KR101176041B1 - 디펩티딜 펩티데이즈 포에 대한 억제제 스크리닝 방법 및 그 억제 제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단백질 칩을 이용하여 디펩티딜 펩티데이즈 IV (이하, 'DPPIV', 또는 'DPP4'라 함)의 활성을 탐색하는 방법과 그 효소를 억제하는 물질에 관한 발명이다. 상기 본 발명에 따라 탐색된 DPP4 활성을 억제하는 물질은 우수한 DPP4 억제 물질로 효과가 우수하였다.

Description

디펩티딜 펩티데이즈 포에 대한 억제제 스크리닝 방법 및 그 억제 제{A Method for screening Dipeptidyl peptidase IV inhibitor and a Dipeptidyl peptidase IV inhibitor therefrom}

본 발명은 단백질 칩을 이용하여 디펩티딜 펩티데이즈 IV (이하, 'DPPIV', 또는 'DPP4'라 함)의 활성을 탐색하는 방법과 그 효소를 억제하는 물질에 관한 발명이다. 상기 본 발명에 따라 탐색된 DPP4 활성을 억제하는 물질은 우수한 DPP4 억제 물질로 효과가 우수하였다.

일반적으로 DPPIV(Dipeptidyl peptidase IV)는 세린 프로테아제로 N-말단의 Xaa-Pro 올리고 펩타이드로부터 두개의 펩타이드를 절단한다. 이 프로테아제는 특이적인 효소 작용으로 생물학적 활성과 불활성을 조절한다. DPPIV는 다양한 조직에서 발현되며 세포막에 고정되어 있거나 또는 수용성으로 신체에 유동적이다. DPPIV는 뉴로 펩타이드를 포함하여 다양한 기질을 인식한다. 효소의 이런 메커니즘은 당뇨병과 밀접한 관련이 있다( Scanlan, M.J. et al . Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91, 56575661(1994). ; Demuth, H.-U. & Heins, J. (1995) ed. Fleischer, B.(R.G.Landes,Austin,TX), pp.135; Drucker, D. J. Exp . Opin . Invest . Drugs 12, 87100 (2003); Hoffmann, T. & Demuth, H.-U. (2002) Langner, J. & Ansorge, S. (KluwerAcademic_Plenum,NewYork), pp.259278;Pederson, R. A., White, H. A., Schlenzig, D., Pauly, R. P., McIntosh, C. H. & Demuth, H. U. Diabetes 47, 12531258 (1998);Pospisilik, J. A., Stafford, S. G., Demuth, H. U., McIntosh, C. H. & Pederson, R. A. Diabetes 51, 26772683 (2002).

*DPPIV의 억제는 순환하는 GLP-1(Glucagon-like peptide-1)을 높이고 인슐린 분비를 자극하여 2형 당뇨병의 고혈당을 개선할 수 있다(Ahren, B., Holst, J.J., Martensson, H. & Balkan, B. Eur .J. Pharmacol . 404 (1-2), 239-245 (2000) ; Deacon, C.F., Hughes, T.E. & Joist, J.J. Diabetes 47, 764-769 (1998). 많은 저분자 DPPIV 억제제가 보고되었다. GLP-1은 인크레틴(incretin) 호르몬으로 소장의 L-세포로부터 음식물의 흡수에 반응하여 분비된다. 이 호르몬은 글루카곤의 분비 억제, 위를 비우는 것을 더디게 하는 일, 비만의 유도, 췌장 B-세포의 분화와 재생을 자극하는 일에 중요한 역할을 한다. 생체 내에서 GLP-1은 DPPIV에 의해서 빠르게 불활성화되며, 이것은 GLP-1의 N-말단 디펩타이드(dipeptides)의 절단에 의해서 이루어진다(Holst, J.J. & Deacon, E.F. Curr . Opin . Pharmacol . 4(6), 589-596 (2004); Drucker, D.J. Gastroenterology 122(2), 531-544 (2002);Kieffer, T.J., McIntosh, C.H. & Pederson, R.A. Endocrinology 136(8), 3585-3596 (1995);Deacon, C.F. Diabetes 44, 1126-1131 (1995).

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 DPP4 활성을 억제하는 물질 탐색하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법을 이용하여 DPP4 활성을 억제하는 물질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신규 DPP4 억제물질을 이용하여 2형 당뇨병 치료제를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a) 라이브러리 화합물 파일 전체에 대하여 분자 도킹 시뮬레이션을 실시하여 단백질 칩 스크리닝을 위한 물질을 탐색하는 단계; b) 상기 탐색된 물질을 6His에 대한 항체, 디펩티딜 펩티데이즈 IV에 대한 기질 및 형광 물질이 표지된 물질이 고정된 단백질 칩에 첨가하는 단계: 및 c) 상기 결합 정도를 분석하는 단계를 포함하는 디펩티딜 펩티데이즈 IV에 대한 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 도킹 계산을 위한 검색 알고리즘은 알파 트라이앵글 방법을 사용한 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 형광물질은 Cy3(그린), Cy5(레드), FITC(그린), 알렉사(Alexa), 보디피(BODIPY), 로다민(Rhodamine), 및 Q-도트(dot)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광물질인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 디펩티딜 펩티데이즈 IV에 대한 기질은 서열번호 1에 기재된 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명에서 '6His에 대한 항체'는 상기 서열번호 1에 기재된 서열의 C말단에 나열된 여섯 개의 히스티딘 잔기에 특이적인 항체를 의미한다.

본 발명에서 'His-Tag(H-H-H-H-H-H)에 대한 항체'는 상기 서열번호 1에 기재된 서열의 C말단에 나열된 여섯 개의 히스티딘 잔기에 특이적인 항체를 의미한다.

즉 본 발명에서는 His-Tag(H-H-H-H-H-H)사용하여 기질에 붙이고, His-Tag에 대한 항체를 이용하여 칩에 고정하였다.

또한 본 발명은 상기 본 발명에 따른 스크리닝 방법에 의하여 얻은 3-(5-{[1-카르복시-2-(1H-인돌-3-일)-에틸아미노]-메틸}-푸란-2-일)-벤조산, 6-[3- 벤조일-4-하이드록시-2-(4-메톡시-페닐)-5-옥소-2,5-다이하이드로-피롤-1-일]-헥산산, 2-{3-(4-클로로-페닐)-4-[(1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-카르보닐)-아미노]-부티릴아미노}-3-하이드록시-프로핀산, 및 2-[4-(2-아미노-프로피오닐아미노)-3-(4-클로로-페닐)-부티릴아미노]-4-메틸-펜탄산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물 또는 그것의 염을 포함하는 디펩티딜 펩티데이즈 IV에 대한 억제제를 제공한다.

본 발명의 상기 화합물들은 러시아의 InterBioScreen(IBM) www.ibsscreen.chg.ru이라는 회사에서 판매하는 Natural compound library(40,000종)에서 스크리닝한 물질이고, 그 러시아의 InterBioScreen(IBM) 사로부터 구입하였다.

또한 본 발명은 상기 본 발명에 따른 스크리닝 방법에 의하여 얻은 3-(5-{[1-카르복시-2-(1H-인돌-3-일)-에틸아미노]-메틸}-푸란-2-일)-벤조산, 6-[3- 벤조일-4-하이드록시-2-(4-메톡시-페닐)-5-옥소-2,5-다이하이드로-피롤-1-일]-헥산산, 2-{3-(4-클로로-페닐)-4-[(1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-카르보닐)-아미노]-부티릴아미노}-3-하이드록시-프로핀산, 및 2-[4-(2-아미노-프로피오닐아미노)-3-(4-클로로-페닐)-부티릴아미노]-4-메틸-펜탄산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물 또는 그것의 염을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

본 발명의 화합물은 디펩티딜 펩티데이즈 IV에 대한 억제제이다.

따라서, 당해 화합물은 디펩티딜 펩티데이즈 IV에 대한 활성을 억제하는 데 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기 본 발명의 화합물 및 이의 염 뿐만 아니라 당해 화합물 또는 이의 염을 함유하는 약제학적 제제를 디펩티딜 펩티데이즈 IV에 대한 억제가 유용한 질병의 치료를 위해 사용할 수 있다.

이러한 질병으로는 예를 들어, 당뇨병 등의 치료 또는 예방이다.

약물 제조의 경우, 유효량의 본 발명의 화합물 또는 이의 염 이외에 통상의 보조제, 담체 및 첨가제를 사용한다.

활성 성분의 투여량은 투여되는 방식, 환자의 연령, 체중, 치료될 질환의 성질과 중증도 및 유사 요인에 따라 다를 수 있다.

1일 투여량은 1일 1회 투여되는 단일 투여량으로 투여할 수 있거나, 1일 2회 이상의 투여량으로 나눌 수 있으며 통상적으로 0.001 내지 100mg이다.

경구, 비경구, 정맥내, 경피, 국소, 흡입 및 비강내 제제가 바람직한 투여 형태이다.

제제의 통상적인 약제학적 형태, 예를 들어, 정제, 피복된 정제, 캡슐제, 분산성 산제, 입제, 수성 액제, 수성 또는 유성 현탁제, 시럽제, 용제 또는 점적제를 사용할 수 있다.

고체 형태의 약물은 불활성 성분 및 담체, 예를 들어, 탄산칼슘, 인산칼슘, 인산나트륨, 락토스, 전분, 만니톨, 알기네이트, 젤라틴, 구아 고무, 마그네슘 또는 알루미늄 스테아레이트, 메틸셀룰로즈, 활석, 고분산 실리카, 실리콘 오일, 고분자량 지방산(예: 스테아르산), 젤라틴, 아가 아가(agar agar), 식물성 또는 동물성 지방과 오일 및 고형 고분자량 중합체(예: 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있으며, 경구 투여에 적합한 제제는 임의로 추가의 풍미제 및/또는 감미제를 함유할 수 있다.

액체 형태의 약물은 멸균시킬 수 있으며/있거나, 임의로 삼투압 조절 또는 완충 목적의 방부제, 안정화제, 습윤제, 투과제, 유화제, 확산제, 가용화제, 염, 당 또는 당 알콜, 및/또는 점도 조절제와 같은 보조제를 함유할 수 있다.

이러한 첨가제의 예로는 타르트레이트 및 시트레이트 완충액, 에탄올, 착화제(예: 에틸렌디아민테트라아세트산 및 이의 비독성 염)가 있다. 점도를 조절하기 위해, 액상 폴리에틸렌 옥사이드, 미정질 셀룰로스(예: 카복시메틸셀룰로스), 폴리비닐피롤리돈, 덱스트란 또는 젤라틴과 같은 고분자량 중합체가 고려된다. 고체 담체 물질로는 예를 들어, 전분, 락토스, 만니톨, 메틸셀룰로스, 활석, 고분산 실리카, 고분자량 지방산(예: 스테아르산), 젤라틴, 아가 아가, 인산칼슘, 마그네슘 스테아레이트, 동물성 및 식물성 지방 및 고형 고분자량 중합체(예: 폴리에틸렌 글리콜)이 있다.

비경구 또는 국소용 유성 현탁제는 식물성, 합성 또는 반합성 오일, 예를 들어, 각 경우에 1개 내지 6개의 탄소원자를 갖는 1가 또는 3가 알콜(예: 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올 또는 이의 이성체, 글리콜 또는 글리세롤)로 에스테르화된, 지방산(예: 팔미트산, 라우르산, 트리데실산, 마르가르산, 스테아르산, 아라키드산, 미리스트산, 베헨산, 펜타데실산, 리놀레산, 엘라이드산, 브라시드산, 에루신산 또는 올레산) 쇄 중에 8개 내지 22개의 탄소원자를 갖는 액상 지방 에스테르를 함유할 수 있다. 이러한 지방 에스테르로는 예를 들어, 시판되는 미글리올, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 이소프로필 스테아레이트, 포화 지방 알콜의 PEG 6-카프르산, 카프릴산/카프르산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 글리세롤 트리올레에이트, 에틸 올레에이트, 왁스상 지방 에스테르(예: 합성 오리 둔부샘(rump gland) 지방), 코코넛유 지방산의 이소프로필 에스테르, 올레일 올레에이트, 데실 올레에이트, 에틸 락테이트, 디부틸 프탈레이트, 디이소프로필 아디페이트, 폴리올의 지방산 에스테르 등이 있다. 상이한 점도의 실리콘 오일 또는 지방 알콜(예: 이소트리데실 알콜, 2-옥틸도데칸올, 세틸 스테아릴 알콜 또는 올레일 알콜), 지방산(예: 올레산)이 마찬가지로 적합하다. 또한, 피마자유, 아몬드유, 올리브유, 참기름, 면실유, 땅콩유 또는 대두유와 같은 식물성 오일을 사용할 수 있다.

용매로서는, 겔형성제 및 가용화제, 물 또는 물과 혼화성인 용매가 고려된다. 예를 들어, 에탄올 또는 이소프로판올, 벤질 알콜, 2-옥틸도데칸올, 폴리에틸렌 글리콜, 프탈레이트, 아디페이트, 프로필렌 글리콜, 글리세린, 디프로필렌 글리콜, 트리프로필렌 글리콜, 왁스, 메틸 셀로솔브, 셀로솔브, 에스테르, 모르폴린, 디옥산, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, 테트라하이드로푸란, 사이클로헥사논 등과 같은 알콜이 고려된다.

필름 형성제로서는, 물 뿐만 아니라 유기 용매(예: 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스 또는 가용성 전분) 중에서 용해되거나 팽윤될 수 있는 셀룰로스 에테르를 사용할 수 있다.

겔 형성제와 필름 형성제 간의 혼합된 형태도 가능하다. 그 중에서도, 본원에서는 이온성 거대 분자가 사용될 수 있는데, 예를 들면, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산 및 이의 염, 나트륨 아벨로펙틴 세미글리콜레이트, 알긴산 또는 나트륨 염으로서의 프로필렌 글리콜 알기네이트, 아라비아 고무, 크산탄 고무, 구아 고무 또는 카라긴 고무를 사용할 수 있다.

추가의 제형 보조제로서는 글리세린, 상이한 점도의 파라핀, 트리에탄올아민, 콜라겐, 알란토인, 노반티솔산을 사용할 수 있다. 나트륨 라우릴 설페이트, 지방 알콜 에테르 설페이트, 이나트륨 N-라우릴-β-이미노 디프로피오네이트, 폴리에톡실화 피마자유 또는 소르비탄 모노올레에이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트(예: 트윈), 세틸 알콜, 레시틴, 글리세린 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 알킬페놀 폴리글리콜 에테르, 세틸트리메틸암모늄 클로라이드 또는 모노알킬 또는 디알킬 폴리글리콜 에테르 오르토인산 모노에탄올아민 염과 같은 계면활성제, 유화제 또는 습윤제를 사용한다. 목적하는 제형을 제조하기 위해, 유액 안정화용 안정화제(예: 몬모릴로나이트 또는 콜로이드성 실리카), 항산화제와 같은, 활성 물질의 분해 방지용 안정화제(예: 토코페롤 또는 부틸하이드록시아니솔), 또는 방부제(예: p-하이드록시벤조에이트 에스테르)가 또한 요구될 수 있다.

비경구 투여용 제제는 앰풀 또는 바이알과 같은 개별적 투여 단위 형태로 존재할 수도 있다. 바람직하게는, 활성 성분의 용액, 특히 수용액 및 그 중에서도 등장성 용액을 사용하나, 현탁액도 사용한다. 이러한 주사 형태는 완성된 제제로서 이용할 수 있거나, 동결건조물과 같은 활성 화합물을 임의로 다른 고체 담체 물질, 목적하는 용매 또는 현탁제와 혼합하여 사용 직전에 제조할 수 있다.

비강내 제제는 수성 또는 유성 용액이나 수성 또는 유성 현탁액으로 존재할 수 있다. 이들은 사용 전에 적합한 용매 또는 현탁제로 제조하는 동결건조물로서 존재할 수도 있다.

제제를 제조하여 용기 내로 충전시키고 밀봉하는 공정은 통상의 항균 및 무균 조건하에 수행한다.

본 발명의 화합물들은 당업계에 주지된 통상의 제조방법에 의하여 제조될 수 있다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 단백질 칩을 이용한 DPP4 활성 분석법을 개발하고 이를 활용하여 활성 억제 물질 탐색하는 발명이다. 기판 위에 고정할 DPP4 기질은 효소와의 작용을 고려하여 방향 특이적으로 기질을 디자인하는 과정이 필요하였고 또한 DPP4 기질과 효소작용이 일어난 후의 활성을 측정하기 위한 광학적 측정을 고려하여야 한다.

DPP4 활성을 억제하는 물질을 발굴하기 위하여 천연물 유래 화합물 라이브러리로부터 스크리닝하여 신규 DPP4 억제물질을 발굴하면 2형 당뇨병 치료제 및 생리조절 물질로서 개발할 수 있다.

본 발명은 단백질 칩을 이용한 DPP4 활성 분석법 및 활성억제 물질 탐색을 통한 활성 억제 물질에 관한 발명이다.

단백질을 고정할 수 있는 링커가 코팅된 기판을 이용하였으며, 기질을 방향 특이적으로 부착하여 효소와 반응할 수 있고 형광 스캐너로 측정할 수 있도록 기질을 도안하였고, 4만 개의 천연물 유래 화합물 라이브러리 가상 탐색을 위해 가상 탐색 방법이 사용되었으며, 인슐린 항체를 이용하여 쥐의 췌장 B-세포에서 DPP4 억제제가 인슐린 분비 증가에 미치는 영향을 확인하였다.

상기한 본 발명에 의하여 DPP4의 활성을 측정할 수 있으며, 화합물 라이브러리로부터 DPP4 억제효과를 가지는 물질을 탐색할 수 있다. 본 발명을 통해 발굴된 화합물은 DPP4 억제효과를 통해 의약품 및 상업용으로 개발이 가능하다.

도 1은 ProteoChip 상에서 DPP4 분석을 도식화한 도면이다.
도 2는 ProteoChip 상에서 DPP4 분석 실험한 대표결과로 (A)는 DPP4의 농도에 따른 기질 절단 결과와 그 그래프 이며, (B)는 Galvus에 의하여 DPP4 활성이 억제됨을 확인한 결과와 그 그래프이다.
도 3은 DPP4 억제제 가상 탐색에 사용된 방법을 도식화한 것이다.
도 4는 가상 스크리닝 결과 결합력이 가장 우수한 100개 화합물의 일련번호를 명시한 표이다.
도 5는 가상 스크리닝으로 발굴한 후보물질들을 100nM로 처리하여 칩 상에서 효과적으로 DPP4를 억제하는 것을 발굴한 실험결과와 그 그래프이다.
도 6은 DPP4를 억제하는 물질의 구조와 칩 상에서 억제농도(IC₅₀; half-maximal 억제 농도)를 나타낸 것이다.
도 7은 단백질칩 스크리닝 결과 활성이 우수한 4개 화합물이 DPPIV 타겟 단백질의 active site에 결합한 분자 도킹 구조를 보여준다.
도 8은 RIN-m5F에서 DPP4 억제제를 처리하여 인슐린 증가를 나타낸 결과를 나타낸 것이다. 상단은 DPP4 억제제의 농도별 처리에 의한 인슐린 분비를 측정한 형광 스캐너 상의 이미지이며, 하단의 그림은 Low glucose를 100%로 환산하여 계산한 상대적인 결과 그래프이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: DPP4 기질 디자인 및 분석 설계 (도 1)

DPP4 기질: Biotin-GPGPHHHHHH(서열번호 1)

N-말단의 바이오틴은 straptavidin과 결합하여 분석할 수 있으며, GP 서열은 DPP4에 의하여 절단되는 인식부위며, C-말단의 6his 는 단백질칩 기판에 고정되어 방향성을 갖게 한다. 합성은 펩트론 사(대전, 대한민국)에서 합성하였다.

실시예 2: DPP4 활성 분석 칩 준비

프로테오젠 사(춘천, 강원도)에서 공급하는 프로링커가 코팅된 기판(ProteoChip)을 사용하였으며, 기판 위에 6His에 대한 항체(고마 바이오텍)를 100㎍/ml 농도로 30% 글리세롤에 희석하여 기판 위에 4℃에서 밤새 고정시켰으며 이후 PBST 세척 버퍼를 이용하여 세척하고 질소 가스를 이용하여 건조시켜서 준비하였다.

실시예 3: DPP4 활성 분석

실시예 1을 통해 합성한 기질을 10~250㎍/ml 농도가 되게 30% 글리세롤에 희석하여 4 ℃에서 3시간 동안 실시예 2를 통해 준비된 기판에 스팟팅하고 고정하였으며 이후 PBST로 세척하고 질소 가스를 이용하여 건조하였다. 5% BSA를 이용하여 실온에서 1시간 블록킹을 한 후 PBST로 세척하고 질소 가스를 이용하여 건조하였다. DPP4 효소(Calbiochem사)를 완충용액 (50mM Tris-HCl, 0.1mg/ml BSA, 100mM NaCl, 10% Glycerol, pH7.8)에 희석(0~2000ng/ml)하여 기판에 스팟팅하고 30℃에서 1시간 반응을 시키고 PBST로 세척하고 질소가스를 흘려주어 건조하였다. 30% 글리세롤에 Cy5로 표지된 스트렙타비딘(streptavidin, GE healthcare사)을 1:100으로 희석하여 기판에 스팟팅하고 30℃에서 1시간 동안 반응 시킨 후 PBST로 세척하고 질소가스를 이용하여 건조하였으며, Genetics사의 aQuire 형광 스캐너를 이용하여 639mm 파장에서 해당 형광 이미지를 분석하였고 GenePix Pro 6.0(Axon사)를 이용하여 그 값을 측정하였다(도 2).

실시예 4: 라이브러리로부터 가상 탐색

DPPIV 타겟 단백질에 대한 inhibitor 스크리닝을 위하여, 먼저 컴퓨터를 이용한 가상 스크리닝을 실시하여 100 개의 라이브러리 화합물을 선정하였다. 이를 위하여 사용된 소프트웨어는 Chemical Computing Group의 MOE (Molecular Operating Environment) 프로그램과 Cambridge Crystallographic Data Centre (CCDC)의 GOLD 4.0.1 프로그램이다. 탐색 방법은 분자 도킹 시뮬레이션을 사용하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다 (도 3). 우선 40,000개 라이브러리 화합물 파일 전체에 대하여 1차 분자 도킹 시뮬레이션을 실시하였다. 타겟 리셉터 단백질은 DPPIV 모델 중에서 Protein Data Bank (PDB)의 1N1M 구조를 사용하였다. 도킹 계산을 위한 검색 알고리즘은 알파 트라이앵글 (Alpha Triangle) 방법을 사용하여 각 리간드 화합물당 최대 500,000번의 구조변화 에너지 계산을 실시하였다. 이 방법은 분자의 3개 point를 삼각형으로 형상화하고 리셉터 단백질의 또 다른 트라이앵글과 매칭 여부를 판단하여 도킹하는 알고리즘을 사용한다. 스코어링 방법은 LondondG 방법을 사용하여 리간드당 최대 10개의 pose를 계산하였다. LondondG 함수는 결합으로 인한 rotational/translation entropy 변화, ligand의 결합으로 인한 flexibility energy의 감소, 수소결합 에너지, 금속이온 ligation, desolavtion energy 차이 등이 파라미터로 사용하며 계산 공식은 다음과 같다.

40,000개 화합물에 대한 1차 도킹 시뮬레이션 결과 결합력이 우수한 10,000개 화합물을 선별하여 2차 도킹 시뮬레이션을 실시하였다. 2차 도킹 시뮬레이션에서는 GOLD 프로그램을 사용하여 Slow 옵션을 이용하여 연산을 실시하였다. GOLD 프로그램에서는 스코어링 함수로 GoldScore, ChemScore, ASPScore의 3가지 옵션을 지원하는데, 2차 도킹 시뮬레이션에서는 GoldScore를 사용하였다. 10,000개 화합물에 대한 도킹 시뮬레이션 및 에너지 최소화 결과 스코어인 GOLD_Score 값이 가장 우수한 100 개 화합물을 골라서 단백질칩 스크리닝을 위한 시작 물질로 제안하였다 (도 4).

실시예 5: 단백질 칩 상에서 DPP4 억제제 스크리닝

실시예 4를 통해 발굴한 100개의 화합물 라이브러리를 이용하여 실시예 3의 방법을 이용한 DPP4 활성을 측정하는 방법을 통해 DPP4 활성을 억제하는 4개의 물질을 스크리닝 하였다. DPP4 일차 스크리닝을 위하여 기질은 100㎍/ml로 희석하여 his6가 고정된 기판에 스팟팅하였고 DPP4는 40ng/ml로 반응시켰으며 화합물의 농도는 2500nM, 500nM, 100nM 농도를 사용하였고, 포지티브 컨트롤은 갈버스(Galvus)를 사용하였다 (도 5).

본 발명을 통해 탐색된 구조 4가지는 IPS-03001;3-(5-{[1-Carboxy-2-(1H-indol-3-yl)-ethylamino]-methyl}-furan-2-yl)-benzoic acid, IPS-03002; 6-[3-Benzoyl-4-hydroxy-2-(4-methoxy-phenyl)-5-oxo-2,5-dihydro-pyrrol-1-yl]-hexanoic acid, IPS-03003; 2-{3-(4-Chloro-phenyl)-4-[(1,2,3,4-tetrahydro-isoquinoline-3-carbonyl)-amino]-butyrylamino}-3-hydroxy-propionic acid, IPS-03004; 2-[4-(2-Amino-propionylamino)-3-(4-chloro-phenyl)-butyrylamino]-4-methyl-pentanoic acid 이다 (도면 6).

실시예 6: 단백질 칩 상에서 DPP4 억제제 이차 스크리닝

실시예 5를 통해서 효과가 좋은(IC 50 값이 100nM 이하) 4개의 물질을 다시 각각 농도별(250nM~1.7nM)로 사용하여 실시예5에서 사용한 방법으로 억제하는 것들을 확인 하고 IC50 값을 구하였다(도 6). 또한 도킹 시뮬레이션을 통하여 제안된 DPP4와의 결합 구조를 제안하였다 (도 7).

실시예 7: 탐색한 화합물들의 생물학적 활성 분석

RIN-m5F(Rat insulin beta) 세포는 ATCC(U.S.A)에서 구입하였다.

세포는 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin이 포함된 RPMI1640(GIBCO) 배지를 이용하여 96 plate에 2 X10⁴/well씩 seeding후 24시간 배양하였다. 배양한 세포는 PBS로 washing 한 다음 1% FBS와 1% penicillin-streptomycin이 포함된 DMEM low glucose(GIBCO) 배지로 starvation을 시킨다. 8시간동안 starvation시킨 세포는 다시 PBS로 washing하였다. 그런 다음 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin DMEM high glucose(GIBCO) 배지에 GLP-1, IPS-03001~4, Galvus를 각각 농도별로 처리후 48시간동안 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 수거한 세포배양액은 새로운 96 plate에 옮겨 4℃에 보관했다.

Insulin 분비의 측정을 위하여 인슐린 A 사슬, B 사슬을 각각 확인할 수 있는 항체를 구입하여 인슐린의 분비 증가를 측정하였다. 이의 측정을 위해 단백질을 고정할 수 있는 ProteoChip에 인슐린 A 사슬을 항원으로 사용하는 항체(Santacruze사)를 20㎍/ml 로 30% 글리세롤에 희석하여 4℃에서 밤새 코팅하였으며 준비된 세포배양액을 1시간 반응시키고 PBST로 세척 후에 인슐린 B 사슬을 인식하는 단클론 항체(Genetex사)를 사용하여 분비된 인슐린과 결합할 수 있게 하였고 형광(Cy5)이 표지된 인슐린 B를 인식하는 항체의 2차 항체(Invitrogen 사)를 이용하여 인슐린의 양을 측정하였다 (도 8).

서열목록 전자파일 첨부

Claims (3)

1. a) 라이브러리 화합물 파일 전체에 대하여 분자 도킹 시뮬레이션을 실시하여 단백질 칩 스크리닝을 위한 물질을 탐색하는 단계;
   b) 상기 탐색된 물질을 6His에 대한 항체, 디펩티딜 펩티데이즈 IV에 대한 기질 및 형광 물질이 표지된 물질이 고정된 단백질 칩에 첨가하는 단계: 및
   c) 상기 단백질 칩 상에 디펩티딜 펩티데이즈 IV 및 디펩티딜 펩티데이즈 IV에 대한 억제제 후보물질을 첨가하고 상기 디펩티딜 펩티데이즈 IV에 디펩티딜 펩티데이즈 IV 억제제 후보물질의 결합 정도에 따른 형광 강도를 분석하는 단계를 포함하는 디펩티딜 펩티데이즈 IV에 대한 억제제의 스크리닝 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 형광물질은 Cy3(그린), Cy5(레드), FITC(그린), 알렉사(Alexa), 보디피(BODIPY), 로다민(Rhodamine), 및 Q-도트(dot)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광물질인 것을 특징으로 하는 디펩티딜 펩티데이즈 IV에 대한 억제제의 스크리닝 방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 디펩티딜 펩티데이즈 IV에 대한 기질은 서열번호 1에 기재된 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 디펩티딜 펩티데이즈 IV에 대한 억제제의 스크리닝 방법.

Images