CN105102464A - 梅咖斯托克斯氨基-三唑基-bodipy化合物及用于活神经元染色和人血清白蛋白fa1药物位点探测的应用 - Google Patents

梅咖斯托克斯氨基-三唑基-bodipy化合物及用于活神经元染色和人血清白蛋白fa1药物位点探测的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105102464A
CN105102464A CN201380067802.8A CN201380067802A CN105102464A CN 105102464 A CN105102464 A CN 105102464A CN 201380067802 A CN201380067802 A CN 201380067802A CN 105102464 A CN105102464 A CN 105102464A
Authority
CN
China
Prior art keywords
alkyl
compound
thiazolinyl
halogen
alkynyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201380067802.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105102464B (zh
Inventor
张荣太
余俊成
梁洁敏
尹盛郁
马克·本德雷利埃斯科巴尔
陈美琪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Agency for Science Technology and Research Singapore
National University of Singapore
Original Assignee
Agency for Science Technology and Research Singapore
National University of Singapore
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Agency for Science Technology and Research Singapore, National University of Singapore filed Critical Agency for Science Technology and Research Singapore
Publication of CN105102464A publication Critical patent/CN105102464A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105102464B publication Critical patent/CN105102464B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table
    • C07F5/02—Boron compounds
    • C07F5/022—Boron compounds without C-boron linkages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/0008—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes substituted on the polymethine chain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
    • C09B23/04—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups one >CH- group, e.g. cyanines, isocyanines, pseudocyanines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B57/00—Other synthetic dyes of known constitution
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5058—Neurological cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/76—Assays involving albumins other than in routine use for blocking surfaces or for anchoring haptens during immunisation
    • G01N2333/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
    • G01N2458/30—Electrochemically active labels

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Low-Molecular Organic Synthesis Reactions Using Catalysts (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

描述了新的氨基-三唑基-BODIPY化合物的文库。所述文库的特定化合物作为用于人血清白蛋白(HSA)和活的原代神经元的选择性荧光探针。用于HSA的荧光探针独特地且特异性地与HSA的脂肪酸位点1结合，从而证明是用于与HSA上此类位点结合之药物的有价值的且独特的探针。还描述了文库化合物的合成方法。

Description

梅咖斯托克斯氨基-三唑基-BODIPY化合物及用于活神经元染色和人血清白蛋白FA1药物位点探测的应用
相关申请
本申请要求于2012年12月26日提交的美国临时申请No.61/745,916的权益。
上述申请的全部教导通过引用并入本文。
背景技术
对了解化学和生物学中基本识别事件的需求已经做出了相当大的努力来开发化学探针。由于高灵敏度、快速响应时间以及技术简单，荧光探针是用于分析传感和光学成像两者的有吸引力的和通用的工具。然而，调节荧光探针与其靶标之间相互作用的机制往往知之甚少；因此，使用理论计算来预测结构要求并设计新的探针的能力是有限的。最近，组合的方法推进了荧光探针的生成和优化，尤其是用于在分子识别水平上仍然不确定的复杂科学问题。利用常规的合成方法由市售结构单元得到已知荧光支架之组合策略的开发将使得能够获取更广范围的荧光探针。
基于BODIPY支架的荧光探针和分子成像探针的开发已被广泛利用，原因是其显著的荧光特性(例如高的光稳定性、消光系数和量子产率，可调的激发光谱和发射光谱)(1-7)以及容易转化成用于正电子发射断层扫描(PositronEmissionTomography，PET)成像的探针(8，9)。大多数对4，4-二氟-4-硼杂3a，4a二氮杂-s-吲哒省(4，4-difluoro-4-bora-3a，4a-diaza-s-indacene，BODIPY)支架进行衍生化的方法都涉及液相化学，这通常需要繁琐的纯化步骤(10)。在固相上进行BODIPY衍生化的尝试由于其在酸性和碱性条件二者下的不稳定性而受阻(11)。
需要开发基于可用的荧光支架(例如基于BODIPY的支架)以迅速获得新的化合物文库的方法。此外，在这些文库中，需要开发对具有关键生物学功能的多种分析物具有选择性和特异性的探针。
发明概述
本发明是基于对用于检测人血清白蛋白的生物分析物的选择性荧光探针的发现以及对使活神经元可视化具有选择性的荧光探针的相关发现。因此，在一个实施方案中，本发明是一类新的氨基-三唑基BODIPY化合物。本发明的化合物可通过高通量合成的方法迅速地合成并且包含3个可衍生的部分。本发明还涉及氨基-三唑基BODIPY化合物的合成方法。具体而言，描述了固相合成法和溶液相合成法两者。在另一个实施方案中，本发明是用于人血清白蛋白的荧光探针。在又一个实施方案中，本发明是用于原代神经元的选择性染色的荧光染料。本发明还涉及用于检测生物流体样品中人血清白蛋白的方法。在一些实施方案中，荧光强度的测量值与人血清白蛋白的浓度成比例。本文中还描述了用于使活神经元可视化的方法，其可用于体外或体内应用。
附图简述
通过下面如附图中举例说明的对本发明之示例性实施方案的更具体的描述，上述内容将变得明显。
图1示出了基于BODIPY的BDC和MK文库设计，并且还指出了结构和光谱性质之间的关系。
图2示出了代表性的氨基-三唑基-BODIPY的归一化吸光度和荧光发射光谱。BDC-8(蓝色)：吸收λmax＝473nm，发射λmax＝585nm；MK101-8(绿色)：吸收λmax＝474nm，发射λmax＝563nm；MKHA374-48(黄色)：吸收λmax＝468nm，λmax＝557nm。还包括报道的BODIPY的相应光谱(BD-27；红色)以用于比较：吸收λmax＝551nm，发射λmax＝568nm。还描述了BDC-8、MK101-8、MKHA374-48和BD-27的结构。
图3示出了在室温(rt)下溶剂黏度对BDC-9(100μM)的荧光强度的影响。在更黏稠的醇类中，当在正辛醇和正己醇中时BDC-9的强度系统地增强。
图4示出了BDC-9(10μM)对10mM的HEPES缓冲液(pH7.4)中的16种不同浓度(0.13、0.25、0.50、1.00mg/mL)的蛋白质的荧光响应(F)；(λexc.：460nm，λem.：575nm)。F0为在HEPES缓冲液中BDC-9的荧光强度。数值表示为平均值(n＝4)。
图5示出了在用磷酸盐缓冲液中的HSA的系列稀释液(1.2×10-4至4mg/mL)孵育后的BDC-9(10μM)的荧光光谱，λexc.：460nm。数值表示为平均值(n＝3)。
图6示出了BDC-9(10μM)在用HSA的系列稀释液孵育后的荧光发射响应；λexc.：460nm，λem.：575nm；数值表示为平均值且误差条为标准差(n＝3)；LOD＝0.3μg/mL；线性范围＝0.37至31μg/mL，R2＝0.999。
图7a和7b示出了BDC-9的物种选择性。具体而言，图7a示出了BDC-9(10μM)在与各自的白蛋白的系列稀释液(1.2×10-4至4mg/mL)相互作用后的荧光发射响应；λexc.：460nm，λem.：575nm；数值表示为平均值且误差条为标准差(n＝3)。图7b是BDC-9(10μM)与各自的白蛋白混合后的拍摄图像。用手持式UV灯在365nm处进行辐照。
图8示出了与位点选择性HSA结合药物的竞争。用磷酸盐缓冲液中不同浓度的药物(高达200μM)将HSA(无脂肪酸)(0.34mg/mL，5μM)预孵育2小时，之后添加BDC-9(10μM)。F是在所指定的药物浓度下的荧光强度，F0是未添加药物的荧光强度；λexc.：460nm，λem.：575nm；数值表示为平均值且误差条为标准差(n＝3)。
图9示出了工作作图分析(jobplotanalysis)。具体而言，在磷酸盐缓冲液中将BDC-9与HSA(无脂肪酸)以不同的比例混合，同时保持总浓度在20μM；λexc.：460nm，λem.：575nm；数值表示为平均值且误差条为标准差(n＝3)。
图10是显示在用磷酸盐缓冲液中的HSA(10μM)孵育后BDC-9的系列稀释液(0μM、0.47μM至60μM)的荧光发射的荧光光谱；λexc.：460nm，λem.：575nm；数值表示为平均值且误差条为标准差(n＝3)；KD＝12.7±0.4μM(一个位点特异性结合模型)。
图11示出了尿样中BDC-9的荧光响应。将HSA(0至1mg/mL)添加至磷酸盐缓冲液(pH＝7.3)中的来自健康个体的10％尿液中。在10μM浓度时添加BDC-9；λexc.：460nm，λem.：575nm；数值表示为平均值且误差条为标准差(n＝3)；线性回归：R2＝0.998。
图12a示出了MKCA101-3(左)，MKHA101-3(中)和MKAA101-3(右)染色的混合原代神经细胞群的流式细胞术图，示出了基于化合物荧光从主群体中分离出神经元群(约2G多至约3.5G)。在各光谱中约0至约1G示出了未染色的对照。
图12b是来自已分化的神经球的神经元的图像。MKHA101-3相对于MKCA101-3显示出显著提高的特异性。
图13示出了MKHA101-3及其衍生物的化学结构。
图14示出了MKHA374-48亲和类似物的化学结构。
图15示出了用于识别神经元特异性探针MKHA101-3的原代神经元筛选的示意图。左边的图像显示明亮染色的神经元，与它们的其他的胶质细胞对照物截然相反。
图16a示出了MKHA101-3(左)和MKHA374-48/NeuO(右)的结构。
图16b是MKHA101-3(左)和NeuO(右)染色的混合活神经元细胞群的流式细胞图，示出了基于化合物荧光从主群体中分离出的神经元群。
图17示出了在放大100倍，比例尺为20μm时，MKHA101-3染色的神经元的活细胞共聚焦图像以及混合的原代神经元细胞培养物的活细胞化合物染色和免疫染色。用500nM的MKHA101-3(绿色)对细胞进行染色并在放大10倍时进行成像，之后用4％PFA固定。然后，用0.1％的Triton-X进行透化处理并用GFAP(红色)和神经元(绿色)进行免疫染色。
图18示出了活细胞化合物染色和混合的原代神经细胞培养物的免疫染色。用500nM的NeuO(绿色)对细胞进行染色并在放大10倍时进行成像，之后用4％PFA固定。然后，用0.1％的Triton-X进行透化处理并用β-III微管蛋白(Tuji，黄色)，GFAP(红色)和O4进行免疫染色。
图19a示出了来自用500nM的NeuO染色的来自新生和成年小鼠脑之混合原代神经细胞的流式细胞术散点图。
图19b是示出了从分选自新生和成年脑的整体(未分选的)、明亮级分和暗淡级分之细胞所测量的β-III微管蛋白的基因表达的柱状图。
图19c示出了用500nM的MKHA101-3染色的混合原代神经元细胞的流式细胞术散点图。右边的直方图示出了化合物阳性的细胞占整个细胞群体的20％。
图20a示出了从化合物阳性级分再培养的具有神经元形态的活细胞。
图20b和20c示出了认为对β-III微管蛋白(绿色)，核染色(蓝色)为阳性的免疫染色细胞；比例尺：50μm。
图21是显示经MKHA101-3染色的混合原代神经细胞的整体(未分选的)、明亮级分和暗淡级分的β-III微管蛋白的表达的柱状图。明亮级分与整体和暗淡级分相比，明显地显示出了β-III微管蛋白的更高表达。
图22是显示神经元生存力的柱状图。通过优先黏附到聚D-赖氨酸涂层上来分离来自P1-3小鼠幼仔的原代神经元。将它们熟化5天，之后以规定的浓度添加化合物，经历24个小时。根据制造商的说明使用MTS测定(Promega)来评估生存力。
图23，在上部图形中，示出了用500nM的NeuO染色以及使用时间推移成像进行成像以使神经元树突的形成可视化的DIV1神经元培养物的视频照片。图23的下部图形示出了来自神经前体细胞的神经元发育/分化的时间推移成像。可以看出明亮的NeuO染色的神经元从球体的内部迁移出来。
图24描述了设计用于共价地结合神经元靶标以及亲和富集的亲和分子。
图25描述了使用AffiNeuO7和AffiNeuO5系列进行亲和富集的代表性方案。
图26描述了NeuO-PET，其可在一些实施方案中用于PET成像。
图27描述了用于活神经元的NeuR和NeuIR红色荧光探针。
图28示出了用MKHA101-3染色的胚胎脑切片和在放大10倍时的成像。捕捉的图像显示了染料特别地加亮了具有长树枝状突起的细胞，使人联想起神经元染色。
发明详述
本发明的示例性实施方案描述如下。
公开了一类新的三唑衍生的4，4-二氟-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-吲哒省(BODIPY)化合物。这类化合物包括两种新的荧光探针，包括首次独立地与脂肪酸位点1结合的人血清白蛋白(HSA)探针，并且还包括特异性地且独特地对原代神经元进行染色的神经元细胞探针。
文库设计-梅咖斯托克斯(MegaStokes)氨基-三唑基-BODIPY化合物
最近报道了采用Knoevenagel反应和保持荧光团完整性的温和的酸性裂解条件的第一种固相BODIPY文库(12)。本发明涉及采用铜-催化的叠氮-炔环加成反应(Copper-CatalyzedAzide-AlkyneCycloaddition，CuAAC)来制备氨基-三唑基-BODIPY化合物(BDC和MK)以及它们相应的乙酰基(AC)、氯乙酰基(CA)和羟乙酰基(HA)衍生物的第一文库(13)的替代的固相组合衍生策略。值得注意的是，在BODIPY核心的位置3和位置5处引入与氨基取代基配对的三唑部分导致了荧光化合物非常大的斯托克斯位移(74nm至160nm)。最小化其激发光谱和发射光谱之间的重叠的梅咖斯托克斯染料提供了超过其他荧光团的增强的灵敏度和作为用于体外应用的传感器的特殊潜力。尽管其他荧光结构(例如香豆素，苯乙烯基)已被修饰以增强其斯托克斯位移，本文中所公开的BDC和MK文库的化合物代表了首次系统地产生的基于BODIPY支架的梅咖斯托克斯染料。此外，这些氨基-三唑基-BODIPY化合物显示出对环境变化的敏感性。本文中鉴定的是表现为环境敏感性荧光开启型传感器的化合物。这样的BODIPY核心结构的固有荧光在特定的环境中被回收。
设计，合成和光物理学性质
由于CuAAC的高效率、稳健性以及其在温和反应条件中的成功，其对于组合的目的而言是非常有利的(13，14)。所得的三唑环是化学上稳定的且在荧光核心内的某些位置上，可调节所得到的荧光衍生物的光谱波长(15，16)。文献调查显示，在BODIPY支架位置3和位置5处引入供电子基和吸电子基可有效地改变其斯托克斯位移(17-19)。基于这些报告，设计三官能的BODIPY苯胺(4，方案1)来用于BODIPY文库的合成。该支架具有3个用于多样化的点，位置3和位置5处的两个亲电子位点，其可被例如分别通过CuAAC和亲核取代修饰(20-24)，和在内消旋位置的一个苯胺位点，其可被乙酰化修饰。
开发了两种用于合成氨基-三唑基BODIPY化合物的方法，即，固相法和溶液相法。溶液相法允许较大规模的生产BODIPY化合物，而固相法提供了大的化合物文库的实际路线。这两种方法都详述如下。
固相合成
固相法允许小规模地迅速合成较大的氨基-三唑基BODIPY化合物的文库。4上的苯胺官能团能够将支架负载到氯代三苯甲基氯聚苯乙烯(CTC-PS)树脂上。随后在弱酸性的条件下的切割保持了荧光团的完整性(方案1)(12)。在某些实施方案中，可使用其他的氯化的或溴化的固体支持物支架。
在一个示例性实施方案中，4的合成由四个步骤组成，具有37％的总产率。按照报道的方法很容易地由对硝基苯甲醛和吡咯制备1(25，26)。用N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)进行氯化，随后用2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ)进行氧化从而提供2，随后用BF3.OEt2对2进行处理以得到高度稳定的BODIPY类似物3(26，27)。用活性铁进行还原提供了定量产率的4。然后用标准的偶联条件将苯胺负载到CTC-PS树脂上。用叠氮化钠处理产生了双取代的叠氮化物中间体，在所述中间体上，首先通过胺结构单元的单取代(方案3)以及随后通过炔结构单元的CuAAC(方案4)引入多样性。最后用CH2Cl2中的0.5％三氟乙酸(TFA)切割产生BDC和MK文库的相应氨基三唑基BODIPY化合物，在最少的纯化步骤中具有95％的平均纯度。这些化合物具有游离的苯胺，其可进一步经酰基氯结构单元乙酰化以添加官能性，生成相应的乙酰基(AC)、氯乙酰基(CA)、乙酰氧基乙酰氯(AA)和羟基乙酰基(HA)衍生物(方案5)。在某些实施方案中，CA标签对于蛋白标记是有用的，而与一些MK化合物偶联的HA标签具有对原代神经元的特定荧光响应。在某些实施方案中，AA标签以及其他类似的衍生物可以是有用的对完整活细胞具有改进渗透性的疏水性HA前体。随后通过细胞酯酶的水解释放活性HA化合物。
方案1.氨基-三唑基BODIPY化合物的固相合成
试剂和条件：(a)吡咯，TFA，室温，3小时；(b)NCS，干燥的THF，-78℃至室温，3小时；(c)DDQ，干燥的CH2Cl2，室温，1小时；(d)BF3OEt2，干燥的CH2Cl2，室温，2小时；(e)活性Fe，CH3OH∶CH3COOH(10∶1)，回流，15分钟；(f)CTC-PS树脂，DIEA，CH2Cl2/DMF，室温，24小时；(g)NaN3，DMF，室温，30分钟；(h)DMF∶哌啶(4∶1)，室温，45分钟；(i)DMF∶R2R3NH(4∶1)，室温，1小时；(j)R1-C≡CH，CuI，抗坏血酸，室温，30分钟；(k)CH2Cl2中0.5％的TFA；(l)R4COCl，饱和NaHCO3，室温，10分钟；(m)CH3COOCH2COCl，饱和NaHCO3，室温，10分钟；(n)K2CO3，MeOH，H2O，室温，1小时。化合物5中的暗色球体代表氯代三苯甲基聚苯乙烯树脂。
溶液相合成
在一些作为替代的实施方案中，将产生BDC和MK化合物的溶液相法用于染料的大规模合成(方案2)。在一个示例性实施方案中，如在固相法中所描述的来合成化合物1、2和3。随后将氨基和三唑基官能团添加到3上。首先用二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中约2.2当量的叠氮化钠处理化合物3以产生双取代的叠氮化物中间体。紧接其后是用1当量未经纯化的相应的胺结构单元进行亲核取代(方案3)。反应完成后，除去DMF，并且将粗制混合物重新溶解于叔丁醇溶剂中，之后用合适的炔结构单元进行CuAAC(方案4)。最后用活性铁对硝基苯部分进行还原，得到相应的BDC和MK化合物，任选地使用在固相合成中描述的步骤对其进一步乙酰化以产生相应的乙酰基(AC)、氯乙酰基(CA)、乙酰氧基乙酰氯(AA)和羟乙酰基(HA)衍生物(方案5)。
方案2.氨基-三唑基BODIPY化合物的溶液相合成。
试剂和条件：(a)吡咯，TFA，室温，3小时；(b)NCS，干燥的THF，-78℃至室温，3小时；(c)DDQ，干燥的CH2Cl2，室温，1小时；(d)BF3OEt2，干燥的CH2Cl2，室温，2小时；(e)NaN3(2.2当量)，DMF，室温，30分钟；(f)哌啶(1当量)，DMF，室温；(g)R2R3NH(1当量)，DMF，室温，1小时；(h)R1-C≡CH，CuI，抗坏血酸，tBuOH，室温；(i)活性铁，CH3OH∶CH3COOH(10∶1)，回流；(j)R4COCl，饱和NaHCO3，室温，10分钟；(k)CH3COOCH2COCl，饱和NaHCO3，室温，10分钟；(l)K2CO3，MeOH，H2O，室温，1小时。
在某些实施方案中，本发明的胺结构单元包括伯胺和仲胺，例如HNRxRy，其中Rx和Ry各自独立地为H、(C1-C10)烷基、(C6-C10)芳基(C0-C6)烷基、(C3-C10)杂芳基、(C3-C8)环烷基、(C2-C10)炔基或(C2-C10)烯基，其中各自任选地具有1至5个取代基，所述取代基各自在任意位置，并且各自选自：(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、NH2、-NH(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷氧基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷氧基)、-NH(CO)(C2-C6烯基)、-Si(C1-C6烷基)、-SO2(C1-C6烷基)、-SH、-B(OH)2、-O对甲苯磺酰基、-CO(C1-C6烷氧基)、-COH、-COOH、-CO(C1-C6烷基)或卤素。在一些优选的实施方案中，所述取代基不合有羟基存在。在一些替代实施方案中，Rx和Ry取代基可一起形成环，这样该环包括环状氨基例如哌啶和吡咯烷，且可包括杂原子例如在吗啉中。环状氨基任选地被1至5个选自卤素或(C1-C6)烷基的取代基所取代，或任选地与另一个环系例如芳族环系融合在一起。取代基可存在于芳族环系的邻位、间位或对位的任何位置。在某些其他实施方案中，胺结构单元包括苄胺，其任选地被各自独立地选自以下的取代基在一个或更多个位置所取代：H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、NH2、-NH(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷氧基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷氧基)、-NH(CO)(C2-C6烯基)、-Si(C1-C6烷基)、-SO2(C1-C6烷基)、-SH、-B(OH)2、-O对甲苯磺酰基、-CO(C1-C6烷氧基)、-COH、-COOH、-CO(C1-C6烷基)或卤素。在一些替代实施方案中，胺结构单元是氨基苯，其中苯环任选地被各自独立地选自以下的取代基在一个或更多个位置所取代：H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、NH2、-NH(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷氧基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷氧基)、-NH(CO)(C2-C6烯基)、-Si(C1-C6烷基)、-SO2(C1-C6烷基)、-SH、-B(OH)2、-O对甲苯磺酰基、-CO(C1-C6烷氧基)、-COH、-COOH、-CO(C1-C6烷基)或卤素。可在本发明中使用的胺结构单元的某些示例性实施方案示于方案3中。
方案3.用于BDC和MK文库的胺结构单元。
在本发明的某些实施方案中，炔结构单元是式R1-C≡CH的化合物，其中R1选自(C1-C10)烷基、(C3-C8)环烷基、(C6-C10)芳基、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基或(C3-C10)杂芳基，而且其中R1任选地被1至5个选自以下的取代基在任意位置所取代：(C1-C10)烷基、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基、(C3-C8)环烷基、(C1-C6)烷氧基、(C6-C10)芳氧基、(C6-C10)芳基、氨基、-NH(CO)(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C2-C6烯基)、-NH(CO)(C2-C6炔基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷基)、卤素、OCF3、CF3、羟基或卤素放射性同位素。可在本发明中使用的炔结构单元的某些示例性实施方案示于方案4中。
方案4.用于BDC和MK文库的炔结构单元。
方案5.苯胺部分的衍生物
在本发明的某些实施方案中，酰基氯结构单元具有式R4COCl的结构，其中R4是CO(C1-C6)烷基，其任选地被1至3个另外的取代基在任意位置所取代，所述取代基独立地选自卤素、羟基、-NH2、NH-乙酰基或O-乙酰基。酰基氯的一些优选实施方案包括以下的取代。当R4是甲基时，则形成AC衍生物(例如，BDCAC或MKAC)。当R4为CH2Cl时，则形成CA衍生物。类似地，当R4是CH2X时，形成XA衍生物。AA衍生物包括其中R4是CH2OAc的化合物，而HA衍生物包括等于CH2OH的R4。
光物理性质
本发明的许多氨基-三唑基-BODIPY化合物显示出类似的吸收波长最大值(表1)，然而其发射最大值跨越较广的范围。值得注意的是，梅咖斯托克斯BODIPY染料的光谱性质可用不同的炔结构单元进行微调。在一些实施方案中，富电子的炔(例如，4-乙炔基-N，N-二甲基苯胺)比含有吸电子基团的炔(例如，4-(三氟甲氧基)苯基乙炔)产生具有更长吸收波长的化合物。虽然由于光诱导电子转移(PeT)效果，BDC和MK化合物展现出低的量子产率(28，29)，苯胺基团的乙酰化以平均7倍的荧光增强部分地恢复了其荧光发射。另一方面，来自伯胺结构单元的MK化合物在荧光量子产率方面显示出额外的4至7倍的增强。不受限于理论，相信这种现象是游离NH和BODIPY氟之间形成分子内氢键的结果，其降低了结构的构象柔性(conformationalflexibility)，因此增强了荧光(30)。这些性质证实了本发明的BDC和MK化合物表现为具有潜在的可调量子产率的荧光开启传感器的能力。
表1.氨基-三唑基-BODIPY化合物的光谱特性。
氨基-三唑基BODIPY化合物作为荧光分子转子
本发明的氨基-三唑基BODIPY化合物在BODIPY核心的位置3和位置5处具有可自由转动的模体(motif)。在某些实施方案中，特定的环境限制这些模体的旋转。这些环境包括与合适的分析物相互作用。旋转的限制导致启动荧光响应。在实施例2中通过在具有覆盖一定范围的黏度的类似极性的不同溶剂中BDC-9光谱的荧光分析，验证了氨基-三唑基BODIPY化合物的分子转子特性。
用于人血清白蛋白的独特探针
人血清白蛋白(HSA)是人血浆中最丰富的蛋白质。具有约0.6mM的循环浓度，HSA在维持渗透压和生理pH值方面起主要的作用(31)。蛋白尿(尿液中HSA的流失)是公知的心血管风险标记以及肝和肾疾病的指征(32，33)。更重要的是，这种令人难以置信地可塑的蛋白质是广泛的必需配体(包括激素、脂肪酸和药物分子)的主要转运蛋白。因此，已做出努力来开发可用于检测和定量生物流体中的HSA并识别药物的结合位点的敏感且位点特异性的荧光探针。
HSA包括九个结合位点(34-38)，其中已知脂肪酸(FA)位点1、3和4(Sudlow位点II)，5、6和7(Sudlow位点I)对药物化合物具有亲和力(31，39-44)。因此，非常需要设计适用于简单竞争测定以鉴定药物结合位点的荧光探针。已成功开发出用于FA位点3、4、6和7的探针(45-61)。然而，缺乏用于其余位点的荧光探针。HSA的不同位点具有不同的物理特性且在药物的药物代谢动力学中具有重要的作用。因此，鉴定HSA的结合位点或药物位点是至关重要的。与不同的HSA位点特异性结合的荧光化合物可以是使用简单竞争测定以探测药物的结合位点的便捷工具。需要开发对HSA的脂肪酸1或5具有结合亲和力的选择性荧光探针。
本发明的氨基-三唑基-BODIPY化合物尤其可用作用于生物分析物(如人血清白蛋白)的荧光探针。具体而言，式(I)化合物表现出对HSA的选择性，其中式(I)是：
其中：
R1是H或CO(C1-C6)烷基，其中CO(C1-C6)烷基任选地被1至3个选自以下的取代基在任意位置所取代：卤素、羟基、O-乙酰基、NH-乙酰基或-NH2；
R2和R3各自独立地为H、(C1-C10)烷基、(C6-C10)芳基(C0-C6)烷基、(C3-C10)杂芳基、(C3-C8)环烷基、(C2-C10)炔基或(C2-C10)烯基；其中R2和R3任选地被1至5个选自以下的取代基在任意位置所取代：(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、NH2、-NH(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷氧基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷氧基)、-NH(CO)(C2-C6烯基)、-Si(C1-C6烷基)、-SO2(C1-C6烷基)、-SH、-B(OH)2、-O对甲苯磺酰基、-CO(C1-C6烷氧基)、-COH、-COOH、-CO(C1-C6烷基)或卤素；
或者R2和R3一起形成环，其中所述环任选地被1至5个选自卤素或(C1-C6)烷基的另外的取代基所取代；并且
R4是(C1-C10)烷基、(C3-C8)环烷基、(C6-C10)芳基、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基或(C3-C10)杂芳基，而且其中R4任选地被1至5个选自以下的取代基在任意位置所取代：(C1-C10)烷基、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基、(C3-C8)环烷基、(C1-C6)烷氧基、(C6-C10)芳氧基、(C6-C10)芳基、氨基、-NH(CO)(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C2-C6烯基)、-NH(CO)(C2-C6炔基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷基)、卤素、OCF3、CF3、羟基或卤素放射性同位素。
在一些更具体的实施方案中，式(II)化合物对HSA的FA1位点具有选择性：
在某些实施方案中，本发明是用于人血清白蛋白(HSA)的荧光探针，其包含式(II)化合物。
在另一些实施方案中，本发明是用于检测生物流体样品中的人血清白蛋白(HSA)的方法，其包括使认为包含HSA的生物流体样品与式(I)化合物接触以形成孵育介质(incubationmedium)；
在足以形成经培养混合物的条件下孵育所述孵育介质；以及
通过荧光显微术分析所述混合物，其中所述混合物的荧光信号相对于不存在含有HSA样品的式(I)化合物之荧光信号的增强指示存在HSA。
在检测HSA的方法的一些实施方案中，荧光信号的强度的测量值与存在于样品中的HSA的浓度成比例。在某些实施方案中，式(I)化合物具有式(II)的结构。本文中所使用的“孵育”可指通过机械方式或者通过扩散的混合。孵育还可包括保持温度曲线。在某些实施方案中，式(I)化合物具有基线荧光。因此，在确定HSA之存在的分析方法中，荧光相对于式(I)的基线荧光的改变(例如荧光信号的增强或发射最大值的移动)指示目标分析物。使活神经元可视化的方法包括荧光显微术。用于测量式(I)化合物的荧光信号的荧光显微术法包括一般的荧光显微术、共聚焦显微术、双光子显微术和超分辨率(例如STORM)显微术。
HSA的X-射线晶体学研究已发现FA1位点是重要的药物结合位点。相比现有的荧光探针，本发明的氨基-三唑基-BODIPY化合物可用于使用简单的结合竞争测定来直接探测与HSAFA1位点结合的药物。在与HSA结合后，荧光染料表现出非常高的荧光。具有FA1位点亲和力的药物与荧光染料竞争位点结合。因此，在本发明的另一个实施方案中，本发明包括用于评估与HSA的FA1位点结合的药物的方法，所述方法包括监视染料荧光的减小。所述方法还提供了该药物的结合强度的测量。
用于原代神经元的独特探针
阐明支配神经功能的复杂神经元网络一直是神经科学家所感兴趣的主题，这些神经科学家相信可通过对大脑内神经元连接的缠结作图来破译人类的思想(82)。因而已经逐步形成了众多神经元标记方法以使这些复杂的细胞可视化。这些方法包括高尔基法(Golgimethod)、Nissl染色以及钙染料如Fura和Dil(83)。然而，大多数已建立的神经元标记染料在经固定的组织制备物上效果最好或者对神经元不具有选择性，而是依赖于逆行标记或人工注射以实现在活细胞中所期望的效果(84)。除了上面提到的那些，迄今还没有能够在其体外或体内环境中特异性地标记活神经元的化学染料。
神经元化合物的可用性否定了对使用抗体以及转基因动物的需要。这在神经元的情况下尤其有用，因为大多数的神经元标记物是细胞内的(例如，β-III微管蛋白，MAP2.NeuN)。因此需要细胞透化(因而细胞死亡)。表达广泛荧光蛋白的神经元的小鼠模型是可用的，然而荧光蛋白的表达在整个动物发育(例如在Thy1转基因小鼠品系中活化Cre重组酶所需的时间)中并不是一致的(85)。因此，仍然存在难以研究的神经发育领域，其各自可能需要不同的神经元模型以得到最佳的荧光蛋白表达。此外，荧光蛋白表达的并入可能干扰细胞的功能从而使得难以从这些转基因模型中得出功能性结论(86)。
没有用于细胞分离的好的神经元标记物也是一个问题(87)。神经元一般难以分离和培养。可能是由于在早期发育阶段增大的可塑性，在胚胎阶段和出生后的阶段神经元是最易存活的并可能在体外进行培养，但是已经证实只要给予合适的培养和分离条件，成熟的神经元也可被分离用于体外培养(88)。使用慢病毒转染也成为用于选择性标记感兴趣的神经元群体的受欢迎的方法(89)。神经元标记的现有方法包括抗体标记(其损害了细胞的生存力)或对荧光蛋白表达的转基因修饰(其可能影响细胞的天然功能)。市售的大多数神经元标记染料缺乏神经元特异性，而是依靠逆行标记或显微注射来实现神经元标记。然而，这些方法耗时并且往往标记效率较低。仍然需要一种能够标记活的神经元的荧光染料，从而能够进行广泛的细胞追踪和分离的应用，而不用受某些前面提到的方法所施加的限制。
本发明的氨基-三唑基-BODIPY化合物尤其可用作原代神经元的荧光探针。本文中公开的化合物实现了相对于其他神经细胞来对活神经元进行特异性标记。这可一般地应用到所有的神经元细胞制备物中而不管遗传背景如何，并导致了对许多应用有用的稳定的荧光信号。具体而言，式(I)化合物显示出对活神经元染色的选择性，其中式(I)为：
其中：
R1是H或CO(C1-C6)烷基，其中CO(C1-C6)烷基任选地被1至3个选自以下的取代基在任意位置所取代：卤素、羟基、O-乙酰基、NH-乙酰基或-NH2；
R2和R3各自独立地为H、(C1-C10)烷基、(C6-C10)芳基(C0-C6)烷基、(C3-C10)杂芳基、(C3-C8)环烷基、(C2-C10)炔基或(C2-C10)烯基；其中R2和R3任选地被1至5个选自以下的取代基在任意位置所取代：(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、NH2、-NH(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷氧基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷氧基)、-NH(CO)(C2-C6烯基)、-Si(C1-C6烷基)、-SO2(C1-C6烷基)、-SH、-B(OH)2、-O对甲苯磺酰基、-CO(C1-C6烷氧基)、-COH、-COOH、-CO(C1-C6烷基)或卤素；
或者R2和R3一起形成环，其中所述环任选地被1至5个选自卤素或(C1-C6)烷基的另外的取代基所取代；并且
R4是(C1-C10)烷基、(C3-C8)环烷基、(C6-C10)芳基、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基或(C3-C10)杂芳基，而且其中R4任选地被1至5个选自以下的取代基在任意位置所取代：(C1-C10)烷基、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基、(C3-C8)环烷基、(C1-C6)烷氧基、(C6-C10)芳氧基、(C6-C10)芳基、氨基、-NH(CO)(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C2-C6烯基)、-NH(CO)(C2-C6炔基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷基)、卤素、OCF3、CF3、羟基或卤素放射性同位素。
在一些更具体的实施方案中，式(III)化合物对活神经元染色具有选择性：
其中：
R2、R3和R4如式(I)中所定义的。
在另一些具体的实施方案中，式(XIV)化合物对活神经元染色具有选择性：
其中：
R4是(C1-C10)烷基、(C3-C8)环烷基、(C6-C10)芳基、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基或(C3-C10)杂芳基，而且其中R4任选地被1至5个选自以下的取代基在任意位置所取代：(C1-C10)烷基、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基、(C3-C8)环烷基、(C1-C6)烷氧基、(C6-C10)芳氧基、(C6-C10)芳基、氨基、-NH(CO)(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C2-C6烯基)、-NH(CO)(C2-C6炔基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷基)、卤素、OCF3、CF3、羟基或卤素放射性同位素；并且
R5为在任意位置存在的1至5个选自以下的取代基：H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、NH2、-NH(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷氧基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷氧基)、-NH(CO)(C2-C6烯基)、-Si(C1-C6烷基)、-SO2(C1-C6烷基)、-SH、-B(OH)2、-O对甲苯磺酰基、-CO(C1-C6烷氧基)、-COH、-COOH、-CO(C1-C6烷基)或卤素。
在又一个具体的实施方案中，用于活神经元选择性染色的是式(V)化合物：
在一些实施方案中，本发明是用于活神经元特异性染色的荧光染料。在某些实施方案中，染料是式(XV)化合物：
其中：
R2和R3各自独立地为H、(C1-C10)烷基、(C6-C10)芳基(C0-C6)烷基、(C3-C10)杂芳基、(C3-C8)环烷基、(C2-C10)炔基或(C2-C10)烯基；
其中(C1-C10)烷基、(C6-C10)芳基(C0-C6)烷基、(C3-C10)杂芳基、(C3-C8)环烷基、(C2-C10)炔基和(C2-C10)烯基任选地被1至5个选自以下的取代基在任意位置所取代：(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、NH2、-NH(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷氧基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷氧基)、-NH(CO)(C2-C6烯基)、-Si(C1-C6烷基)、-SO2(C1-C6烷基)、-SH、-B(OH)2、-O对甲苯磺酰基、-CO(C1-C6烷氧基)、-COH、-COOH、-CO(C1-C6烷基)或卤素；
或者R2和R3一起形成环，其中所述环任选地被1至5个选自卤素或(C1-C6)烷基的另外的取代基所取代；
R6是H或CO(CH3)；并且
R7是(C1-C10)烷基、(C3-C8)环烷基、(C6-C10)芳基、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基或(C3-C10)杂芳基，而且其中R4任选地被1至5个选自以下的取代基在任意位置所取代：(C1-C10)烷基、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基、(C3-C8)环烷基、(C1-C6)烷氧基、(C6-C10)芳氧基、(C6-C10)芳基、氨基、-NH(CO)(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C2-C6烯基)、-NH(CO)(C2-C6炔基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷基)、卤素、OCF3、CF3、羟基或卤素放射性同位素。
在另一些实施方案中，本发明是用于使细胞培养物中的活神经元可视化的方法，其包括：使细胞培养物与式(I)化合物接触以形成孵育介质，在足以对活神经元染色的条件下孵育所述孵育介质并用荧光显微术使经染色的活神经元可视化。
在某些实施方案中，所述方法利用了具有式(XIV)或(V)结构的式(I)化合物。在某些实施方案中，该方法用于体外应用。在某些其他实施方案中，所述方法用于在体内应用。本文中所使用的“孵育”可指通过机械设备或者通过扩散的混合。孵育还可包括保持温度曲线。使活神经元可视化的方法包括荧光显微术。在某些其他的实施方案中，例如对于含有18F的化合物，可使用正电子放射断层扫描(PET)技术。荧光显微术包括一般的荧光显微术、共聚焦显微术、双光子显微术和超分辨率(例如STORM)显微术。
在某些实施方案中，本发明的神经元染料在神经元细胞的体外培养物/测定中监视神经元的生存力、发育和树突形成。本文中所公开的染料也可与其他荧光细胞标记物组合以研究细胞的相互作用。染料也可应用于脑切片和体内，通过双光子或整体动物成像进行神经元成像。神经元染料在疾病(例如雷特(Rett)病或帕金森病)模型中可能具有应用性，在这些疾病模型中它们可用来监测疾病发病机制中神经元的变性。
定义
“烷基”是指饱和脂肪族支链或直链单价烃基，通常是C1-C10，优选C1-C6。“(C1-C6)烷基”是指具有直链或支链排列的1至6个碳原子的基团。“(C1-C6)烷基”包括甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、戊基和己基。
“亚烷基”是指饱和脂肪族直链二价烃基。因此，“(C1-C6)亚烷基”是指具有由1至6个线性排列的碳原子的二价饱和脂肪族基团。“(C1-C6)亚烷基”包括亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基和亚己基。
“杂环”是指饱和或部分不饱和(3至7元)的单环杂环，其包含一个氮原子和任选地独立地选自N、O或S的一个额外的杂原子。当一个杂原子是S时，它可以任选地是单氧化的或二氧化的(即-S(O)-或S(O)2)。单环杂环的实例包括但不限制于：氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、哌嗪、六氢嘧啶、四氢呋喃、四氢吡喃、吗啉、硫代吗啉、硫代吗啉1，1-二氧化物、四氢-2H-1，2-噻嗪、四氢-2H-1，2-噻嗪1，1-二氧化物、异噻唑烷、或异噻唑烷1，1-二氧化物。
“环烷基”是指饱和脂肪族环烃环。因此，“C3-C8环烷基”是指(3至8元)饱和脂肪族环烃环。C3-C8环烷基包括但不限制于：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。优选地，环烷基是C1-C6环烷基。
术语“烷氧基”是指-O-烷基；“羟烷基”是指被羟基取代的烷基；“芳烷基”是指被芳基取代的烷基；“烷氧基烷基”是指被烷氧基取代的烷基；“烷基胺”是指被烷基取代的胺；“环烷基烷基”是指被环烷基取代的烷基；“二烷基胺”是指被两个烷基取代的胺；“烷基羰基”是指-C(O)-A＊，其中A＊是烷基；“烷氧基羰基”是指-C(O)OA＊，其中A＊是烷基；并且其中烷基如上文所定义。烷氧基优选为O(C1-C6)烷基且包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基和己氧基。
“环烷氧基”是指环烷基-O-基团，其中环烷基如上文所定义。示例性的(C3-C7)环烷氧基包括环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基和环庚氧基。
“杂”指的是用至少一个选自N、S和O中的杂原子取代环体系中至少一个碳原子成员。杂环体系可被杂原子取代1个或2个碳原子成员。
“卤素(halogen)”和“卤代(halo)”在本文中可互换使用并且各自指的是氟、氯、溴或碘。
“氰基”是指-C≡N。
“硝基”是指-NO2。
本文中所使用的氨基可以是伯(-NH2)、仲(-NHRx)或叔(-NRxRy)，其中Rx和Ry可以是任意的烷基、芳基、杂环基、环烷基或亚烯基，各自任选地且独立地被一个或更多个上述取代基所取代。Rx和Ry取代基可一起形成“环”，其中本文中所使用的“环”是环氨基，例如哌啶和吡咯烷，且可包括杂原子，例如在吗啉中。
术语“卤代烷基”、“卤代环烷基”和“卤代烷氧基”是指烷基、环烷基或者烷氧基，视情况而定，被一个或更多个卤素原子所取代。术语“卤素”是指F、Cl、Br或I。优选地在卤代烷基或卤代烷氧基中的卤素是F。
术语“酰基”是指-C(O)B＊，其中B＊是任选地取代的烷基或芳基(例如，任选地取代的苯基)。
“亚烷基”由-[CH2]z-表示，其中z是正整数，优选为1至8，更优选1至4。
“亚烯基”是其中至少一对相邻的亚甲基被-CH＝CH-取代的亚烷基。
术语“(C6-C16)芳基”单独使用或作为如在“芳烷基”、“芳基烷氧基”、“芳氧基”或“芳氧基烷基”中较大部分的一部分使用时指的是碳环芳香环。术语“碳环芳基”可与术语“芳基”、“芳基环”、“碳环芳香环”、“芳基基团”以及“碳环芳香基团”互换使用。芳基一般有6至16个环原子。“取代的芳基”是在任何一个或更多个可取代的环原子处被取代。本文中所用的术语“C6-C16芳基”是指包含6至16个碳原子的单环、双环或三环碳环体系并包括苯基(Ph)、萘基、蒽基、1，2-二氢萘基、1，2，3-4-四氢萘基、芴基、茚满基、茚基等。(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基通过(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基的(C1-C6)烷基部分连接到分子的其余部分。
术语苄基(Bn)指的是-CH2Ph。
术语“杂芳基”、“杂芳族”、“杂芳环”、“杂芳基团”和“杂芳族基团”，单独使用或作为如“杂芳烷基”或“杂芳烷氧基”中较大部分的一部分使用时指的是具有5至14个总环原子的芳香环基团，所述总环原子选自碳和至少一个(通常为1至4个，更通常为1或2个)杂原子(例如，氧、氮或硫)。它们包括单环以及其中单环杂芳族环融合至一个或更多个其他碳环芳族或杂芳环的多环。本文中所用的术语“5至14元杂芳基”是指含有一个或两个芳环和其中5至14个总原子的单环、双环或三环体系，除非另有说明，否则一、二、三、四或五是独立地选自N、NH、N-(C1-6烷基)、O和S的杂原子。(C3-C10)杂芳基包括呋喃基、苯硫基、吡啶基、吡咯基、咪唑基并且在本发明的一些优选实施方案中，杂芳基是(C3-C10)杂芳基。
术语“2至4元多环基”是具有2至4个烃环或环结构(如苯环)的环状化合物。该术语一般包括所有的多环芳族化合物，包括多环芳族烃，含有硫、氮、氧或其他非碳原子的杂环芳族化合物，及其经取代的衍生物。
术语“烯基”是指包括至少一个双键的直链或支链烃基。(C6-C10)芳基(C2-C6)烯基通过(C6-C10)芳基(C2-C6)烯基的(C2-C6)烯基部分连接到分子的其余部分。同样地，术语“炔基”是指包含至少一个碳-碳三键的直链或支链烃基。
本发明化合物的可药用盐也包括在内。例如，可通过使化合物与合适的有机酸或无机酸反应从而产生可药用的阴离子盐形式来得到包含胺或其他碱性基团的本发明化合物的酸式盐。阴离子盐的实例包括乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、依地酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、二盐酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酰氨苯胂酸盐、己基间苯二酚盐、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、羟乙磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、黏酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、扑酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐、以及三乙基碘盐。
可通过与合适的碱反应来制备包含羧酸或其他酸性官能团的本发明的化合物的盐。可用提供可药用的阳离子的碱来制造这样的可药用盐，其包括碱金属(尤其是钠和钾)盐、碱土金属(尤其是钙和镁)盐、铝盐和铵盐以及从生理学上可接受的有机碱(例如三甲胺、三乙胺、吗啉、吡啶、哌啶、甲基吡啶、二环己胺、N，N′-二苄基乙二胺、2-羟基乙胺、双-(2-羟乙基)胺、三-(2-羟乙基)胺、普鲁卡因、二苄基哌啶、脱氢枞胺、N，N′-双脱氢枞胺、葡糖胺、N-甲基葡糖胺、可力丁、奎宁、喹啉)以及碱性氨基酸(例如赖氨酸和精氨酸)制成的盐。
固相支持树脂用于固相合成。一个这样的例子是“CT-PS树脂”。具体而言，它是2-氯代三苯甲基-聚苯乙烯。
“细胞提取物”是裂解的细胞，通过离心从其中除去不溶解的物质。
“组织切片”是适于分析的组织部分。组织切片可指单个组织切片或多个组织切片。
“生物流体”是生物来源的液体或气体。在本申请中，生物流体可包括血液、血浆、尿液、唾液和黏液。
如本文中所用的“光谱学”包括通过物质与辐射的能量发生反应的任何方法。这包括但绝不限制于：显微术、荧光显微术、紫外/可见光谱和流式细胞术。
本文中所使用的“化学反应性部分”指的是可被并入到结构或化合物(例如荧光团)中的低分子量的非蛋白质化合物，即对于检测生物分析物是有用的。在本发明的一些优选的实施方案中，化学反应性部分通过在其自己的结构内的原子或共价地结合化学连接基团与荧光团共价地结合。用于本发明使用的化学反应性部分的关键特征是其结合生物分析物的能力。在一个优选的实施方案中，化学反应性部分是对结合一定的生物分析物有选择性的。这样的化学反应性部分的实例包括丙烯酰基、卤代乙酰基、N-羟基琥珀酰亚胺酯、亚氨酸酯、五氟苯酯、羟甲基膦、马来酰亚胺、吡啶二硫物、硫代磺酸酯、乙烯砜、酰肼、烷氧基胺、芳基叠氮化物、二苯甲酮和异氰酸酯。在一些优选的实施方案中，化学反应性部分是生物素，其与亲和素结合用于进行检测，或者双丫丙啶部分，其可以作为光反应性交联剂。通过UV光(360nm)照明从双丫丙啶中产生碳烯，然后碳烯与存在于生物分析物中邻近的亲核物质反应形成共价键。
实施例
实施例1.BDC和MKBODIPY化合物的合成。
材料
除非另有说明，否则所有市售的试剂、溶剂和蛋白质都购自SigmaAldrich、AlfaAesar、Fluka、Merck或Acros，并按原样使用。CH2Cl2(FisherScientific，分析级)是在氮气下从P2O5中新鲜蒸馏的。无水的THF购自AlfaAesar，不再进一步纯化而使用。磷酸盐缓冲液是按照以下Dulbecco’sPBS缓冲液(1×)的修改配方而制备的：0.2gKH2PO4，2.17gNa2HPO4·7H2O，1000mLMilliQTMH2O，pH7.3。
分析
用BrukerACF300(300MHz，DPX300(300MHz)和AMX500(500MHz)光谱分析仪记录1H-NMR、19F-NMR和13C-NMR谱。用Finnigan/MAT95XL-T光谱分析仪获得高分辨率的质谱(ESI)。用SpectraMaxM2分光光度计(MolecularDevices)测定光谱和量子产率数据。使用GraphPrism5.0进行数据分析。用具有DAD检测器的HPLC-MS(Agilent-1200系列)和具有ESI探针的单四极杆质谱仪(6130系列)进行分析表征。分析型HPLC法：洗脱液，A：H2O(0.1％HCOOH)；B：CH3CN(0.1％HCOOH)，梯度5％B至95％B(10分钟)。反相PhenomenexC18Luna柱(4.6×50mm2，3.5μm粒径)，流量：1mL/分钟。
量子产率测量值
通过测量荧光光谱完整的发射面积并与当在460nm激发时EtOH中测定的吖啶黄的面积进行比较来计算量子产率。使用下面的等式来计算氨基-三唑基-BODIPY的量子产率，其中F代表荧光发射的面积，η是溶剂的折射率且Abs是在选择用于标准品和样品的激发波长下的吸光度。发射集中在510和700nm之间。
合成
用于在固相上制备BDC和MK文库化合物的一般方法：
将2-氯代三苯甲基氯树脂(220mg，0.275mM)在CH2Cl2(3.0mL)中溶胀15分钟。将DMF∶CH2Cl2(1∶1，2mL)中4(30mg，0.085mmol)的溶液和DIEA(200μL，1.15mmol)添加到树脂混悬液中并在室温下振荡24小时，之后用MeOH(0.4mL，1.8mL/g树脂)和DIEA(100μL)加盖树脂12小时。过滤树脂，用DMF(4×10mL)和CH2Cl2(4×10mL)洗涤并干燥。将载荷的树脂重悬于CH2Cl2中并在室温下振荡15分钟并用DMF洗涤。加入在DMF(3.0mL)中的叠氮化钠的混悬液(50mg，0.77mmol)，并将反应混合物在室温下再振荡30分钟。用DMF(4×10mL)洗涤之后，添加DMF∶哌啶(4∶1)(4.0mL)的溶液，并将反应振荡45分钟。随后添加炔(0.854mmol)、CuI(65mg，0.34mmol)和抗坏血酸(60mg，34mmol)并将反应混合物再振荡30分钟。过滤树脂，用DMF(4×10mL)和CH2Cl2(4×10mL)洗涤，在这之后用CH2Cl2(3×15mL，每10分钟)中的0.5％TFA进行切割。在真空中将有机萃取物回收并浓缩。在硅胶上(洗脱剂∶CH2Cl2至CH2Cl2∶MeOH(98∶2))将残余物通过快速柱色谱法进行纯化以得到相应的作为橙色固体的BDC和MK文库化合物(一般约16mg，0.03mmol，70％产率)。表2和5具有特定的化学结构和详细的表征数据，包括在254nm处的百分比纯度，计算的和实验确定的质量，吸收和发射光谱的λmax和量子产率(φ)。
在溶液相中制备BDC和MK文库化合物的一般方法：
将NaN3(34mg，0.52mmol)添加到在乙腈(1mL)中3的溶液(100mg，0.26mM)中并搅拌30分钟。然后添加相应的胺(0.26mmol)，将反应再搅拌1小时。在真空中将反应混合物蒸发并重新溶解于t-BuOH∶THF∶H2O(4∶1∶1)(1mL)中，随后添加炔(0.26mmol)、CuI(50mg，0.26mmol)和抗坏血酸(46mg，0.26mmol)并搅拌30分钟。在真空中蒸发有机溶剂并将所得的残余物用水(20mL)进行稀释，并用DCM(20mL×3)进行萃取。在真空中将合并的有机萃取物浓缩，并在硅胶上通过快速柱色谱法进行纯化。将所得到的残余物溶解于EtOH(1mL)和乙酸(0.1mL)中并加热至90℃。在1M的HCl中将铁粉(28mg，0.5mmol)的混悬液活化1分钟，用无水EtOH润洗并加入到反应混合物中。反应完成后，将铁除去并在真空中蒸发溶剂。用CH2Cl2(20mL)稀释残余物并用饱和NaHCO3(3×20mL)洗涤。用饱和盐水洗涤有机萃取物并经无水Na2SO4干燥并在真空中进行蒸发以得到作为橙色固体的相应的BDC和MK文库化合物(一般约35mg，0.06mmol，24％总产率)。表2和5具有特定的化学结构和详细的表征数据。
用于制备BDCAC、BDCCA、MKAC和MKCA文库化合物的一般方法：
向在CH2Cl2(1.5mL)中各自的BDC和MK化合物(一般约6mg，0.011mmol)的溶液中添加6滴饱和NaHCO3水溶液并冷却至0℃。在1分钟内分批添加酰基氯(一般约10μL，0.11mmol)，将所得混合物在室温下进行搅拌并通过分析型TLC进行监测。反应完成后，用CH2Cl2(15mL)稀释反应，用水(2×15mL)、饱和NaHCO3(1×15mL)、饱和盐水(1×15mL)洗涤并经无水Na2SO4干燥。蒸发有机萃取物以得到作为橙色固体的相应的BDCAC、BDCCA、BDCXA、MKAC、MKCA或MKXA化合物(一般约6mg，＞90％产率)。表3、4、6和7具有特定的化学结构和详细的表征数据。
制备MKHA化合物的一般方法：
向在CH2Cl2(1.5mL)中各MK化合物(一般约6mg，0.011mmol)的溶液添加6滴饱和NaHCO3水溶液并冷却至0℃。在1分钟内分批添加乙酰氧基乙酰氯(10μL，0.11mmol)，将所得混合物在室温下搅拌并通过分析型TLC进行监测。完成后，蒸发CH2Cl2并将混合物重新溶解于MeOH(1.5mL)中。添加6滴饱和Na2CO3水溶液，将反应混合物在室温下进行搅拌并通过分析型TLC进行监测。用CH2Cl2(15mL)稀释反应，用水(2×15mL)、饱和NaHCO3(1×15mL)、饱和盐水(1×15mL)洗涤并经无水Na2SO4干燥。蒸发有机萃取物以得到作为橙色固体的相应的MKHA化合物(一般约6mg，＞90％产率)。表8具有化学结构和详细的表征数据。
用于特定化合物的制备方法和表征数据：
2，2′-((4-硝基苯基)亚甲基)双(1H-吡咯)(1)。向在吡咯(10mL，144mM)中的4-硝基苯甲醛(1.0g，6.6mmol)溶液添加TFA(0.51mL，0.66mmol)并在室温下搅拌3小时。在真空中将混合物浓缩，并在硅胶上(己烷∶EtOAc，4∶1)通过快速柱色谱法进行纯化以得到作为亮黄色固体的1(1.63g，6.10mmol，92％产率)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ8.17(d，J＝8.7Hz，2H)，7.99(br.s，2H)，7.36(d，J＝8.7Hz，2H)，7.99(br.s，2H)，6.75(d，J＝5.8Hz，2H)，6.18(dd，J＝5.8，2.9Hz，2H)，5.87(br.s，2H)，5.58(s，1H)；13CNMR(125MHz，CDCl3)：δ＝144.7，144.2，132.2，130.5，123.8，118.0，108.5，107.7，45.9；MS(ESI)：m/z[M+H]+＝268.1.
1，1′-二氯-5-(4-硝基苯基)二吡咯甲川(2)。在-78℃的N2气氛下将在无水THF(35mL)中的1(1.1g，4.1mmol)的溶液搅拌15分钟。使用均压漏斗逐滴添加无水THF(35mL)中的N-氯代琥珀酰亚胺(1.4g，10.3mmol)并将所得的混合物在室温下搅拌3小时。完成后，添加2，3-二氯-5，6-二氰基-对苯醌(1.12g，4.92mmol)并将反应混合物在室温下再搅拌2个小时。在真空中除去THF并用水(20mL)稀释得到的混合物并用CH2Cl2(3×70mL)进行萃取。将合并的有机萃取物用饱和盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并在真空中除去溶剂。在硅胶上(己烷∶EtOAc，10∶1)通过快速柱色谱法将所得的残余物进行纯化以得到作为深橙色固体的2(0.78g，2.3mmol，57％产率)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ＝8.32(d，J＝4.3Hz，2H)，7.62(d，J＝4.3Hz，2H)，6.41(d，J＝2.1Hz，2H)，6.29(d，J＝2.1Hz，2H)；13CNMR(125MHz，CDCl3)：δ＝164.0，147.1，146.6，146.1，136.0，130.8，127.3，123.8，121.8，116.3，112.1，32.7，14.8；MS(ESI)：m/z[M+H]+＝334.0.
3，5-二氯-8-(4′-硝基苯基)-4，4-二氟-4-硼杂-3a，4a二氮杂-s-吲哒省(3)。向在无水CH2Cl2(70mL)中的2(1.0g，2.97mmol)的溶液添加N，N-二异丙基乙胺(3.1mL，17.8mmol)，于0℃搅拌10分钟。逐滴添加三氟化硼乙醚合物(2.2mL，17.8mmol)，在室温下将所得混合物搅拌2小时。完成后，在真空中除去溶剂并且在硅胶上(己烷∶EtOAc∶MeOH，10∶1∶0.1)通过快速柱色谱法将所得的残余物进行纯化以得到作为深红紫色固体的3(0.81g，2.14mmol，72％产量)。
`HNMR(300MHz，CDCl3)：δ＝8.39(d，J＝4.4Hz，2H)，7.69(d，J＝4.4Hz，2H)，6.75(d，J＝2.2Hz，2H)，6.48(d，J＝2.2Hz，2H)；13CNMR(125MHz，CDCl3)：δ＝162.4，148.4，147.1，132.0，125.3，126.8，124.5，123.8，127.3，120.8，114.9，111.3；19FNMR(282MHz，CDCl3)：δ＝-72.12(q，J＝30Hz)；MS(ESI)：m/z[M+H]+＝382.9.
3，5-二氯-8-(4′-氨基苯基)-4，4-二氟-4-硼杂-3α，4α-二氮杂-s-吲哒省(4)。在1M的HCl中将铁粉(1.46g，26.2mM)的混悬液活化1分钟，用无水EtOH润洗并按原样使用。向在EtOH(80mL)和乙酸(8mL)中3(500mg，1.3mmol)的溶液中添加活化的铁并回流。通过TLC对反应混合物进行监测。完成后，除去铁并在真空中蒸发溶剂。用水稀释残余物，并用CH2Cl2(3×70mL)进行萃取。用饱和Na2CO3、饱和盐水洗涤合并的有机萃取物，经无水Na2SO4干燥并在真空中除去溶剂。在硅胶上(己烷∶EtOAc∶MeOH∶NH3：6∶3∶1∶0.05)通过快速柱色谱法将所得的残余物进行纯化以得到作为暗红色固体的4(197mg，0.56mmol，98％产率)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ＝7.33(dt，J＝8.5，2.6Hz，2H)，6.92(d，J＝3.8Hz，2H)，6.76(dt，J＝8.5，2.6Hz，2H)，6.42(d，J＝3.8Hz，2H)，4.11(br.s，2H)；13CNMR(125MHz，CDCl3)：δ＝162.4，147.6，132.0，128.7，125.2，26.9，124.5，120.8，114.9，111.3；19FNMR(282MHz，CDCl3)：δ＝-72.05(q，J＝25Hz)；HRMS(C15H11BCl2F2N3)：算得[M+H]+：352.0386，实测[M+H]+：352.0215.
10-(4-氨基苯基)-5，5-二氟-7-(4-苯基-1H-1，2，3-三唑-1-基)-3-(哌啶-1-基)-5H-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼环己烯-4-正离子-5-负离子(BDC-9)：橙色固体(17mg，0.032mmol，72％产率)；
1HNMR(500MHz，CDCl3)：δ＝8.56(s，1H)，7.94(d，J＝6.9Hz，2H)，7.45(t，J＝7.6，Hz，2H)，7.35(t，J＝7.6Hz，1H)，7.27(d，8.2Hz，2H)，6.94(d，J＝5.7Hz，1H)，6.80(d，J＝8.2Hz，2H)，6.62(d，J＝3.8Hz，1H)，6.42(d，J＝3.8Hz，1H)，6.32(d，J＝5.1Hz，1H)，5.30(s，1H)，3.78-3.88(m，4H)，1.64-1.80(m，6H)，1.26(br.s，2H)；13CNMR(75MHz，CDCl3)：δ＝162.2，146.7，136.0，135.7，134.9，131.8，131.3，131.0，130.8，129.6，128.7，127.9，126.0，125.0，122.4，122.3，116.9，115.4，115.0，114.9，109.7，53.4，52.0，29.7，26.3，24.0；19FNMR(282MHz，CDCl3)：δ＝-55.82(q，J＝34Hz)；HRMS(C28H27BF2N7)：算得[M+H]+：510.2384，实测[M+H]+：510.2399.
7-(苄氨基)-5，5-二氟-10-(4-(2-羟基乙酰氨基)苯基)-3-(4-丙基-1H-1，2，3-三唑-1-基)-5H-二吡咯并[1，2-c：2′，1′-f][1，3，2]二氮杂硼环己烯-4-正离子-5-负离子(MKHA374-48)：橙色固体(15mg，0.027mmol，61％产率)；
1HNMR(500MHz，CDCl3)：δ＝8.91(s，1H)，8.15(s，1H)，7.71(d，J＝8.2Hz，2H)，7.33-7.39(m，5H)，7.27-7.30(m，3H)，6.95(d，J＝5.0Hz，1H)，6.74(br.s，1H)，6.38(s，2H)，6.20(d，J＝4.4Hz，1H)，4.60(d，J＝6.3Hz，2H)，4.30(s，2H)，2.80(t，J＝7.6Hz，2H)，1.80(qt，J＝7.6Hz，2H)，1.03(t，J＝7.6Hz，3H)；13CNMR(125MHz，CDCl3)：δ＝170.8，162.5，139.0，136.9，136.1，133.9，132.4，132.0，131.8，131.0，129.2，128.9，128.4，127.6，126.8，119.6，119.0，112.5，109.5，62.6，48.4，28.7，22.4，13.7；19FNMR(282MHz，CDCl3)：δ＝-68.29(q，J＝33Hz)；HRMS(C29H28BF2N7O2)：算得[M+H]+：556.2444，实测[M+H]+：556.2461.
表2.BDC化合物文库的化学结构和表征数据。
表3.BDCAC化合物文库的化学结构和表征数据。
表4.BDCCA化合物文库的化学结构和表征数据。
表5.MK化合物文库的化学结构和表征数据。
表6.MKAC化合物文库的化学结构和表征数据。
表7.MKCA化合物文库的化学结构和表征数据。
表8.MKHA化合物的化学结构和表征数据。
实施例2.氨基-三唑基-BODIPY化合物作为荧光分子转子的分析。
在具有覆盖一定范围的黏度的类似极性的不同溶剂中分析化合物(BDC-9)的荧光光谱。如图3所示，观察到了荧光强度和黏度之间的强相关性。增大的溶剂黏度降低了BODIPY核心的位置3和位置5的键旋转，不受理论的限制，这最小化了非辐射能量的损失并导致更高的量子产率(24)。这一结果证实了氨基-三唑基-BODIPY作为荧光分子转子的潜力。
实施例3.选择性HSA荧光探针的鉴定
材料和方法
除非另有说明，否则在室温下在磷酸盐缓冲液(pH7.3，1％DMSO)中制备BDC-9与HSA的混合物，在孵育2小时后进行荧光测量。
体外荧光筛选
在含1％DMSO的10mMpH7.4的HEPES缓冲液中对氨基-三唑基-BODIPY(10μM)进行筛选。使用SpectraMaxM2酶标仪在384孔板中测定荧光强度。在每个化合物的激发范围内提供激发并且从超出激发波长至少30nm处开始获得发射光谱。所有的分析物均在四个系列的浓度下进行测试。
检查了BDC、BDCAC和BDCCA对分为九个不同的集合(即pH标准物、黏性溶液、遗传大分子、肽、金属离子、氧化还原分子、核酸、蛋白质和其他代谢物)的84种生物相关的分析物的荧光响应。氨基-三唑基-BODIPY化合物在与某些特定的蛋白质孵育后显示出显著的荧光增强。作为一个代表性的实例，相对于其他蛋白质和分析物，化合物BDC-9显示了对人血清白蛋白(HSA)的显著选择性(图4)。
除了其高选择性，BDC-9显示了在与HSA结合后荧光220倍的显著增强(图5)。证明BDC-9的响应在0.37至31μg/mL的动态范围内呈线性，并且确定了HSA的检测限(S/N＝3)为0.3μg/mL(图6)。
研究了BDC-9对来自不同物种的血清白蛋白的选择性。血清白蛋白代表其一级序列在跨跃多种物种中具有高度相似性的蛋白质家族(约75％同源性)(34，39，40，62)。然而，发现一些白蛋白的配体显示物种依赖性结合差异且物种选择性探针的开发可能对白蛋白结合位点的结构研究有用(63-67)。评估了BDC-9对来自大鼠(RSA)、猪(PSA)、兔(RbSA)、绵羊(SSA)和牛(BSA)的系列浓度的血清白蛋白的荧光响应。如在图7a-b中所示，BDC-9显示了对HSA的显著选择性，对其他物种具有微小的响应(68，69)。
实施例4.BDC-9对HSA的结合分析
研究了BDC-9的结合特性。HSA包含至少九个结合位点(34-38)，其中已知脂肪酸(FA)位点1、3和4(Sudlow位点II)，5、6和7(Sudlow位点I)对药物化合物具有亲和力(31，39-44)。最近的报告表明了HSA上对应于脂肪酸1位点(FA1)的第三主要的药物结合位点的重要性(70)。为了验证特异性结合并确定HSA中BDC-9的结合位点，使用与各自位点结合的药物(例如，氯高铁血红素(FA1位点)(71，72)、丹磺酰基-L-正缬氨酸(FA3/4位点)(73)、丙泊酚(FA3/4和FA5位点)(35)、布洛芬(FA3/4和FA6位点)(74)和华法林(FA7位点)(74))进行竞争测试(75)。
如图8中所示，仅与血红素的竞争才引起了BDC-9荧光响应的显著减小，而与所有其他药物的竞争没有影响BDC-9的荧光。这些观察结果清楚地表明，BDC-9的环境启动响应是由于其与HSA的FA1位点(血红素位点)的结合。已经有一些与FA3/4(48，49，73)、FA6(51)和FA7(54，55，76)位点结合的荧光染料的报道。本发明代表了与FA1位点结合的首次已知的经实验证明的荧光染料(76)，其中结合不依赖于与结合脂质的接触(72)。因此，BDC-9是用于检查HSA上的亚铁血红素区的有价值的探针。
进行工作作图分析以确定通过BDC-9和HSA形成的复合物的化学计量，并确认来自位点选择性研究的结果。BDC-9的荧光响应在BDC-9∶HSA为1∶1比例时达到峰值，这表明BDC-9主要在蛋白质的一个位点上进行结合(图9)(77，78)。
BDC-9与HSA的解离常数的确定。
用HSA(10μM)对系列浓度的BDC-9(0.47至60μM)进行滴定并在575nm(λexc＝460nm)处测定荧光强度。使用以下等式确定结合的BDC-9在每个浓度下的荧光强度：
其中，F和F0是分别具有和不具有HSA之给定浓度的BDC-9的荧光强度。F饱和是相同浓度下完全结合的BDC-9的荧光强度。
将一点结合模型拟合为HSA(0.67mg/mL)与系列浓度的BDC-9的滴定，并将BDC-9的解离常数(KD)确定为12.7±0.4μM(图10)。
实施例5.应用BDC-9以量化尿液中的HSA
为了检查BDC-9在复杂基质中的选择性和灵敏度，利用BDC-9量化尿液样品中HSA的量。微量白蛋白尿(其涉及15至40μg/mL的白蛋白排泄率(80，81))是一种公知的心血管风险标记物以及肝和肾疾病的指示(32，33)。分析了掺入不同量(高达1mg/mL)的HSA的尿液中BDC-9的荧光响应。在BDC-9的荧光响应与在临床上显著的范围内的HSA量之间存在极好的线性相关性(图11)，这证明BDC-9量化尿样中HSA水平的潜力。
实施例6.MKHA和NeuO神经细胞探针的发现
在对第2代氨基-三唑基-BODIPY化合物(MK、MKAC、MKCA)的基于细胞之初步筛选中，MKCA化合物显示出对原代神经元的一些弱的响应。随后转变成MKHA衍生物，一般显著地改善了对原代神经元的荧光响应(图12)。对MKAA的酯化(以及可能的其他酯)提高了对完整活细胞的渗透性，同时保持了染色的特异性(图12)。乙酰化的MKAA在跨过活细胞膜后，通过细胞酯酶经历迅速的水解生成了负责荧光响应的活性MKHA化合物。图13和14显示了已经被合成并对原代神经元染色进行了测试的示例性MKHA化合物的结构。
对于神经元探针的发现，利用了原代脑细胞筛选平台，这涉及使用通过差速贴壁法(differentialadhesionmethod)而分离的原代神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞。将这些细胞制备为在384孔微孔板中彼此并排，并在分离后4-5天用500nM浓度的5,000DOFL化合物一式两份地孵育1小时(图15)。通过自动的基于强度的分析和基于图像的评价确定了对原代神经元具有特异性的荧光探针MKHA101-3。进行了初步的结构活性关系(SAR)研究并发现改进的化合物MKHA374-48与原始的MKHA101-3相比，对活神经元显示出更优的选择性(图16)。化合物MKHA374-48在本文中作为替代地称为NeuO(发音为“neo”)(神经元橙色，NeuronOrange)。
实施例7.NeuO对活神经元是特异的
用MKHA101-3进行细胞成像
相对于其他神经细胞，MKHA101-3特异性地对细胞体和树突进行染色。使用来自P1-P3小鼠的非均质脑细胞制备物，发现化合物阳性的细胞也是β-III微管蛋白阳性的(图17)。发现对星形胶质细胞标记物GFAP和少突胶质细胞标记物O4检测呈阳性的其他细胞是化合物阴性的，从而证明了MKHA101-3化合物对神经元的特异性。
用NeuO进行细胞成像
相对于其他神经细胞，NeuO特异性地对细胞体和树突进行染色。使用来自P1-P3小鼠的非均质脑细胞制备物，发现化合物阳性的细胞也是β-III微管蛋白(Tuji)阳性的(图18a)。发现对星形胶质细胞标记物GFAP和少突胶质细胞标记物O4检测呈阳性的其他细胞是化合物阴性的，从而证明了本发明化合物对神经元的特异性。NeuO看来对所有的神经元进行染色而不管其是何种亚型(图18b)。
流式细胞术分析和FACS分选
对由P1-P3的小鼠幼仔的大脑制备的混合细胞群进行的流式细胞术分析也示出了从主要群体中分离的明确细胞群体(10％-20％)(图19)。为了进一步分析这一化合物阳性细胞群，从细胞再培养物中分选出两个群体(明亮的和暗淡的)并提取RNA用于基因分析。
通过FACS分离的化合物阳性细胞示出神经元的形态并且是β-III微管蛋白阳性的。
分选出化合物明亮的和暗淡的细胞并以50,000个细胞/cm2的密度接种在聚-D-赖氨酸包被的板上的补充有B27和FGF(10ng/μL)的神经基础培养基中以进行再培养。5天后，在化合物明亮的再培养级分中观察到以树突的伸长为特征的具有神经元形态的细胞(图20a)。随后这些细胞进行神经元标记物β-III微管蛋白的免疫染色，结果为阳性(图20b和20c)。化合物暗淡的再培养级分显示几乎没有让人联想到神经元的任何细胞生长。
化合物阳性细胞表现出神经元标记物β-III微管蛋白的高表达。
由FACS分选的化合物阳性神经元群中提取的RNA来分析神经元标记物β-III微管蛋白的基因表达。化合物明亮级分比化合物暗淡级分始终显示出更高的β-III微管蛋白的表达(高至10倍)(图21)。在化合物明亮级分中β-III微管蛋白的表达往往也比未分选的级分高2倍，从而表明了探针化合物。
染色后神经元保持生存力
对于长期的跟踪和下游的功能性研究，化合物对细胞没有细胞毒性以及在染色后细胞保持生存力是至关重要的。细胞毒性测试(MTS，Promega)表明以500nM或更高的工作浓度用NeuO孵育24小时并未显著地影响细胞的生存力(图22)。
NeuO可用于体外神经元发育的长期成像
为了测试NeuO作为神经元细胞追踪物的潜力，对从P1-3小鼠幼仔中新鲜获得的神经元进行染色，并使用时间1成像体外观察了其树突的形成(图23)。在进行时间推移的研究以分析神经元的发育和其与其他神经细胞的相互作用中，细胞的存活和染料信号是至关重要的。
实施例8.MKHA化合物和其他神经元成像应用
基于SAR研究，设计并合成了另外的化合物以用于包括共价结合(图24)、拉下(pull-down)(图24和25)、PET成像(图26)和近红外光谱(图27)的多种应用。发现在图24-27中所描述的所有化合物都可对活神经元进行染色。
实施例9.MKHA化合物具有特异性地标记活小鼠大脑中神经元的潜力。
为了评估本文中公开的染料用于活脑切片染色的潜力，用化合物对新鲜的胚胎脑切片进行染色并在荧光显微镜下成像。MKHA101-3及其衍生物显示了特异性的细胞标记模式，其中染料加亮的细胞具有与神经元模式相一致的方式聚集的长树枝状突起和细胞体(图28)。这有力地表明了染料可被进一步应用于脑切片制备物中神经元的成像。
参考文献
1.O.Buyukcakir，etal.，Org.Lett.11，(2009)，4644-4647.
2.C.Yuetal.，Chem.-Eur.J.18，(2012)，6437-6442.
3.A.Martin，etal.，Chem.Commun.48，(2012)，5617-5619.
4.K.Umezawa，etal.，J.Am.Chem.Soc.130，(2008)，1550-1551.
5.J.etal.，Chem.-Eur.J.2011，17，7261-7270.
6.A.Loudet，K.Burgess，Chem.Rev.2007，107，4891-4932.
7.G.Ulrich，R.Ziessel，A.Harriman，Angew.Chem.，Int.Ed.2008，47，1184-1201.
8.C.Bernhard，etal.，Chem.Commun.2010，46，8267-8269.
9.J.A.Hendricks，etal.，Angew.Chem.，Int.Ed.2012，51，4603-4606.
10.J.-S.Lee，etal.，J.Am.Chem.Soc.2009，131，10077-10082.
11.L.D.Lavis，R.T.Raines，ACSChem.Biol.2008，3，142-155.
12.M.Vendrell，etal.，Chem.Commun.2011，47，8424.
13.M.Vendrell，D.Zhai，J.C.Er，Y.-T.Chang，Chem.Rev.2012，112，4391-4420.
14.M.Meldal，C.W.Chem.Rev.2008，108，2952-3015.
15.K.Sivakumar，etal.，Org.Lett.2004，6，4603-4606.
16.D.K.Scrafton，etal.，J.Org.Chem.2008，73，2871-2874.
17.J.Han，etal.，Org.Biomol.Chem.2009，7，34-36.
18.X.Qian，etal.，Chem.Commun.2010，46，6418-6436.
19.W.Qin，etal.，J.Phys.Chem.A2007，111，8588-8597.
20.B.Verbelen，etal.，Chem.Commun.2012，48，9129-9131.
21.T.Rohand，etal.，Chem.Commun.2006，266-268.
22.T.Rohand，etal.，Photochem.Photobiol.Sci.2007，6，1061-1066.
23.V.Leen，etal.，Chem.Commun.2010，46，4908-4910.
24.W.Qin，etal.，J.Phys.Chem.C2009，113，11731-11740.
25.B.Temelli，C.Unaleroglu，Tetrahedron2006，62，10130-10135.
26.L.Li，B.Nguyen，K.Burgess，Bioorg.Med.Chem.Lett.2008，18，3112-3116.
27.L.Li，J.Han，B.Nguyen，K.Burgess，J.Org.Chem.2008，73，1963-1970.
28.O.A.Bozdemir，etal.，J.Am.Chem.Soc.2010，132，8029-8036.
29.A.Coskun，E.Deniz，E.U.Akkaya，Org.Lett.2005，7，5187-5189.
30.W.Qin，etal.，J.Phys.Chem.A2008，113，439-447.
31.G.Fanali，etal.，Mol.AspectsMed.2012，33，209-290.
32.D.J.F.Rowe，A.Dawnay，G.F.Watts，Ann.Clin.Biochem.1990，27，297-312.
33.C.E.Mogensen，O.Schmitz，Med.Clin.NorthAm.1988，72，1465-1492.
34.S.Curry，etal.，Nat.Struct.Mol.Biol.1998，5，827-835.
35.A.A.Bhattacharya，T.Grüne，S.Curry，J.Mol.Biol.2000，303，721-732.
36.I.Petitpas，etal.，J.Mol.Biol.2001，314，955-960.
37.I.Petitpas，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.2003，100，6440-6445.
38.S.Sugio，etal.，ProteinEng.1999，12，439-446.
39.S.Curry，etal.，Biochim.Biophys.Acta，Mol.CellBiol.L.1999，1441，131-140.
40.S.Curry，DrugMetab.Pharmacokinet.2009，24，342-357.
41.L.Zhu，etal.，J.Struct.Biol.2008，162，40-49.
42.J.R.Simard，etal，Proc.Natl.Acad.Sci.2005，102，17958-17963.
43.G.Sudlow，D.J.Birkett，D.N.Wade，Mol.Pharmacol.1976，12，1052-1061.
44.G.Sudlow，D.J.Birkett，D.N.Wade，Mol.Pharmacol.1975，11，824-832.
45.F.Moreno，etal.，Photochem.Photobiol.1999，70，695-700.
46.K.Takehara，etal.，Anal.Sci.2009，25，115-120.
47.X.-t.Chen，Y.Xiang，A.-j.Tong，Talanta2010，80，1952-1958.
48.F.Ding，W.Liu，J.-X.Diao，Y.Sun，J.Hazard.Mater.2011，186，352-359.
49.K.K.Park，J.W.Park，A.D.Hamilton，Org.Biomol.Chem.2009，7，4225-4232.
50.M.Banerjee，etal.，J.Photochem.Photobiol.B2012，108，23-33.
51.Y.Wang，etal.，ProteinSci.2011，20，2095-2101.
52.D.C.Wilton，Biochem.J.1990，270，163-166.
53.B.Sengupta，P.K.Sengupta，Biopolymers2003，72，427-434.
54.F.Moreno，etal.，Photochem.Photobiol.1999，69，8-15.
55.Y.Sun，etal.，J.Lumin.2012，132，879-886.
56.J.Rohacova，etal.，J.Phys.Chem.B2011，115，10518-10524.
57.E.Alarcon，etal.，Photochem.Photobiol.Sci2010，9，93-102.
58.Z.-d.Qi，etal.，J.Pharm.Biomed.Anal.2008，46，699-706.
59.S.Deepa，A.K.Mishra，J.Pharm.Biomed.Anal.2005，38，556-563.
60.F.-L.Cui，J.-L.Wang，Y.-R.Cui，J.-P.Li，Anal.Chim.Acta2006，571，175-183.
61.A.-l.Tsai，etal.，Biochim.Biophys.Acta，Gen.Subj.1989，993，74-82.
62.S.Curry，Vol.33，2004，pp.29-46.
63.M.Pistolozzi，C.Bertucci，Chirality2008，20，552-558.
64.N.E.Basken，etal.，Nucl.Med.Biol.2008，35，281-286.
65.C.J.Mathias，S.R.Bergmann，M.A.Green，J.Nucl.Med.1995，36，1451-1455.
66.J.J.Lima，DrugMetab.Dispos.1988，16，563-567.
67.N.E.Basken，C.J.Mathias，M.A.Green，J.Pharm.Sci.2009，98，2170-2179.
68.A.Baldridge，etal.，ACSComb.Sci.2011，13，214-217.
69.Y.-H.Ahn，J.-S.Lee，Y.-T.Chang，J.Comb.Chem.2008，10，376-380.
70.F.Zsila，Mol.Pharmaceutics2013，10，1668-1682.
71.P.Zunszain，etal.，BMCStruct.Biol.2003，3，6.
72.M.Wardell，etal.，Biochem.Biophys.Res.Commun.2002，291，813-819.
73.A.J.Ryan，etal.，J.Struct.Biol.2011，174，84-91.
74.J.Ghuman，etal.，J.Mol.Biol.2005，353，38-52.
75.G.Zhang，N.Zhao，L.Wang，J.Lumin.2011，131，2716-2724.
76.K.Park，J.Park，A.Hamilton，J.Fluoresc.2007，17，361-369.
77.R.Subramanyam，etal.，J.Photochem.Photobiol.B2009，95，81-88.
78.C.Y.Huang，Meth.Enzymol.1982，87，509-525.
79.P.Job，Ann.Chim.Anal.1928，9，113-203.
80.M.A.Kessler，etal.，Anal.Biochem.1997，248，180-182.
81.M.A.Kessler，etal.，Clin.Chem.1997，43，996-1002.
82.J.DeFelipe，Science2010，330，1198-1201.
83.C.etal.，Prog.Neurobiol.2000，62，327-351.
84.M.G.Honig，R.I.Hume，TrendsNeurosci.1989，12，333-341.
85.S.M.Appleyard，Endocrinology2009，150，5199-5201.
86.K.Duff，F.Suleman，Brief.Funct.GenomicProteomic2004，3，47-59.
87.H.Okano，etal.，ParkinsonismRelat.D.2002，9，23-28.
88.G.J.Brewer，J.Neurosci.Meth.1997，71，143-155.
89.S.Tolu，etal.，FASEBJ.2010，24，723-730.
本文中引用的所有专利、公开的申请和参考文献的教导都通过引用整体并入本文。
虽然已经参考本发明的示例性实施方案具体地显示并描述了本发明，但是本领域的技术人员应该理解，可在其中做出的形式和细节上的多种变化而不脱离由所附权利要求书所涵盖的本发明的范围。

Claims (21)

1.具有式(I)结构的化合物或其可药用盐：
其中：
R1是H或CO(C1-C6)烷基，其中CO(C1-C6)烷基任选地被1至3个选自以下的取代基在任意位置所取代：卤素、羟基、O-乙酰基、NH-乙酰基或-NH2；
R2和R3各自独立地为H、(C1-C10)烷基、(C6-C10)芳基(C0-C6)烷基、(C3-C10)杂芳基、(C3-C8)环烷基、(C2-C10)炔基或(C2-C0)烯基；
其中(C1-C10)烷基、(C6-C10)芳基(C0-C6)烷基、(C3-C10)杂芳基、(C3-C8)环烷基、(C2-C10)炔基和(C2-C10)烯基任选地被1至5个选自以下的取代基在任意位置所取代：(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、NH2、-NH(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷氧基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷氧基)、-NH(CO)(C2-C6烯基)、-Si(C1-C6烷基)、-SO2(C1-C6烷基)、-SH、-B(OH)2、-O对甲苯磺酰基、-CO(C1-C6烷氧基)、-COH、-COOH、-CO(C1-C6烷基)或卤素；
或者R2和R3一起形成环，其中所述环任选地被1至5个选自卤素或(C1-C6)烷基的另外的取代基所取代；并且
R4是(C1-C10)烷基、(C3-C8)环烷基、(C6-C10)芳基、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基或(C3-C10)杂芳基，而且其中R4任选地被1至5个选自以下的取代基在任意位置所取代：(C1-C10)烷基、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基、(C3-C8)环烷基、(C1-C6)烷氧基、(C6-C10)芳氧基、(C6-C10)芳基、氨基、-NH(CO)(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C2-C6烯基)、-NH(CO)(C2-C6炔基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷基)、卤素、OCF3、CF3、羟基或卤素放射性同位素。
2.权利要求1所述的化合物，其中R1是H、COCH3、COCH2Cl、COCH2OH、COCH2NH2或COCH2O(CO)CH3。
3.权利要求2所述的化合物，其具有式(II)的结构：
4.权利要求2所述的化合物，其具有式(III)的结构：
5.权利要求2所述的化合物，其具有式(IV)的结构：
6.权利要求2所述的化合物，其具有式(V)的结构：
7.权利要求1所述的化合物，其中所述化合物与选自以下的化学反应性部分缀合：生物素、双吖丙啶、丙烯酰基、卤代乙酰基、二氮丙啶、N-羟基琥珀酰亚胺酯、亚氨酸酯、五氟苯酯、羟甲基膦、马来酰亚胺、吡啶基二硫化物、硫代磺酸酯、乙烯砜、酰肼、烷氧基胺、芳基叠氮化物、二苯甲酮、异氰酸酯、炔或酮。
8.用于固相合成式(I)化合物或其可药用盐的方法：
其中：
R1是H或CO(C1-C6)烷基，其中CO(C1-C6)烷基任选地被1至3个选自以下的取代基在任意位置所取代：卤素、羟基、O-乙酰基、NH-乙酰基或-NH2；
R2和R3各自独立地为H、(C1-C10)烷基、(C6-C10)芳基(C0-C6)烷基、(C3-C10)杂芳基、(C3-C8)环烷基、(C2-C10)炔基或(C2-C10)烯基；
其中(C1-C10)烷基、(C6-C10)芳基(C0-C6)烷基、(C3-C10)杂芳基、(C3-C8)环烷基、(C2-C10)炔基和(C2-C10)烯基任选地被1至5个选自以下的取代基在任意位置所取代：(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、NH2、-NH(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷氧基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷氧基)、-NH(CO)(C2-C6烯基)、-Si(C1-C6烷基)、-SO2(C1-C6烷基)、-SH、-B(OH)2、-O对甲苯磺酰基、-CO(C1-C6烷氧基)、-COH、-COOH、-CO(C1-C6烷基)或卤素；
或者R2和R3一起形成环，其中所述环任选地被1至5个选自卤素或(C1-C6)烷基的另外的取代基所取代；并且
R4是(C1-C10)烷基、(C3-C8)环烷基、(C6-C10)芳基、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基或(C3-C10)杂芳基，而且其中R4任选地被1至5个选自以下的取代基在任意位置所取代：(C1-C10)烷基、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基、(C3-C8)环烷基、(C1-C6)烷氧基、(C6-C10)芳氧基、(C6-C10)芳基、氨基、-NH(CO)(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C2-C6烯基)、-NH(CO)(C2-C6炔基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷基)、卤素、OCF3、CF3、羟基或卤素放射性同位素；
所述方法包括：
(a)在足以形成式(VII)的双(叠氮基)BODIPY化合物的条件下使式(VI)化合物与叠氮化物反应：
(b)在足以形成式(VIII)化合物的条件下使式(VII)化合物与式R2R3NH的胺反应：
(c)在铜(I)催化剂的存在下，在足以形成式(IX)化合物的条件下使式(VIII)化合物与式R4-C≡CH的炔反应：
(d)从式(IX)化合物中除去固体支持树脂以形成非结合的BODIPY化合物，其中式(I)中的R1是H；以及
(e)任选地使步骤d)的所述非结合的BODIPY化合物与式R1COCl的酰基氯反应以形成式(I)化合物，其中R1是任选地被1至3个选自卤素、O-乙酰基或N-乙酰基的取代基所取代的CO(C1-C6)烷基。
9.权利要求8所述的方法，其中当进行步骤(e)时，所述方法包括在足以使酯或酰胺键皂化的条件下用碱处理反应混合物的额外步骤，其中R1是任选地被1至3个羟基或-NH2取代基所取代的CO(C1-C6)烷基。
10.用于溶液相合成式(I)化合物或其可药用盐的方法：
其中：
R1是H或CO(C1-C6)烷基，其中CO(C1-C6)烷基任选地被1至3个选自以下的取代基在任意位置所取代：卤素、羟基、O-乙酰基、NH-乙酰基或-NH2；
R2和R3各自独立地为H、(C1-C10)烷基、(C6-C10)芳基(C0-C6)烷基、(C3-C10)杂芳基、(C3-C8)环烷基、(C2-C10)炔基或(C2-C10)烯基；
其中(C1-C10)烷基、(C6-C10)芳基(C0-C6)烷基、(C3-C10)杂芳基、(C3-C8)环烷基、(C2-C10)炔基和(C2-C10)烯基任选地被1至5个选自以下的取代基在任意位置所取代：(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、NH2、-NH(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷氧基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷氧基)、-NH(CO)(C2-C6烯基)、-Si(C1-C6烷基)、-SO2(C1-C6烷基)、-SH、-B(OH)2、-O对甲苯磺酰基、-CO(C1-C6烷氧基)、-COH、-COOH、-CO(C1-C6烷基)或卤素；
或者R2和R3一起形成环，其中所述环任选地被1至5个选自卤素或(C1-C6)烷基的另外的取代基所取代；并且
R4是(C1-C10)烷基、(C3-C8)环烷基、(C6-C10)芳基、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基或(C3-C10)杂芳基，而且其中R4任选地被1至5个选自以下的取代基在任意位置所取代：(C1-C10)烷基、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基、(C3-C8)环烷基、(C1-C6)烷氧基、(C6-C10)芳氧基、(C6-C10)芳基、氨基、-NH(CO)(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C2-C6烯基)、-NH(CO)(C2-C6炔基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷基)、卤素、OCF3、CF3、羟基或卤素放射性同位素；
所述方法包括：
(a)在足以形成式(XI)的双(叠氮基)BODIPY化合物的条件下使式(X)化合物与叠氮化物反应：
(b)在足以形成式(XII)化合物的条件下使式(XI)化合物与式R2R3NH的胺反应：
(c)在铜(I)催化剂的存在下，在足以形成式(XIII)化合物的条件下使式(XII)化合物与式R4-C≡CH的炔反应：
(d)还原式(XIII)化合物中的NO2基团以形成BODIPY化合物，其中式(I)中的R1是H；以及
(e)任选地使步骤d)中的所述BODIPY化合物与式R1COCl的酰基氯反应以形成式(I)化合物，其中R1是任选地被1至3个选自卤素、O-乙酰基或N-乙酰基的取代基所取代的CO(C1-C6)烷基。
11.权利要求10所述的方法，其中当进行步骤(e)时，所述方法包括在足以使酯或酰胺键皂化的条件下用碱处理反应混合物的额外步骤，其中R1是任选地被1至3个羟基或-NH2取代基所取代的CO(C1-C6)烷基。
12.用于人血清白蛋白(HSA)的荧光探针，其包含式(II)化合物：
其中所述探针对HSA的FAI结合位点具有选择性。
13.用于检测生物流体的样品中的人血清白蛋白(HSA)的方法，其包括：
a)使认为包含HSA的生物流体的样品与式(I)化合物接触以形成孵育介质：
其中：
R1是H或CO(C1-C6)烷基，其中CO(C1-C6)烷基任选地被1至3个选自以下的取代基在任意位置所取代：卤素、羟基、O-乙酰基、NH-乙酰基或-NH2；
R2和R3各自独立地为H、(C1-C10)烷基、(C6-C10)芳基(C0-C6)烷基、(C3-C10)杂芳基、(C3-C8)环烷基、(C2-C10)炔基或(C2-C10)烯基；
其中(C1-C10)烷基、(C6-C10)芳基(C0-C6)烷基、(C3-C10)杂芳基、(C3-C8)环烷基、(C2-C10)炔基和(C2-C10)烯基任选地被1至5个选自以下的取代基在任意位置所取代：(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、NH2、-NH(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷氧基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷氧基)、-NH(CO)(C2-C6烯基)、-Si(C1-C6烷基)、-SO2(C1-C6烷基)、-SH、-B(OH)2、-O对甲苯磺酰基、-CO(C1-C6烷氧基)、-COH、-COOH、-CO(C1-C6烷基)或卤素；
或者R2和R3一起形成环，其中所述环任选地被1至5个选自卤素或(C1-C6)烷基的另外的取代基所取代；并且
R4是(C1-C10)烷基、(C3-C8)环烷基、(C6-C10)芳基、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基或(C3-C10)杂芳基，而且其中R4任选地被1至5个选自以下的取代基在任意位置所取代：(C1-C10)烷基、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基、(C3-C8)环烷基、(C1-C6)烷氧基、(C6-C10)芳氧基、(C6-C10)芳基、氨基、-NH(CO)(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C2-C6烯基)、-NH(CO)(C2-C6炔基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷基)、卤素、OCF3、CF3、羟基或卤素放射性同位素；
b)在足以形成经孵育混合物的条件下孵育步骤a)的孵育介质；以及
c)通过荧光显微术分析步骤b)的混合物，其中所述混合物的荧光信号相对于不存在含HSA样品的式(I)化合物的荧光信号的增强指示存在HSA。
14.权利要求13所述的方法，其中所述荧光信号的强度测量值与存在于所述样品中的HSA的浓度成比例。
15.权利要求13所述的方法，其中所述式(I)化合物具有式(II)的结构：
16.用于使细胞培养物中的活神经元可视化的方法，其包括：
a)使细胞培养物与式(I)化合物接触以形成孵育介质：
其中：
R1是H或CO(C1-C6)烷基，其中CO(C1-C6)烷基任选地被1至3个选自以下的取代基在任意位置所取代：卤素、羟基、O-乙酰基、NH-乙酰基或-NH2；
R2和R3各自独立地为H、(C1-C10)烷基、(C6-C10)芳基(C0-C6)烷基、(C3-C10)杂芳基、(C3-C8)环烷基、(C2-C10)炔基或(C2-C10)烯基；
其中(C1-C10)烷基、(C6-C10)芳基(C0-C6)烷基、(C3-C10)杂芳基、(C3-C8)环烷基、(C2-C10)炔基和(C2-C10)烯基任选地被1至5个选自以下的取代基在任意位置所取代：(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、NH2、-NH(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷氧基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷氧基)、-NH(CO)(C2-C6烯基)、-Si(C1-C6烷基)、-SO2(C1-C6烷基)、-SH、-B(OH)2、-O对甲苯磺酰基、-CO(C1-C6烷氧基)、-COH、-COOH、-CO(C1-C6烷基)或卤素；
或者R2和R3一起形成环，其中所述环任选地被1至5个选自卤素或(C1-C6)烷基的另外的取代基所取代；并且
R4是(C1-C10)烷基、(C3-C8)环烷基、(C6-C10)芳基、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基或(C3-C10)杂芳基，而且其中R4任选地被1至5个选自以下的取代基在任意位置所取代：(C1-C10)烷基、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基、(C3-C8)环烷基、(C1-C6)烷氧基、(C6-C10)芳氧基、(C6-C10)芳基、氨基、-NH(CO)(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C2-C6烯基)、-NH(CO)(C2-C6炔基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷基)、卤素、OCF3、CF3、羟基或卤素放射性同位素；
b)在足以对所述活神经元进行染色的条件下孵育步骤a)的孵育介质；以及
c)用荧光显微术使步骤b)的经染色的活神经元可视化。
17.权利要求16所述的方法，其中所述式(I)化合物是具有式(XIV)结构的化合物：
其中：
R4是(C1-C10)烷基、(C3-C8)环烷基、(C6-C10)芳基、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基或(C3-C10)杂芳基，而且其中R4任选地被1至5个选自以下的取代基在任意位置所取代：(C1-C10)烷基、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基、(C3-C8)环烷基、(C1-C6)烷氧基、(C6-C10)芳氧基、(C6-C10)芳基、氨基、-NH(CO)(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C2-C6烯基)、-NH(CO)(C2-C6炔基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷基)、卤素、OCF3、CF3、羟基或卤素放射性同位素；并且
R5为在任意位置存在的1至5个选自以下的取代基：H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、NH2、-NH(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷氧基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷氧基)、-NH(CO)(C2-C6烯基)、-Si(C1-C6烷基)、-SO2(C1-C6烷基)、-SH、-B(OH)2、-O对甲苯磺酰基、-CO(C1-C6烷氧基)、-COH、-COOH、-CO(C1-C6烷基)或卤素。
18.权利要求17所述的方法，其中所述式(I)化合物具有式(V)的结构：
19.权利要求16所述的方法，其中所述方法用于体外应用。
20.权利要求16所述的方法，其中所述方法用于体内应用。
21.用于活神经元的特异性染色的荧光染料，其包含式(XV)化合物：
其中：
R2和R3各自独立地为H、(C1-C10)烷基、(C6-C10)芳基(C0-C6)烷基、(C3-C10)杂芳基、(C3-C8)环烷基、(C2-C10)炔基或(C2-C10)烯基；
其中(C1-C10)烷基、(C6-C10)芳基(C0-C6)烷基、(C3-C10)杂芳基、(C3-C8)环烷基、(C2-C10)炔基和(C2-C10)烯基任选地被1至5个选自以下的取代基在任意位置所取代：(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、NH2、-NH(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷基)、-NH(CO)(C1-C6烷氧基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷氧基)、-NH(CO)(C2-C6烯基)、-Si(C1-C6烷基)、-SO2(C1-C6烷基)、-SH、-B(OH)2、-O对甲苯磺酰基、-CO(C1-C6烷氧基)、-COH、-COOH、-CO(C1-C6烷基)或卤素；
或者R2和R3一起形成环，其中所述环任选地被1至5个选自卤素或(C1-C6)烷基的另外的取代基所取代；
R6是H或CO(CH3)；并且
R7是(C1-C10)烷基、(C3-C8)环烷基、(C6-C10)芳基、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基或(C3-C10)杂芳基，而且其中R4任选地被1至5个选自以下的取代基在任意位置所取代：(C1-C10)烷基、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基、(C3-C8)环烷基、(C1-C6)烷氧基、(C6-C10)芳氧基、(C6-C10)芳基、氨基、-NH(CO)(C1-C6烷基)、-NH(CO)(C2-C6烯基)、-NH(CO)(C2-C6炔基)、-NH(CO)(C1-C6卤代烷基)、卤素、OCF3、CF3、羟基或卤素放射性同位素。
CN201380067802.8A 2012-12-26 2013-12-26 梅咖斯托克斯氨基‑三唑基‑bodipy化合物及用于活神经元染色和人血清白蛋白fa1药物位点探测的应用 Expired - Fee Related CN105102464B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261745916P 2012-12-26 2012-12-26
US61/745,916 2012-12-26
PCT/SG2013/000550 WO2014104975A1 (en) 2012-12-26 2013-12-26 Megastokes amino-triazolyl-bodipy compounds and applications to live neuron staining and human serum albumin fa1 drug site probing

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105102464A true CN105102464A (zh) 2015-11-25
CN105102464B CN105102464B (zh) 2017-03-29

Family

ID=51021837

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380067802.8A Expired - Fee Related CN105102464B (zh) 2012-12-26 2013-12-26 梅咖斯托克斯氨基‑三唑基‑bodipy化合物及用于活神经元染色和人血清白蛋白fa1药物位点探测的应用

Country Status (7)

Country Link
US (1) US9513294B2 (zh)
EP (1) EP2938619B1 (zh)
JP (1) JP6300380B2 (zh)
KR (1) KR101715543B1 (zh)
CN (1) CN105102464B (zh)
SG (1) SG11201503497UA (zh)
WO (1) WO2014104975A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107033621A (zh) * 2017-05-12 2017-08-11 华东理工大学 一种具有大Stokes位移近红外BODIPY染料及其制备和应用
CN108299484A (zh) * 2018-02-07 2018-07-20 四川大学 一种3,5-二吗啉基-8-对甲基苯基氟硼荧类衍生物及其制备方法和应用
CN108484651A (zh) * 2018-02-07 2018-09-04 四川大学 一种3-吗啉基-8-对甲基苯基氟硼荧类衍生物及其制备方法和应用
CN109187403A (zh) * 2018-10-19 2019-01-11 海南师范大学 一种5-苯基-1-(对甲基苯基)-1h-三唑与血清作用的差异蛋白检测方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3294900B1 (en) 2015-05-08 2021-09-22 Spectral Platforms, Inc. Use of albumin-based non-covalent complexes for the detection of micro-organisms
US11105747B2 (en) 2017-03-20 2021-08-31 Spectral Platforms, Inc. Spectroscopic methods to detect and characterize microorganisms
WO2020120636A1 (en) 2018-12-14 2020-06-18 Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule (Rwth) Aachen Fluorescence dye
GB202301468D0 (en) * 2023-02-01 2023-03-15 Univ Oxford Innovation Ltd Sulphide sensing assembly

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1944540A (zh) * 2006-09-15 2007-04-11 大连理工大学 生物分析用近红外氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料
CN102061103A (zh) * 2009-11-11 2011-05-18 大连理工大学 一类氟化硼络合二吡咯甲川染料、制备方法及其应用
CN102286213A (zh) * 2011-05-12 2011-12-21 河南大学 近红外氮杂-bodipy染料及其制备方法和应用
CN102352118A (zh) * 2011-07-18 2012-02-15 南京邮电大学 一种近红外荧光染料及制备和应用
WO2012071012A2 (en) * 2010-11-24 2012-05-31 National University Of Singapore Bodipy structure fluorescence dye for neural stem cell probe
WO2012118444A1 (en) * 2011-03-01 2012-09-07 Agency For Science, Technology And Research Novel compounds with photoluminescnce properties and applications thereof
WO2012173575A1 (en) * 2011-06-15 2012-12-20 National University Of Singapore Alkylamino bodipy dyes as selective fluorescent probes for proteins and mouse embryonic stem cells

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2158782C (en) 1994-09-23 2010-01-12 Pierrette Gaudreau Marker for growth hormone-releasing factor receptors
US5804395A (en) 1995-12-01 1998-09-08 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Fluorescence polarization assays of enzymes and substrates therefore
US6106999A (en) * 1997-08-12 2000-08-22 Mitsui Chemicals Photosensitizer, visible light curable resin composition using the same, and use of the composition
JP3987628B2 (ja) * 1997-08-12 2007-10-10 関西ペイント株式会社 可視光硬化性樹脂組成物およびその用途
US7968306B2 (en) 2002-02-13 2011-06-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for measuring activity of a specific fraction of albumin
CN101059507B (zh) 2006-04-18 2011-05-11 中国科学院大连化学物理研究所 一种bodipy类荧光试剂在生物大分子标记中的应用
US7858598B2 (en) * 2007-03-12 2010-12-28 Morningside Ventures Limited & Versitech Limited Reagents for detection of hypochlorous acid
US8277775B2 (en) 2007-08-17 2012-10-02 The Research Foundation Of The City University Of New York Boron dipyrromethene difluoro (BODIPY) conjugates
WO2009070234A2 (en) 2007-11-21 2009-06-04 The University Of The Sciences In Philadelphia Complexation of fatty acid-conjugated molecules with albumin
KR101135449B1 (ko) 2009-03-10 2012-04-13 한국과학기술연구원 헤파라나제 활성 측정용 이온 복합체 나노 입자 및 그 제조방법
WO2010131826A1 (ko) 2009-05-12 2010-11-18 주식회사 이노파마스크린 오스테오폰틴 억제제 스크리닝 방법 및 그에 따른 억제제
US8835641B2 (en) 2010-07-19 2014-09-16 University Of Ottawa Fluorescent markers and use thereof for labeling specific protein targets

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1944540A (zh) * 2006-09-15 2007-04-11 大连理工大学 生物分析用近红外氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料
CN102061103A (zh) * 2009-11-11 2011-05-18 大连理工大学 一类氟化硼络合二吡咯甲川染料、制备方法及其应用
WO2012071012A2 (en) * 2010-11-24 2012-05-31 National University Of Singapore Bodipy structure fluorescence dye for neural stem cell probe
WO2012118444A1 (en) * 2011-03-01 2012-09-07 Agency For Science, Technology And Research Novel compounds with photoluminescnce properties and applications thereof
CN102286213A (zh) * 2011-05-12 2011-12-21 河南大学 近红外氮杂-bodipy染料及其制备方法和应用
WO2012173575A1 (en) * 2011-06-15 2012-12-20 National University Of Singapore Alkylamino bodipy dyes as selective fluorescent probes for proteins and mouse embryonic stem cells
CN102352118A (zh) * 2011-07-18 2012-02-15 南京邮电大学 一种近红外荧光染料及制备和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Y URANO ET AL.: "Selective molecular imaging of viable cancer cells with pH-activatable fluorescence probes", 《NATURE MEDICINE》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107033621A (zh) * 2017-05-12 2017-08-11 华东理工大学 一种具有大Stokes位移近红外BODIPY染料及其制备和应用
CN108299484A (zh) * 2018-02-07 2018-07-20 四川大学 一种3,5-二吗啉基-8-对甲基苯基氟硼荧类衍生物及其制备方法和应用
CN108484651A (zh) * 2018-02-07 2018-09-04 四川大学 一种3-吗啉基-8-对甲基苯基氟硼荧类衍生物及其制备方法和应用
CN108299484B (zh) * 2018-02-07 2020-07-24 四川大学 一种3,5-二吗啉基-8-对甲基苯基氟硼荧类衍生物及其制备方法和应用
CN109187403A (zh) * 2018-10-19 2019-01-11 海南师范大学 一种5-苯基-1-(对甲基苯基)-1h-三唑与血清作用的差异蛋白检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2016511746A (ja) 2016-04-21
EP2938619A4 (en) 2016-11-16
EP2938619A1 (en) 2015-11-04
WO2014104975A9 (en) 2017-06-22
KR20150098639A (ko) 2015-08-28
US9513294B2 (en) 2016-12-06
CN105102464B (zh) 2017-03-29
SG11201503497UA (en) 2015-06-29
EP2938619B1 (en) 2018-02-21
KR101715543B1 (ko) 2017-03-10
WO2014104975A1 (en) 2014-07-03
US20150309040A1 (en) 2015-10-29
JP6300380B2 (ja) 2018-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105102464A (zh) 梅咖斯托克斯氨基-三唑基-bodipy化合物及用于活神经元染色和人血清白蛋白fa1药物位点探测的应用
Vegesna et al. pH-activatable near-infrared fluorescent probes for detection of lysosomal pH inside living cells
Shen et al. A rhodamine B-based probe for the detection of HOCl in lysosomes
Wang et al. Novel pyrazoline-based fluorescent probe for detecting glutathione and its application in cells
Chen et al. A large stokes shift fluorescent probe for sensing of thiophenols based on imidazo [1, 5-α] pyridine in both aqueous medium and living cells
EP2721038B1 (en) Alkylamino bodipy dyes as selective fluorescent probes for proteins and mouse embryonic stem cells
CN106220640B (zh) 一类汞离子荧光探针及其制备方法和应用
Li et al. A visual and “turn-on” fluorescent probe for rapid detection of cysteine over homocysteine and glutathione
Zhang et al. A near-infrared ratiometric fluorescent probe for highly selective recognition and bioimaging of cysteine
Wang et al. Viscosity sensitive fluorescent dyes with excellent photostability based on hemicyanine dyes for targeting cell membrane
Lu et al. A coumarin-based fluorescent probe for specific detection of cysteine in the lysosome of living cells
Wang et al. Near-infrared squaraine dye as a selective protein sensor based on self-assembly
Ma et al. Synthesis, optical properties and cytotoxicity of meso-heteroatom substituted IR-786 analogs
Cui et al. A novel polarity-sensitive fluorescent probe for lighting up lipid droplets and its application in discriminating dead and living zebrafish
Dell’Acqua et al. MediaChrom: discovering a class of pyrimidoindolone-based polarity-sensitive dyes
Bai et al. Construction of an NIR and lysosome-targeted quinoline-BODIPY photosensitizer and its application in photodynamic therapy for human gastric carcinoma cells
Xu et al. The α, β-unsaturated pyrazolone-based fluorescent sensor with red emission and its application for real-time monitoring hypochlorite in cancer cells and zebrafish
Shen et al. Red emission cysteine probe with high selectivity based on fluorescent protein chromophores and turn-on fluorescence in cell cultures
CN110156688A (zh) 一种靶向内质网检测极性的荧光探针及其应用
Ren et al. Ultrafast 2, 7-Naphthyridine-Based fluorescent probe for detection of thiophenol with a remarkable Stokes shift and its application In vitro and in vivo
Liao et al. An effective HBT/indanone-based fluorescent probe for cysteine detection in cells
CN109503550B (zh) 2-氮杂芳基-6-取代氨基喹唑啉酮化合物及其制备方法和应用
US8883962B2 (en) Zinc-responsive peptides, and methods of use thereof
Chao et al. A fluorescent probe based on pyrene ring for detecting Cys and its application in biology
Kuzu et al. Design, synthesis, and applications of nucleic acid-specific benzoxazole-N, N-dialkylphenylamines derivatives for nucleolus imaging in the cells

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20170329

Termination date: 20211226

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee