BR112012001915B1

BR112012001915B1 - derivado do análogo de glp-1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, composição farmacêutica e uso dos mesmos

Info

Publication number: BR112012001915B1
Application number: BR112012001915-5A
Authority: BR
Inventors: Lü Aifeng; Sun Changan; Yuan Hengli; Wang Yali
Original assignee: Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2009-07-30
Filing date: 2010-07-29
Publication date: 2019-11-12
Also published as: ES2694394T3; CN101987868B; PL2460825T3; RU2565536C2; EP2460825A4; RU2012105355A; PT2460825T; JP2013500278A; AU2010278466B2; EP2460825B1; CN101987868A; DK2460825T3; EP2460825A1; CN102421797B; CA2769229A1; CA2769229C; ZA201200239B; CN102421797A; HK1154027A1; AU2010278466A1

Abstract

derivado do análogo de glp-1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, composição farmacêutica e uso dos mesmos a presente invenção refere-se a um derivado de um análogo de glp-1 ou seus sais farmacêuticos, em que o referido análogo de glp-1 contém a sequência de aminoácidos de fórmula geral (i). x1-x2-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-x10-ser-x12-x13-x14-glu-x16-x17- ala-x19-x20-x21-phe-ile-x24-trp-leu-x27-x28-x29-x30-x31-x32-x33-x34-x35-x36-x37-x38-x39-lys (i) o derivado do análogo de glp-1 fornecido por esta invenção tem a função do glp-1 humano, e uma meia-vida in vivo mais longa comparado com o glp-1 humano. o derivado do análogo de glp-1 ou seus sais farmacêuticos, ou composições farmacêuticas que contêm o derivado do análogo de glp-1 ou seus sais farmacêuticos fornecidos por esta invenção podem ser usados amplamente no tratamento de diabetes não dependente de insulina, diabetes dependente de insulina ou obesidade.

Description

A presente invenção refere-se a uma série de derivados do análogo de peptídeo 1 semelhante ao glucagon (GLP-1) humano e sais farmacêuticos dos mesmos. Os derivados do análogo de GLP-1 fornecidos nesta invenção têm a função do GLP-1 humano e uma meia-vida in vivo mais longa comparados com o GLP-1 humano. A presente invenção também se refere ao emprego dos derivados do análogo de GLP-1, os sais farmacêuticos dos mesmos, ou composições farmacêuticas que contêm os derivados do análogo de GLP-1 ou os sais farmacêuticos dos mesmos no tratamento de diabetes não dependente de insulina, diabetes dependente de insulina ou obesidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Diabetes melito é uma doença epidêmica global e é uma síndrome dos distúrbios metabólicos de glicose, proteína e lipídeo devido à deficiência absoluta ou relativa de insulina (Chen Ruijie. Status of research on diabetes drugs, Academic journal of Guangdong College of Pharmacy, 2001, 7(2):131-133). O diabetes melito pode ser dividido em diabetes melito do tipo I e diabetes melito do tipo II (diabetes melito do Tipo 2, T2DM, o mesmo a seguir) de acordo com a patogênese do mesmo. 90 a 95% de todos os pacientes diagnosticados com diabetes melito sofrem de T2DM, e os pacientes estão frequentemente associados com obesidade, uma deficiência de atividade física (inatividade física), uma idade mais avançada, uma história familiar de diabetes melito, um dano no metabolismo de glicose e tendo uma história familiar de diabetes melito e outros mais. T2DM também é uma doença progressiva. De acordo com os dados estatísticos em 2000, a Organização Mundial de Saúde calculou que há cerca de 171 milhões de pessoas no mundo que sofrem muito de diabetes melito; em 2005, os Centros para Controle e Prevenção da Doença dos E.U.A. calcularam que há 20,8 milhões de americanos que sofrem de diabetes melito, que é cerca de 7 % da popuPetição 870190077534, de 12/08/2019, pág. 7/14

2/43 lação dos Estados ligados de América; em 2006, de acordo com a estatística da Federação Internacional de Diabetes, o número global dos pacientes que sofrem de diabetes melito é cerca de 246 milhões (cerca de 5,9 % da população global no total) e além disso 46% dos pacientes têm 40 a 59 anos de idade. Estudos mostraram que nesse sentido apresenta-se uma diferença muito importante sobre como responder à glicose entre pessoas saudáveis e os pacientes com T2DM. A resposta à hiperglicemia pós-prandial de pessoas saudáveis pertence à resposta inicial à insulina.

T2DM é caracterizado pela inibição da secreção da insulina e a disfunção de células β pancreáticas, resultando em uma deficiência de insulina e uma hiperglicemia (Ferrannini E. Insulin resistance versus insulin deficiency in non-insulin-dependent diabetes mellitus: problems and prospects. Endocr Rev. 1998, 19(4):477 - 490). Pacientes de T2DM tipicamente sofrem de uma hiperglicemia pós-prandial e em jejum (glicose em jejum >125 mg/dL), e o elevado açúcar sanguíneo é devido principalmente a que as células β pancreáticas não secretam bastante insulina para compensar a deficiência de insulina causada pela inibição de insulina no tecido circundante (Weyer C., Bogardus C., Mott DM., e outros The natural history of insulin secretory dysfunction and insulin resistance in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus. J. Clin. Invest. 1999, 104(6): 787-794).

O fator de risco principal de T2DM é obesidade, a qual é muito prejudicial à saúde humana. O sofrimento de risco de uma doença cardiovascular e uma morte anormal dos pacientes aumenta, entretanto T2DM frequentemente coexiste com outras doenças de alto risco tais como hipertensão, dislipidemia e obesidade; 60% dos pacientes de T2DM são acompanhados por complicações microvasculares, incluindo retinopatia e neuropatia, e também são acompanhados por morbidades cardiovasculares associadas com T2DM tais como a doença cardíaca coronária, infarto do miocárdio e choque e outros mais. Nos E.U.A., doença cardiovascular (CVD) é a causa principal que resulta em morbidez e morte, e T2DM é o fator de risco principal que causa complicações macrovasculares tais como uma aterosclerose, infarto do miocárdio, choque e doenças vasculares periféricas. O risco

3/43 de morte causado por doenças cardíacas e um choque de um adulto com diabetes é 2 a 4 vezes mais alto que o de uma pessoa não diabética. Além disso, quase 65% das pessoas com diabetes morrem de doenças do coração e do choque.

Além do dano físico e fisiológico aos pacientes, T2DM causa grande ônus econômico na sociedade. De acordo com a estatística, o custo do tratamento de complicações associadas com diabetes é cerca de $ 22,9 bilhões, o custo total do tratamento de T2DM e complicações do mesmo é quase $ 57,1 bilhões, e o custo total não incluído no orçamento é mais de $ 8 bilhões todos os anos nos Estados ligados.

Fármacos para o tratamento de T2DM foram o foco, tais como os fármacos hipoglicêmicos orais iniciais da classe de sulfonila e classe de biguanida e o recente sensibilizador à insulina e inibidores de a-glicosidase, o desenvolvimento de insulinas animais e insulinas humanas e uma variedade de novas técnicas de formulações, a pesquisa de novos mecanismos de tratamento com fármaco simplesmente aumentando a insulina de novas maneiras agindo sobre a produção de insulina. O ganho de peso é a reação colateral comum após a administração de agentes hipoglicêmicos orais ou por injeção, que podem reduzir a complacência, e podem aumentar o risco de desenvolver doença cardiovascular. Por esse motivo, o desenvolvimento de novos tipos de fármacos para o tratamento de T2DM que tenham alta segurança, boa complacência do paciente e reação colateral reduzida tornase o tema quente das instituições de pesquisa e companhias farmacêuticas contra o diabetes.

Já há 100 anos atrás, Moore sugeriu que o duodeno pudesse secretar um estimulante químico que pudesse estimular a secreção no pâncreas e tentou injetar extrato de intestino para tratar diabetes. Subsequentemente foi descoberto que fatores humorais derivados da secreção intestinal podem realçar a função do endócrino do pâncreas, e cerca de 50% da secreção de insulina induzida por glicose intravenosa ou oral é derivada do estímulo de peptídeos produzidos pelo intestino. Por conseguinte Zunz e Labarre criaram o conceito de incretina. Dois tipos de incretinas foram iso

4/43 ladas até agora, isto é polipeptídeo insulinotrópico dependente de glicose (GIP) e peptídeo 1 semelhante ao glucagon (GLP-1). Tanto GIP quanto GLP-1 são secretados pelas células nervosas intestinais específicas quando o nutriente é absorvido, em que GIP é secretado pelo duodeno e células K proximais jejunais, GLP-1 é sintetizado em células L e principalmente existem no intestino delgado e cólon distais (Drucker DJ. Enhancing incretin action for the treatment of type 2 diabetes. Diabetes Care. 2003, 26(10): 29292940).

GLP-1 existe em duas formas bioativas, isto é amida de GLP-1 (7-37) e GLP-1 (7-36) no plasma, entre as quais apenas um aminoácido é diferente, e seus efeitos biológicos e meia-vida in vivo são os mesmos (Drucker DJ. Enhancing incretin action for the treatment of type 2 diabetes. Diabetes Care. 2003, 26(10):2929-2940).

GLP-1 normalmente referido é o nome comum de amida de GLP-1 (7-37) e GLP-1 (7-36). GIP e GLP-1 são degradados para formas inativas por dipeptidil peptidase-IV (DPP-IV) rapidamente depois de liberados no trato gastrointestinal, de forma que a meia-vida in vivo de GIP e GLP1 é muito curta (a meia-vida in vivo de GIP é cerca de 5 a 7 minutos, a meiavida in vivo de GLP-1 é cerca de 2 minutos) (Drucker DJ. Enhancing incretin action for the treatment of type 2 diabetes. Diabetes Care. 2003, 26(10):2929-2940). Pesquisas mostram que a maior parte do processo de degradação ocorre quando o GIP e GLP-1 entram nos vasos sanguíneos contendo DPP-IV, e uma pequena quantidade de GLP-1 e GIP que não foram degradados entrará no pâncreas e serão ligados com seus sítios de ligação para estimular células β a liberarem a insulina. Diferente do mecanismo de sulfonilureia para promover diretamente células β funcionais para liberarem insulina, a maior parte do efeito de incretina é dependente de glicose. Além disso, alguns testes in vitro em animais e seres humanos mostraram que GLP-1 também tem funções tais como supressão de células α e redução de hipersecreção de glucagon e assim por diante.

Embora os níveis plasmáticos de GIP em pacientes com T2DM sejam normais quando a função de incretina declina ou se perde significan

5/43 temente, os níveis de GLP-1 em pacientes com T2DM declinam, assim os fármacos baseados em GLP-1 contribuem mais para o tratamento de T2DM. Embora os níveis de ambas as amidas de GLP-1 (7-37) e GLP-1 (7-36) aumentem em vários minutos depois de uma refeição, o conteúdo de amida de GLP-1 (7-36) é maior, assim a secreção de GLP-1 podería ter sido grandemente aumentada pelo efeito duplo de endócrino e transmissão de sinal neural antes da comida digerida entrar no intestino delgado e cólon do fundo do trato digestivo. O nível plasmático de GLP-1 em estado de jejum é muito baixo (cerca de 5 a 10 pmol/L), e é aumentado rapidamente após a alimentação (até 15 a 50 pmol / L). Sob a dupla função de DPP-IV e depuração renal, o nível in vivo de GLP-1 em circulação é reduzido rapidamente, embora o trabalho de pesquisar se outras enzimas tais como endopeptidase neutra humana 24 · 11 e outras mais também desempenham um papel vital na inativação da atividade de GLP-1 esteja em desenvolvimento, porque o segundo resíduo de aminoácido de GLP-1 é uma alanina que é um bom substrato de DPP-IV e assim o GLP-1 é fácil de ser degradado em fragmentos de peptídeo inativos. Na realidade, o DPP-IV in vivo é a razão fundamental para a perda da atividade da incretina. Experimentos mostram que o nível de GLP-1 em camundongos, nos quais o gene de DPP-IV foi silenciado, é mais alto do que em camundongos normais significantemente, e a secreção de insulina também é aumentada. Justamente em razão do presente de DPPIV, o conteúdo in vivo do GLP-1 completo e biologicamente ativo é apenas 10 a 20% do conteúdo total de GLP-1 em plasma (Deacon CF, Nauck MA, Toft-Nielsen M, e outros Both subcutaneously and intravenously administered glucagon-like peptide 1 are rapidly degraded from the NH2-terminus in type 2-diabetic patients and in healthy subjects. Diabetes. 1995, 44(9): 1126— 1131).

GLP-1 e GIP desempenham seus respectivos papéis através da ligação a receptores acoplados à proteína G (GPCRs) que têm estruturas completamente diferentes. A maioria dos receptores de GIP é expressa pelas células β pancreáticas, e uma parte menor dos receptores de GIP é expressa pelo tecido adiposo e o sistema nervoso central. Em contraste, re

6/43 ceptores de GLP-1 são principalmente expressos nas células α e β pancreáticas e tecidos periféricos incluindo os sistemas nervosos centrais e periféricos, cérebro, rim, pulmão e trato gastrointestinal e outros mais. A ativação de duas incretinas em células β resultará no rápido aumento do nível de cAMP e cálcio intracelular nas células, desse modo conduzindo sua secreção à região extracelular de maneira dependente de glicose. A transmissão de sinal prolongada de receptores de incretina está associada com proteína cinase A, resultando na transcrição de gene, aumento da biossíntese de insulina e estimulação da proliferação de células β (Gallwitz B. Glucagon-like peptide-1-based therapies for the treatment of type 2 diabetes mellitus. Treat Endocrinol. 2005, 4(6):361-370). A ativação de receptor de GLP-1 e receptor de GIP também pode inibir a apoptose de células β pancreáticas de roedor e ser humano, entretanto aumenta sua sobrevivência (Li Y, Hansotia T, Yusta B, e outros Glucagon-like peptide-1 receptor signaling modulates beta cell apoptosis. J Biol Chem. 2003, 278(1): 471-478). Em consistência com a expressão de receptor de GLP-1, GLP-1 também pode inibir secreção de glucagon, esvaziamento gástrico e ingestão de alimento, e realça a degradação de glicose através do mecanismo neural. Será observado que, igual à outra reação de secreção de insulina, o papel de GLP-1 de controlar o nível de glicose é dependente de glucagon, enquanto o papel de glucagon de liberação contra-reguladora de glucagon causada pelo baixo açúcar sanguíneo foi totalmente mantido até mesmo no nível farmacológico de GLP-1.

O papel fisiológico importante de GIP e GLP-1 endógeno em homeostasia de glicose foi estudado em profundidade através do emprego de antagonistas de receptor ou camundongos nocaute de gene. O antagonismo agudo de GLP-1 ou GIP reduz a secreção de insulina in vivo de roedor e aumenta o conteúdo de glicose plasmática. Similarmente, os camundongos mutantes, nos quais o receptor de GIP ou GLP-1 está inativado, também experimentaram secreção de insulina estimulada por glicose deficiente e tolerância à glicose prejudicada. GLP-1 também tem uma função de regulação da glicose sanguínea em jejum, porque os antagonistas agudos ou o dano no gene de GLP-1 causam o aumento do nível de glicose em je

7/43 jum de roedores; ao mesmo tempo, GLP-1 é a base do controle de glicose em corpos humanos e estudos sobre o antagonista de Exendina (9-39) mostraram que a destruição da função de GLP-1 resulta em secreção de insulina estimulada por glicose deficiente, taxa de depuração de glicose reduzida, níveis de glucagon aumentados e esvaziamento gástrico acelerado. Os papéis fisiológicos de GLP-1 (Deacon CF. Therapeutic strategies based on glucagon-like peptide 1. Diabetes. 2004, 53(9):2181-2189) compreendem: (1) ajudar a organizar a absorção de glicose, mediar a secreção de insulina dependente de glicose; (2) inibir a secreção de glucagon pós-prandial, reduzindo a liberação de glicose hepática; (3) regular o esvaziamento gástrico, prevenindo a circulação excessiva de glicose quando o alimento é absorvido no intestino; (4) inibir a ingestão de alimento (por exemplo apetite). Estudos com animais também mostraram um papel fisiológico de GLP-1 estabilizando o número de células β pancreáticas in vivo.

Devido aos bons efeitos de GLP-1 e GIP no controle do açúcar sanguíneo e muitos outros aspectos, especialmente suas características de não produzir hipoglicemia e retardar o esvaziamento gástrico para controlar peso, atraem o interesse de muitos cientistas. Pessoas tentam pesquisar fármacos com base em GLP-1 e GIP para o tratamento de T2DM. Sabe-se bem que pacientes de T2DM não têm ou perdem o efeito de incretina, em que uma razão é que o efeito de incretina de GIP in vivo no paciente de T2DM é significantemente reduzido; entretanto, o nível de GLP-1 in vivo em paciente de T2DM é muito baixo, e o nível de GLP-1 causado por estímulos dietéticos é significantemente reduzido (Toft-Nielsen MB, Damholt MB, Madsbad S, e outros Determinants of the impaired secretion of glucagon-like peptide-1 in type 2 diabetic patients. J Clin Endocrinol Metab. 2001, 86(8):3717-3723). Em razão do papel de GLP-1 in vivo em pacientes com T2DM ter ficado parcialmente reservado, o sinergista de GLP-1 é uma das direções de pesquisa dos fármacos projetados para realçar o efeito de incretina em pacientes de T2DM.

O análogo de GLP-1, tão idêntico ao GLP ou GIP endógeno, pode inibir a liberação de glucagon in vivo e estimular secreção de insulina in

8/43 vivo de maneira dependente de glicose. Além disso, análogos de GLP-1 têm um papel nos seguintes sintomas: (1) baixo açúcar sanguíneo. Diferentes de outros fármacos secretagogos, os análogos de GLP-1 promovem a secreção de insulina in vivo de uma maneira dependente de glicose e por conseguinte seu papel com relação à redução da glicose sanguínea exibe uma autolimitação, que geralmente não causa hipoglicemia em grandes doses. Apesar de ter sido relatado na literatura que GLP-1 pode reduzir o açúcar sanguíneo para um nível abaixo do nível normal, este efeito é transitório e é considerado como um resultado natural de GLP-1 que promove a secreção de insulina. Porque a inativação de insulina ocupa algum tempo, quando o efeito de estimulação de GLP-1 é reduzido devido à redução do nível de açúcar sanguíneo, enquanto não houver nova secreção de insulina, a insulina original ainda atua. Em uma palavra, GLP-1 pode reduzir temporariamente o açúcar sanguíneo para um nível abaixo do nível normal mas não causa hipoglicemia séria e persistente; o papel sobre a saciedade e peso corporal. Além de reduzir diretamente a glicose sanguínea, GLP-1 também pode reduzir a quantidade de ingestão de alimento, que foi verificada em roedores e seres humanos. Por conseguinte o nível de glicose sanguínea pode ser controlado por redução do peso corporal indiretamente. GLP-1 também tem o papel potencial de inibir a secreção de gastrina e ácido gástrico estimulados pela alimentação, e estas funções mostram que GLP-1 também pode ter um papel na prevenção de úlcera péptica. Os mecanismos de ação de GLP-1 fazem ele próprio tornar-se não apenas um fármaco ideal para o tratamento de pacientes com diabetes do tipo 2, mas também o fármaco para o tratamento de pacientes com diabetes por obesidade. GLP-1 pode realçar a saciedade dos pacientes, reduzir a ingestão de alimento e manter o peso corporal ou perder peso; (3) manutenção da saúde de células β. Vários estudos sugerem que GLP-1 pode impedir a conversão de tolerância à glicose prejudicada para diabetes, e algumas literaturas informam que classe de compostos com GLP-1 têm efeito direto sobre o crescimento e proliferação de células β pancreáticas de animais experimentais, e foi constatado por alguns experimentos que GLP-1 pode promover a diferenciação de células

9/43 tronco pancreáticas para células β funcionais. Estes resultados sugerem que GLP-1 tem a função de proteger a ilhota pancreática e retardar a progressão do diabetes, e pode manter as morfologias e funções das células β, enquanto reduz a apoptose de células β; (4) o efeito sobre a hiperglicemia pós-prandial. Este fenômeno representa uma nova direção para o tratamento de T2DM. Desde que alguns fármacos orais e insulinas exógenas não podem inibir ou reduzir a secreção exorbitante de glucagon em pacientes com T2DM, análogos de GLP-1 podem afetar a hipersecreção de glucagon por meio da inibição direta da liberação de glucagon ou inibição parácrina de glucagon originada da promoção da secreção de insulina. A hiperglicemia pós-prandial pode ser reduzida eficazmente por meio destes dois mecanismos; entretanto a manutenção da função de células β também pode desempenhar um papel no controle da hiperglicemia pós-prandial de longa duração.

Entretanto análogos de GLP-1 são administrados por meio de injeção subcutânea, que não precisa calcular a quantidade de carboidratos para estimar a dosagem ótima de fármaco, e não precisa automonitorar a glicose sanguínea, seguindo-se que estes tipos de fármacos são mais fáceis de ser empregados do que a insulina.

Uma variedade de efeitos de GLP-1 natural foi confirmada, os quais trazem nova esperança para o tratamento de T2DM, entretanto, o GLP-1 humano natural é muito instável e pode ser degradado por dipeptidil peptidase IV (DPP-IV) e sua meia-vida é somente 1 ~ 2 minutos. Ao empregar GLP-1 natural para reduzir o açúcar sanguíneo, a infusão intravenosa contínua ou injeção subcutânea contínua é necessária, originando a má viabilidade clínica. Em face desta situação, os pesquisadores continuam a explorar o método para estender o tempo de ação de GLP-1. Por conseguinte, o desenvolvimento de análogos de GLP-1 de longa ação ou derivados dos mesmos torna-se uma área importante de interesse no campo farmacêutico.

Exenatida é uma Exendina-4 sintética que é desenvolvida pela Eli Lilly Company e Amylin Company com o nome comercial Byetta®. Exenatida foi aprovado para o tratamento de T2DM por FDA e EMEA. Ele tem

10/43

50% de homologia com GLP-1 mamífero em sequência e tem um sítio de afinidade similar do receptor com GLP-1 (Drucker DJ, Nauck MA. The incretin system: glucagon-like peptide-1 receptor agonists and dipeptidyl peptidase-4 inhibitors in type 2 diabetes. Lancet. 2006, 368(9548):1696-1705), e é codificado pelo gene específico de lagarto; comparado com GLP-1, a posição 2 de Alanina em GLP-1 é substituída com uma glicina em Exenatida, que inibe eficazmente a enzimólise da enzima de DPP-IV, e sua meia-vida in vivo é cerca de 60 a 90 minutos (Kolterman OG, Kim DD, Shen L, e outros Pharmacokinetics, pharmacodynamics, and safety of exenatide in patients with type 2 diabetes melllitus. Am Health Syst Pharm. 2005, 62(2): 173-181), a concentração in vivo de Exenatida depois de uma única injeção subcutânea é aumentada persistentemente e pode chegar à concentração máxima de plasma depois de 2 horas mais ou menos, que pode ser mantida durante 4 a 6 horas (Nielsen LL, Baron AD. Pharmacology of exenatide (synthetic exendin-4) for the treatment of type 2 diabetes. Curr Opin Investig Drugs. 2003, 4(4):401-05). Deve ser observado que o metabolismo de Exenatida não ocorre no fígado, mas é degradado principalmente por proteína protease depois de filtrado por glomérulos renais.

Exenatida tem atividades especiais reguladoras de glicose, incluindo realce da secreção de insulina dependente de glicose, inibição dependente de glicose da secreção de glucagon excessiva indevida, redução do esvaziamento gástrico e redução da ingestão de alimento e outros mais. Estudos in vitro e in vivo nos modelos de diabetes constataram que Exenatida também tem os efeitos de armazenar a secreção de insulina de primeira etapa (primeira fase), promover a proliferação de células β e promover a regeneração de insulina a partir de sua célula precursora.

A fim de obter-se melhor controle da glicose sanguínea, é necessária uma injeção duas vezes por dia de Exenatida, o que dá aos pacientes uma grande inconveniência. Além disso, Exenatida também causa uma náusea branda à moderada (cerca de 40 % de pacientes terão esta reação), diarréia e vomitação (menos de 15 % de pacientes têm ambas as reações); cerca de 50% de pacientes tratados com Exenatida podem gerar anticorpos,

11/43 embora estes anticorpos não afetem a eficácia ou conduzam a outros efeitos clínicos. Recentemente constatou-se que em seis pacientes ocorreu hemorragia ou sintomas de pancreatite necrosante depois de tomarem Byetta.

CJC-1131 é um análogo de GLP-1 com resistência à peptidase desenvolvida por ConjuChem Biotechnologies Inc., em que Ala na posição 2 de GLP-1 é substituído com D-Ala a fim de realçar a capacidade de resistir à enzimólise de DPP-IV, e cuja estrutura contém um ligador reativo ativo que pode ligar-se à albumina sérica de maneira covalente (não reversível) (Kim JG, Baggio LL, Bridon DP, e outros Development and characterization of a glucagon-like peptide-1 albumin conjugate: the ability to activate the glucagon-like peptide 1 receptor in vivo. Diabetes 2003, 52(3):751-759), e o complexo de GLP-1-albumina sérica retém a atividade de GLP-1, enquanto aumenta a estabilidade para a enzimólise de DPP-IV, estende a duração de ação in vivo, e a meia-vida em plasma do mesmo é cerca de 20 dias.

Um estudo constatou que o Ki aproximado era 12 nM (o Ki de GLP-1 é 5,2 nM) quando o complexo de CJC-1131-albumina sérica é ligado à célula de ovário de hamster chinês transfectada com receptor de GLP-1 pancreático humano recombinante; entretanto o EC50 do complexo que ativa cAMP é 11 a 13 nM, em que o EC50 é similar ao de GLP-1. Literaturas existentes mostram que esta molécula de ligação pode reduzir o nível de glicose sanguínea pós-prandial dos camundongos cujo açúcar sanguíneo é normal ou alto, e testes mostram que esta atividade de CJC-1131 age sobre um certo receptor funcional de GLP-1, entretanto em camundongos CJC1131 também tem um efeito sobre a redução do esvaziamento gástrico e inibição da ingestão de alimento e outros mais.

Parte do teste clínico de Fase II de CJC-1131 foi concluída. Em setembro de 2005, ConjuChem concluiu que CJC-1131 pode não ser adequado para regimes de dosagem crônicos depois de análise dos resultados de teste existentes, e suspendeu o estudo clínico de CJC-1131. O teste clínico de CJC-1131 ainda não foi reiniciado.

Albugon (albumina-GLP-1) é um fármaco de longa ação para o tratamento de T2DM desenvolvido por GlaxoSmithKline autorizado por Hu

12/43 man Genome Sciences Inc., o qual é uma proteína de fusão de GLP-1 (com mutações que aumentam a resistência à DDP-IV) e albumina. Sua meiavida em macacos é 3 dias. A idéia básica do desenvolvimento do mesmo é juntar o GLP-1 recombinante e albumina sérica para formar um complexo; desse modo sua meia-vida in vivo é significantemente aumentada. A administração de Albugon reduz eficazmente o nível de glicose sanguínea de camundongos, aumenta a secreção de insulina, reduz o esvaziamento gástrico e reduz a ingestão de alimento etc. (Baggio LL, Huang Q, Brown TJ, e outros A Recombinant Human Glucagon-Like Peptide (GLP)-1-Albumin Protein (Albugon) Mimics Peptidergic Activation of GLP-1 Receptor-Dependent Pathways Coupled With Satiety, Gastrointestinal Motility, and Glucose Homeostasis. Diabetes 2004, 53(9):2492-2500). Atualmente Albugon está em teste clínico de fase III.

WO9808871 descreve um derivado de GLP-1 que é obtido pela modificação em GLP-1 (7-37) com ácido graxo e a meia-vida in vivo de GLP1 é realçada significantemente. WO9943705 descreve um derivado de GLP1 que é quimicamente modificado no terminal de N, mas algumas literaturas relatam que a modificação dos aminoácidos no terminal de N reduz significantemente a atividade do derivado de GLP-1 inteiro (J. Med. Chem. 2000, 43, 1664 1669). Além disso, CN200680006362, CN200680006474, W02007113205, CN200480004658, CN200810152147 e W02006097538 etc também descrevem uma série de análogos de GLP-1 ou derivados dos mesmos produzidos por modificação química ou substituição de aminoácidos, em que o mais representativo é liraglutida desenvolvido por Novo Nordisk, cujo teste clínico de fase III foi concluído. Liraglutida é um derivado de GLP-1 cuja estrutura contém um análogo de GLP-1 cuja sequência é 97% homóloga com GLP-1 humano, e este análogo de GLP-1 é ligado com ácido palmítico covalentemente para formar Liraglutida, em que o ácido palmítico da estrutura de Liraglutida é ligado à albumina sérica não covalentemente, e estas características estruturais determinam que ele pode ser liberado lentamente do local da injeção sem mudança da atividade de GLP-1 e a meiavida in vivo é estendida; enquanto isso o ácido palmítico na estrutura forma

13/43 um certo impedimento estérico para impedir a degradação por DPP-IV e para reduzir a depuração renal. Por causa das características descritas acima, a meia-vida de Liraglutida no corpo humano administrado por meio de injeção subcutânea é cerca de 10 a 14 horas, em teoria, ele pode ser administrado uma vez por dia e a dose diária é 0,6 a 1,8 mg. Em 23 de abril de 2009, Novo Nordisk anunciou que o Comitê para Produtos Medicinais para Uso Humano (CHMP) subordinado à EMEA forneceu uma avaliação positiva sobre Liraglutida e recomendou a aprovação de sua inscrição. Novo Nordisk espera que a Comissão Européia aprove seu pedido de inscrição dentro de dois meses.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção pretende fornecer uma série de derivados de análogo de GLP-1 que é muito mais ativa e tem uma meia-vida in vivo mais longa. O derivado do análogo de GLP-1 fornecido nesta invenção tem a mesma função que o GLP-1 humano e tem uma meia-vida in vivo mais longa comparado com GLP-1 humano.

A presente invenção também pretende fornecer uma composição farmacêutica que compreende os referidos derivados do análogo de GLP-1 ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos, para emprego no tratamento de diabetes melito não dependente de insulina, diabetes dependente de insulina e obesidade.

Os objetivos da presente invenção são alcançados pelas seguintes soluções técnicas. A presente invenção fornece uma série de derivados de análogo de GLP-1 que tem sequência de aminoácidos de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos:

X1 -X2-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Ser-X12-X13-X14-Glu-X16-X17Ala-X19-X20-X21 -Phe-lle-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30-X31 -X32-X33X34-X35-X36-X37-X38-X39-Lys (l) em que os referidos derivados do análogo de GLP-1 contêm um substituinte lipofílico de fórmula R1(CH2)n-CO-, em que R1 é selecionado de CH3- e HOOC-, n é um número inteiro selecionado de 8 a 25, X1, X2, X10, X12,

14/43

X13, X14, X16, X17, X19, X20, X21, X24, X27, X28, X29, X30, X31, X32, X33, X34, X35, X36, X37, X38 e X39 são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural ou não natural ou os segmentos de peptídeo consistindo em qualquer aminoácido natural ou não natural.

Os referidos derivados de análogo de GLP-1 referem-se a um novo peptídeo GLP-1 obtido pela substituição parcial de aminoácido ou a extensão no terminal de C do peptídeo GLP-1 humano (7-37) que serve como um precursor, compreendendo amida de GLP-1 (7-36) e GLP-1 (7-37), que tem mesma função que o GLP-1 humano.

Os referidos derivados remetem a fazer modificação química para resíduos de aminoácidos do análogo de GLP-1 empregando-se substituintes lipofílicos, em que uma modificação típica é formar uma amida ou éster, de preferência, formar uma amida.

Em uma modalidade preferida da invenção, o substituinte lipofílico de fórmula R1(CH2)n-CO- e o grupo amino dos resíduos de aminoácidos do análogo de GLP-1 são ligados por uma ligação de amida, em que R1 é selecionado de CH3- e HOOC-, e n é um número inteiro selecionado de 8 a 25.

Em outra modalidade preferida da invenção, o substituinte lipofílico de fórmula R1(CH2)n-CO- e o grupo amino ε do Lys no terminal de C do análogo de GLP-1 são ligados por uma ligação de amida, em que R1 é selecionado de CH3- e HOOC-, e n é um número inteiro selecionado de 8 a 25.

Contudo em outra modalidade preferida da invenção, o substituinte lipofílico de fórmula R1(CH2)n-CO- e o grupo amino α do Lys no terminal de C do análogo de GLP-1 são ligados por uma ligação de amida, em que R1 é selecionado de CH3- e HOOC-, e n é um número inteiro selecionado de 8 a 25, e 14 é o mais preferido.

Em outra modalidade preferida da invenção, X1 na sequência de aminoácidos do análogo de GLP-1 é selecionado de L-His e D-His; X2 é selecionado de Ala, D-Ala, Gly, Vai, Leu, lie, Lys e Aib; X10 é selecionado de Vai e Leu; X12 é selecionado de Ser, Lys e Arg; X13 é selecionado de Tyr e Gin; X14 é selecionado de Leu e Met; X16 é selecionado de Gly, Glu e Aib;

15/43

X17 é selecionado de Gin, Glu, Lys e Arg; X19 é selecionado de Ala e Vai; X20 é selecionado de Lys, Glu e Arg; X21 é selecionado de Glu e Leu; X24 é selecionado de Vai e Lys; X27 é selecionado de Vai e Lys; X28 é selecionado de Lys, Glu, Asn e Arg; X29 é selecionado de Gly e Aib; X30 é selecionado de Arg, Gly e Lys; X31 é selecionado de Gly, Ala, Glu, Pro e Lys; X32 é selecionado de Lys e Ser; X33 é selecionado de Lys e Ser; X34 é selecionado de Gly, Ala e Sar; X35 é selecionado de Gly, Ala e Sar; X36 é selecionado de Pro e Gly; X37 é selecionado de Pro e Gly; X38 é selecionado de Pro e Gly; X39 é selecionado de Ser e Tyr.

Em uma modalidade mais preferida da presente invenção, a sequência de aminoácidos do análogo de GLP-1 é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 120.

Em outra modalidade preferida da presente invenção, o substituinte lipofílico de fórmula R1(CH2)n-CO- e o grupo amino dos resíduos de aminoácidos do análogo de GLP-1, do qual a sequência é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 120, são ligados por uma ligação de amida, em que R1 é selecionado de CH3- e HOOC-, e n é um número inteiro selecionado de 8 a 25.

Em uma modalidade mais preferida da presente invenção, o substituinte lipofílico de fórmula R1(CH2)n-CO- e o grupo amino ε do Lys de terminal de C do análogo de GLP-1, selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 120, são ligados por uma ligação de amida, em que R1 é selecionado de CH3- e HOOC-, e n é um número inteiro selecionado de 8 a 25.

Em uma modalidade mais preferida da presente invenção, o substituinte lipofílico de fórmula R1 (CH2)n-CO- e o grupo amino a do Lys de terminal de C do análogo de GLP-1, selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 120, são ligados por uma ligação de amida, em que R1 é selecionado de CH3- e HOOC-, e n é um número inteiro selecionado de 8 a 25, de preferência n é selecionado de 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 e 22, mais preferivelmente, n é 14.

Em uma modalidade mais preferida desta invenção, o substituin

16/43 te lipofílico de fórmula R1(CH2)n-CO- e o grupo amino a do Lys de terminal de C do análogo de GLP-1, selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 20, são ligados por uma ligação de amida, em que R1 é selecionado de CH3- e HOOC-, e n é um número inteiro selecionado de 8 a 25, de preferência n é selecionado de 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 e 22, mais preferivelmente, n é 14.

Em outra modalidade mais preferida desta invenção, o substituinte lipofílico de fórmula R1 (CH2)n-CO- e o amido α do Lys de terminal de C do análogo de GLP-1, selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 8, são ligados por uma ligação de amida, em que R1 é CH3, e n é 14.

Os derivados de análogos de GLP-1 fornecidos nesta invenção são parte dos compostos anfotéricos e a pessoa versada na técnica pode convertê-los em sais empregando-se compostos ácidos ou alcalinos com tecnologias conhecidas, em que ácidos normalmente empregados para a formação de sais de adição de ácido são: ácido hidroclórico, ácido hidrobrômico, ácido hidriódico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido ptoluenossulfônico, ácido metanossulfônico, ácido oxálico, ácido sulfônico de p-bromofenila, ácido carbônico, ácido sucínico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido acético; os sais incluem sulfato, pirossulfato, trifluoroacetato, sulfito, bissulfito, fosfato, bifosfato, fosfato di-hídrico, metafosfato, pirofosfato, cloridrato, brometo, iodeto, acetato, propionato, octanoatos, acrilato, formiato, ácido isobutírico, hexanoato, enantatos, propiolato, oxalato, malonato, sucinato, suberato, fumarato, maleato, 1,4-butinodioato, 1,6-hexinadioato, benzoato, cloro-benzoato, metil-benzoato, dinitro-benzoato, hidroxil-benzoato, metóxi-benzoato, fenilacetato, fenpropionato, fenilbutirato, citrato, lactato, □hidroxibutirato, glicolato, tartarato, metanossulfonato, propanossulfonato, 1naftol-sulfonato, 2-naftol-sulfonato, mandelato e outros mais, de preferência trifluoro-acetato. Substâncias alcalinas também podem ser se transformadas em sais com derivados de análogos de GLP-1, em que as substâncias alcalinas incluem amônio, hidróxidos de metais de álcali ou metal alcalino terroso, e carbonato, bicarbonato, hidróxido tipicamente de sódio, hidróxido

17/43 de potássio, hidróxido de amônio, carbonato de sódio, carbonato de potássio e outros mais.

As composições farmacêuticas contendo derivados de GLP-1 de acordo com a invenção podem ser empregadas para tratar pacientes que precisam deste tratamento por meio de administração parenteral. A administração parenteral pode ser selecionada de injeções subcutâneas, intramusculares ou intravenosas. Os derivados de GLP-1 da invenção também podem ser administrados por meio de rotinas transdérmicas, tais como administração por meio de emplastro (de preferência emplastro de iontoforese) e administração pela mucosa.

As composições farmacêuticas que contêm os derivados de GLP-1 da invenção podem ser preparadas por técnicas comuns na arte da indústria farmacêutica. Estas técnicas incluem adequada dissolução e misturação dos componentes para se obter as composições finais desejadas. Por exemplo, os derivados de GLP-1 são dissolvidos em uma certa quantidade de água, em que o volume de água é ligeiramente menor que o volume final da composição obtida. Os agentes isotônicos, conservantes, tensoativos e tampões são adicionados de acordo com a necessidade, em que os referidos agentes isotônicos são cloreto de sódio, manitol, glicerol, propileno glicol, açúcar ou alditol. Os referidos conservantes são fenol, ortocresol, para-cresol, meta-cresol, éster de metilparaidroxibenzoato, álcool de benzila. Os referidos agentes de tamponamento adequados são acetato de sódio, carbonato de sódio, glicina, histidina, lisina, fosfato de diidrogênio de sódio, fosfato de hidrogênio de dissódio, fosfato de sódio. Os referidos tensoativos são Poloxamer, Poloxamer -188, Poloxamer-407, Tween 80 e Tween-20. Se necessário, as soluções aquosas de ácidos tais como ácido hidroclórico ou álcali tais como solução de hidróxido de sódio são adicionadas para ajustar os valores do pH das soluções, e finalmente o volume de solução é ajustado pela adição de água para se obter a concentração exigida. Além dos referidos componentes, as composições farmacêuticas da invenção também incluem aminoácidos bastante básicos ou outros reagentes alcalinos que têm a mesma função de diminuir os agregados formados pela composição du

18/43 rente o armazenamento, tais como lisina, histidina, arginina, imidazol durante o armazenamento.

Os derivados dos análogos de GLP-1 da invenção são sintetizados manualmente, em que a resina é resina de HMPA-AM, o grupo amino α dos derivados de aminoácido é protegido pelo Fmoc (carbonila de formila de fluoreno), o tiol de cadeia lateral de cisteína, o amido de cadeia lateral de glutamina, o imidazol de cadeia lateral de histidina são protegidos por Trt (trifenilmetila), a guanidila de cadeia lateral de arginina é protegida por Pbf (2,2,4,6,7-pentametil-diidrobenzofuran-5-sulfonila), a indolila de cadeia lateral de triptofano e o grupo amino de cadeia lateral de lisina são protegidos por Boc (terc-Butoxicarbonila), a hidroxila de cadeia lateral de treonina, o fenilol de cadeia lateral de tirosina, a hidroxila de cadeia lateral de serina são protegidos por tBu (terc-butila). A carboxila de aminoácidos de terminal de C da única cadeia de peptídeo dos derivados de peptídeo miméticos de eritropoetina que serão sintetizados é conectada com uma resina altamente molecular insolúvel (resina de amida Rink) através de ligações covalentes, e em seguida, os aminoácidos ligados a um veículo de fase sólida agem como componentes de amino, o grupo de proteção de amino é removido por solução de Hexaidropiridina / DMF a 20%, e em seguida reage com derivados de aminoácido excessivos para ligar uma cadeia de peptídeo longa. A operação (Condensação -> lavagem —► desproteção -> lavagem —> próximo ciclo de condensação) é repetida para se obter o comprimento de cadeia de peptídeo desejado. Finalmente, a cadeia de peptídeo é clivada das resinas empregando-se mistura de TFA: água: 1,2-ditioglicol: triisopropilsilano (92,5:2,5:2,5:2,5), para se obter os derivados crus de análogos de GLP-1 através de precipitação em um éter. Os monômeros de peptídeo crus são purificados por meio do emprego da coluna de fase reversa C18, e desse modo obtendo-se os derivados desejados de análogos de GLP-1. O método de teste de ninidrina foi empregado para monitorar as etapas de condensação e desproteção. Isto é, quando há aminos livres na cadeia de peptídeo da resina, o reagente de ninidrina ficará azul e nenhuma cor será mostrada quando não houver nenhum amino livre (o reagente de Ninidrina sozinho é

19/43 amarelo). Então, depois que a reação de condensação estiver concluída, se ela ficar amarela através de teste de ninidrina (cor do reagente de Ninidrina de per si), então isto sugere que a etapa de acoplamento está concluída e a operação de desproteção antes do próximo acoplamento de aminoácido pode ser executada; se o teste apresentar azul, isto sugere que ainda há alguns aminos livres nas cadeias de peptídeo, e é necessário repetir novamente a etapa de acoplamento ou mudar o agente de condensação existente até as resinas de peptídeo ficarem amarelas através de teste de ninidrina. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Para descrever a presente invenção com mais detalhes, os exemplos seguintes são fornecidos. Entretanto, a presente invenção não deve ser interpretada como limitada às modalidades apresentadas aqui. Exemplo 1. O método para síntese de fase sólida de HS-20001

1. Preparação de Resina Fmoc-Lys (Mtt)-HMP-AM (1) Secagem e dilatação de resina de HMP-AM g (30 mmol) de resina de HMP-AM (0,6 mmol/g) secada durante 24 horas a vácuo são colocados em um frasco de borbulhamento de 2 L, as resinas são dilatadas com 500 mL de Ν,Ν-dimetilformamida (DMF) durante 30 minutos, o DMF é retirado, as resinas são lavadas com DMF durante 1 minuto, a etapa de lavagem é repetida duas vezes.

(2) Preparação de Resina Fmoc-Lys (Mtt)-HMP-AM

Φ Acoplamento de Fmoc-Lys (Mtt)-OH com resina de HMP-AM

As resinas são lavadas com 500 mL de DCM, e em seguida a etapa de lavagem é repetida duas vezes. 56,2 g (90 mmol) de Fmoc-Lys (Mtt)-OH e 11,4 g (90 mmol) de DIC são dissolvidos em 1L de DCM, então são adicionados na na resina de HMP-AM dilatada, em seguida 366 mg (3 mmol) de DMAP são adicionados para reagir durante 24 horas;

® Lavagem da resina

Depois da reação, a resina é lavada alternadamente com DMF e IPAduas vezes, lavada com DMF durante 3 vezes;

® Tamponamento de hidroxila

15,3 g (150 mmol) de anidrido acético e 19,4 g (150 mmol) de

20/43

DlEAsão dissolvidos em 1Lde DMF e são adicionados na resina para reagir durante 10 minutos.

® Lavagem da resina

A resina é lavada duas vezes com 1 L de MeOH/DMF a 50%, DCM/DMF a 50%, e em seguida lavado com DCM durante três vezes e com etanol desidratado durante três vezes sucessivamente. Depois de secada sob vácuo, a resina Fmoc-Lys (Mtt)-HMP-AM é obtida.

(3) Ensaios de carregamento de resina de Fmoc-Lys(Mtt)-HMP-AM

Precisamente 5 ~ 10 mg de resina são colocados em 1 mL de solução de Hexaidropiridina / DMF a 20%, agitados durante 20 minutos, em seguida 50 uL de sobrenadante são empregados com um pipeto e são diluídos em 2,5 ml de DMF;

Amostras brancas: 50 uL de Hexaidropiridina/DMF a 20% são empregados com um piopet e são diluídos em 2,5 ml de DMF;

Grau de substituição é calculado como segue:

Sub = (Ax51)/(7,8xm) em que A é o valor de absorção de UV a 301 nm; m é o peso da resina, a unidade é mg.

2. Secagem e dilatação da resina sintetizada de fase sólida g (20 mmol) de resina de Fmoc-Lys (Mtt)-HMPA-AM (0,4 mmol/g) secada a vácuo durante 24 horas são colocados em um frasco de borbulhamento de 2L, em seguida 500 ml de N, N-dimetilformamida (DMF) são adicionados para dilatar a resina durante 30 minutos, em seguida a solução de DMF é extraída.

3. Remoção do grupo de proteção de 4- metil trifenilmetila (Mtt) de resina de Fmoc-Lys (Mtt)-HMPA-AM

A resina é lavada com 200 ml de DCM duas vezes, em seguida 1200 mL de TFA / DCM a 1% (TFA é cerca de 8 vezes excessivo) são adicionados para remover grupo de proteção de Mtt durante 1 hora, a resina é lavada alternadamente com 200 mL de N, N-diisopropil etilamina a 5% (DIEA) / DMF e DMF durante três vezes, em seguida lavada com DMF durante 3 vezes;

21/43

4. Condensação de ácido palmítico mmol de ácido palmítico e 50 mmol de 3 - (dietoxifosforilóxi) -

1,2,3 - fentriazin -4 - cetona (DEPBT) são dissolvidos em 400 ml de DMF, em seguida 100 mmol de DIEA são adicionados e agitados durante 3 minutos a temperatura ambiente, a referida solução é adicionada à resina, reagida em banhos de água a 37°C durante 2 horas sob N2. Depois da reação, a solução de reação é extraída, a resina é lavada com DMF, álcool isopropílico (IPA) e DMF consecutivamente.

5. Remoção de grupo de proteção de 9 - Fmoc (fluorenilmetiloxicarbonil) de resina Fmoc-Lys (ácido N-e-palmítico)-HMPA-AM

200 mL de solução de piperidina/DMF a 20% são colocados em um frasco de borbulhamento enchido de resina Fmoc-Lys (Mtt)-HMPA-AM, reagido durante 5 minutos e em seguida é extraído, em seguida 200 mL de solução de piperidina/DMF a 20% são adicionados para reagir durante 20 minutos a temperatura ambiente. Depois da reação, a resina é lavada com 200 mL de DMF durante quatro vezes.

6. Síntese da fase sólida da parte de cadeia de peptídeo de HS-20001 (D Condensação de Fmoc-Ser (tBu)-OH mmol de Fmoc-Ser (tBu)-OH são dissolvidos em 125 mL de 1-hidroxibenzo triazol a 0,4M (HOBt) / DMF, em seguida 125 ml de N, N'diisopropil carbodiimida a 0,4M (DIC) / DCM são adicionados para ativar e reagir durante 10 minutos a temperatura ambiente; a referida solução é adicionada na resina, reagida sob proteção de nitrogênio a temperatura ambiente, e ninidrina é empregada detectar e controlar o grau da reação. Depois da reação, a solução de reação é removida; a resina é lavada com DMF, IPA e DMF sucessivamente.

® Extensão da cadeia de peptídeo

Peptídeo de resina HS-20001 é sintetizado de acordo com a sequência da cadeia de peptídeo de HS-20001 do terminal de amino (terminal N) para o terminal de carbóxi (terminal C) (His-(D)-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-ThrSer-Asp-Leu-Ser-Lys-GIn-Nle-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-lle-Glu-TrpLeu-Lys-Gln-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser), em que as

22/43 quantidades de aminoácidos e reagentes de condensação são as mesmas como as quantidades para Fmoc-Ser (tBu)-OH, aminoácidos protegidos são Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, FmocGln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, FmocGlu(OtBu)-OH, Fmoc-lle-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-ValOH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-D-AlaOH e Fmoc-His(Trt)-OH respectivamente, e reações de condensação e desproteção são repetidas.

® Pós-processamento de peptídeo de resina HS-20001

O referido peptídeo de resina HS-20001 obtido na etapa @ é lavado com DMF, IPA e DMF sucessivamente, lavado com éter absoluto duas vezes, em seguida secado sob vácuo, e o peptídeo de resina HS-20001 é obtido.

As resinas de peptídeo HS-20001 secadas reagiram com lisado fresco), de ácido trifluoroacético (TFA): triisopropilsilano (TIS): água = 95:2,5:2,5 (por volume e 10 mL totais de lisado por grama da resina seca) durante 4 horas a temperatura ambiente. A solução de reação é filtrada depois da reação, a resina é lavada duas vezes com TFA, o filtrado é coletado e combinado, e é concentrado em 1/3 do volume original por evaporação giratória, HS-20001 é precipitado e lavado com éter absoluto frio, depois de centrifugação e secagem a vácuo, HS-20001 cru branco é obtido.

® Preparação de HS-20001 com de cromatografia líquida de fase reversa g de HS-20001 cru são dissolvidos em uma certa quantidade de água, filtrados com 0,45 pm de filtro de membrana, em seguida purificados com cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (RPHPLC), em que a fase móvel é A TFA/H2O a 0,1%, B TFA / acetonitrilo a 0,1%, em que, a coluna é coluna Denali C-18 (diâmetro de partícula

8,3 pm, 5 x 30 cm), temperatura de coluna é 45 °C, detecção de comprimento de onda é 220 nm, taxa de fluxo é 120 mL/ minuto. Os picos do produto são coletados, concentrados sob vácuo para remover mais do acetonitrilo,

23/43 em seguida o produto de HS-20001 2,25 g são obtidos através de liofilização, do qual a pureza é 98,5%, a produção é 22,5%.

Exemplo 2. O método de síntese de fase sólida para HS-20002

1. Preparação de Resina Fmoc-Lys (Mtt)-HMP-AM Veja Exemplo 1.

2. Secagem e dilatação da resina sintetizada de fase sólida g (20 mmol) de resina Fmoc-Lys(Mtt)-HMPA-AM (0,4 mmol/g) secados durante 24 a vácuo são colocado em uma frasco de borbulhamento de 2 L, a resina é dilatada com 500 mL de DMF durante 30 minutos, em seguida a solução de DMF é extraída.

3. Remoção de grupo de proteção de Mtt de resina Fmoc-Lys (Mtt)-HMPAAM

A resina é lavada com 200 mL de DCM duas vezes, grupo de proteção de Mtt é removido por adição de 1200 mL de TFA/ DCM a 1% (TFA é cerca de 8 vezes excessivo) durante 1 hora, em seguida lavado com 200 mL DIEA/DMF a 5% e DMF alternadamente durante três vezes, em seguida lavado com DCM durante três vezes.

4. Condensação de ácido palmítico mmol de ácido palmítico e 50 mmol de DEPBT são dissolvidos em 400 mL de DMF, e em seguida 100 mmol de DIEA são adicionados por agitação para reagir durante 3 minutos a temperatura ambiente, a referida solução é adicionada à resina, reagida em banhos de água a 37°C sob N2 durante 2 horas. Depois da reação, a solução de reação é removida e a resina é lavada com DMF, álcool isopropílico (IPA) e DMF sucessivamente.

5. Remoção do grupo de proteção Fmoc de resina Fmoc-Lys (ácido Ν-εpalmítico)-HMPA-AM

200 ml de solução de Piperidina / DMF a 20% são colocados em uma frasco de borbulhamento enchido com resina Fmoc-Lys(Mtt)-HMPA-AM, extraídos depois de reagir durante 5 minutos, em seguida 200 ml de solução de Piperidina / DMF a 20% são adicionados para reagir durante 20 minutos a temperatura ambiente. Depois da conclusão da reação, a resina é lavada durante quatro vezes com 200 ml de DMF.

24/43

6. Método de síntese de fase sólida para a parte de cadeia de peptídeo de HS-20002

Φ Condensação de Fmoc-Ser (tBu)-OH mmol de Fmoc-Ser(tBu)-OH são dissolvidos em 125 mL de HOBt/DMF a 0,4M, em seguida 125 mL de DIC/DCM a 0,4M são adicionados para ativar e reagir durante 10 minutos a temperatura ambiente; a referida solução é colocada na resina e reagida sob N2 a temperatura ambiente, e teste de ninidrina é empregado para detectar e controlar o grau da reação. Depois da reação, a solução de reação é removida, e a resina é lavada com DMF, IPAe DMF sucessivamente.

® Extensão da cadeia de peptídeo

Peptídeo de resina HS-20002 é sintetizado de acordo com a sequência de cadeia de peptídeo de HS-20002 do N-amino (terminal N) para o terminal de carbóxi (terminal C) (His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-LeuSer-Lys-GIn-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-lle-Glu-Trp-Leu-Lys-AsnGly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser), em que as quantidades de aminoácidos e reagentes de condensação são assim como aquelas de Fmoc-Ser (tBu)-OH, aminoácidos protegidos são Fmoc-Ser(tBu)-OH, FmocPro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-lle-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Met-OH, FmocGln(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH e Fmoc-His(Trt)-OH respectivamente, e condensação e reações de desproteção são repetidas. ® Pós-processamento de peptídeo de resina HS-20002

O referido peptídeo de resina HS-20002 obtido na etapa ® é lavado com DMF, IPA e DMF sucessivamente, lavado duas vezes com éter absoluto, em seguida secado a vácuo, peptídeo de resina HS-20002 é obtido finalmente.

® Preparação de peptídeo cru HS-20002

A resina de peptídeo HS-20002 secada é reagida com lisado fresco de ácido trifluoroacético (TFA): triisopropilsilano (TIS): água: 1,2etaneditiol (EDT) = 94:1:2,5:2,5 (por volume e 10 mL totais de lisado por

25/43 grama da resina seca) durante 4 horas a temperatura ambiente. A solução de reação é filtrada depois da reação, a resina é lavada com TFA duas vezes, o filtrado é coletado e combinado, e é concentrado a 1/3 do volume original por evaporação giratória, HS-20002 é precipitado com éter absoluto frio, depois de centrifugação e secagem sob vácuo, HS-20002 cru branco é obtido.

® Preparação de HS-20002 com de cromatografia líquida de fase reversa g de HS-20002 cru são dissolvidos em uma certa quantidade de água, filtrados com 0,45 pm de filtro de membrana, em seguida purificados com cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (RPHPLC), em que fase móvel é A TFA/H2O a 0,1% é, B TFA / acetonitrilo a 0,1%, em que a coluna é coluna Denali C-18 (diâmetro de partícula 8,3 pm, 5 x 30 cm), temperatura de coluna é 45 °C, detecção de comprimento de onda é 220 nm, taxa de fluxo é 120 mL/ minuto. Os picos de produto são coletados, concentrados sob vácuo para remover mais do acetonitrilo, em seguida o produto de HS-20002 2,1 g são obtidos por liofilização, do qual a pureza é 98%, a produção é 20,5%.

Exemplo 3. O método de síntese de fase sólida para HS-20003

1. Preparação de Resina Fmoc-Lys (Mtt)-HMP-AM Veja Exemplo 1.

2. Secagem e dilatação da resina sintetizada de fase sólida g (20 mmol) de resina Fmoc-Lys (Mtt)-HMPA-AM (0,4 mmol/g) secadas durante 24 horas a vácuo são colocado em um frasco de borbulhamento de 2L, a resina é dilatada com 500 mL de DMF durante 30 minutos, em seguida solução de DMF é extraída.

3. Remoção de grupo de proteção Fmoc de resina Fmoc-Lys (Mtt)-HMPAAM

200 mL de solução de piperidina/DMF a 20% são adicionados em uma frasco de borbulhamento enchido com resina Fmoc-Lys (Mtt)HMPA-AM, a solução é extraída depois de 5 minutos, e em seguida 200 mL de solução de piperidina/DMF a 20% são adicionados e deixados para reagir durante outros 20 minutos a temperatura ambiente. Depois da reação, a

26/43 resina é lavada com 200 mL de DMF durante quatro vezes.

4. Condensação de Ácido Palmítico mmol de ácido de Palmítico e 50 mmol de DEPBT são dissolvidos em 400 mL de DMF, em seguida 100 mmol de DIEA são adicionados por agitação para reagir durante 3 minutos a temperatura ambiente, a referida solução é adicionada à resina, reagida em banhos de água a a 37°C sob N2 durante 2 horas. Depois da reação, a solução de reação é removida e a resina é lavada com DMF, álcool isopropílico (IPA) e DMF sucessivamente.

5. Remoção de grupo de proteção de Mtt de resina de ácido-Lys(Mtt)HMPA-AM palmítico

A resina é lavada com 200 mL de DCM duas vezes, grupo de proteção de Mtt é removido por adição de 1200 mL de TFA/ DCM a 1% (TFA é é cerca de 8 vezes excessivo) para reagir durante 1 hora. A resina é lavada com 200 mL de DIEA/DMF a 5% e DMF alternadamente durante três vezes, em seguida lavada com DCM durante três vezes.

6. Método de síntese de fase sólida para a parte de cadeia de peptídeo de HS-20003

Φ Condensação de Fmoc-Ser (tBu)-OH mmol de Fmoc-Ser (tBu)-OH e 50 mmol de DEPBT são dissolvidos em uma certa quantidade de DCM, em seguida 100 mmol de DIEA são adicionados para ativação durante 3 minutos a temperatura ambiente; a referida solução é adicionada à resina, reagida sob N2 a temperatura ambiente, e ninidrina é empregada para detectar e controlar o grau da reação. Depois da reação, a solução de reação é removida e a resina é lavada com DMF, IPAe DMF sucessivamente.

O Extensão da cadeia de peptídeo

Peptídeo de resina HS-20003 é sintetizado de acordo com a sequência de cadeia de peptídeo de HS-20003 do N-amino (terminal N) para o terminal de carbóxi (terminal C) (His-(D)-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-AspVal-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-ValArg-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser), em que as quantidades de aminoácidos e reagentes de condensação são assim como aquelas de

27/43

Fmoc-Ser (tBu)-OH, aminoácidos protegidos são Fmoc-Ser(tBu)-OH, FmocPro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-lle-OH, Fmoc-Phe-OH, FmocGlu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH respectivamente, e condensação e reações de desproteção são repetidas.

® Pós-processamento de peptídeo de resina HS-20003

O referido peptídeo de resina HS-20003 obtido na etapa (D é lavado com DMF, IPA e DMF sucessivamente, lavado com éter absoluto duas vezes, em seguida secado a vácuo e peptídeo de resina HS-20003 é obtido finalmente.

@ Preparação de peptídeo cru HS-20003

A resina de peptídeo HS-20003 secada é reagida com lisado fresco de ácido trifluoroacético (TFA): triisopropilsilano (TIS): água = 95:2,5:2,5 (através de volume e 10 mL total de lisado por grama da resina seca) durante 4 horas a temperatura ambiente. A solução de reação é filtrada depois da reação, a resina é lavada com TFA duas vezes, o filtrado é coletado e combinado, e é concentrado em 1/3 do volume original por evaporação giratória, HS-20003 é precipitado com éter frio sob agitação, depois de centrifugação e secagem a vácuo, HS-20003 cru branco é obtido finalmente. © Preparação de HS-20003 com cromatografia líquida de fase reversa g HS-20003 cru são dissolvidos em uma certa quantidade de ácido acético / água a 20% e agitados durante pelo menos 4 horas, em seguida filtrados com 0,45 pm de filtro de membrana, em seguida purificados com cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (RP-HPLC), em que fase móvel é ATFA/H2O a 0,1%, B TFA / acetonitrilo a 0,1%, em que a coluna é coluna Denali C-18 (diâmetro de partícula 8,3 pm, 5 x 30 cm), temperatura de coluna é 45 °C, detecção de comprimento de onda é 220 nm, taxa de fluxo é 120ml_/ minuto. Os picos de produto são coletados, concentrados com descompressão para remover mais do acetonitrilo, em seguida o produto de HS-20003 2,5g são obtidos por liofilização, do qual a pureza é 98,5%, a produção é 25%.

28/43

Exemplo 4. O método de síntese de fase sólida para HS-20004

1. Preparação de Resina Fmoc-Lys (Mtt)-HMP-AM Veja Exemplo 1.

2. Secagem e dilatação da resina sintetizada de fase sólida g (20 mmol) de resina Fmoc-Lys(Mtt)-HMPA-AM (0,4 mmol/g) secados durante 24 a vácuo são colocados em um frasco de borbulhamento de 2 L, 500 mL de DMF são adicionados para dilatar a resina durante 30 minutos, solução de DMF é extraída.

3. Remoção de grupo de proteção Fmoc de resina de Fmoc-Lys (Mtt)HMPA-AM

200 mL de solução de piperidina/DMF a 20% são adicionados em uma frasco de borbulhamento enchido com resina Fmoc-Lys (Mtt)HMPA-AM, e em seguida extraído depois de 5 minutos, e em seguida 200 mL de solução de piperidina/DMF a 20% são adicionados para reagir durante 20 minutos a temperatura ambiente. Depois da reação, a resina é lavada com 200 mL de DMF durante quatro vezes.

4. Condensação de ácido Palmítico mmol de ácido de palmítico e 50 mmol DEPBT são dissolvidos em 400 mL de DMF, e em seguida 100 mmol de DlEAsão adicionados por agitação durante 3 minutos a temperatura ambiente, a referida solução é adicionada à resina, reagida em banhos de água a 37°C sob N2 durante 2 horas. Depois da reação, a solução de reação é removida e a resina é lavada com DMF, álcool isopropílico (IPA) e DMF sucessivamente.

A resina é lavada com 200 mL de DCM duas vezes, grupo de proteção de Mtt é removido por adição de 1200 mL de TFA/ DCM a 1% (TFA é é cerca de 8 vezes excessivo) para reagir durante 1 hora, em seguida lavado com DIEA/DMF a 5% e DMF alternadamente durante três vezes, em seguida lavada com DCM durante três vezes.

6. O método de síntese de fase sólida para a parte de cadeia de peptídeo de HS-20004

29/43

Φ Condensação de Fmoc-Ser (tBu)-OH mmol de Fmoc-Ser(tBu)-OH e 50 mmol de DEPBT são dissolvidos em uma certa quantidade de DCM, em seguida 100 mmol de DIEA são adicionados para ativação durante 3 minutos a temperatura ambiente; a referida solução é adicionada à resina, reagida sob N2 a temperatura ambiente, e ninidrina é empregado para detectar e controlar os graus da reação. Depois da reação, a solução de reação é removida; a resina é lavada com DMF, IPAe DMF sucessivamente.

® Extensão da cadeia de peptídeo

Peptídeo de resina HS-20004 é sintetizado de acordo com a sequência da cadeia de peptídeo de HS-20004 do N-amino (terminal N) para o terminal de carbóxi (terminal C) (His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser - Asp-ValSer-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-ArgGly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser), em que as quantidades de aminoácidos e reagentes de condensação são assim como aqueles de Fmoc-Ser (tBu)-OH, aminoácidos protegidos são Fmoc-Ser(tBu)-OH, FmocPro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-lle-OH, Fmoc-Phe-OH, FmocGlu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Aib-OH e Fmoc-His(Trt)-OH respectivamente e as reações de condensação e desproteção são repetidas.

® Pós-processamento para peptídeo de resina HS-20004

O referido peptídeo de resina HS-20004 obtido na etapa ® é lavado com DMF, IPA e DMF sucessivamente, lavado com éter absoluto duas vezes, em seguida secado a vácuo, peptídeo de resina de HS-20004 é obtido finalmente.

® Preparação de peptídeo de HS-20004 cru

O peptídeo de resina HS-20004 secado é reagido com lisado fresco de ácido trifluoroacético (TFA): triisopropilsilano (TIS): água = 95:2,5:2,5 (através de volume e 10 ml_ total de lisado por grama da resina seca) durante 4 horas a temperatura ambiente. A solução de reação é filtrada depois da reação, a resina é lavada com TFA duas vezes, o filtrado é co

30/43 letado e combinado, e é concentrado em 1/3 do volume original por evaporação giratória, HS-20004 é precipitado com éter frio sob agitação, depois de centrifugação e secagem a vácuo, HS-20004 cru branco é obtido finalmente. ® Preparação de HS-20004 com cromatografia líquida de fase reversa g de HS-20002 cru são dissolvidos em uma certa quantidade de ácido acético / água a 20% e agitados durante pelo menos 4 horas, em seguida filtrados com 0,45 pm de filtro de membrana, em seguida purificados com cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (RP-HPLC), em que fase móvel é A TFA/H2O a 0,1%, B TFA / acetonitrilo a 0,1%, o gradiente é como segue: em que, a coluna é coluna Denali C-18 (diâmetro de partícula 8,3 pm, 5 x 30 cm), temperatura de coluna é 45 °C, detecção de comprimento de onda é 220 nm, taxa de fluxo é 120mL/ minuto. Os picos de produto são coletados, concentrados sob vácuo para remover mais de acetonitrilo, em seguida o produto de HS-20004 2,25 g são obtido por liofilização, do qual a pureza é 98,5%, a produção é 22,5%.

Exemplo 5. O método de síntese de fase sólida para HS-20005

O método de preparação de HS-20005 é assim como aquele descrito no exemplo 4, em que a diferença é que a sequência de aminoácidos é substituída com SEQ ID NO: 5, e 2,5 g de produto de HS-20005 é obtido, cuja a pureza é 98,5%, a produção é 25%.

Exemplo 6. O método de síntese de fase sólida para HS-20006

O método de preparação de HS-20006 é assim como aquele descrito no exemplo 4, em que a diferença é que a sequência de aminoácidos é substituída com SEQ ID NO: 6, e 2,25 g de produto de HS-20006 são obtidos, cuja a pureza é 98,5%, a produção é 22,5%.

Exemplo 7. O método de síntese de fase sólida para HS-20007

O método de preparação de HS-20007 é assim como aquele descrito no exemplo 4, em que a diferença é que a sequência de aminoácidos é substituída com SEQ ID NO: 7, e 2,1 g de produto de HS-20007 são obtidos, cuja a pureza é 98%, a produção é 20,5%.

Exemplo 8. O método de síntese de fase sólida para HS-20008

O método de preparação de HS-20008 é assim como aquele

31/43 descrito no exemplo 4, em que a diferença é que a sequência de aminoácidos é substituída com SEQ ID NO: 8, e 2,5 g produto de HS-20008 são obtidos, cuja a pureza é 98,5%, a produção é 25%.

Método de síntese de fase sólida de exemplo de referência para Liraglutida

1. Preparação de resina de Fmoc-Lys(Mtt)-HMP-AM (1) secagem e dilatação de resina HMP-AM g (30 mmol) de resina de HMP-AM (0,6 mmol/g) secados durante 24 horas a vácuo são colocado em um frasco de borbulhamento de 2 L, 500 mL de N, N-dimetilformamida (DMF) são adicionados para dilatar a resina durante 30 minutos, a solução de DMF é extraída, DMF é adicionado para lavar a resina durante 1 minuto, a etapa de lavagem é repetida duas vezes.

(2) Preparação de Resina de Fmoc-Lys(Mtt)-HMP-AM ©Acoplamento de resina Fmoc-Lys (Mtt)-OH e HMP-AM

A resina é lavada com 500 mL de DCM durante três vezes, 56,2 g (90 mmol) de Fmoc-Lys(Mtt)-OH e 11,4 g (90 mmol) de DIC são dissolvidos em 1L de DCM, em seguida adicionado na resina HMP-AM dilatada, em seguida 366 mg (3 mmol) de DMAP são adicionados para deixar reagir durante 24 horas;

® Lavagem da resina

® Tamponamento de hidroxila

15,3 g (150 mmol) de anidrido acético e 19,4 g (150 mmol) de DIEA são dissolvidos em 1L de DMF e adicionado à resina para reagir durante 10 minutos.

® Lavagem da resina

A resina é lavada com 1 L de MeOH/DMF a 50%, DCM/DMF a 50% duas vezes, lavada com DCM durante três vezes, lavada com etanol absoluto durante três vezes, em seguida secada sob vácuo para se obter a resina de Fmoc-Lys(Mtt)-HMP-AM.

(3) Ensaios de carregamento de resina de Fmoc-Lys(Mtt)-HMP-AM

32/43

Amostras brancas: 50 uL de Hexaidropiridina/DMF a 20% são levados com um pipeto e são diluídos em 2,5 ml de DMF;

Grau de substituição é calculado como segue:

Sub = (A x 51)/(7,8 χ m) em que A é o valor de absorção de UV a 301 nm; m é a quantidade da resina, a unidade é mg.

2. Secagem e dilatação da resina da síntese de fase sólida g (20 mmol) de resina Fmoc-Gly-HMP-AM (0,4 mmol/g) secados durante 24 horas a vácuo são colocados em um frasco de borbulhamento de 2 L, em seguida 500 ml de N, N-dimetilformamida (DMF) são adicionados para dilatar a resina durante 30 minutos, em seguida a solução de DMF é extraída.

3. O método de síntese de fase sólida da parte de cadeia de peptídeo de Liraglutida

Φ condensação de Fmoc-Arg(Pbf)-OH mmol de Fmoc-Arg(Pbf)-OH são dissolvidos em 125 mL de 1hidroxibenzotriazol a 0,4 M (HOBt) / DMF, em seguida 125 ml de Ν, N'diisopropilcarbodiimida a 0,4 M (DIC) / DCM são adicionados para ativar e reagir durante 10 minutos a temperatura ambiente; a referida solução é adicionada à resina, reagida sob N2 a temperatura ambiente, e teste de ninidrina é empregado para detectar e controlar os graus da reação. Depois da reação, a solução de reação é extraída; a resina é lavada com DMF, IPA e DMF sucessivamente.

® Extensão da cadeia de peptídeo

Peptídeo de precursor de Liraglutida é sintetizado de acordo com a sequência da cadeia de peptídeo de Liraglutida do N-amido (terminal N) para o terminal de carbóxi (terminal C) (His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-SerAsp -Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-GIn-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu

33/43

Val-Arg-Gly-Arg-Gly), em que as quantidades de aminoácidos e reagentes de condensação são assim como aquela de Fmoc-Arg(Pbf)-OH, aminoácidos protegidos são Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, FmocTrp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-lle-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)OH, Fmoc-Lys(Mtt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, FmocSer(tBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH respectivamente, e as reações de condensação e desproteção são repetidas.

® Remoção de grupo de proteção de Mtt do peptídeo de precursor de Liraglutida

A resina é lavada com 200 ml de DCM duas vezes, grupo de proteção de Mtt é duas vezes removido por adição de 1200 mL TFA / DCM a 1% (TFAé cerca de 8 vezes excessivo) para reagir durante 1 hora, a resina é lavada com 200 mLde N, N-diisopropiletilamina (DIEA) / DMF a 5% e DMF alternadamente durante três vezes, lavada durante 3 vezes com DMF;

® Modificação de peptídeo de precursor de Liraglutida com ácido de palmítico mmol de Fmoc-Glu-OtBu são dissolvidos em 125 mL de 1hidroxibenzo triazol (HOBt) / DMF a 0,4 M, em seguida 125 ml de N, N'diisopropilcarbodiimida (DIG) / DCM a 0,4 M é adicionado para ativar e reagir durante 10 minutos a temperatura ambiente; a referida solução é adicionada à resina, reagida sob N2 a temperatura ambiente, e ninidrina é empregada para detectar e controlar os graus da reação. Depois da reação, a solução de reação é extraída, a resina é lavada com DMF, IPAe DMF sucessivamente.

L de PIP/DMF a 20% é adicionado para remover grupo de proteção Fmoc durante 5 minutos, em seguida é extraído, em seguida é adicionado 1 L de PIP/DMF a 20% para remover grupo de proteção de Fmoc durante 20 minutos, em seguida é extraído, a resina é lavada com DMF durante quatro vezes;

mmol de ácido de palmítico e 50 mmol de 3 (dietoxifosforilóxi) -1,2,3 - fentriazina -4 - cetona (DEPBT) são dissolvido em

34/43

400 ml de DMF, em seguida 100 mmol de DlEAsão adicionados para reagir durante 3 minutos sob agitação a temperatura ambiente, a referida solução é adicionada à resina, reagida em banhos de água a 37°C sob N2 durante 2 horas. Depois da reação, a solução de reação é extraída, a resina é lavada com DMF, álcool isopropílico (IPA) e DMF sucessivamente.

4. Pós-processamento do peptídeo de resina de Liraglutida

O referido peptídeo de resina de Liraglutida obtido na etapa (2) é lavado com DMF, IPA e DMF sucessivamente, lavado por três vezes com DCM, lavado com éter absoluto duas vezes, em seguida secado a vácuo, finalmente o peptídeo de resina de Liraglutida é obtido.

5. Preparação de peptídeo cru de Liraglutida

A resina de peptídeo seca de Liraglutida é reagida com lisado fresco de ácido trifluoroacético (TFA): triisopropilsilano (TIS): água = 95:2,5:2,5 (por volume e 10 mL totais de lisado por grama da resina seca) durante 4 horas a temperatura ambiente. A solução de reação é filtrada depois da reação, a resina é lavada com TFA duas vezes, o filtrado é coletado e combinado, concentrado em 1/3 do volume original por evaporação giratória, Liraglutida é precipitada com éter absoluto frio, depois de centrifugação e secagem a vácuo, HS-20001 cru branco é obtido.

® Preparação de Liraglutida com cromatografia líquida de fase reversa g de Liraglutida cru são dissolvidos em uma certa quantidade de solução de NH4HCO3, filtrados com 0,45 pm de filtro de membrana, em seguida são purificado com cromatografia líquido de alto desempenho de fase reversa (RP-HPLC), em que fase móvel é A TFA/H2O a 0,1%, B TFA / acetonitrilo a 0,1%, em que a coluna é coluna Denali C-18 (diâmetro de partícula 8,3 pm, 5 x 30 cm), temperatura de coluna é 45 °C, detecção de comprimento de onda é 220 nm, taxa de fluxo é 120 mL/ minuto. Os picos de produto são coletados, concentrados com descompressão para remover mais de acetonitrilo, em seguida 2,25 g de produto de Liraglutida são obtidos por liofilização, cuja pureza é 98%, a produção é 12,5%.

Exemplo Experimental 1: Teste da atividade agonística dos compostos sobre o receptor de peptídeo 1 semelhante ao glucagon (GLP1R)

35/43

GLP1R é um receptor acoplado com proteína Gs, cuja ligação aos agonistas resultará no aumento de concentração de cAMP intracelular. No presente experimento, GLP1R e o plasmídeo de gene repórter de luciferase regulado por elementos de resposta à cAMP são co-transfectados em células de HEK293. Quando o composto liga-se ao receptor e ativa os receptores, a expressão da luciferase aumenta. O estado de ativação do composto para GLP1R pode ser conhecido testando-se a atividade da luciferase.

N° dos fármacos de teste:	Quantidade (mg)	DMSO (ul)	Concentração final (mM)
Liraglutida	2	53,31556	10
HS-20001	2	43,81871	10
HS-20002	2	43,91502	10
HS-20003	2	44,99387	10
HS-20004	2	44,8526	10
HS-20005	2	43,81871	10
HS-20006	2	43,91502	10
HS-20007	2	44,99387	10
HS-20008	2	44,8526	10

Procedimentos experimentais:

1. Células de HEK293 estavelmente transfectadas com GLP1R e plasmídeo de pCRE-Luc são implantadas em placa de 96 cavidades com a quantidade de 40000 células / cavidade /100 μΙ, e incubadas a 37°C durante 24 horas.

2. Os compostos ou fármacos positivos tendo um certo gradiente de concentração são adicionados (3 cavidades por concentração) e incubados a 37°C durante 5 horas. O controle negativo é o solvente DMSO.

3. 50 μΙ de meio de cultura são retirados de cada cavidade e 50 μΙ do substrato da luciferase são adicionados e em seguida turbilhonados durante 10 minutos.

4. 80 μΙ de solução de reação são retirados e transferidos para uma placa branca de 96 cavidades, em seguida detectados na leitora de mi

36/43 croplaca Invision (instrumento de medição de rotulação de enzima).

Os resultados experimentais: comparados com compostos positivos liraglutida, a atividade do composto HS-20001 da invenção é cerca de igual à dos compostos positivos, mas HS-20002—20008 apresentam atividade agonística muito superior.

' abela 1. Valores de EC50 da série de compostos:

Compostos	EC50 (nM)	95% de Cl (nM)	Taxa de reação máxima (%)
Liraglutida	0,014707	9,726e-012 a 2,223e-011	96,84616
HS-20001	0,013552	7,6757e-012 a 2,3963e-011	98,11013
HS-20002	0,0014145	1,2036e-012a 1,6623e-012	87,99447
HS-20003	0,00071876	4,9657e-013 a 1,0404e-012	87,86082
HS-20004	0,00037259	2,1453e-013 a 6,4710e-013	90,81368
HS-20005	0,00023552	7,3567e-012 a 2,2346e-011	89,13468
HS-20006	0,00064358	1,3581 e-012 a 1,4523e-012	87,4281
HS-20007	0,00054921	4,1354e-013a 1,2514e-012	87,0389
HS-20008	0,00021002	2,2436e-013 a 6,0245e-013	88,4628

Exemplo Experimental 2: Teste da atividade in vivo

Camundongos db/db com diabetes do tipo 2 são divididos em seis grupos com base na glicose sanguínea randômica e peso corporal (8 por grupo). Salina fisiológica, 3 ou 10 pg/kg dos novos compostos da série HS (Liraglutida, 20001, 20002, 20003, 20004, 2005, 2006, 2007, 2008) são administrados por meio de uma única injeção subcutânea. A glicose sanguínea randômica dos camundongos é determinada em momentos diferentes após a administração.

Os pacientes animais empregados no experimento são camundongos db/db, que são produtos de uma corporação norte-americana designada Jackson e são conservados e reproduzidos pelo Shanghai Institute of Materia Medica of Chinese Academy of Science, do qual o Certificado de Conformidade é: SCXK(HU)2008-0017, Peso Corporal: 35 a 50 g; Sexo: Machos 85, fêmeas 86, reproduzidos em Alojamento para animais de grau SPF;

37/43

Temperatura: 22 a 24°C; Umidade: 45 a 80%; Luz: 150 a 300 Lx, 12 horas de dia alternado com noite.

Os fármacos de teste do experimento são HS-20001, HS-20002, HS-20003, HS-20004, HS-20005, HS-20006, HS-20007, HS-20008, liraglutida (desenvolvido por Novo Nordisk, como Controle positivo).

Método de preparação: 1 frasco do composto (2 mg / frasco) é dissolvido com água duplamente destilada para preparar uma solução incolor e transparente cuja concentração é 2 mg/ml, em seguida a solução é diluída para 0,6 pg/ml e 2 pg/ml com salina fisiológica (Injeção de cloreto de sódio, Double-Crane Pharmaceutical Co., Ltd., Anhui, número de batelada: 080728 6C). O medidor de glicose sanguínea ACCU-CHEK® Advantage da Roche é empregado para determinar a glicose sanguínea.

Determinação de dose e grupo

Grupo de Teste 1:

Grupo de controle: salina fisiológica

Grupo de liraglutida: 3 pg/kg

Grupo de HS-20001: 3 pg/kg

Grupo de HS-20002: 3 pg/kg

Grupo de HS-20003: 3 pg/kg

Grupo de HS-20004: 3 pg/kg

Grupo de HS-20005: 3 pg/kg

Grupo de HS-20006: 3 pg/kg

Grupo de HS-20007: 3 pg/kg

Grupo de HS-20008: 3 pg/kg

Grupo de Teste 2:

Grupo de controle: salina fisiológica

Grupo de liraglutida: 10 pg/kg

Grupo de HS-20001: 10 pg/kg

Grupo de HS-20002: 10 pg/kg

Grupo de HS-20003: 10 pg/kg

Grupo de HS-20004: 10 pg/kg

Grupo de HS-20005: 10 pg/kg

38/43

Grupo de HS-20006: 10 pg/kg

Grupo de HS-20007: 10 pg/kg Grupo de HS-20008: 10 pg/kg

Rotina e volume de administração: Dose única de injeção subcutânea, volume da dose é 5 ml/kg.

Método de Teste

Análise, agrupamento, e administração de camundongos db/db com diabetes do tipo 2

Grupo de Teste 1:

171 camundongos db/db (machos 85, fêmeas 86) são criados em gaiolas invividuais depois de desmamar, alimentados com dieta hiperlipídica. As glicoses sanguíneas randômicas e em jejum são medidas depois que os camundongos db/db têm sete semanas de idade. 80 camundongos db/db que ficam doentes são escolhidos e são divididos em 10 grupos de acordo com a glicose sanguínea randômica, glicose sanguínea em jejum e peso corporal como segue: grupo de controle modelo, grupo de Liraglutida-3 pg/kg, grupo de HS-20001-3 pg/kg, grupo de HS-20002-3 pg/kg, grupo de HS-20003-3 pg/kg, grupo de HS-20004-3 pg/kg, grupo de HS-20005-3 pg/kg, grupo de HS-20006-3 pg/kg, grupo de HS-20007-3 pg/kg e grupo de HS20008-3 pg/kg.

Grupo de Teste 2:

As glicoses sanguíneas randômicas de camundongos db/db são medidas. 80 camundongos db/db que ficam doentes são escolhidos e são divididos em 10 grupos de acordo com a glicose sanguínea randômica e peso corporal como segue: grupo de controle modelo, grupo de Liraglutida-10 pg/kg, grupo de HS-20001-10 pg/kg, grupo de HS-20002-10 pg/kg, grupo de HS-20003-10 pg/kg, grupo de HS-20004-10 pg/kg, grupo de HS-20005-10 pg/kg, grupo de HS-20006-10 pg/kg, grupo de HS-20007-10 pg/kg e grupo de HS-20008-10 pg/kg.

Cada grupo tem 8 camundongos, metade machos e metade fêmeas. Os animais de cada grupo são administrados com os compostos de teste ou controle de solvente respectivamente por meio de uma única inje

39/43 ção subcutânea. A glicose sanguínea randômica é determinada a 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas e 24 horas após a administração e a taxa de redução da glicose sanguínea é calculada:

Taxa de redução da glicose sanguínea = (glicose sanguínea do grupo de controle - glicose sanguínea do grupo de tratamento) / glicose sanguínea do grupo de controle * 100%.

Os resultados experimentais

Teste 1: Efeito dos novos compostos em baixas doses administrados por uma única dose sobre a glicose sanguínea randômica de camundongos db/db

Os resultados podem ser vistos na Tabela 2 e Tabela 3. Camundongos db/db são administrados com 3 pg/kg de HS-20002, 20004, 20005, 20006, 20007 ou 20008 por meio de uma única injeção subcutânea, depois de uma hora, os valores da glicose sanguínea randômica dos referidos camundongos são reduzidos significantemente comparados com os do grupo de controle (P < 0,05), as taxas de redução são 24,51%, 15,00%, 14,00%, 14,25%, 13,98% e 13,90% respectivamente; depois de 2 horas e 4 horas da administração, os valores da glicose sanguínea randômica mantêm um nível mais baixo e têm diferença significante dos do grupo de controle (P < 0,05); depois de 8 horas da administração, os valores da glicose sanguínea randômica não têm nenhuma diferença significante dos do grupo de controle. Os camundongos são administrados com 3 pg/kg de HS-20003 por meio de injeção subcutânea, depois de uma hora, os valores da glicose sanguínea randômica são reduzidos significantemente comparados com os do grupo de controle (P < 0,05), até 17,33%, depois de 2 horas, 4 horas e 8 horas da administração, os valores da glicose sanguínea randômica não apresentam nenhuma diferença significante dos do grupo de controle. Depois de administrados com 3 pg/kg de HS-20001 para camundongos db/db por meio de uma única injeção subcutânea, os valores da glicose sanguínea randômica são reduzidos um pouco comparados aos do grupo de controle, mas nenhuma diferença significante. Os valores da glicose sanguínea randômica do grupo de camundongos administrados com liraglutida não têm nenhuma

40/43 redução significante.

Tabela 2: Efeito da administração dos novos compostos (mmol/L, X±s, n = 8) por meio de uma única dose sobre a glicose sanguínea randômica de camundongos db/db no mesmo dia.

Grupos	Antes da administração	Tempo após a administração (h)
1	2	4	8
Controle	25,14±1,09	23,66±0,73	22,63±0,97	22,00±1,00	25,39±1,08
Liraglutida -3 pg/kg	25,11±2,33	21,78±2,31	23,15±2,62	21,56±1,37	23,93+2,09
HS-20001-3 pg/kg	25,21±1,44	20,34±2,29	19,84±1,76	20,74±2,51	24,29±1,60
HS-20002-3 pg/kg	25,25+1,57	17,86±1,90*	19,56±0,90*	18,10±0,79**	24,19+1,79
HS-20003-3 pg/kg	25,16±1,49	19,56±1,19*	19,44±1,48	19,63+1,12	22,59±1,05
HS-20004-3 pg/kg	25,11±1,63	20,11±1,28*	18,81±1,50*	17,98±1,38*	23,30±1,47
HS-20005-3 pg/kg	25,21±1,56	20,11±1,19*	18,96±1,50*	18,98±1,48*	22,36±1,67
HS-20006-3 pg/kg	25,11±1,49	20,36±1,25*	19,91+1,70*	19,58±1,54*	24,30±1,50
HS-20007-3 pg/kg	25,16±1,63	20,43±1,19*	19,81±1,610*	20,98±2,38*	23,42±1,38
HS-20008-3 pg/kg	25,11+1,58	20,56±1,30*	20,81±1,70*	19,30±2,02*	22,41±1,51

* P < 0,05, * * P < 0,01, Comparados com os do grupo de controle

Tabela 3: A taxa de redução da glicose sanguínea randômica (%, n = 8) de camundongos db/db administrados com os novos compostos por meio de uma única dose no mesmo dia

grupo	Tempo após a administração (h)
1	2	4	8
Liraglutida-3 pg/kg	7,98%	-2,32%	1,99%	5,76%
HS-20001-3 pg/kg	14,05%	12,32%	5,74%	4,33%
HS-20002-3 pg/kg	24,51%	13,54%	17,73%	4,73%
HS-20003-3 pg/kg	17,33%	14,09%	10,80%	11,03%
HS-20004-3 pg/kg	15,00%	16,85%	18,30%	8,22%
HS-20005-3 pg/kg	14,00%	12,87%	10,53%	8,02%

41/43

grupo	Tempo após a administração (h)
1	2	4	8
HS-20006-3 pg/kg	14,25%	13,12%	10,86%	8,14%
HS-20007-3 pg/kg	13,98%	11,85%	9,30%	6,54%
HS-20008-3 pg/kg	13,90%	11,62%	8,90%	6,25%

Teste 2: Efeito dos novos compostos em altas doses administrados por meio de uma única dose sobre a glicose sanguínea randômica de camundongos db/db

Os resultados podem ser vistos na Tabela 4 e Tabela 5. Camundongos db/db são administrados com 10 pg/kg de HS-20002 por meio de uma única injeção subcutânea; depois de uma hora, os valores da glicose sanguínea randômica dos camundongos são reduzidos significantemente comparados com os do grupo de controle (P < 0,01); depois de 2 horas, 4 horas e 8 horas da administração, os valores da glicose sanguínea randômica mantêm um nível mais baixo, em que os valores em 4 horas após a administração são muito óbvios, cuja taxa de redução é até 40,67% e é significantemente diferente da do grupo de controle (P < 0,001), até 24 horas após a administração, os valores da glicose sanguínea randômica ainda são significantemente mais baixos que os do grupo de controle. Os camundongos foram administrados com 10 pg/kg de HS-20003 por meio de uma única injeção subcutânea; depois de uma hora, os valores da glicose sanguínea randômica são reduzidos significantemente comparados com os do grupo de controle (P < 0,01) e ocorre até 23,62% de redução; depois de 2 horas, 4 horas e 8 horas da administração, os valores da glicose sanguínea randômica ainda persistem em um nível mais baixo; depois de 24 horas da administração, não há nenhuma diferença significante comparado com o grupo de controle. Camundongos db/db são administrados com 10 pg/kg de HS20001 por meio de uma única injeção subcutânea; depois de 2 horas, os valores da glicose sanguínea randômica são reduzidos significantemente comparados com os do grupo de controle; depois de 4 horas e 8 horas da administração, os valores da glicose sanguínea randômica ainda persistem em um nível mais baixo; depois de 24 horas da administração, os valores da

42/43 glicose sanguínea randômica não apresentam nenhuma diferença significante dos do grupo de controle. HS-20002, HS-20004, HS-20005, HS-20006, HS-20007 ou HS-20008 são administrados a camundongos por meio de uma única injeção subcutânea e os valores da glicose sanguínea randômica são reduzidos imediatamente e significantemente, a taxa de redução é até

36,20%; depois de 2 horas, depois de 4 horas e 8 horas da administração, os valores de glicose sanguínea persistem ainda em um nível mais baixo; depois de 24 horas da administração, não há nenhuma diferença significante comparados com os do grupo de controle. Os valores da glicose sanguínea 10 randômica de camundongos do grupo administrado com liraglutida não têm nenhuma redução significante.

Tabela 4: Efeito dos novos compostos administrados por meio de uma única dose (mmol/L, ±s, n = 8) sobre a glicose sanguínea randômica de camundongos db/db no mesmo dia.

grupo	Antes da administração	Tempo após a administração (h)
1	2	4	8	24
controle	23,08+137	27,15+151	28,40+158	30,76+1,15	29,9610,88	27,75+1,64
liraglutida10 pg/kg	23,19+1,35	28,59+1,50	28,89+1,17	28,55+1,31	31,8410,65	27,78+1,14
HS-20001- 10 pg/kg	23,16+1,57	23,90+1,79	20,94+1,57**	2020+1,78***	23,86+1,87*	24,60+1,92
HS-20002- 10 pg/kg	23,15+1,32	19,74+1,16**	20,31+201**	1825+1,98***	2255+220**	2260+1,46*
HS-20003- 10 pg/kg	2320+1,36	20,7410,98**	21,1010,80***	19,54+1,80***	22141216**	24,45+155

_______________________________________________________________________

Antes da Tempo após a administração (h) grupo administração

		1	2	4	8	24
controle	23,08+1,37	30,76+1,15	302910,98	29,9010,89	31,04+0,94	28,98+1,62
HS-2000410 pg/kg	23,18±1,65	19,63+1,81***	21,86+1,66***	21,44+1,68***	23,80+1,46***	25,64+135
HS-20005- 10 pg/kg	23,64±1,35	19,39+1,61***	21,56+1,56***	21,49+1,34***	23,46+151***	25,52+1,68
HS-20006- 10 pg/kg	23,54+1,39	19,52+1,72***	21,43+1,49***	21,53+1,67***	23,39+1,55***	25,59+1,74
HS-20007- 10 pg/kg	23,56±1,42	19,41+154***	21,84+1,57*“	21,64+1,56***	23,81±1,67***	25,51±153

43/43 „ 23,49+1,49 19,38+1,83“ 21,61+1,68“ 21,72t1j63“ 23,56+1,80“ 25,72t1,69 pg/kg * P < 0,05, * * P < 0,01, * * * p < 0,001, Comparados com o grupo de controle,

Tabela 5: A taxa de redução da glicose sanguínea randômica (%, n = 8) de camundongos db/db administrados com os novos compostos por meio de uma única dose no mesmo dia.

grupo	Tempo após a administração (h)
1	2	4	8	24
liraglutida-10 pg/kg	-5,29%	-1,40%	7,19%	-6,26%	-0,09%
HS-20001-10 pg/kg	11,97%	26,50%	34,34%	20,36%	11,35%
HS-20002-10 pg/kg	27,30%	28,71%	40,67%	24,74%	18,56%
HS-20003-10 pg/kg	23,62%	25,93%	36,49%	26,12%	11,89%
HS-20004-10 pg/kg	36,20%	27,82%	28,30%	23,32%	11,52%
HS-20005-10 pg/kg	37,58%	28,32%	29,12%	24,10%	12,46%
HS-20006-10 pg/kg	38,12%	27,66%	29,78%	23,72%	13,66%
HS-20007-10 pg/kg	36,72%	25,43%	26,54%	23,03%	12,16%
HS-20008-10 pg/kg	35,49%	25,79%	27,33%	22,57%	14,58%

Conclusão dos testes:

A glicose sanguínea randômica de camundongos db / db administrados com a série dos novos compostos da invenção por meio de uma única injeção subcutânea pode ser reduzida significantemente; a glicose sanguínea randômica pode ser reduzida obviamente por HS-20002, HS20003, HS-20004, HS-20005, HS-20006, HS-20007 e HS-20008 em uma dose de 3 pg/kg. Onde HS-20002 e HS-20004 apresentam um efeito muito superior sobre a redução de glicose sanguínea randômica, a duração do efeito hipoglicêmico após a única injeção subcutânea está relacionada com a dose; a duração do efeito de HS-20002 e HS-20004 sobre a redução de glicose sanguínea randômica na dose de 3 pg/kg é mais de 4 horas, e a duração do efeito de HS-20001, HS-20002, HS-20003, HS-20004, HS-20005, HS-20006, HS-20007 e HS-20008 sobre a redução de glicose sanguínea randômica na dose de 10 pg/kg e mais de 8 horas.

Claims

1. Derivado de análogo de GLP-1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos do referido análogo de GLP-1 é selecionada a partir de:

His-(D)-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-NleGlu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Gln-Gly-Gly-Pro-SerSer-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys;

His-(D)-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-LeuGlu-Glu-Glu-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Gly-Pro-SerSer-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys (SEQ ID NO: 3);

His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-GluGlu-Glu-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Gly-Pro-Ser-SerGly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys (SEQ ID NO: 4);

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-GluGly-Gln-Ala-Ala-Glu-Phe-Ile-Val-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Lys-Lys-GlyGly-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys (SEQ ID NO: 5);

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-GluGly-Gln-Ala-Ala-Glu-Phe-Ile-Val-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Lys-Lys-GlySar-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys (SEQ ID NO: 6);

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-GluGlu-Gln-Ala-Ala-Glu-Phe-Ile-Val-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Lys-Lys-GlyGly-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys (SEQ ID NO: 7); e

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-GluGlu-Gln-Ala-Ala-Glu-Phe-Ile-Val-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Lys-Lys-GlySar-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys (SEQ ID No.8),em que o derivado do referido análogo de GLP-1 contêm um substituinte lipofílico de fórmula R1(CH2)n-CO-, em que Ri é selecionado de CH3- e HOOC-, n é um número inteiro selecionado de 8 a 25, em que o substituinte lipofílico de fórmula R1(CH2)n-CO- e o grupo amino α do Lys C-terminal do análogo de GLP-1 são ligados por uma ligação de amida, ou o substituinte lipofílico de fórmula R1(CH2)n-CO- e o grupo amino ε do Lys C-terminal do análogo de GLP-1 são ligados por uma ligação de amida.

Petição 870190077534, de 12/08/2019, pág. 8/14

2/2

2. Derivado do análogo de GLP-1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Ri é CH3- e n é um número inteiro selecionado a partir de 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 e 22.

3. Derivado do análogo de GLP-1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizad pelo fato de que R1 é CH3- e n é 14.

4. Derivado do análogo de GLP-1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R1 HOOC e n é um número inteiro selecionado a partir de 8, 14, 16, 18, 20 e 22.

5. Derivado do análogo de GLP-1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que R1 é HOOC e n é 14.

6. Derivado do análogo de GLP-1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos do análogo de GLP-1 é SEQ ID NO: 4.

7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende:

(1) uma quantidade terapeuticamente eficaz do derivado do análogo de GLP-1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e (2) um excipiente farmaceuticamente aceitável ou veículo de fármaco.

8. Uso do derivado do análogo de GLP-1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para o tratamento de diabetes melito não dependente de insulina, diabetes dependente de insulina ou obesidade.