

Claims (3)

1.一个基于胺基取代氮杂氟硼二吡咯近红外化合物，其特征是它有如下结构：

2.一种制备权利要求1所述的基于胺基氮杂氟硼二吡咯的近红外化合物的方法，其特征是它包括下列步骤：

步骤1、在100mL圆底烧瓶中，加入1eq的4-N，N-二乙氨基-苯乙酮和1eq的苯甲醛于10mL乙醇溶剂中，缓慢滴加10％NaOH水溶液(2.5eq)，反应5小时结束，减压抽滤，水洗至中性，冷乙醇洗涤，抽干得黄色产品1a；

步骤2、取1eq的1a于50mL圆底烧瓶中，加入5eq的硝基甲烷、5eq的乙二胺和30mL甲醇溶剂，65℃回流12小时，反应结束后反应混合物用蒸馏水和乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥有机层，减压旋蒸除去溶剂，干燥得到产物2a；

步骤3、取1eq的2a于50mL两颈圆底烧瓶中，加入5eq的乙酸铵，氮气保护下于30mL正丁醇中加热回流24h，反应结束冷却至室温，过滤，用冷乙醇洗涤，干燥得到深蓝色固体3a；

步骤4、在50mL两颈烧瓶中，加入1eq的3a，10mL重蒸二氯甲烷溶液，20eq的三乙胺和20eq三氟化硼乙醚溶液，氮气保护下室温反应24小时，反应混合物用蒸馏水、饱和食盐水依次洗涤，然后无水硫酸钠干燥，减压浓缩，用100-140目硅胶装柱分离，用1∶1v/v的CH₂Cl₂/hexane的展开剂进行硅胶柱层析分离，得到目标化合物NEt₂-aza-BODIPY。

3.权利要求1所述的胺基取代氮杂氟硼二吡咯近红外光敏剂在制备作为对氢离子选择性裸眼显色识别和荧光识别探针方面的应用。