WO2010131826A1 - 오스테오폰틴 억제제 스크리닝 방법 및 그에 따른 억제제 - Google Patents

오스테오폰틴 억제제 스크리닝 방법 및 그에 따른 억제제 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for screening an osteopontin inhibitor and an inhibitor obtained by the method.
  • Osteopontin is produced in osteoclasts and osteoblasts and is known to play an important role in bone metabolism. Although not required for normal bone development in rats, it is involved in bone remodeling and sometimes serves as a defense against infection and injury. In addition, research has been reported to have the activity to promote the growth or metastasis of cancer cells. Osteopontin-free rats had less bone mineral density and less bone weakness (Hiroyuki Yoshitake et al., 1999, PNAS., 96: 8156-8160). Osteopontin functions normally in rats with symptoms of rheumatoid arthritis. The rats' symptoms gradually worsened, the joints swollen and cartilage destroyed.
  • osteopontin-inhibiting arthritis did not progress and cartilage was not destroyed (Kenji Yumoto et al., 2002 PNAS., 99: 4556-4561).
  • substances that inhibit the activity of osteopontin may be used to prevent and treat osteoporosis, rheumatoid arthritis and periodontal disease.
  • Osteopontin is a glycoprotein with a mass of 44 kilodaltons, phosphorylated and acidified by serines and threonines. The feature is that it has a calcium binding motif, which may explain its ability to bind a lot of calcium (Giachelli, C. M et al., 1995 Trends Cardiovasc Med 3: 88-95). Osteopontin in the bone matrix promotes the attachment of osteoclasts to bone through matrix binding (Ross, F.P., et al., 1993 J. Biol. Chem 268: 9901-9907). Water-soluble osteopontin in osteoclasts regulates calcium levels, acts as a chemotactic agent and inhibits endothelial cell death (Khan SA., Et al., 2002 Mol Biol Cell 85: 728-736).
  • Osteopontin has a domain containing RGD (arginine-glycine-asphatate), which interacts with cell surface integrins ( ⁇ v ⁇ 3, ⁇ v ⁇ 1, ⁇ v ⁇ 5) and is involved in cell adhesion, and the (SVVYGLR) sequence is integrin They interact with ( ⁇ 9 ⁇ 1, ⁇ 4 ⁇ 1) and are exposed to cleavage by thrombin.
  • RGD arginine-glycine-asphatate
  • ⁇ v ⁇ 3, a major integrin on the surface of osteoclasts, is usually expressed at low levels in the small intestine or vascular muscle cells, but is expressed at high levels in bones, inflamed areas, placenta, and infiltrated tumors, resulting in bone resorption of osteoclasts and activation of macrophages. It acts on angiogenesis.
  • Osteopontin acts as an integrin ⁇ v ⁇ 3 ligand to increase bone resorption by osteoclasts and promotes osteoclast migration and is involved in early attachment (Ichiro Nakamura., Et al., 2007 J Bone Miner Metab) 25: 337-344).
  • Osteoclasts are differentiated from hematopoietic stem cells (Boyle WJ., Et al., 2003 Nature 423: 337-42).
  • osteoclasts were normally made but inhibited osteoclast differentiation in osteoclasts by RANKL in the differentiation of human osteoclasts with reduced osteopontin expression.
  • osteopontin has been suggested as an important factor in the differentiation into osteoclasts in humans (Cathy J. Aitken., Et al., 2004 J. Cell. Biochem 93: 896-903).
  • the present invention has been made in view of the above necessity, and an object of the present invention is to provide a method for screening an osteopontin inhibitor.
  • Another object of the present invention is to provide an osteopontin inhibitor.
  • Another object of the present invention is to provide a use for the treatment of diseases of osteopontin inhibitors.
  • the present invention includes the steps of: a) searching for a starting material for protein chip screening by performing a molecular docking simulation of the entire library compound file; b) preparing a mixture by mixing the found starting material with Osteopontin and fluorescently labeled Osteopontin; c) adding the mixture onto an integrin ⁇ v ⁇ 3 receptor immobilized on a protein chip; and d) analyzing the binding degree.
  • the above screening method of the present invention is called 'Integrated Drug Discovery Platform (IDDP) technology'.
  • IDDP Integrated Drug Discovery Platform
  • This integrated drug screening-based technology is InnoPharma Screen's unique drug development system, which integrates structure-based screening (in silico), protein chip-based screening (HTS), and / or cell-based assays. It is a standard platform for new drug development that can find the most effective drug candidates at the minimum cost in the shortest time from target discovery to optimization of lead substance.
  • the search algorithm for the docking calculation is preferably an alpha triangle method, but is not limited thereto.
  • the fluorescent material is Cy3 (green), Cy5 (red), FITC (green), Alexa (BODIPY), Rhodamine, and Q-dot ( dot) is preferably at least one fluorescent material selected from the group consisting of, and the fluorescent material is more preferably Cy5, but is not limited thereto.
  • the present invention provides an osteopontin inhibitor comprising at least one compound selected from the group consisting of Formulas 1 to 3, derivatives thereof or salts thereof.
  • the present invention provides a composition for treating or preventing osteoporosis, arthritis, or periodontal disease comprising at least one compound selected from the group consisting of Formula 1 to 3, its derivatives or salts thereof as an active ingredient.
  • the term "derivative” means a similar compound obtained by chemically changing a part of a compound, for example, a compound in which a hydrogen atom or a specific atomic group in the compound is substituted by another atom or atomic group.
  • Compounds of the invention are osteopontin inhibitors, and compounds of the invention may be used to inhibit osteopontin activity.
  • the present invention can be used for the treatment of diseases in which osteopontin inhibition is useful, as well as pharmaceutical compounds containing the compounds or salts thereof, as well as compounds of one of the compounds of formulas 1 to 3 Can be.
  • Such diseases include, for example, inflammation of joints, including arthritis and rheumatoid arthritis, as well as other joint diseases such as rheumatoid spondylitis and osteoarthritis. Further applicability is the treatment of osteoporosis, periodontal disease and the like.
  • auxiliaries, carriers and additives are used in addition to effective amounts of the compounds of the invention or salts thereof.
  • the dosage of active ingredient may vary depending on the manner in which it is administered, the age, weight of the patient, the nature and severity of the disease to be treated and similar factors.
  • the daily dose may be administered in a single dose administered once daily, or may be divided into two or more doses per day, typically 0.001 to 100 mg.
  • parenteral, intravenous, transdermal, topical, inhaled and intranasal preparations are the preferred dosage forms.
  • compositions can be used, for example tablets, coated tablets, capsules, dispersible powders, granules, aqueous solutions, aqueous or oily suspensions, syrups, solutions or drops.
  • Drugs in solid form include inert ingredients and carriers such as calcium carbonate, calcium phosphate, sodium phosphate, lactose, starch, mannitol, alginate, gelatin, guar gum, magnesium or aluminum stearate, methylcellulose, talc, high dispersion May contain silica, silicone oils, high molecular weight fatty acids such as stearic acid, gelatin, agar agar, vegetable or animal fats and oils, and solid high molecular weight polymers such as polyethylene glycols. Suitable formulations may optionally contain additional flavoring and / or sweetening agents.
  • inert ingredients and carriers such as calcium carbonate, calcium phosphate, sodium phosphate, lactose, starch, mannitol, alginate, gelatin, guar gum, magnesium or aluminum stearate, methylcellulose, talc, high dispersion May contain silica, silicone oils, high molecular weight fatty acids such as stearic acid, gelatin, a
  • Drugs in liquid form may be sterilized and / or optionally with preservatives, stabilizers, wetting agents, permeants, emulsifiers, diffusion agents, solubilizers, salts, sugars or sugar alcohols, and / or viscosity modifiers for osmotic pressure control or buffering purposes. It may contain the same adjuvant.
  • additives examples include tartrate and citrate buffer, ethanol, complexing agents such as ethylenediaminetetraacetic acid and its nontoxic salts.
  • high molecular weight polymers such as liquid polyethylene oxide, microcrystalline cellulose (such as carboxymethylcellulose), polyvinylpyrrolidone, dextran or gelatin are contemplated.
  • Solid carrier materials include, for example, starch, lactose, mannitol, methylcellulose, talc, highly dispersed silica, high molecular weight fatty acids such as stearic acid, gelatin, agar agar, calcium phosphate, magnesium stearate, animal and vegetable fats.
  • solid high molecular weight polymers such as polyethylene glycol.
  • Parenteral or topical oily suspensions are vegetable, synthetic or semisynthetic oils, for example monohydric or trihydric alcohols having 1 to 6 carbon atoms in each case (e.g. methanol, ethanol, propanol, butanol, pentanol Or fatty acids (e.g., palmitic acid, lauric acid, tridecyl acid, margaric acid, stearic acid, arachidic acid, myristic acid, behenic acid, pentadecyl acid, esterified with isomers, glycols or glycerol thereof) , Linoleic acid, elideic acid, brasidic acid, erucic acid or oleic acid) chains may contain liquid fatty esters having from 8 to 22 carbon atoms.
  • monohydric or trihydric alcohols having 1 to 6 carbon atoms in each case
  • fatty acids e.g., palmitic acid, lauric acid, tridecyl acid, mar
  • Such fatty esters include, for example, commercially available migliol, isopropyl myristate, isopropyl palmitate, isopropyl stearate, PEG 6-capric acid of saturated fatty alcohols, caprylic / capric acid esters, Polyoxyethylene glycerol trioleate, ethyl oleate, waxy fatty esters (e.g. synthetic duck rump gland fat), isopropyl ester of coconut oil fatty acid, oleyl oleate, decyl oleate, ethyl lactate , Dibutyl phthalate, diisopropyl adipate, fatty acid esters of polyols, and the like.
  • migliol isopropyl myristate, isopropyl palmitate, isopropyl stearate
  • PEG 6-capric acid of saturated fatty alcohols caprylic / capric acid esters
  • Silicone oils or fatty alcohols of different viscosities eg isotridecyl alcohol, 2-octyldodecanol, cetyl stearyl alcohol or oleyl alcohol
  • fatty acids eg oleic acid
  • vegetable oils such as castor oil, almond oil, olive oil, sesame oil, cottonseed oil, peanut oil or soybean oil may be used.
  • a gel forming agent and a solubilizer water or a solvent miscible with water are contemplated.
  • cellulose ethers which can be dissolved or swelled in water as well as in organic solvents such as hydroxypropylmethylcellulose, methylcellulose, ethylcellulose or soluble starch can be used.
  • ionic macromolecules can be used herein, for example, sodium carboxymethylcellulose, polyacrylic acid, polymethacrylic acid and salts thereof, propylene glycol know as sodium avelopectin semiglycolate, alginic acid or sodium salt. Nate, gum arabic, xanthan rubber, guar rubber or carrageen rubber can be used.
  • Further formulation aids may include glycerin, paraffins of different viscosities, triethanolamine, collagen, allantoin, novantisolic acid.
  • glycerin paraffins of different viscosities
  • triethanolamine collagen
  • allantoin novantisolic acid.
  • surfactants such as cetyl alcohol, lecithin, glycerin monostearate, polyoxyethylene stearate, alkylphenol polyglycol ethers, cetyltrimethylammonium chloride or monoalkyl or dialkyl polyglycol ether orthophosphoric acid monoethanolamine salts, Emulsifiers or wetting agents are used.
  • stabilizers for emulsion stabilization e.g. montmorillonite or colloidal silica
  • stabilizers for the degradation of active substances such as antioxidants (e.g. tocopherol or butylhydroxyanisole), or preservatives ( Eg p-hydroxybenzoate ester) may also be required.
  • Formulations for parenteral administration may be in the form of individual dosage units such as ampoules or vials.
  • solutions of the active ingredient are used, in particular aqueous solutions and, inter alia, isotonic solutions, but suspensions are also used.
  • injectable forms can be used as finished preparations or can be prepared immediately before use by mixing the active compound, such as a lyophilisate, with another solid carrier material, the desired solvent or suspending agent.
  • Intranasal preparations may be present in aqueous or oily solutions or in aqueous or oily suspensions. They may be present as lyophilisates prepared with a suitable solvent or suspending agent prior to use.
  • the process of preparing the formulation, filling it into a container and sealing it is carried out under conventional antibacterial and sterile conditions.
  • the compounds of the present invention can be prepared by conventional methods of preparation well known in the art.
  • the compounds of the present invention are substances screened in a natural compound library (40,000 species) sold by InterBioScreen (IBM) www.ibscreen.com, Russia, and InterBioScreen (IBM). ) Purchased from the company.
  • IBM InterBioScreen
  • Osteopontin is a glycoprotein that is abundant in the bone matrix and is involved in osteoclast differentiation and adhesion movement.
  • the osteoclast is a cause of bone-related diseases such as osteoporosis, rheumatoid arthritis and periodontal disease.
  • Substances that inhibit the activity of osteopontin can be developed as raw materials for the treatment of such bone-related diseases and medicines.
  • a method of quickly and easily screening tens of thousands of compounds was needed. Substances discovered using virtual screening methods and protein chips could be developed as osteopontin inhibitors.
  • the screening method of the present invention and a substance that inhibits the activity of osteopontin according to the present invention can be developed as a raw material for treating bone-related diseases and pharmaceuticals by inhibiting the differentiation and migration of osteoclasts.
  • Table 1 is a virtual screening method of the osteopontin inhibitor and Table 1 shows the binding energy values of the 100 compounds having the best binding results as a result of the virtual screening.
  • Figure 2 is a graph showing the results of experiments confirmed by the concentration of the binding by the interaction of osteopontin and integrin ⁇ v ⁇ 3,
  • 3 is a representative image and a virtual image of binding experiments by interaction of osteopontin with integrin ⁇ v ⁇ 3 from a natural-derived compound library
  • FIG. 8 is a graph quantifying the broken bone area of the In vivo Calvaria animal model from the results of FIG. 7.
  • the software used for the virtual screening of FIG. 1 is a Molecular Operating Environment (MOE) program of the Chemical Computing Group.
  • the search method used molecular docking simulation. The specific method is as follows. First, first order molecular docking simulations were performed for all 40,000 library compound files. The search algorithm for the docking calculation was performed using up to 500,000 structural change energy calculations for each ligand compound using the Alpha Triangle method. The method uses an algorithm that shapes the three points of the molecule into triangles and docks by determining whether they match another triangle of the receptor protein. The scoring method used the LondondG method to calculate up to 10 poses per ligand. There are three scoring methods supported by MOE: LondondG, AffinitydG, and AlphaHB. LondondG used in this calculation is as follows.
  • the LondondG function uses parameters such as rotational / translation entropy change due to bonding, reduction of flexibility energy due to ligand binding, hydrogen bonding energy, metal ion ligation, and desolavtion energy difference.
  • the second docking simulation was performed by selecting 5,000 compounds having excellent binding strength.
  • the method used for the second docking simulation is basically the same as the method for the first docking simulation, and an energy minimization method is added.
  • Energy minimization molecular dynamics calculations were performed for the docked ligand poses to explore the most stable ligand structure that can be derived from the binding structure.
  • the calculated binding energy values were used as parameters of the binding force screening. Docking simulations for 5,000 compounds and 100 compounds with the best LondondG values, scores of energy minimization results, were selected and suggested as starting materials for protein chip screening (Table 1).
  • Table 1 shows the binding energy values of the 100 compounds having the highest binding force as a result of the virtual screening.
  • Integrin ⁇ v ⁇ 3 receptor microarray by spotting integrin ⁇ v ⁇ 3 (Chemicon, Temecula, Canada) on a ProteoChip TM (Proteogen Inc., Seoul, Korea) surface with a microarray (CM-1000; Proteogen, Inc., Seoul, Korea) (Integrin adhesion protein chip) was constructed.
  • integrin ⁇ v ⁇ 3 100 ⁇ g / ml of integrin ⁇ v ⁇ 3 in phosphate-buffered saline (PBS) containing 10 mM ⁇ -octylthioglucopyranoside, 1 mM CaCl 2 , 1 mM MgCl 2 and 30% glycerol solution
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the combined and remaining integrin ⁇ v ⁇ 3 was washed with phosphate-buffered saline containing 0.5% Tween-20 (0.5% PBST) and stored at 4 ° C. until use.
  • the integrin ⁇ v ⁇ 3-osteopontin In order to examine the interaction of integrin ⁇ v ⁇ 3-osteopontin, the integrin ⁇ v ⁇ 3-attached protein chips prepared in Example 2 were blocked with 3% BSA for 1 hour and washed three times with PBST. The integrin microarray was then subjected to Cym 5 fluorescently labeled osteopontin at a concentration ranging from 10 ⁇ g / ml to 12 ng / ml to 10 mM ⁇ -octyl-thio-gluco-pyranoside ( ⁇ -octyl-thio-gluco- pyranoside), 1mM CaCl 2 , 1mM MgCl 2 , 0.2mM MnCl 2 and 30% glycerol solution in phosphate-buffered saline (PBS) diluted with spotted reaction.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • FIG. 2 is a graph showing dose-response curves of integrin ⁇ v ⁇ 3-osteopontin interaction with fluorescence scan images showing integrin ⁇ v ⁇ 3-osteopontin interaction.
  • FIG. 3B is a graph showing the relationship between the relative fluorescence intensity of the osteopontin spot and the log of Cy-5 fluorescently labeled fibronectin concentration.
  • integrin ⁇ v ⁇ 3 was shown to work well with osteopontin labeled with Cy5. Among these, osteopontin showed a saturation reaction at about 1 ⁇ g / ml or more. As a result, it can be seen that the integrin ⁇ v ⁇ 3-attached protein chip is effective and suitable for the screening of binding inhibitors of the integrin ⁇ v ⁇ 3 and osteopontin.
  • the natural product-derived compound library 50 mM
  • osteopontin (Cy-5; Amersham Parmacia Biotech, Uppsala Sweden) were labeled with osteopontin and then obtained in Example 1.
  • Phosphate-buffered saline solution containing 10 mM ⁇ -octyl-thio-gluco-pyranoside, 1 mM CaCl 2 , 1 mM MgCl 2 , 0.2 mM MnCl 2 and 30% glycerol solution ( diluted in phosphate-buffered saline (PBS).
  • the integrin ⁇ v ⁇ 3-attached protein chips prepared in Example 2 were blocked with 3% BSA for 1 hour and washed three times with PBST. Then, using the microarray (CM-1000; Proteogen, Inc., Seoul, Korea) under the condition of 70% of 30 ° C., the mixed solution containing each of the above libraries and osteopontin was prepared. After spotting on the integrin ⁇ v ⁇ 3 receptor immobilized on, the cells were allowed to react for one hour. After washing with washing solution (0.0% PBST) was dried using nitrogen and the degree of inhibition of the library was measured by analyzing the degree of ligand binding in relative fluorescence intensity using a fluorescence laser scanner. As a result, a large number of libraries showed relatively low fluorescence intensities, demonstrating that the compound effectively inhibits the integrin ⁇ v ⁇ 3-osteopontin binding reaction (FIG. 3).
  • Figure 3 is the result of experiments to determine whether the inhibition of the interaction of the integrin ⁇ v ⁇ 3 and osteopontin of the library.
  • RGD amino acid sequence: GRGDSP
  • the result is a single color, such as a color, but in this case it is difficult to see the fluorescence intensity easily, so the software of the device changes the color according to the fluorescence intensity.
  • the fluorescence intensity is expressed in the order of white to red, orange, yellow, green and blue. 2, it can be seen that only the fluorescently labeled osteopontin was reacted with integrin ⁇ v ⁇ 3 and osteopontin in white or red color.
  • the interaction of integrin ⁇ v ⁇ 3 with osteopontin is suppressed, and thus the fluorescence is shown as the lowest blue color because the osteopontin does not bind to integrin ⁇ v ⁇ 3.
  • Example 3-3 Using the method used in Example 3-3, the three inhibitors (Fig. 5) discovered in Example 3-3 were diluted in concentrations from 100 mM to 2 times by concentration to 1 mM and treated with integrin ⁇ v ⁇ 3 fixed at a concentration of 100 mg / ml. IC 50 values that inhibit osteopontin binding labeled with Cy5 at a concentration of 1 mg / ml were determined (FIG. 4).
  • Bone marrow cells harvested from 5 week old mice were placed in a 48-well plate and contained hM-CSF (R & D system Inc.), a macrophage differentiation factor, at a concentration of 30 ng / ml.
  • hM-CSF R & D system Inc.
  • a-MEM In differentiation medium
  • the osteoclast differentiation factor, RANKL was expressed in Escherichia coli, purified, purified, and added at a concentration of 100 ng / ml, followed by culturing in osteoclasts under the same conditions. Cell differentiation was induced. After 4 days of incubation, the cells were fixed at room temperature for 15 minutes in 3.7% formaldehyde and washed twice with distilled water and then acetate, fastgar at the ratios described in the instructions of Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) kitTM (Sigma Co.).
  • TRAP Acid Phosphatase, Leukocyte
  • Differentiated osteoclasts were stained by adding 200 ⁇ g / well of a dye solution prepared by mixing four fast gargnet GBC bases, naphthol AS-BI phosphate, sodium nitrite and tartrate for 37 to 20 minutes. 6, the osteopontin inhibitors IPS-02001, IPS-02002, IPS-02003 using the above experiment to analyze the inhibition of differentiation of osteoclasts. As a result, IPS-02001 and IPS-02002 showed excellent osteoclast differentiation inhibitory effect, but IPS-02003 showed no inhibitory effect.
  • LPS (12.5 mg / kg) or RANKL (2 mg / kg) in the cranial cranial canal of 7-week-old mice to investigate the inhibitory effects of RANKL or LPS-induced bone destruction in real mice.
  • Image-pro Plus4.5 Media Cybernetics, Inc. was used to analyze the degree of inhibition of bone destruction.
  • Lipopolysaccharide (10 mg / kg), an inflammation-causing substance that destroys bone cells, is treated in the rat's head bones to artificially induce osteoporosis, and IPS-02001 (10 mg / kg) is treated to restore bone cell destruction.
  • IPS-02001 confirmed the in vivo efficacy of inhibiting bone destruction caused by LPS (FIG. 7).

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Abstract

본 발명은 오스테오폰틴을 억제하는 물질을 탐색하여 발굴된 화합물에 관한 발명이다. 상기 본 발명에 따라 탐색된 오스테오폰틴을 억제하는 물질은 우수한 골다공증 등의 억제 물질로서의 유효성을 높일 수 있다.

Description

오스테오폰틴 억제제 스크리닝 방법 및 그에 따른 억제제
본 발명은 오스테오폰틴 억제제의 스크리닝 방법과 그 방법에 따라 얻어진 억제제에 관한 발명이다.
오스테오폰틴은 파골세포와 조골세포에서 생성되어 뼈의 대사에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 쥐에서 정상적인 뼈의 발생에는 필요하지 않지만 뼈의 재형성에 관여하고 있으며 때로는 감염과 부상에 대한 방어 메커니즘으로 작용하기도 한다. 또한 암세포의 성장이나 전이를 촉진하는 활성을 지니고 있다는 연구결과들도 보고되고 있다. 오스테오폰틴을 제거한 쥐에서 골밀도 감소나 골조직 약화가 덜 일어났으며(Hiroyuki Yoshitake et al., 1999, PNAS., 96:8156-8160), 류마티스성 관절염 증상을 보이는 쥐에서도 오스테오폰틴이 정상적으로 작용하는 쥐는 증상이 점차 악화, 관절이 부어오르고 연골이 파괴됐다. 반면 오스테오폰틴을 억제한 관절염 증상이 진행되지 않고 연골도 파괴되지 않았다(Kenji Yumoto et al., 2002 PNAS., 99:4556-4561). 이런 결과로 보아 오스테오폰틴의 활성을 억제하는 물질은 골다공증 및 류마티스 관절염 및 치주질환을 예방, 치료 하는데 사용될 수 있을 것이다.
오스테오폰틴은 당단백질로 44킬로달톤의 질량을 가지며 세린들과 쓰레오닌에 인산화 되고 산성을 띈다. 특징은 칼슘 결합 모티프를 가지고 있어 많은 칼슘과 결합할 수 있는 능력이 있음을 설명할 수 있다(Giachelli, C. M et al., 1995 Trends Cardiovasc Med 3:88-95). 골 기질에 있는 오스테오폰틴은 기질결합을 통해 파골세포가 뼈에 부착하는 것을 촉진시킨다(Ross, F.P., et al., 1993 J. Biol. Chem 268:9901-9907). 파골세포 내에 있는 수용성 오스테오폰틴은 칼슘 수준을 조절하고 주화성물질로서 작용하고 내피세포의 사멸을 억제한다 (Khan SA., et al., 2002 Mol Biol Cell 85:728-736).
오스테오폰틴은 RGD(아르기닌-글라이신-아스팔테이트)를 포함하는 도메인을 가지고 있어 세포 표면의 인테그린들(αvβ3, αvβ1, αvβ5)과 상호작용하며 세포의 부착에 관여하고, (SVVYGLR)서열은 인테그린들(α9β1, α4β1)과 상호작용해 트롬빈에 의한 절단에 노출된다. 그리고 다양한 CD44 변형체도 오스테오폰틴의 리셉터로 알려져 있다 (Giachelli C. M., et al., 2000 Matrix biology 19:615-622).
파골세포 표면의 주요 인테그린인 αvβ3는 보통 소장이나 혈관 근육세포 등에서 낮은 수준으로 발현이 되지만 뼈, 염증 부위, 태반, 침윤된 종양 에서는 높은 수준으로 발현이 되어 파골세포의 뼈 재흡수와 마크로파지의 활성화, 혈관신생 등에 작용한다. 특히 오스테오폰틴은 파골세포에 의한 뼈의 재흡수를 높이는데 인테그린 αvβ3 리간드로 작용하여 파골세포의 이동을 촉진하고, 초기의 부착에 관여한다(Ichiro Nakamura., et al., 2007 J Bone Miner Metab 25:337-344). 세포의 부착에서 오스테오폰틴과 인테그린 αvβ3과 결합에는 오스테오폰틴의 RGD 서열을 매개로 한다고 알려져 있으며 또한 Ca, Mn, Mg 등의 미네랄이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Dana D. Hu., et al., 1995 JBC 28:9917-9925).
파골세포는 파골세포는 조혈모세포 (hematopoietic stem cell)로부터 분화가 된다(Boyle WJ., et al., 2003 Nature 423:337-42). 파골세포의 분화에서 오스테오폰틴 발현이 억제된 쥐에서 파골세포는 정상적으로 만들어 졌지만 오스테오폰틴 발현을 줄인 인간의 파골세포의 분화에서 RANKL에 의한 파골세포화 초기 분화에서 파골세포로 분화되는 것을 억제하는 결과를 보여 인간에서 오스테오폰틴은 파골세포로 분화하는데 중요한 요소로 제기되었다(Cathy J. Aitken., et al., 2004 J. Cell. Biochem 93:896-903).
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 오스테오폰틴 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 오스테오폰틴 억제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 오스테오폰틴 억제제의 질병 치료에 대한 용도를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a) 라이브러리 화합물 파일 전체에 대하여 분자 도킹 시뮬레이션을 실시하여 단백질 칩 스크리닝을 위한 시작물질을 탐색하는 단계; b) 상기 탐색된 시작물질을 오스페오폰틴과 형광물질 표지된 오스테오폰틴과 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; c) 상기 혼합물을 단백질 칩에 고정된 인테그린 αvβ3 수용체 위에 첨가하는 단계: 및 d) 상기 결합 정도를 분석하는 단계를 포함하는 오스테오폰틴 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 상기의 스크리닝 방법을 '통합 신약 스크리닝 기반(Integrated Drug Discovery Platform;IDDP) 기술'이라고 명명한다.
이 통합 신약 스크리닝 기반 기술은 (주)이노파마스크린의 독창적인 신약개발 시스템으로, 구조기반 스크리닝(in silico), 단백질 칩 기반 스크리닝(HTS), 및/또는 세포기반 어쎄이(in vitro)를 통합적으로 이용하여 타겟 발굴에서 선도물질 최적화 까지 가장 빠른 시간 안에 최소한의 비용으로 가장 효과적인 약물후보물질을 발견할 수 있는 신약개발의 표준플랫폼이며,
전통적인 신약발굴 시스템과는 확연히 다른, IT/BT/NT의 통합적인 신약발굴 시스템이고, 기존에 3년 이상이 걸린 타겟 분석에서 선도물질 최적화 까지의 과정을 최소 3개월에서 1년 이하로 획기적으로 줄일 수 있으며, Kinase, GPCR, Protease, Phosphatase 등 주요 타겟에 대한 Assay가 셋 업 되어 있으며, 약리효과 검증을 위한 타겟 별 assay가 준비 되어 있고, 히트된 선도물질의 IC50가 1μM 이하로 sensitivity가 담보되며, 통합적인 신약발굴의 각 단계를 거치면서 검색 된 물질의 다양한 데이터들이 제공 되어 전임상 및 임상단계로 넘어 가기에 아주 효율적이고, 구조기반의 스크리닝에서 걸러진 물질들이 다시 칩 기반의 High-Throughput-Screening을 거치기 때문에, In vitro 상에서도 검증이 되며, 히트된 소수의 물질들은 다시 구조기반의 분자시뮬레이션을 통해 그 상호작용을 정확히 조사 할 수 있으며, 또한 In silico와 In vitro의 동시 스크리닝을 함으로써 신약개발에 드는 비용을 획기적으로 낮출 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 도킹 계산을 위한 검색 알고리즘은 알파 트라이앵글 방법을 사용한 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 형광물질은 Cy3(그린), Cy5(레드), FITC(그린), 알렉사(Alexa), 보디피(BODIPY), 로다민(Rhodamine), 및 Q-도트(dot)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광물질인 것이 바람직하고, 상기 형광물질은 Cy5인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명은 하기 화학식 1내지 3으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물, 그 유도체 또는 그것의 염을 포함하는 오스테오폰틴 억제제를 제공한다.
[규칙 제91조에 의한 정정 10.03.2010]　
Figure WO-DOC-FIGURE-101
[화학식 1]
[규칙 제91조에 의한 정정 10.03.2010]　
Figure WO-DOC-FIGURE-102
[화학식 2]
[규칙 제91조에 의한 정정 10.03.2010]　
Figure WO-DOC-FIGURE-103
[화학식 3]
또한 본 발명은 상기 화학식 1내지 3으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물, 그 유도체 또는 그것의 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증, 관절염, 또는 치주질환 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 '유도체'라는 용어는 어떤 화합물의 일부를 화학적으로 변화시켜서 얻어지는 유사한 화합물을 의미하는 것으로, 예를 들어서, 화합물 중의 수소원자 또는 특정 원자단이 다른 원자 또는 원자단에 의하여 치환된 화합물을 말한다.
본 발명의 화합물은 오스테오폰틴 억제제로, 본 발명의 화합물은 오스테오폰틴 활성을 억제하는 데 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 화학식 1 내지 화학식 3의 화합물 중 하나의 화합물, 그 유도체 및/또는 이의 염 뿐만 아니라 당해 화합물 또는 이의 염을 함유하는 약제학적 제제를 오스테오폰틴 억제가 유용한 질병의 치료를 위해 사용할 수 있다.
이러한 질병으로는 예를 들어, 관절염 및 류마티스 관절염을 포함하는 관절의 염증 뿐만 아니라 류마티스 척추염 및 골관절염과 같은 기타 관절 질환이 포함된다. 추가의 적용 가능성은 골다공증, 치주질환 등의 치료이다.
약물 제조의 경우, 유효량의 본 발명의 화합물 또는 이의 염 이외에 통상의 보조제, 담체 및 첨가제를 사용한다.
활성 성분의 투여량은 투여되는 방식, 환자의 연령, 체중, 치료될 질환의 성질과 중증도 및 유사 요인에 따라 다를 수 있다.
1일 투여량은 1일 1회 투여되는 단일 투여량으로 투여할 수 있거나, 1일 2회 이상의 투여량으로 나눌 수 있으며 통상적으로 0.001 내지 100mg이다.
경구, 비경구, 정맥내, 경피, 국소, 흡입 및 비강내 제제가 바람직한 투여 형태이다.
제제의 통상적인 약제학적 형태, 예를 들어, 정제, 피복된 정제, 캡슐제, 분산성 산제, 입제, 수성 액제, 수성 또는 유성 현탁제, 시럽제, 용제 또는 점적제를 사용할 수 있다.
고체 형태의 약물은 불활성 성분 및 담체, 예를 들어, 탄산칼슘, 인산칼슘, 인산나트륨, 락토스, 전분, 만니톨, 알기네이트, 젤라틴, 구아 고무, 마그네슘 또는 알루미늄 스테아레이트, 메틸셀룰로즈, 활석, 고분산 실리카, 실리콘 오일, 고분자량 지방산(예: 스테아르산), 젤라틴, 아가 아가(agar agar), 식물성 또는 동물성 지방과 오일 및 고형 고분자량 중합체(예: 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있으며, 경구 투여에 적합한 제제는 임의로 추가의 풍미제 및/또는 감미제를 함유할 수 있다.
액체 형태의 약물은 멸균시킬 수 있으며/있거나, 임의로 삼투압 조절 또는 완충 목적의 방부제, 안정화제, 습윤제, 투과제, 유화제, 확산제, 가용화제, 염, 당 또는 당 알콜, 및/또는 점도 조절제와 같은 보조제를 함유할 수 있다.
이러한 첨가제의 예로는 타르트레이트 및 시트레이트 완충액, 에탄올, 착화제(예: 에틸렌디아민테트라아세트산 및 이의 비독성 염)가 있다. 점도를 조절하기 위해, 액상 폴리에틸렌 옥사이드, 미정질 셀룰로스(예: 카복시메틸셀룰로스), 폴리비닐피롤리돈, 덱스트란 또는 젤라틴과 같은 고분자량 중합체가 고려된다. 고체 담체 물질로는 예를 들어, 전분, 락토스, 만니톨, 메틸셀룰로스, 활석, 고분산 실리카, 고분자량 지방산(예: 스테아르산), 젤라틴, 아가 아가, 인산칼슘, 마그네슘 스테아레이트, 동물성 및 식물성 지방 및 고형 고분자량 중합체(예: 폴리에틸렌 글리콜)이 있다.
비경구 또는 국소용 유성 현탁제는 식물성, 합성 또는 반합성 오일, 예를 들어, 각 경우에 1개 내지 6개의 탄소원자를 갖는 1가 또는 3가 알콜(예: 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올 또는 이의 이성체, 글리콜 또는 글리세롤)로 에스테르화된, 지방산(예: 팔미트산, 라우르산, 트리데실산, 마르가르산, 스테아르산, 아라키드산, 미리스트산, 베헨산, 펜타데실산, 리놀레산, 엘라이드산, 브라시드산, 에루신산 또는 올레산) 쇄 중에 8개 내지 22개의 탄소원자를 갖는 액상 지방 에스테르를 함유할 수 있다. 이러한 지방 에스테르로는 예를 들어, 시판되는 미글리올, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 이소프로필 스테아레이트, 포화 지방 알콜의 PEG 6-카프르산, 카프릴산/카프르산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 글리세롤 트리올레에이트, 에틸 올레에이트, 왁스상 지방 에스테르(예: 합성 오리 둔부샘(rump gland) 지방), 코코넛유 지방산의 이소프로필 에스테르, 올레일 올레에이트, 데실 올레에이트, 에틸 락테이트, 디부틸 프탈레이트, 디이소프로필 아디페이트, 폴리올의 지방산 에스테르 등이 있다. 상이한 점도의 실리콘 오일 또는 지방 알콜(예: 이소트리데실 알콜, 2-옥틸도데칸올, 세틸 스테아릴 알콜 또는 올레일 알콜), 지방산(예: 올레산)이 마찬가지로 적합하다. 또한, 피마자유, 아몬드유, 올리브유, 참기름, 면실유, 땅콩유 또는 대두유와 같은 식물성 오일을 사용할 수 있다.
용매로서는, 겔형성제 및 가용화제, 물 또는 물과 혼화성인 용매가 고려된다. 예를 들어, 에탄올 또는 이소프로판올, 벤질 알콜, 2-옥틸도데칸올, 폴리에틸렌 글리콜, 프탈레이트, 아디페이트, 프로필렌 글리콜, 글리세린, 디프로필렌 글리콜, 트리프로필렌 글리콜, 왁스, 메틸 셀로솔브, 셀로솔브, 에스테르, 모르폴린, 디옥산, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, 테트라하이드로푸란, 사이클로헥사논 등과 같은 알콜이 고려된다.
필름 형성제로서는, 물 뿐만 아니라 유기 용매(예: 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스 또는 가용성 전분) 중에서 용해되거나 팽윤될 수 있는 셀룰로스 에테르를 사용할 수 있다.
겔 형성제와 필름 형성제 간의 혼합된 형태도 가능하다. 그 중에서도, 본원에서는 이온성 거대 분자가 사용될 수 있는데, 예를 들면, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산 및 이의 염, 나트륨 아벨로펙틴 세미글리콜레이트, 알긴산 또는 나트륨 염으로서의 프로필렌 글리콜 알기네이트, 아라비아 고무, 크산탄 고무, 구아 고무 또는 카라긴 고무를 사용할 수 있다.
추가의 제형 보조제로서는 글리세린, 상이한 점도의 파라핀, 트리에탄올아민, 콜라겐, 알란토인, 노반티솔산을 사용할 수 있다. 나트륨 라우릴 설페이트, 지방 알콜 에테르 설페이트, 이나트륨 N-라우릴-β-이미노 디프로피오네이트, 폴리에톡실화 피마자유 또는 소르비탄 모노올레에이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트(예: 트윈), 세틸 알콜, 레시틴, 글리세린 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 알킬페놀 폴리글리콜 에테르, 세틸트리메틸암모늄 클로라이드 또는 모노알킬 또는 디알킬 폴리글리콜 에테르 오르토인산 모노에탄올아민 염과 같은 계면활성제, 유화제 또는 습윤제를 사용한다. 목적하는 제형을 제조하기 위해, 유액 안정화용 안정화제(예: 몬모릴로나이트 또는 콜로이드성 실리카), 항산화제와 같은, 활성 물질의 분해 방지용 안정화제(예: 토코페롤 또는 부틸하이드록시아니솔), 또는 방부제(예: p-하이드록시벤조에이트 에스테르)가 또한 요구될 수 있다.
비경구 투여용 제제는 앰풀 또는 바이알과 같은 개별적 투여 단위 형태로 존재할 수도 있다. 바람직하게는, 활성 성분의 용액, 특히 수용액 및 그 중에서도 등장성 용액을 사용하나, 현탁액도 사용한다. 이러한 주사 형태는 완성된 제제로서 이용할 수 있거나, 동결건조물과 같은 활성 화합물을 임의로 다른 고체 담체 물질, 목적하는 용매 또는 현탁제와 혼합하여 사용 직전에 제조할 수 있다.
비강내 제제는 수성 또는 유성 용액이나 수성 또는 유성 현탁액으로 존재할 수 있다. 이들은 사용 전에 적합한 용매 또는 현탁제로 제조하는 동결건조물로서 존재할 수도 있다.
제제를 제조하여 용기내로 충전시키고 밀봉하는 공정은 통상의 항균 및 무균 조건하에 수행한다.
본 발명의 화합물들은 당업계에 주지된 통상의 제조방법에 의하여 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 화합물들은 러시아의 InterBioScreen(IBM) www.ibscreen.com이라는 회사에서 판매하는 Natural compound library(40,000종)에서 스크리닝한 물질이고, 그 러시아의 InterBioScreen(IBM) 사로부터 구입하였다.
이하 본 발명을 설명한다.
오스테오폰틴은 골기질에 풍부하게 존재하는 당단백질로 파골세포의 분화와 부착 이동에 관여를 하고 있으며 파골세포는 골다공증 및 류마티스 관절염 및 치주질환등 뼈와 관련된 질병의 원인이 되고 있다. 오스테오폰틴의 활성을 억제하는 물질은 이런 뼈와 관련된 질환의 치료제 및 의약품의 원료로 개발될 수 있다. 오스테오폰틴 억제제를 스크리닝 하기위해 수만개의 화합물을 빠르고 쉽게 스크리닝 하는 방법이 필요하였다. 가상 탐색 방법과 단백질칩을 이용하여 탐색된 물질은 오스테오폰틴 억제제로 개발될 수 있었다.
본 발명의 스크리닝 방법과 이에 따른 오스테오폰틴의 활성을 억제하는 물질은 파골세포의 분화와 이동을 억제하여 뼈와 관련된 질환의 치료제 및 의약품의 원료로 개발될 수 있다.
도 1은 오스테오폰틴 억제제의 가상 스크리닝 방법 및 표1은 가상 스크리닝 결과 결합력이 가장 우수한 100개 화합물의 결합 에너지값에 대한 내용이며,
도 2는 오스테오폰틴과 인테그린 αvβ3의 상호작용에 의한 결합의 농도 별 확인한 실험 결과와 그 그래프이며,
도 3는 천연물 유래 화합물 라이브러리로부터 오스테오폰틴과 인테그린 αvβ3의 상호작용에 의한 결합 실험한 대표결과와 그 가상 이미지이며,
도 4은 오스테오폰틴과 인테그린 αvβ3와의 결합의 경쟁적 저해제로 농도 의존적으로 되는 실험결과와 억제농도(IC50; half-maximal 억제 농도)를 나타낸 것이며,
도 5는 오스테오폰틴을 억제하는 물질의 화학적 구조와 그 명칭이며,
도 6은 탐색한 오스테오폰틴을 억제 물질의 생물학적 효능 분석으로 파골세포 분화 억제능을 분석한 결과이다.
도 7은 In vivo Calvaria 동물 모델을 이용한 골 파괴 억제 효과를 나타내는 실험결과이다.
도 8은 도 7 결과에서 In vivo Calvaria 동물 모델의 파괴된 골 면적을 수치화한 그래프이다.
이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 목적으로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1: 인테그린과 오스테오폰틴의 결합을 방해하는 물질 가상탐색
도 1의 가상 스크리닝을 위하여 사용된 소프트웨어는 Chemical Computing Group의 MOE (Molecular Operating Environment) 프로그램이다. 탐색 방법은 분자 도킹 시뮬레이션을 사용하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다. 우선 40,000개 라이브러리 화합물 파일 전체에 대하여 1차 분자 도킹 시뮬레이션을 실시하였다. 도킹 계산을 위한 검색 알고리즘은 알파 트라이앵글 (Alpha Triangle) 방법을 사용하여 각 리간드 화합물당 최대 500,000번의 구조변화 에너지 계산을 실시하였다. 이 방법은 분자의 3개 point를 삼각형으로 형상화하고 리셉터 단백질의 또 다른 트라이앵글과 매칭 여부를 판단하여 도킹하는 알고리즘을 사용한다. 스코어링 방법은 LondondG 방법을 사용하여 리간드당 최대 10개의 pose를 계산하였다. MOE에서 지원하는 스코어링 방법은 LondondG, AffinitydG, AlphaHB의 3가지가 있으며, 본 계산에 사용된 LondondG는 아래와 같다.
[규칙 제91조에 의한 정정 10.03.2010]　
Figure WO-DOC-FIGURE-104
LondondG 함수는 결합으로 인한 rotational/translation entropy 변화, ligand의 결합으로 인한 flexibility energy의 감소, 수소결합 에너지, 금속이온 ligation, desolavtion energy 차이 등이 파라미터로 사용된다.
40,000개 화합물에 대한 1차 도킹 시뮬레이션 결과 결합력이 우수한 5,000개 화합물을 선별하여 2차 도킹 시뮬레이션을 실시하였다. 2차 도킹 시뮬레이션에 사용된 방법은 기본적으로 1차 도킹 시뮬레이션의 방법과 동일하며, 에너지 최소화 방법이 추가되었다. 도킹된 리간드 pose에 대하여 에너지 최소화 분자 역학 계산을 실시하여 결합 구조에서 나올 수 있는 가장 안정한 리간드의 구조를 탐색하였다. 그 결과 계산된 결합에너지 값을 결합력 선별의 파라미터로 사용하였다. 5,000개 화합물에 대한 도킹 시뮬레이션 및 에너지 최소화 결과 스코어인 LondondG 값이 가장 우수한 100 개 화합물을 골라서 단백질칩 스크리닝을 위한 시작 물질로 제안하였다 (표 1).
[규칙 제91조에 의한 정정 10.03.2010]　
표 1
Figure WO-DOC-TABLE-1
표 1은 가상 스크리닝 결과 결합력이 가장 우수한 100개 화합물의 결합 에너지값 을 나타낸다.
실시예 2: 기판에 인테그린 αvβ3 수용체의 고정화
마이크로어레이어(CM-1000; Proteogen, Inc., 서울, 한국)로 인테그린 αvβ3(Chemicon, Temecula, Canada)을 ProteoChipTM(Proteogen Inc., 서울, 한국)표면 상에 스팟팅하여 인테그린 αvβ3 수용체 마이크로어레이(인테그린 부착 단백질 칩)를 구성하였다. 10mM β-옥틸티오글루코피라노사이드 (octylthioglucopyranoside), 1mM CaCl2, 1mM MgCl2 및 30% 글리세롤 용액을 함유하는 인산-완충 생리식염수 (phosphate-buffered saline; PBS)에 인테그린 αvβ3를 100㎍/㎖로 희석하여 스팟팅하고 4℃에서 밤새 반응시킨 다음, 결합하고 남은 인테그린 αvβ3을 0.5% 트윈-20을 함유한 인산-완충 생리식염수(0.5% PBST)로 세척하였고, 사용시까지 4℃에서 보관하였다.
실시예 3: 라이브러리로부터 인테그린 αvβ3-OPN interaction 길항물질 고속 대량 탐색
3-1) 인테그린 αvβ3과 오스테오폰틴의 상호작용
인테그린 αvβ3-오스테오폰틴의 상호작용을 알아보기 위하여, 실시예 2에서 제조한 인테그린 αvβ3-부착 단백질 칩을 1시간 동안 3% BSA로 블로킹하고 PBST로 세 번 세척하였다. 그런 다음, 상기 인테그린 마이크로어레이에 10㎍/ml 내지 12ng/ml 범위 농도의 Cy-5 형광 표지된 오스테오폰틴을 10mM β-옥틸-티오-글루코-피라노사이드 (β-octyl-thio-gluco-pyranoside), 1mM CaCl2, 1mM MgCl2, 0.2mM MnCl2 및 30% 글리세롤 용액을 함유하는 인산-완충 생리식염수 (phosphate-buffered saline; PBS)에 희석시켜 스팟팅하여 반응시켰다. 특히 인테그린과 오스테오폰틴의 결합에서 칼슘, 망간, 마그네슘의 역할은 중요하다고 알려져 있다.
도2는 인테그린 αvβ3-오스테오폰틴의 상호작용을 나타내는 형광 스캔 이미지와 인테그린 αvβ3-오스테오폰틴 상호작용의 용량-반응 곡선을 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 상기 도 3b는 상기 오스테오폰틴 스팟의 상대적 형광 세기와 Cy-5 형광 표지된 피브로넥틴 농도의 로그 사이의 관계를 측정하여 나타낸 그래프이다.
상기 도2에서, 인테그린 αvβ3은 Cy5로 표지된 오스테오폰틴과 잘 작용하는 것으로 나타났다. 이 중에서도 약 1㎍/ml 이상에서 오스테오폰틴은 포화 반응을 나타내었다. 이로 인해 상기 인테그린 αvβ3-부착 단백질 칩이 상기 인테그린 αvβ3와 오스테오폰틴의 결합 억제제 탐색을 위해 유효하고 적절한 것임을 알 수 있다.
3-2) 오스테오폰틴과 라이브러리 혼합 용액의 제조
오스테오폰틴-인테그린 결합 반응 실험을 위해 형광물질(Cy-5; Amersham Parmacia Biotech, Uppsala Sweden)로 오스테오폰틴을 표지한 후 실시예 1을 통해서 얻은 천연물 유래 화합물 라이브러리(50mM)과 오스테오폰틴(1㎍/mL)을 혼합하여 각각의 혼합 용액을 제조하였다. 10mM β-옥틸-티오-글루코-피라노사이드 (β-octyl-thio-gluco-pyranoside), 1mM CaCl2, 1mM MgCl2, 0.2mM MnCl2 및 30% 글리세롤 용액을 함유하는 인산-완충 생리식염수 (phosphate-buffered saline; PBS)에 희석시켜 사용하였다.
3-3) 오스테오폰틴-인테그린 αvβ3 결합 억제 초고속 대량 탐색
실시예 2에서 제조한 인테그린 αvβ3-부착 단백질 칩을 1시간 동안 3% BSA로 블로킹하고 PBST로 세 번 세척하였다. 그런 다음, 상기 제조한 각각의 라이브러리와 오스테오폰틴을 함유하는 혼합 용액을 30℃ 습도가 70%인 조건에서 마이크로어레이어(CM-1000; Proteogen, Inc., 서울, 한국)를 이용하여 칩 표면에 고정된 인테그린 αvβ3 수용체 위에 스팟팅한 후, 한 시간 동안 반응시켰다. 워싱용액(0.0%PBST)으로 세척한 후 질소를 이용하여 말리고 형광 레이저 스캐너를 이용하여 리간드 결합 정도를 상대적 형광 세기로 분석함으로써 라이브러리의 억제능력을 측정하였다. 그 결과, 다수의 라이브러리에서 상대적으로 현저히 낮은 형광 세기를 나타내는 것으로 나타나, 이 화합물이 인테그린 αvβ3-오스테오폰틴 결합 반응을 효과적으로 억제하는 것임을 증명하였다 (도 3).
도3은 라이브러리의 인테그린 αvβ3과 오스테오폰틴의 상호작용을 억제하는지를 알아보기 위해 실험한 결과이다.
상기 실험에서, 양성(positive) 대조군은 형광 물질로 표지된 오스테오폰틴을 사용하였고 음성(negative) 대조군은 표지되지 않은 RGD 펩타이드를 사용하였다. 상기 RGD는 자동화 펩타이드 합성장치를 이용하여 합성한 것으로 펩트론(Peptron, 대전, 한국)사로부터 합성하여 실험하였다. RGD(아미노산서열: GRGDSP)는 인테그린 αvβ3와 오스테오폰틴 결합에 작용하는 것으로 보고되었고 이와 같은 억제 역할을 할 수 있다.
도 3에서 형광의 강도는 무지개 색깔로 표현된다. 원래는 빨강색 또는 파
랑색과 같이 하나의 색으로 결과가 나오나 이 경우 형광 강도를 쉽게 보기가 어려워 기기의 소프트웨어가 이것을 형광 강도에 따라 색깔의 변화를 주게 되어 있다.
보통 형광 강도가 가장 강한 경우 흰색부터 빨강, 주황, 노랑, 초록, 파랑의 순으로 형광 강도를 표현하게 된다. 도2의 결과를 보면, 형광 표지된 오스테오폰틴만 반응시킨 것은 색깔이 흰색 또는 빨간색으로 인테그린 αvβ3와 오스테오폰틴의 결합이 되어 있음을 알 수 있다. RGD(GRGDSP) 염기서열을 포함하는 펩타이드를 사용하여 실험한 것의 경우 인테그린 αvβ3와 오스테오폰틴의 상호작용을 억제하여 인테그린 αvβ3에 오스테오폰틴이 결합하지 않아 형광이 제일 낮은 파란색으로 나타나고 있다.
라이브러리중 일부가 인테그린 αvβ3와 오스테오폰틴의 상호작용을 억제하여 인테그린 αvβ3에 오스테오폰틴이 결합하지 않아 형광이 제일 낮은 파란색으로 나타나고 있다. 따라서 이 특정 화합물은 인테그린 αvβ3와 오스테오폰틴의 결합을 강력히 저해하는 물질임을 증명하는 것이다(도 3).
3-4) 오스테오폰틴-인테그린 αvβ3 결합 억제제의 평가
실시예3-3에서 사용한 방법을 이용하여 실시예 3-3에서 발굴된 3개의 억제제(도면5)에 대하여 농도별로 100mM 부터 2배로 희석해서 1mM까지 처리하여 100mg/ml 농도로 고정된 인테그린 αvβ3과 1mg/ml 농도의 Cy5로 표지된 오스테오폰틴 결합을 억제하는 IC50 값을 구하였다 (도 4).
실시예 4: 단백질 칩을 이용하여 탐색한 물질들의 생물학적 활성 탐색
태어난 지 5주 되는 생쥐 (C57BL/6J)로부터 채취한 골수세포를 48-웰 플레이트에 넣고, 대식세포 (macrophage) 분화 인자인 hM-CSF (R&D system Inc.)를 30ng/ml의 농도로 포함하는 분화배지 (a-MEM (Invitrogen. co.,), 10%(v/v) 우태아혈청 (FBS), 100units/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신)에서 3일 동안 4x104 세포/웰로 37℃, 95%(v/v) 공기, 5% (v/v) CO2에서 배양하여 골수세포로부터 파생된 대식세포를 얻었다. 여기에 상기 30ng/ml의 농도의 hM-CSF에 더하여, 파골세포분화 인자인 생쥐 RANKL을 대장균에서 발현시켜 순수 분리 정제하여 100ng/ml의 농도로 첨가한 후 동일한 조건에서 배양을 계속하여 파골세포로의 세포분화를 유도하였다. 배양 4일 후, 세포를 3.7% 포름알데히드로 15분 동안 실온에서 고정시키고 증류수로 2회 세척한 후 Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) kitTM (Sigma Co.)의 사용설명서에 기재된 비율로 아세테이트, 패스트 가르넷 GBC 염기 (Fast Gargnet GBC base), 나프톨 AS-BI 인산, 소듐 니트라이트, 타르트레이트를 섞어 만든 염색액을 200㎍/웰을 넣고 37에서 20분 동안 반응시켜 분화된 파골세포를 염색하였다.도 6은 상기 실험을 이용하여 오스테오폰틴 억제제인 IPS-02001, IPS-02002, IPS-02003 을 10 mM로 처리 하여 파골 세포의 분화 억제능을 분석하였다. 그 결과 IPS-02001 과 IPS-02002는 우수한 파골 세포의 분화 억제 효능을 관찰할 수 있었지만, IPS-02003 경우 억제능을 보이지 않았다.
실시예 4: 단백질 칩을 이용하여 탐색한 물질들의 생물학적 활성 탐색
도 6은 쥐 파골세포(2X104/well)를 48 well plate에 가하고 M-CSF(30 ng/ml)과 RANKL(200 ng/ml)을 동시에 첨가한 후 오스테오폰틴 억제제인 C01, C02, G10을 10 mM로 처리 하여 파골 세포의 분화 억제능을 분석하였다. 그 결과 C01과 C02는 우수한 파골 세포의 분화 억제 효능을 관찰할 수 있었지만, G10경우 억제능을 보이지 않았다.
실시예 5: 생쥐 두개관 모델(Calvaria)
실제 생쥐에서 RANKL 혹은 LPS에 의해 유도되는 뼈 파괴작용의 억제 효능을 살펴보기 위하여 생후 7주 되는 생쥐의 머리뼈 두개관 (頭蓋冠; calvaria)에 LPS(12.5mg/kg) 또는 RANKL (2mg/kg) 처리하여 뼈 파괴를 유도하고 여기에 약물을 20 mg/kg 농도로 4일간 매일 처리하였다. 5일째 생쥐 두개관을 채취해 그 단면을 H&E 염색하여 살펴 보았고, Image-pro Plus4.5 (Media Cybernetics, Inc.)를 이용하여 뼈 파괴작용 억제 정도를 분석하였다.
골세포를 파괴하는 염증 유발 물질인 Lipopolysaccharide(10 mg/kg)를 쥐 머리뼈에 처리하여 골다공증을 인위적으로 유발하고, 여기에 IPS-02001 (10 mg/kg)을 처리하여 골세포 파괴가 복구되는 과정의 실험을 통하여 IPS-02001이 LPS에 의한 골 파괴작용을 억제하는 in vivo 효능을 확인하였다 (도 7)

Claims (8)

  1. a) 라이브러리 화합물 파일 전체에 대하여 분자 도킹 시뮬레이션을 실시하여 단백질 칩 스크리닝을 위한 시작물질을 탐색하는 단계;
    b) 상기 탐색된 시작물질을 오스페오폰틴과 형광물질 표지된 오스테오폰틴과 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계;
    c) 상기 혼합물을 단백질 칩에 고정된 인테그린 αvβ3 수용체 위에 첨가하는 단계: 및
    d) 상기 결합 정도를 분석하는 단계를 포함하는 오스테오폰틴 억제제의 스크리닝 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 도킹 계산을 위한 검색 알고리즘은 알파 트라이앵글 방법을 사용한 것을 특징으로 하는 오스테오폰틴 억제제의 스크리닝 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 형광물질은 Cy3(그린), Cy5(레드), FITC(그린), 알렉사(Alexa), 보디피(BODIPY), 로다민(Rhodamine), 및 Q-도트(dot)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광물질인 것을 특징으로 하는 오스테오폰틴 억제제의 스크리닝 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 형광물질은 Cy5인 것을 특징으로 하는 오스테오폰틴 억제제의 스크리닝 방법.
  5. [규칙 제91조에 의한 정정 10.03.2010]　
    제 1항 내지 제3항 중 어느 한항에 따른 스크리닝 방법에 의하여 얻은 하기 화학식 4 및 3으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물, 그 유도체 또는 그것의 염을 포함하는 오스테오폰틴 억제제.
    Figure WO-DOC-FIGURE-105
    [화학식 4] 단, 상기 화학식 4에서 R은 H 또는 Cl임.
    Figure WO-DOC-FIGURE-106
    [화학식 3]
  6. [규칙 제91조에 의한 정정 10.03.2010]　
    하기 화학식 4 및 3으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물, 그 유도체 또는 그것의 염을 포함하는 오스테오폰틴 억제제.
    Figure WO-DOC-FIGURE-107
    [화학식 4] 단, 상기 화학식 4에서 R은 H 또는 Cl임.
    Figure WO-DOC-FIGURE-108
    [화학식 3]
  7. [규칙 제91조에 의한 정정 10.03.2010]　
    제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 스크리닝 방법에 의하여 얻은 하기 화학식 4 내지 3으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물, 그 유도체 또는 그것의 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증, 관절염, 또는 치주질환 치료 또는 예방용 조성물.
    Figure WO-DOC-FIGURE-109
    [화학식 4] 단, 상기 화학식 4에서 R은 H 또는 Cl임.
    Figure WO-DOC-FIGURE-110
    [화학식 3]
  8. [규칙 제91조에 의한 정정 10.03.2010]　
    하기 화학식 4 내지 3으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물, 그 유도체 또는 그것의 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증, 관절염 또는 치주 질환 치료 또는 예방용 조성물.
    Figure WO-DOC-FIGURE-111
    [화학식 4] 단, 상기 화학식 4에서 R은 H 또는 Cl임.
    Figure WO-DOC-FIGURE-112
    [화학식 3]
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