EA006860B1 - Композиции и способы модулирования гемиканалов коннексина - Google Patents

Композиции и способы модулирования гемиканалов коннексина Download PDF

Info

Publication number
EA006860B1
EA006860B1 EA200400984A EA200400984A EA006860B1 EA 006860 B1 EA006860 B1 EA 006860B1 EA 200400984 A EA200400984 A EA 200400984A EA 200400984 A EA200400984 A EA 200400984A EA 006860 B1 EA006860 B1 EA 006860B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
compound
cells
connexin
tissue
cell
Prior art date
Application number
EA200400984A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200400984A1 (ru
Inventor
Йерген Себерг Петерсен
Серен Неве
Мортен Шак Нильсен
Эдди Мейер
Эва Стайнесс
Петер Холме Йенсен
Бьярне Дуэ Ларсен
Ларс Бо Лауренборг Хансен
Original Assignee
Уайт
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Уайт filed Critical Уайт
Publication of EA200400984A1 publication Critical patent/EA200400984A1/ru
Publication of EA006860B1 publication Critical patent/EA006860B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/05—Dipeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/07—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/06—Antiarrhythmics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/60—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances involving radioactive labelled substances
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material
    • G01N2440/14—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material phosphorylation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/326—Arrhythmias, e.g. ventricular fibrillation, tachycardia, atrioventricular block, torsade de pointes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Abstract

Описание соединения и способы модулирования функций гемиканалов в клетке, ткани или органе. Изобретение также относится к пригодным для применения методам отбора с целью обнаружения подобных соединений, в частности соединений, способных модулировать фосфорилирование коннексина. Предлагаются также терапевтические методы предупреждения или лечения состояний у млекопитающих, на которые влияет нежелательная функция гемиканалов у млекопитающих, такая как сердечная аритмия.

Description

Настоящее изобретение в целом относится к соединениям и способам модулирования гемиканалов коннексина. Изобретение также относится к пригодным для применения методам отбора, с целью определения подобных соединений.
Предпосылки изобретения
Считается, что щелевые контакты являются важными структурами плазматической мембраны, которые помогают клеткам взаимодействовать с их окружением. Например, полагают, что большинство щелевых контактов способствует прохождению малых молекул и ионов между взаимосвязанными клетками. Считается, что подобное движение оказывает огромное влияние на многие аспекты физиологии клеток. Полагают также, что плазматические мембраны смежных клеток содержат гемиканалы, коннексоны, образованные мультимерными белками, называемыми коннексинами, которые помогают сформировать щелевые контакты. Кроме того, гемиканалы играют независимую роль при обмене соединениями с низкой молекулярной массой между цитоплазмой клеток и периплазматическим или внеклеточным пространством. См. документы ВсппсИ. М. е! а1. (1991) Ыеигоп 6: 305; Кишат, N. аиб Сби1а, Ν.Β. (1996) Се11 84: 381; и ΟιιίκΙ А.Р. е! а1. (2000) I. Се11 Βίο1. 148: 1063 и приведенные в них ссылки.
Имеются, в частности, сообщения, что многие щелевые контакты являются специализированными участками клеточной мембраны с кластерами плотно упакованных каналов. Полагают, что подобные щелевые соединительные каналы напрямую соединяют цитоплазматический компартмент двух соседних клеток.
Считается, что щелевые соединительные каналы состоят из двух гемиканалов (коннексонов), образованных каждой из двух смежных клеток. Было показано, что каждый коннексон (гемиканал) состоит из шести белков, называемых коннексинами. Полагают, что каждый коннексин обменивается четырьмя трансмембранными доменами, двумя внеклеточными петлями и цитоплазматической петлей. Считается, что проводимость электрических импульсов обусловлена щелевыми контактами, и тем самым облегчается нормальная сердечная проводимость и сердечный ритм. См. документы Р.А. Сиеттето, Κ.Β. е! а1., 1. СБи. 1иуек!. 1997, 99, 1991; Э.Ь. Ьетиет, К.А. е! а1., С1гси1абои 1999, 99, 1508; 8. КисИйоГГ, Е. е! а1. Сигг. Βίο1. 1998, 8, 295.
Полагают, что распределение большинства коннексинов сердца значительно варьирует в разных частях сердца. Было показано, что изоформа Сх43 в основном характерна для желудочков, в то время как Сх40 представляет собой изоформу, наиболее часто встречающуюся в предсердиях и проводящей системе.
Имеются сообщения о тесной взаимосвязи между аномалиями коннексина и заболеваниями сердца. См. документы А.С. бе СатуаШо, е! а1., 1. Сатбюуакс. Е1ес1торйукю1. 1994, 5, 686; К.К. Карпейаи, е! а1., С1тси1а!юи 1998, 97, 651; Ν.8. Ре!егк, е! а1., Спси1а1юи 1993, 88, 864; и ЕЕ. 8аГГ1^, Κ.Β. е! а1., Сатбюуакс. Кек. 199, 42, 309.
Известно, что аритмия связана с аномальными экспрессией, распределением и регуляцией щелевых контактов. Сообщается, что пептиды аритмии, описанные у Ьаткеи, В. е! а1. РСТ/ЭК01/00127 (\УО 01/62775), усиливают межклеточные взаимодействия посредством щелевых контактов (СЛС) в тканях позвоночника.
У млекопитающих описаны конкретные белки щелевых контактов, кодируемые семейством гена коннексина (Сх). См. документы Β^иζζοие, К. е! а1. (1996) Еиг. 1. Β^οсйет. 238: 1. Семейство Сх включает в себя Сх26, 30, 31, 32, 37, 40, 43, 45, 46 и 50. Щелевые соединительные каналы были также обнаружены у беспозвоночных, у которых формирующие каналы белки называют иннексинами.
Полагают, что большинство коннексинов, за исключением белка Сх26, может быть фосфорилировано. Белок Сх43 широко экспрессируется в тканях. Есть сообщения, что фосфорилирование белка Сх43 влияет на межклеточные взаимодействия посредством щелевых контактов (СЛС). Например, признают, что фосфорилирование влияет на функциональный цикл Сх43, направление его миграции, фосфорилирование и открытие мембранных каналов. См. Эатготе, Β.Ε е! а1. (1995), Спс. Кек. 76: 381.
Например, 8аГГйх с сотрудниками, используя измерения проводимости, показали, что при ишемии в течение 15 мин наблюдается усиление дефосфорилирования серина в коннексине. См. фиг. 1 (показан трансмембранный белок Сх43 млекопитающих с несколькими сайтами фосфорилирования).
Фосфорилирование и растворение коннексинов привлекло внимание исследователей. В частности, было обнаружено, что Сх43 может фосфорилироваться в миоэпителиальных клетках молочных желез крыс. См. документы ^аид, Υ., е! а1. (1995), I. ΒώΕ Сйеш. 270, 26581; и Υатаиака, I., е! а1. (1997), Еиг. I. Се11. Βώ1. 72: 166.
Как уже отмечалось, полагают, что щелевые соединительные каналы являются специализированными порами, которые соединяют цитоплазмы смежных клеток. Гемиканалы соединяются с внеклеточным окружением. Есть сообщения, что торможение метаболизма сердечных клеток способно активировать пути притока, которые могут быть сконструированы гемиканалами коннексина. Полагают, что тор
- 1 006860 можение метаболизма открывает гемиканалы и ускоряет потерю калия, а также влияет на приток протонов, натрия и кальция, тем самым повреждая ткани сердца. См. Копбо е! а1. 1. Мо1. Се11. Сагбю1. 32: 185972, 2000; Ь1 е! а1., 1. Мо1. Се11. Сагбю1. 33: 2145-55, 2001.
Полагают, что разрыв электрического сигнала в щелевом контакте во время острой ишемии миокарда вносит свой вклад в возникновение аномальной проводимости и повторной аритмии. Разрыву способствуют повышенные уровни внутриклеточных ионов Са2+ и Н+ и накопление метаболитов амфипатического липида при ишемии. Важную роль могут играть и другие механизмы. Например, сообщалось, что разрыв, вызванный острой ишемией, связан с изменениями в фосфорилировании коннексина 43 (Сх43). Приводятся результаты, которые свидетельствуют о быстром и обратимом дефосфорилировании, которое играет свою роль при прерывании связей в миокарде и развитии аритмии при острой ишемии. См. Веагбк1ее М.А. е! а1., Сие. Век. 2000; 87: 656 и приведенные там ссылки.
Интерес привлекают структура и функции гемиканалов.
Например, исследования с помощью атомного силового микроскопа, анализ поглощения флуоресцентного красителя и метод иммунофлуоресцентной конфокальной лазерной спектроскопии дают основания предполагать, что гемиканалы участвуют во внеклеточной кальций-зависимой модуляции объема клетки. Как сообщалось, изменения объема клетки зависят от того, экспрессируется коннексин 43 или нет. Сообщается, что изменения можно предотвратить с помощью блокаторов щелевых контактов (в частности, олеамида и бета-глицирретовой кислоты) или же путем нормализации уровня внеклеточного кальция. Было высказано предположение, что не участвующие в щелевых контактах гемиканалы регулируют объем клетки в ответ на изменение концентрации внеклеточного физиологического кальция, что в противном случае привело бы к возникновению изоосмотической ситуации. См. ΟιιίκΙ А.Р. е! а1. (см. выше).
Было высказано предположение, что открытые гемиканалы, особенно при ишемии или метаболическом стрессе, могут вызвать поглощение клетками ионов Са2+, протонов и накопление в клетках метаболитов амфипатического липида, что вызывает набухание клеток и приводит к повреждению или апоптозу клеток. См. Веагбк1ее е! а1. (см. выше) и ΟιιίκΙ е! а1. (см. выше).
Сообщалось, что Сх43 ίη уйго фосфорилируется активированным белком 8гс по положениям Туг247 (Υ247), Туг265 (Υ265) и, возможно, по другим положениям. Важно то, что межклеточные взаимодействия посредством щелевых контактов (СЛС) устойчивы к разрыву под влиянием фосфорилирования, опосредованного действием у-8гс. Считается, что важную роль играет фосфорилирование Сх43 по положениям Υ247 и Υ265. См. Ьш В., е! а1. (2001) 1. Се11. Вю1. 154(4): 815. См. также фиг. 1.
См. также заявку Ьагкеп, Β.Ό. е! а1. в рамках договора о патентной кооперации (РСТ) под названием Иете Меб1еа1 Икек о£ 1п1гасе11и1аг Соштишеайоп Еасййайпд Сотроипбк, поданной 22 февраля 2002 г. в виде документа РСТ/И802/05773 (νθ 02/077017), в которой описано множество соединений, модулирующих СЛС.
Необходимы соединения, которые способны модулировать функции гемиканалов. Предпочтительные соединения могли бы оказывать помощь в открытии или закрытии гемиканалов. Особенно необходимы методы отбора молекул, позволяющие идентифицировать подобные соединения.
Краткое описание изобретения
Изобретение в целом относится к соединениям и способам их применения для модулирования функции гемиканалов. Конкретные соединения модулируют фосфорилирование гемиканала. Дополнительные соединения согласно изобретению модулируют функцию гемиканала и в некоторых случаях влияют также на межклеточные взаимодействия посредством щелевых контактов (СЛС), в частности, путем открытия или закрытия каналов щелевых контактов. Предлагаются также пригодные к применению методы отбора, с целью детектирования подобных соединений и определения их свойств. Изобретение имеет много полезных применений, включая терапию, с целью лечения или предупреждения различных состояний, модулируемых неправильным функционированием гемиканала.
Существует настоятельная потребность в идентификации соединений, которые модулируют (усиливают или ослабляют) функцию гемиканала. Под термином функция гемиканала понимают открытие или закрытие гемиканалов коннексина с тем, чтобы усилить или затруднить прохождение молекул или ионов через гемиканал. Фраза функция щелевого контакта означает открытие или закрытие щелевых контактов, с тем, чтобы увеличить или затруднить прохождение молекул или ионов через щелевой контакт. Предпочтительные соединения согласно изобретению модулируют фосфорилирование гемиканала и обычно также помогают открывать или закрывать гемиканал. Функцию гемиканала и функцию щелевого контакта можно легко обнаружить и можно оценить количественно с помощью одного или нескольких стандартных методов, которые приводятся в настоящем описании.
Более специфические соединения, модулирующие гемиканал, модулируют (усиливают или ослабляют) фосфорилирование распознанного коннексина. Предпочтительные сайты фосфорилирования или дефосфорилирования включают в себя один или несколько тирозиновых, сериновых или треониновых остатков в коннексине. Как будет указано далее, было обнаружено, что модуляция фосфорилирования по одному или нескольким из указанных сайтов влияет на функцию гемиканала, в частности, путем открытия или закрытия гемиканала. Таким образом, как описано далее, целью настоящего изобретения явля
- 2 006860 ются методы отбора, пригодные для мониторинга фосфорилированного состояния коннексинов как средства для обнаружения соединений, обладающих способностью модулировать функцию гемиканала, и для возможного определения их свойств.
Например, некоторые соединения согласно изобретению способны фосфорилировать по меньшей мере один тирозиновый остаток коннексина. В этом варианте осуществления настоящего изобретения фосфорилирование коннексина поможет закрыть гемиканал. Другие соединения, модулирующие гемиканал, уменьшают фосфорилирование (дефосфорилирование) по меньшей мере одного серинового остатка коннексина. В этом примере дефосфорилирование серина поможет открыть гемиканал. Наконец, другие соединения согласно изобретению усиливают фосфорилирование по меньшей мере одного треонинового остатка коннексина и тем самым обычно облегчают закрытие гемиканала. Дополнительные подходящие соединения согласно изобретению по меньшей мере обеспечивают усиление или ослабление фосфорилирования серина в коннексине, усиление или ослабление фосфорилирования тирозина в коннексине и усиление или ослабление фосфорилирования треонина в коннексине. Предпочтительно одна или несколько модификаций аминокислот помогают обнаружить открытие или закрытие гемиканала.
В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения в изобретении предлагается способ модулирования функции гемиканала предпочтительно путем закрытия гемиканала. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанный способ включает в себя закрытие гемиканала в клетке, ткани или органе, преимущественно подвергнутых стрессу, в том числе контактирование находящейся в состоянии стресса клетки, ткани или органа с терапевтически эффективным количеством по меньшей мере одного из соединений, представленных ниже формулами I или II. Предпочтительный контакт в соответствии с этим способом осуществления настоящего изобретения достаточен для того, чтобы закрыть гемиканал либо до, либо в процессе, либо после стресса, по отношению к соответствующему контролю. Примеры подобного стресса включают в себя одно или несколько вызывающих стресс воздействий, выбранных из ингибирования метаболических процессов, кислородной недостаточности, понижения рН или увеличения внеклеточной концентрации ионов калия, как это описано ниже.
В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает в себя мониторинг фосфорилирования распознанного коннексина, преимущественно коннексина 43 (Сх43). Метод, как правило, позволяет обнаружить и зарегистрировать любое усиление или ослабление фосфорилирования Сх43 по меньшей мере по одному из его остатков тирозина, серина и треонина, предпочтительно усиление фосфорилирования по меньшей мере одного тирозина или треонина. В этом варианте осуществления настоящего изобретения способ также включает в себя закрытие гемиканала и, необязательно, открытие или закрытие каналов щелевых контактов по сравнению с контролем.
В настоящем изобретении предлагаются другие способы модуляции функции гемиканалов. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ включает в себя мониторинг фосфорилирования распознанного коннексина, преимущественно Сх43, с целью обнаружения любого усиления или ослабления фосфорилирования в Сх43 по меньшей мере одного остатка тирозина, серина и треонина, предпочтительно ослабления фосфорилирования одного или нескольких из этих остатков, таких как серин, по сравнению с контролем. В этом примере согласно изобретению способ включает в себя раскрытие гемиканала в подвергнутой стрессу клетке, ткани или органе, в том числе он включает в себя контактирование находящейся в состоянии стресса клетки, ткани или органа с терапевтически эффективным количеством по меньшей мере одного из соединений, представленных ниже в виде формул I или II. Предпочтительно контактирования достаточно для того, чтобы открыть гемиканал и необязательно открыть или закрыть каналы щелевых контактов, по отношению к соответствующему контролю.
Существует настойчивая потребность в более конкретных методах отбора и определения свойств подобных соединений, модулирующих гемиканал. Применение указанных методов отбора могло бы стать важным первым шагом в направлении идентификации и определения свойств ряда новых соединений, модулирующих гемиканал, в частности, путем проведения тестирования в условиях ίη νίίτο соединения-кандидата, относительно контроля, с целью выявить потенциальную способность облегчать закрытие гемиканалов, например по меньшей мере на 5% выше, чем контрольное соединение. Соединения, идентифицированные с помощью указанных методов, в том числе соединения, представленные ниже формулами I или II, могут применяться в терапии, которая способствует гомеостазу клетки, ткани и органа, например, путем предотвращения, снижения или защиты относительной потери компонентов из клетки во внеклеточное окружение.
Таким образом, в настоящем изобретении предлагаются также специфические ίη νίίτο методы отбора соединений-кандидатов, которые потенциально обладают способностью модулировать функции гемиканалов. Как правило, метод включает в себя контактирование подходящих клеток, тканей или органов по меньшей мере с одним соединением, представленным ниже формулами I или II. Контактирование преимущественно осуществляют в условиях, благоприятствующих модулированию фосфорилирования распознанного коннексина, преимущественно коннексина 43 (Сх43), и обнаружению изменения в фосфорилировании Сх43 по отношению к подходящему контролю. Предпочтительно принимается также, что изменение в фосфорилировании указывает на соединение, модулирующее гемиканал. Подобные со
- 3 006860 единения, обнаруживаемые методом отбора, необязательно могут открывать или закрывать щелевые соединительные каналы в соответствии с приведенными в настоящем описании методами анализа.
В каждом из рассмотренных выше методов предпочтительные изменения в фосфорилировании, в соответствии с настоящим изобретением, происходят практически полностью на поверхности или вблизи поверхности внутриклеточного С-конца коннексина. Более предпочтительные сайты фосфорилирования и дефосфорилирования Сх43 приведены на фиг. 1. Под выражением С-конец коннексина понимают район приблизительно от аминокислотного остатка 240 до аминокислотного остатка 281, как показано на фиг. 1.
Конкретный ίη νίίτο метод отбора согласно изобретению, с целью обнаружения фосфорилирования коннексина, включает в себя одну или несколько стадий, предназначенных для мониторинга функции гемиканала, функции щелевого контакта (или обоих). Подобный анализ в общем случае включает в себя по меньшей мере одну и, предпочтительно, все из следующих стадий:
1) культивирование популяции клеток, ткани или органа, например, взятых из сердца или мышцы;
2) индуцирование стресса у клеток, ткани или органа, предпочтительно за счет кислородной недостаточности или подавления метаболических процессов;
3) добавление известного соединения-кандидата, модулирующего гемиканал, такого как соединение, представленное ниже формулами I или II;
4) обнаружение изменения в фосфорилировании коннексина (преимущественно Сх43) по отношению к подходящему контролю; и
5) необязательно измерение изменения, указывающего на соединение, которое модулирует функцию гемиканала и необязательно функцию щелевого соединительного канала.
Указанный анализ позволяет эффективно измерить потенциальную способность соединения, модулирующего гемиканал, усиливать или ослаблять фосфорилирование по меньшей мере остатка серина, тирозина или треонина в предпочтительном белке Сх43. Используемое в настоящем описании выражение стандартный ίη νίίτο анализ на фосфорилирование коннексина или похожее выражение относится к стадиям с 1) по 5) приведенного выше протокола. Анализ может быть проведен практически для любой популяции первичных, вторичных или иммортализованных клеток, таких как клетки, взятые из сердца или мышц.
Приведенный выше стандартный ίη νίίτο анализ в целом является достаточно гибким. Например, стадии 1)-5) могут проводиться практически в любом порядке, при условии, что цели, поставленные при проведении пробы, будут достигнуты. Так, в одном из вариантов проведения анализа соединениекандидат добавляют на стадии 1), стадии 2) (или на обеих стадия) или исключительно после стадии 2).
В настоящем изобретении предлагаются другие способы отбора соединений-кандидатов, способных модулировать функцию гемиканала. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения метод включает в себя контактирование подходящих клеток, ткани или органа по меньшей мере с одним соединением, выбранным из группы, представленной ниже формулами I или II. Как правило, проводят мониторинг любого поглощения репортера, обнаруживаемого клетками, тканью или органом, в присутствии соединения, по отношению к подходящему контролю. Предпочтительные обнаруживаемые репортеры имеют молекулярный размер, который позволяет им проходить через открытый гемиканал. Так, когда при проведении анализа гемиканал открыт, обнаруживаемый репортер попадает в клетку, ткань или орган. Однако если гемиканал закрыт, то возникает препятствие прохождению обнаруживаемого репортера через гемиканал. Контактирование преимущественно проводят в условиях, позволяющих обнаружить любое изменение в поглощении обнаруживаемого репортера относительно подходящего контроля.
В соответствии с настоящим изобретением, гемиканал является закрытым, если фосфорилирован по меньшей мере один остаток тирозина С-концевой области коннексина, предпочтительно Сх43, предпочтительно по меньшей мере один тирозин в положении 247 или в положении 265, более предпочтительно, оба указанных тирозина, что обнаруживают, например, с помощью стандартного ίη νίίτο анализа фосфорилирования коннексина. Под закрытым также понимают положение, когда фосфорилирован по меньшей мере один из остатков треонина в С-концевой области коннексина, при этом указанный остаток может быть фосфорилирован как сам по себе, так и в дополнение к фосфорилированию тирозина. Гемиканал открыт, если дефосфорилирован по меньшей мере один из остатков серина в С-концевой области коннексина. Предпочтительные остатки тирозина, треонина и серина дополнительно показаны на фиг. 1 как сайты киназы.
Более специфичный ίη νίίτο способ отбора для детектирования прохождения обнаруживаемого репортера через гемиканал включает в себя одну или несколько из следующих стадий:
1) культивирование популяции клеток, ткани или органа, например, взятых из сердца или мышцы,
2) индуцирование стресса в клетках, ткани или органе, предпочтительно за счет кислородной недостаточности или за счет подавления метаболических процессов, например, путем добавления производного глюкозы,
3) добавление известного соединения или соединения-кандидата, модулирующего гемиканал, такого как соединение, представленное ниже формулами I или II,
- 4 006860
4) добавление обнаруживаемого репортера, такого как флуоресцентное, хемилюминесцентное или фосфоресцентное соединение, такое как флуоресцентный краситель типа кальцеина и родственных соединений,
5) детектирование изменения в поглощении обнаруживаемого репортера клеткой, тканью или органом по отношению к подходящему контролю; и
6) необязательно измерение изменения как показателя того, что соединение модулирует функцию гемиканала.
Указанная проба позволяет эффективно измерить способность соединений-кандидатов открывать или закрывать гемиканалы в клетках, ткани или органе, при этом указанное изменение может быть легко обнаружено с помощью микроскопии путем визуализации обнаруживаемого репортера. Используемая в данном описании фраза стандартный ίη νίίτο анализ поглощения или похожая фраза относится к стадиям с 1) по 6) приведенного выше протокола. Подобный анализ может быть проведен практически для любой популяции первичных, вторичных или иммортализованных клеток, таких как клетки, взятые из сердца или мышц. Другие приемлемые репортеры включают в себя подходящие радиоактивные соединения, размер которых позволяет им проходить через гемиканал. Конкретные соединения включают в себя соединения, содержащие метки одного или нескольких из следующих радионуклидов: 3Н, 35§ и 14С.
Важно отметить, что стандартный ίη νίίτο анализ поглощения, в общих чертах рассмотренный ранее, не ограничен строго определенным порядком выполнения отдельных его стадий, при условии, что цели, поставленные при проведении пробы, будут достигнуты. Так, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одно соединение-кандидат и обнаруживаемый репортер со стадий 3) и 4), соответственно, в этом случае добавляют индивидуально или совместно до проведения стадии 2). В указанном примере проведения пробы клетки, ткань или орган подвергают стрессу в присутствии испытуемого соединения и обнаруживаемого репортера. В качестве альтернативы, для того, чтобы выявить соединения, способные открывать гемиканалы, обнаруживаемый репортер может быть загружен в клетку на стадии 1.
В настоящем изобретении предлагаются другие способы отбора одного или нескольких соединений-кандидатов с точки зрения их способности модулировать функцию гемиканалов. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ включает в себя взаимодействие клеток, ткани или органа по меньшей мере с одним соединений, выбранным из соединений, представленных ниже формулами I и II. Как правило, с целью определения объема в клетки, ткань или орган вводят обнаруживаемый репортер.
Предпочтительные обнаруживаемые репортеры для использования в этом анализе имеют молекулярную массу, которая позволяет им проходить через открытый гемиканал. Контактирование преимущественно осуществляют в условиях, способствующих обнаружению любых изменений объема клеток, ткани или органа, что регистрируют с помощью обнаруживаемого репортера и сравнивают с подходящим контролем.
Один из конкретных ίη νίίτο способов анализа с целью обнаружения изменений в объеме клетки включает в себя одну или несколько следующих стадий:
1) культивирование популяции клеток, ткани или органа, например, взятых из сердца или мышцы;
2) введение в клетки, ткань или орган обнаруживаемого репортера, такого как флуоресцентное, хемилюминесцентное или фосфоресцентное соединение, такое как флуоресцентный краситель типа кальцеина и родственных соединений;
3) оценка объема клеток, ткани или органа путем обнаружения и количественного определения сигнала от обнаруживаемого репортера;
4) добавление известного соединения или соединения-кандидата, модулирующего гемиканал, такого как соединение, представленное ниже формулами I или II;
5) индуцирование стресса у клеток, ткани или органа предпочтительно за счет кислородной недостаточности или за счет подавления метаболических процессов, например, путем добавления производного глюкозы;
6) обнаружение изменения объема клетки относительно подходящего контроля; и
7) необязательно измерение изменения как показателя того, что соединение модулирует функцию гемиканала и необязательно модулирует функцию щелевого канала.
Этот анализ позволяет эффективно измерить способность соединения-кандидата, модулирующего гемиканал, открывать или закрывать гемиканалы в клетках, ткани или органе путем микроскопического исследования изменения объема клетки. Использование в настоящем описании выражения стандартный ίη νίίτο анализ объема клетки или похожей фразы относится к стадиям с 1) по 7) приведенного выше протокола. Пробу можно проводить практически с любыми популяциями первичных или вторичных клеток, взятых из сердца или мышцы, таких как кардиомиоциты и родственные клетки и ткани.
Стандартный ίη νίίτο анализ объема клетки не ограничен строго определенным порядком выполнения отдельных его стадий, при условии, что цели, поставленные при проведении пробы, будут достигнуты. Так, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения соединение-кандидат со стадии 4) добавляют после индуцирования в клетках стресса на стадии 3), с целью наблюдения за способностью
- 5 006860 соединения закрывать гемиканалы в уже подвергнутых стрессу клетках, что проявляется в замедлении скорости уменьшения объема клетки. Так, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения за изменением скорости уменьшения или увеличения объема клетки следят в течение заданного периода времени. А в другом варианте осуществления настоящего изобретения за изменением объема клетки можно следить вплоть до фиксированного момента времени, например, в течение времени с 1 по 120 мин после того, как клетки, ткань или орган были подвергнуты стрессу.
Как уже обсуждалось выше, ίη νίίτο анализы обладают гибкостью и могут быть адаптированы с тем, чтобы они удовлетворяли предполагаемому использованию способа отбора. Например, конкретный кандидат в соединения, модулирующие гемиканал, такие как соединения, представленные ниже формулами I и II, может применяться в качестве единственного активного агента или применяться в комбинации с другими агентами, в том числе с другими тестируемыми соединениями. В большинстве, но не во всех случаях, ίη νίίτο анализы проводят в сравнении с подходящим контрольным анализом, в котором обычно используются те же или близкие условия, что и для соединений в приведенных выше стадиях, но при этом в культуральную среду не добавляют тестируемые соединения. В таких случаях соединениекандидат, модулирующее гемиканал, можно идентифицировать потому, что оно в условиях проведения анализа обладает по меньшей мере на 2% большей активностью по сравнению с контролем, более предпочтительно по меньшей мере на 5% большей активностью по сравнению с контролем, и еще более предпочтительно по меньшей мере на 10% большей активностью, в частности, приблизительно от 20% приблизительно до 40% большей активностью по сравнению с контрольным анализом.
Как уже обсуждалось выше, специфические соединения, модулирующие гемиканалы, будут влиять также и на щелевые соединительные каналы. Например, некоторые соединения могут помогать закрывать гемиканалы и оказывать помощь при открытии щелевых соединительных каналов. Однако другие соединения могут помогать закрывать гемиканалы и в то же время оказывать помощь при закрытии щелевых соединительных каналов. Наконец, одни соединения могут открывать как гемиканалы, так и щелевые контакты, в то время как другие могут закрывать щелевые контакты и гемиканалы.
Таким образом, в изобретении также предлагается способ усиления межклеточных взаимодействий посредством щелевых контактов (ОЛС) в клетке, ткани или органе. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ включает в себя назначение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного соединения, выбранного, как указано далее, из соединений, представленных формулами I и II. Контактирование с соединением предпочтительно достаточно для усиления ОЛС в клетке, ткани или органе по сравнению с подходящим контролем.
Предлагаются также комбинации ίη νίίτο анализов соединений, выбранных для модулирования гемиканалов и щелевых контактов. В одном из способов осуществления настоящего изобретения используют по меньшей мере один из следующих анализов - стандартного ίη νίίτο анализа фосфорилирования коннексина, стандартного ίη νίίτο анализа захвата и стандартного ίη νίίτο анализа объема клетки, в сочетании с одним или несколькими анализами ОЛС, которые описаны у Багкео В. θί а1. в заявке по договору о патентной кооперации с названием Νονθΐ Αηί^а^^йуίйт^с Рерйбек, поданной 22 февраля 2001 г. и опубликованной как РСТ/ОК 01/00127 (\УО 01/62775), или описаны Баглеи. В. θί а1. в другой заявке по договору о патентной кооперации с названием Νθ\υ Мебюа1 Икек οί ШЛасейЫаг Сοттиη^саί^οη Ρас^1^ίаί^ηд Сοтрοиηά8, поданной 22 февраля 2002 г. и опубликованной как РСТ/ϋδ 02/05773 (\УО 02/077017). Примеры подобных подходящих анализов ОЛС включают в себя измерение проводимости клетки с использованием точечных мембранных контактов, измерение волны кальция и анализ переноса красителя. Описание заявок РСТ/ОК 01/00127 (№О 01/62775) и РСТ/ϋδ 02/05773 (№О 02/077017) приводится здесь для справки.
Для иллюстрации, но не с целью ограничить настоящее изобретение, указанный ранее анализ фосфорилирования коннексина применяют для отбора одного или нескольких соединений, модулирующих гемиканал. Одно или несколько соединений могут быть далее отобраны с помощью анализа кардиомиоцитов с использованием точечных мембранных контактов, который приводится в заявке РСТ/ϋδ 02/05773 (\УО 02/077017). Соединения, которые проявляют подходящую активность в обоих анализах, будут обладать способностью модулировать гемиканалы и щелевые контакты.
В изобретении также предлагается метод ίη νίνο тестирования соединений-кандидатов, модулирующих гемиканалы, с целью помочь и возможно количественно оценить их способность модулировать сердечную аритмию. Как уже обсуждалось, полагают, что можно предупредить, облегчить или вылечить сердечную аритмию путем применения одного соединения или комбинации соединений согласно изобретению. Предпочтительная используемая при тестировании ίη νίνο модель, которую в настоящем описании называют стандартным ίη νίνο анализом аритмии у мышей или похожим выражением, приводится в заявке РСТ/ОК 01/00127 (№О 01/62775), а также в заявке РСТ/ϋδ 02/05773 (№О 02/077017). Некоторые соединения согласно изобретению должны при проведении анализа по возможности отсрочить наступление индуцированной предсердно-желудочковой блокады по меньшей мере на 20% (оценка в баллах по крайней мере 2). Другие соединения будут способны по меньшей мере на 60% отстрочить наступление индуцированной предсердно-желудочковой блокады (оценка в баллах по крайней мере 3). В общем случае анализ включает в себя введение одного или нескольких соединений в организм подходящей
- 6 006860 мыши, инъекцию хлорида кальция с целью вызвать аритмию и определение времени начала возникновения аритмии (преимущественно предсердно-желудочковой блокады 2-й степени), по сравнению с соответствующим контролем.
Важно отметить, что использование различных режимов детектирования (т.е. комбинации по меньшей мере одного стандартного ίη νίίτο анализа и ίη νίνο анализа аритмии, как указывается в настоящем описании) позволяет эффективно проводить несколько анализов, тем самым увеличивая точность и вероятность идентификации соединения, модулирующего гемиканалы (например, соединения, представленного формулами I и II) и обладающего высокой терапевтической способностью. Эта особенность настоящего изобретения особенно важна в том случае, когда необходимо провести тестирование большого количества соединений. Например, могут быть подвергнуты испытаниям некоторые или почти все соединения формул I и II. В качестве альтернативы или дополнительно, подходящие соединения могут быть получены с помощью стандартных синтетических методов, в том числе методов комбинаторной химии, а затем аттестованы в соответствии с настоящим изобретением.
Для тех вариантов осуществления настоящего изобретения, в которых применяют различные режимы детектирования, важно отметить, что значительная ίη νίίτο и ίη νίνο активность, которая определяется с помощью приведенных в настоящем описании анализов, не является требуемой особенностью соединения, модулирующего гемиканалы. Таким образом, некоторые из приведенных в настоящем описании соединений будут проявлять хорошую активность по меньшей мере в одном приведенном здесь стандартном ίη νίίτο анализе, но не будут проявлять значительную активность в стандартном ίη νίνο анализе аритмии. В качестве альтернативы, некоторые другие соединения будут проявлять значительную активность в стандартном ίη νίνο анализе аритмии, но не будут показывать хорошую активность в одном или нескольких стандартных ίη νίίτο анализах. Тем не менее, предпочтительно соединение, модулирующее гемиканалы, будет проявлять хорошую активность по меньшей мере в анализах ίη νίίτο и ίη νίνο, приведенных в настоящем описании.
Соединения, обладающие хорошей активностью в стандартном ίη νίνο анализе аритмии, иногда называют антиаритмическими соединениями или похожим образом, с тем, чтобы обозначить способность соединения продлевать время до возникновения аритмии при проведении анализа.
Как будет подробнее рассмотрено далее, соединения согласно изобретению могут применяться для предупреждения или лечения широкого спектра медицинских состояний, которые связаны или предположительно связаны с нежелательным или аномальным прохождением молекул и/или ионов через клеточные мембраны. Например, подобным образом можно рассматривать практически все медицинские признаки, приведенные в публикациях РСТ/ΌΚ 01/00127 (\УО 01/62775) и РСТ/И8 02/05773 (\УО 02/077017). Некоторые из указанных медицинских признаков приводятся в настоящем описании. Симптомы можно предотвратить, облегчить или вылечить, используя комбинацию соединений, приведенных в настоящей заявке, и в частности, соединений, показывающих хорошую активность по меньшей мере в одном из анализов ίη νίίτο и ίη νίνο, приведенных в настоящем описании.
Дополнительные соединения, подходящие для тестирования и применения в соответствии с настоящим изобретением, приведены в заявке Батхен Β.Ό. еί а1. РСТ/ϋδ 02/05773 (\УО 02/077017).
Изобретение включает в себя также способ предотвращения стресса или лечения ткани или органа млекопитающего от стресса. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ включает в себя введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного соединения, выбранного из группы соединений, представленных формулами I и II. Контактирование с соединением предпочтительно является достаточным для того, чтобы предотвратить стресс или вылечить ткань или орган млекопитающего от стресса.
В настоящем изобретении предлагается также способ лечения ожогов, который заключается во введении нуждающемуся в лечении пациенту терапевтически эффективного количества соединения, которое блокирует открытие гемиканала коннексина.
Предлагается также способ лечения тромбоза. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ включает в себя введение нуждающемуся в подобном лечении пациенту терапевтически эффективного количества соединения, которое блокирует открытие гемиканала коннексина.
В соответствии еще с одним аспектом настоящее изобретение включает в себя также способ лечения респираторного и метаболического ацидоза. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ включает в себя введение нуждающемуся в подобном лечении пациенту терапевтически эффективного количества соединения, которое блокирует открытие гемиканала коннексина.
В настоящем изобретении предлагается также способ лечения фокальной аритмии. Один из примеров осуществления способа согласно изобретению включает в себя введение нуждающемуся в подобном лечении пациенту терапевтически эффективного количества соединения, которое блокирует открытие гемиканала коннексина.
Предлагается также способ лечения или предотвращения повреждения клетки или ткани, вызванного повышенным уровнем содержания глюкозы в крови. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ включает в себя введение нуждающемуся в подобном лечении пациенту терапевтически эффективного количества соединения, которое блокирует открытие гемиканала коннексина.
- 7 006860
Изобретение включает в себя также способ лечения хронической фибрилляции предсердий. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ включает в себя введение нуждающемуся в подобном лечении пациенту терапевтически эффективного количества соединения, которое блокирует открытие гемиканала коннексина.
Предлагается также способ лечения эпилепсии. Как правило, способ включает в себя введение нуждающемуся в подобном лечении пациенту терапевтически эффективного количества соединения, которое способствует открытию гемиканала коннексина.
Предлагается также способ цитозащиты ткани или органа млекопитающего, нуждающегося в подобном лечении, при этом способ включает в себя введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного соединения, выбранного из группы, включающей в себя соединения, представленные формулами I и II.
В настоящем изобретении предлагается также способ предотвращения или лечения повреждений, вызванных реперфузией у млекопитающего, при этом способ включает в себя введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного соединения, выбранного из группы, включающей в себя соединения, представленные формулами I и II.
Во всех приведенных выше терапевтических методах соединение согласно изобретению обладает хорошей антиаритмической активностью, которую определяют с помощью стандартного ίη νίίτο анализа аритмии у мышей (т.е. имеет отметку по меньшей мере 2 балла). Подобные соединения по тексту описания настоящего изобретения иногда называют антиаритмическим соединением, или используют похожее выражение.
Дальнейшие применения и преимущества настоящего изобретения станут понятны из приведенного далее описания и примеров. Ниже обсуждаются также другие аспекты настоящего изобретения.
Краткое описание рисунков
На фиг. 1 показаны сайты фосфорилирования в коннексине (Сх43) (Ноззат Μ.Ζ. с1 а1. (8с1епсе'з 81ке 2000; рр 1-5)). Как видно из рисунка, цитозольный домен трансмембранного белка в Сх43 содержит несколько потенциальных для фосфорилирования сайтов серина и тирозина.
На фиг. 2 показан метаболический стресс, вызванный удалением глюкозы. Как видно из графика, введение соединения 1 снижает стресс, о чем свидетельствует сокращение относительной задержки в проводимости.
На фиг. 3А-В приведены иммуноблоты, показывающие обнаружение фосфорилирования тирозина в коннексине 43 (Сх43). На фиг. 3А представлены результаты, полученные при введении соединения 1. На фиг. 3В представлены результаты, полученные при введении соединения 1 и соединения 2.
На фиг. 4А-В приведены иммуноблоты, показывающие обнаружение фосфорилирования тирозина (8 А) и фосфорилирования серина (8В) в Сх43.
На фиг. 5 приведен график, показывающий влияние 10 нМ соединения 1 на вызванное ишемией поглощение кальцеина выращенными кардиомиоцитами.
На фиг. 6А приведен рисунок, на котором представлен предпочтительный режим проведения анализа по методу ЕЫ8Л. На фиг. 6В приведен график результатов анализа ЕЫ8А фосфорилированного Сх43 по сайту Туг-Р в клетках НеЬа. На фиг. 6С приведен график результатов анализа ЕЫ8А фосфорилированного Сх43 по сайту Туг-Р в клетках СНО.
На фиг. 7А-С приведены микрофотографии, показывающие поглощение красителя выращенными кардиомиоцитами. Фиг. А: кардиомиоциты под световым микроскопом; фиг. В: флуоресценция в контрольных условиях (такие же, как для клеток на фиг. А); фиг. С: флуоресценция после 30 мин ингибирования метаболического развития.
На фиг. 8 приведен график, который показывает, что соединение 1, в зависимости от дозы, уменьшает вызванное стрессом поглощение кальцеина.
На фиг. 9А-В приведены графики, которые показывают влияние соединения 1 на вызванное стрессом разбухание клеток. Фиг. 9 А: относительный объем при ингибировании метаболического развития в присутствии или в отсутствие соединения 1 (0,1 нМ). На фиг. 9В приведены контрольные данные.
На фиг. 10 приведен график, который показывает воздействие соединения 1 (0,1 нМ) на вызванное стрессом разбухание клеток.
На фиг. 11 приведен график, показывающий уменьшение массы сердца относительно массы тела после введения соединения 1 крысам с инфарктом миокарда.
На фиг. 12 приведен график, на котором показано уменьшение размера инфаркта у крыс после введения соединения 1.
На фиг. 13 приведен график, на котором показано улучшение сердечной деятельности после введения соединения 1 крысам с инфарктом миокарда.
Подробное описание изобретения
Как уже указывалось ранее, в настоящем изобретении предлагаются соединения и способы их применения с целью модуляции функции гемиканалов. В частности, соединения модулируют фосфорилирование гемиканалов с целью облегчения открытия или закрытия гемиканалов. Предлагаются также методы отбора, которые могут быть применены для обнаружения или определения свойств подобных соеди
- 8 006860 нений, при этом указанные методы отбора включают в себя ίη νίίτο анализы, анализы ίη νίνο или их комбинации. Предлагаются также терапевтические методы, применимые при лечении или предотвращении условий, на которые влияет несоответствие в функционировании гемиканала.
Цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы впервые показать, что на стресс клетки, ткани или органа неблагоприятное воздействие может оказать открытие или закрытие гемиканалов. Не связывая себя какой-либо теорией, авторы полагают, что метаболический стресс, такой как кислородная недостаточность при ишемии, недостаток глюкозы, прерывание окислительного фосфорилирования, вызванное действием Ηί'Ν. или прерывание цикла лимонной кислоты может привести к прерыванию межклеточного взаимодействия посредством щелевых контактов (ОЛС). Авторы также полагают, что указанное прерывание взаимодействия коррелирует с модуляцией фосфорилирования коннексина, в частности, дефосфорилирования тирозиновых остатков в коннексине и/или сериновых остатков в коннексине, или треониновых остатков в щелевом соединительном канале. В качестве иллюстрации, авторы полагают, что при фибрилляции предсердий клетки предсердия испытывают потребность в повышенном метаболизме, вызванном высокочастотной стимуляцией. Предполагается, что это приводит к лактатному ацидозу, открытию гемиканалов и прерыванию щелевых контактов.
Целью настоящего изобретения являются также способы модуляции функции гемиканалов и, возможно, межклеточного взаимодействия посредством щелевых контактов (ОЛС), при этом указанные способы включают в себя контактирование клеток, ткани или органа с терапевтически эффективным количеством одного соединения или комбинации соединений, обладающих указанной активностью. Предпочтительные соединения приводятся в заявках РСТ/ЭК 01/00127 (XVО 01/62775) и РСТ/118 02/05773 (XVО 02/077017) авторов В.Багзеп е1 а1.
Более предпочтительные соединения, подходящие для использования в настоящем изобретении, включают в себя соединения, представленные ниже формулой I
(I) где К1 означает Н или ацетил (Ас),
К2 означает боковую цепочку одной из аминокислот О, Υ, Ο-Υ, Р или О-Р,
К3 означает любую боковую аминокислоту,
К4 означает боковую цепь одной из аминокислот О, Υ, Ο-Υ, Р или О-Р,
К5 означает ОН или ΝΗ2 и а, 8, Τ, Р и Ц являются целыми числами и независимо означают 0 или 1, и их соли.
Конкретные соединения включают соединения, имеющие формулу II
ΚΙ-Χ1-Χ2-Χ3-Β2 п
где
XI означает 0, А1а, С1у, р-А1а, Туг, ϋ-Туг, Аар,
Х2 означает 0, А1а-С1у-Т4с-Рго, А1а-5аг-Нур-Рго, А1а-Азп,
О-Азп-О-А1а, Э-Азп, С1у, А1а, О-А1а, р-А1а, Азп; или
ХЗ означает Туг, Э-Туг. О1у или Рйе и К.1 означает Н или Ас, при условии, что XI и Х2 одновременно не означают 0, и их соли, К2 означает ОН или ΝΗ2.
Более конкретные соединения, представленные выше формулами I и II, включают следующие соединения:
-9006860
Ο-(ϋΒΡ)-Υ-ΝΗ2, , Η-ΟΑ-3ητ-Ηγρ-ΡΥ-ΝΗ2, Η-ΟΑΟ-Τ4ο-ΡΥ-ΝΗ2,
С1у-А1а-Азп-Туг, О-Тут-О-А5п-О-А1а-С1у, ϋ-Τγτ-ϋ-Αδη-ΟΙγ,, , О1у-<31у-Туг, С1у-А1а-Туг, О-Туг-0-А1а-01у,
ΟΙγ-ϋ-Азп-Туг, Ст1у-РА1а-Туг, βΑΙα-βΑΙε-Τγτ, , (Э1у-рА1а-РЬе, СЯу-Авп-РЪе,, Азп-Туг, Ас-Сйу-Туг,
Ас-А1а-Тут, (восстановленныйО1у)-СНу-Туг ( НгК-СНг-СНг-МН-СНг-С^-Туг ), 81у-даЬ-§1у-кур-рго-1уг §1у-бара-§1у-кур-рго-1уг !уг-рго-йур-§1у-§1п-§1у
1уг-рго-Ьур-£1у-а8п-£1у §1у-0аЪ-а1а-§1у-11ур-рго-1уг §1у-с1ара-а1а-§1у-11ур-рго-1уг !ут-рго-11ур-§1у-а1а-£;1п-§1у !уг-рго-Ьур-§1у-а1а-а5П-§1у
С-1уг-В-рго-О-Ьур-21у-П-81а-§1у
О-!уг-О-рго-О-11ур-§1у-В-а5П-§1у
0-1уг-0-рго-0-йур-£1у-0-а1а-0-§1п-§1у
В-1уг-0-рго-0-11ур-§1у-0-а1а-0-а5п-§1у и их соли.
Кроме того, предпочтительные соединения-кандидаты согласно изобретению обладают биодоступностью при оральном введении, которая составляет по меньшей мере 5% по результатам определения с помощью стандартного анализа на биодоступность. В общем случае предпочтительный анализ заключается в интрадуоденальном введении соединения-кандидата подходящему испытуемому субъекту. Затем определяют и, возможно, количественно оценивают доступность соединения в биологическом образце, преимущественно образце крови.
Кроме того, предпочтительные соединения-кандидаты обычно удовлетворяют правилу 5 Липински. Его использование позволяет оценить био доступность. В соответствии с этим правилом, неудовлетворительная адсорбция более вероятна, когда конкретное соединение-кандидат характеризуется следующими особенностями:
1) наличием более 5 доноров водородных связей (выраженных суммой групп ОН и ΝΗ), 2) молекулярной массой более 500, 3) 1о§ Р, превышающим 5, 4) наличием более 10 акцепторов водорода (выраженных суммой групп N или О) и 5) для многих способов осуществления настоящего изобретения следует избегать одновременно наличия двух параметров, выходящих за указанные границы.
- 10006860
Еще более предпочтительные соединения согласно изобретению обладают относительной устойчивостью в плазме крови. Приемлемый анализ включает в себя контактирование требуемого соединениякандидата с плазмой (например, с сывороткой крови крысы, кролика или примата), инкубацию соединения с плазмой и затем определение и, возможно, количественную оценку устойчивости соединения во времени. Преимущественными источниками плазмы являются крысы, собаки, кошки, мыши, свиньи, коровы, лошади и люди. Предпочтительный анализ, который в описании настоящего изобретения называют стандартным анализом на устойчивость в плазме, приводится в заявке РСТ/И8 02/05773 (νθ 02/077017). Типичные примеры соединений, которые проявляют хорошую активность в этом анализе, содержат на С-конце амидные и сложноэфирные группы, включают использование Ό-аминокислот и производных природных аминокислот, Ν-концевые модификации и циклические структуры. Одна такая модификация или комбинация подобных модификаций способна повысить устойчивость, сохраняя при этом значительную биологическую активность.
Наиболее предпочтительные соединения, модулирующие гемиканалы, для применения в настоящем изобретении включают в себя: Ас-О-Туг-О-Рго-О-4Нур-С1у-О-А1а-С1у^Н2 (соединение 1), Ас-С1у-А5пТуг-ΝΗ (соединение 2) и их соли.
Предпочтительные соединения, модулирующие гемиканалы, проявляют значительную активность в одном или в нескольких стандартных анализах ίη νίΐτο и ίη νίνο, приведенных в настоящем описании. Подобные соединения обладают также способностью закрывать или открывать гемиканалы и необязательно модулировать ОЛС. Подходящие соединения предпочтительно усиливают или ослабляют фосфорилирование коннексина 43 (Сх43), которое определяют с помощью стандартного анализа фосфорилирования коннексина ίη νίΐτο. Более специфический анализ контролирует фосфорилирование и/или дефосфорилирование одного или нескольких аминокислотных остатков тирозина, серина и треонина, как показано на фиг. 1. Более конкретный режим анализа включает в себя
1) культивирование популяции приблизительно из 105 клеток в среде, таких как конфлуэнтные или полуконфлуэнтные кардиомиоциты крысы или клетки Н9с2;
2) индуцирование стресса в клетках путем их промывания и последующего культивирования в течение часа или менее в среде, обедненной глюкозой;
3) добавление соединения 1 в среду в концентрации приблизительно от 0,1 приблизительно до 200 нМ на время от 10 мин до 8 ч;
4) лизис клеток и определение изменения в фосфорилировании тирозина, серина и/или треонина в Сх43 относительно подходящего контроля и
5) измерение изменения в фосфорилировании как показателе того, что соединение модулирует гемиканал.
В одном из вариантов осуществления указанного способа стадия 4) обнаружения далее включает в себя тестирование соединения-кандидата с помощью иммунологического анализа или анализа на основе клеточного сортинга. В том случае, когда применяют иммунологический анализ, этот анализ обычно включает в себя контактирование клеток с соединениями-кандидатами в условиях, достаточных для того, чтобы увеличить или уменьшить фосфорилирование коннексина. Способ предпочтительно включает в себя также получение лизата из клеток и определение увеличения или уменьшения фосфорилирования в лизате клеток. Указанное увеличение или уменьшение считают еще одним показателем того, что соединение модулирует гемиканал.
Предпочтительный иммунологический анализ для применения в приведенном способе описан и включает в себя анализ методом иммунопреципитации, анализ с захватом антитела, анализ по методу двухслойного иммуносэндвича, анализ по методу антигенной ловушки, радиоиммуноанализ и т.п. См. обсуждение стандартных иммунологических методов в Е. Η;·π1ο\ν апб Ό. Ьапе, АпбЬоб1С5: А БаЬогаЮгу Мапиа1, Со1б 8рг1п§ Η;·ιγ6ογ ΕαόοηΙοιν (1988); Аи8иЬе1 еΐ а1. (1989) ίη СиггеШ Ρτοΐο^Η ίη ΜοΕαιΙαΓ Βίοΐο§\'. ί. \νίΕ\· & 8οηδ. №\ν ΥογΚ. описание которых приводится здесь для справки.
Предпочтительным иммунологическим анализом является анализ ЕЬ18А. Так, в одном из способов осуществления настоящего изобретения метод далее предпочтительно включает в себя по меньшей мере одну из следующих стадий:
a) нанесение на твердый носитель первого антитела, которое специфически связывает коннексин, преимущественно коннексин 43 (Сх43),
b) контактирование лизата клеток с указанным твердым носителем в условиях, способствующих формированию комплекса связывания между указанным первым антителом и указанным коннексином,
c) контактирование указанного комплекса связывания первое антитело - коннексин со вторым антителом, при этом контактирование проводят в условиях, достаточных для образования специфического комплекса связывания между вторым антителом и любым фосфорилированным коннексином в связующем комплексе первое антитело - коннексин;
6) контактирование указанного комплекса связывания первое антитело - коннексин - второе антитело с содержащим обнаруживаемую метку третьим антителом, которое связывает указанное второе антитело; и
- 11 006860
е) обнаружение присутствия указанного содержащего обнаруживаемую метку третьего антитела на твердом носителе как дополнительный индикатор соединения.
В одном из вариантов осуществления способа согласно изобретению третье антитело, используемое в изобретении, представляет собой соединение, которое содержит обнаруживаемую метку по меньшей мере одного биотина, флуоресцеинизотиоцианата (МТС), тетраметилродаминизотиоцианата (ТК1ТС), радиоактивного йода или пероксидазы. В другом варианте осуществления настоящего изобретения второе антитело является антителом антифосфотирозина. Наконец, еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения второе антитело является антителом антифосфосерина. В некоторых случаях детектирование содержащего обнаруживаемую метку антитела проводят с использованием счетчиков радио- или гамма-излучения.
В другом способе осуществления настоящего изобретения применяемым иммунологическим методом является радиоиммунный анализ. Указанный радиоиммунный анализ предпочтительно включает в себя по меньшей мере одну, а предпочтительно все указанные стадии:
a) перед получением клеточного лизата в клетки вводят обнаруживаемую метку, при этом введение метки проводят в условиях, способствующих мечению фосфорилированного коннексина, предпочтительно коннексина 43 (Сх43),
b) контактирование клеточного лизата с антителом, которое приводит к образованию специфического комплекса связывания с коннексином,
c) отделение комплекса связывания от клеточного лизата, содержащего обнаруживаемую метку,
б) обнаружение содержащего метку и фосфорилированного коннексина как дополнительный показатель того, что соединение модулирует щелевой контакт.
В одном из вариантов осуществления способа согласно изобретению антитело является антителом против коннексина. В другом варианте осуществления настоящего изобретения стадия обнаружения дополнительно включает в себя проведение анализа по методу вестерн-иммуноблоттинга. Радиоиммунный анализ совместим с широким кругом обнаруживаемых меток, однако для многих применений предпочтительным является введение неорганического производного радиоактивного фосфора.
Антитела, которые применяют в соответствии с настоящим изобретением в указанном выше способе, включая антитела антифосфотирозин, антифосфосерин и анти-Сх43, являются коммерчески доступными из различных источников, таких как Американская коллекция типовых культур (АТСС); компании 81дта Сйет1са1 Со., Сент-Луис, Миссури; 2утеб ЬаЬ, 1пс., о£ Са11£отша; и Атегайат Вюкаеисе, Великобритания.
Предпочтительные соединения, модулирующие гемиканалы, идентифицируемые в соответствии с ранее изложенными стандартными ίη νίΐτο тестами, проявляют высокую способность модулировать фосфорилирование Сх43, особенно по одному или нескольким остаткам тирозина, серина и треонина, как показано на фиг. 1. Более предпочтительно указанные соединения вызывают по меньшей мере 5%-ное изменение в указанном фосфорилировании (что измеряют по увеличению или сокращению количества одного или нескольких фосфорилтирозинов, фосфорилсеринов и/или фосфорилтреонинов в Сх43), предпочтительно по меньшей мере приблизительно 10%-ное, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 50%-ное изменение по отношению к находящимся в состоянии стресса клеткам, в которых соединение содержится в концентрации в диапазоне приблизительно от 0,1 нМ приблизительно до 200 нМ.
Конкретные примеры проведения стандартного анализа фосфорилирования коннексина ίη νίίτο приведены далее в примерах 2-5.
Как уже указывалось ранее, в настоящем изобретении рассматривается также стандартный ίη νίΐτο анализ на поглощение, который может быть использован для обнаружения и возможного определения свойств соединений, модулирующих гемиканалы. Анализ можно применять самостоятельно или в сочетании со стандартным анализом фосфорилирования коннексина ίη νίΐτο. Конкретный вариант осуществления стандартного ίη νίΐτο анализа на связывание включает в себя следующие стадии:
1) культивирование в среде популяции приблизительно 105 конфлуэнтных желудочковых миоцитов крысы;
2) индуцирование стресса в клетках путем замены среды на среду, обедненную глюкозой, на время приблизительно менее 2 ч, преимущественно приблизительно на 30 мин;
3) добавление в среду соединения 1 с концентрацией приблизительно от 0,01 пМ приблизительно до 100 нМ,
4) добавление в среду красителя кальцеина с концентрацией приблизительно от 10 приблизительно до 500 мМ на время приблизительно менее 2 ч, и преимущественно приблизительно на 30 мин,
5) определение изменения в поглощении кальцеина клетками; и
6) измерение изменения как показателя того, что соединение модулирует функцию гемиканала.
Стадию обнаружения изменения в поглощении кальцеина можно провести самостоятельно или в сочетании со стандартными методами, в том числе флуоресцентной световой микроскопией и/или родственными методами клеточного сортинга. Конкретный пример выполнения стандартного ίη νίΐτο анализа поглощения см. в примере 6.
- 12 006860
Предпочтительные соединения, обнаруживаемые указанным выше стандартным ίη νίίτο анализом поглощения, проявляют по меньшей мере приблизительно 5%-ное уменьшение поглощения красителя (закрытие клеточных гемиканалов) по сравнению с находящимися в состоянии стресса клетками, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 20%-ное уменьшение, а еще более предпочтительно приблизительно 50%-ное уменьшение в присутствии тестируемого соединения в интервале концентрации приблизительно от 0,01 пМ до 100 нМ.
Как уже обсуждалось, в изобретении предлагается анализ объема клетки ίη νίίτο, при этом указанный анализ можно проводить самостоятельно или же совместно с одним из стандартных анализов фосфорилирования коннексина ίη νίίτο, или же одним стандартным ίη νίίτο анализом поглощения, или же с обоими этими стандартными анализами вместе. Конкретный вариант осуществления стандартного ίη νίίτο анализа объема клетки включает в себя
1) культивирование в среде популяции приблизительно 105 конфлуэнтных желудочковых миоцитов крысы,
2) добавление в клетки приблизительно от 0,5 приблизительно до 100 мМ кальцеина-АМ, предпочтительно приблизительно 5 мМ в течение приблизительно менее чем 2 ч и преимущественно приблизительно в течение 15 мин,
3) оценка объема клеток путем детектирования и, возможно, количественной оценки сигнала от кальцеина-АМ,
4) добавление в среду соединения 1 с концентрацией приблизительно от 0,01 пМ приблизительно до 100 нМ,
5) индуцирование стресса в клетках путем культивирования в среде, обедненной глюкозой,
6) определение изменения в объеме клетки по отношению к контролю; и
7) измерение изменения как показателя того, что соединение модулирует функцию гемиканала.
Стадию обнаружения изменения объема клетки можно осуществить самостоятельно или в сочетании со стандартными методами, включая лазерную конфокальную микроскопию и/или родственные методы клеточного сортинга. Конкретный пример выполнения стандартного ίη νίίτο анализа объема клетки см. в примере 7.
Предпочтительные соединения, обнаруживаемые указанным выше стандартным ίη νίίτο анализом объема клетки, вызывают по меньшей мере приблизительно 5%-ное уменьшение объема клетки (закрытие гемиканалов), по сравнению с находящимися в состоянии стресса клетками, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 20%-ное уменьшение и, еще более предпочтительно, приблизительно 50%-ное уменьшение в присутствии тестируемого соединения в интервале концентрации приблизительно от 0,01 пМ до 100 нМ. Соединения, отбираемые в соответствии с указанным анализом, ингибируют поток осмолитов через гемиканалы и помогают поддерживать нормальный объем клетки в условиях, которые вызывают набухание клеток. Важно то, что набухание клеток связано с нарушениями в органах, окруженных фиброзными капсулами (например, в сердце, почке и скелетных мышцах) или костной тканью (мозг, спинной мозг), а потому соединения, обладающие способностью блокировать гемиканалы, могут применяться при лечении болезней, связанных с набуханием клеток.
Подходящие контрольные эксперименты, как правило, специально приспособлены для применения соответствующего режима проведения анализа. Например, большинство контрольных экспериментов связано с помещением тестируемого образца (например, популяции культивированных кардиомиоцитов крысы) в бесстрессовые условия, такие как инкубация в среде. Как правило, при проведении контрольного анализа параллельно или отдельно вместо тестируемых соединений добавляют воду, буферный раствор, фосфатно-солевой буферный раствор и т.п. Затем проводят требуемый анализ в соответствии со способом согласно изобретению. Специфические примеры выполнения подходящих контрольных анализов приведены в разделе примеров.
Осуществление способа согласно изобретению совместимо с широким спектром обычных идентифицирующих анализов. Подобные анализы, в случае необходимости, можно проводить в ручном, полуавтоматическом или автоматическом режиме. Для применений, когда требуется осуществить быструю или широкомасштабную стратегию отбора, настоящее изобретение также совместимо со стандартными высокопроизводительными или ультравысокопроизводительными методиками отбора. Примеры подобных методов включают в себя иммунологические анализы и анализы типа клеточного сортинга, которые приводятся в настоящем описании.
Как уже указывалось, настоящее изобретение совместимо с широким спектром методик тестирования. Так, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения проводят дополнительное тестирование соединений-кандидатов с помощью ίη νΐνο тестирования, с целью испытания и, преимущественно, подтверждения активности по отношению к модифицированию гемиканала. Например, один метод или комбинация приведенных в настоящем описании стандартных ίη νίίτο методов может быть использована при дальнейшем тестировании соединений на предмет активности при модулировании гемиканалов, например, с использованием модели стандартного ίη νΐνο анализ аритмии. Стандартный ίη νΐνο анализа аритмии у мышей, приведенный в Сравнительном примере 1, описан в заявках РСТ/ОК 01/00127 (АО 01/62775) и РСТ/и8 02/05773 (АО 02/077017) авторов В. Ьа18еп е1 а1.
- 13 006860
Соединения-кандидаты, идентифицированные с помощью одного или нескольких способов согласно изобретению, имеют разнообразные важные применения, включая использование в качестве проб для идентификации щелевых контактов и, в частности, гемиканалов в разнообразных клетках, тканях или органах. Кроме того, подобные соединения могут применяться в качестве проб для обнаружения щелевых контактов и гемиканалов в различных экспериментальных и болезненных состояниях и в качестве проб для обнаружения структур, которые образуют окрашенные и/или фосфорилированные структуры с определенными углеводородами. Подобные соединения могут найти применение в качестве компонентов твердых носителей, с целью очистки компонентов щелевых контактов с использованием стандартных хроматографических методов.
Соединения, отобранные с помощью приведенных в настоящем описании тестов ίη νίίτο и/или ίη νίνο, могут применяться в качестве лекарственных средств с целью предупреждения или лечения состояний, влияние на которые оказывает открытие гемиканалов (увеличенная проницаемость клеточных мембран по отношению к внеклеточным компартментам), например, ран, таких как ожоги, тромбозы, респираторный и метаболический ацидоз, набухание клеток, в частности, вследствие действия бактериальных токсинов или токсинов из окружающей среды, и фокальной аритмии. Другие медикаментозные средства согласно изобретению могут применяться для защиты клеток от разрушительного изменения их объема. Подобные изменения могут быть вызваны одним фактором или сочетанием факторов, включая избыточное тепло, ишемию, токсины, воспаление, отек, возмущение электролитами, повышенный уровень глюкозы и поздние диабетические осложнения. Сюда также относится лечение хронической фибрилляции предсердий, вызванной повышением фосфорилирования серина. Дополнительные соединения могут применяться в качестве лекарственных средств для предотвращения, лечения, облегчения или ослабления тяжести приведенных далее состояний. См. также применения, указанные в заявках РСТ/ΌΚ 01/00127 (№О 01/62775) и РСТ/ϋδ 02/05773 (№О 02/077017).
Терапевтические способы согласно изобретению обычно заключаются в назначении терапевтически эффективного количества одного соединения или комбинации соединений, модулирующих гемиканалы, которые приведены в настоящем описании, субъекту, который нуждается в подобном лечении, такому как млекопитающее и, в частности, примату, такому как человек. Способы лечения согласно изобретению также включают в себя назначение эффективного количества соединения формулы I или II, как указано выше, субъекту, в частности, млекопитающему, такому как человек, нуждающемуся в подобном лечении, в случае проявления указанных в настоящем описании симптомов.
Типичные субъекты включают в себя млекопитающих, страдающих одним из расстройств или сочетанием приведенных в настоящем описании расстройств, включая состояния, рассмотренные ниже в разделах А-К.
А. Нервная ткань.
Хорошо известно, что микроглии являются основными иммунными клетками-эффекторами центральной нервной системы (ЦНС) и что они активируются в ответ на широкий круг повреждений, которые запускают в мозге ответную воспалительную реакцию, и эти повреждения включают в себя ранение головы и ишемию, нейродегенеративные заболевания, аутоиммунные заболевания, инфекционные заболевания, вызываемые прионами заболевания и опухоли мозга. Активированные микроглии мигрируют к поврежденным участкам ЦНС, где они пролиферируют и постепенно удаляют клеточный дебрис. Еидешп с1 а1. показали, что микроглии могут сообщаться друг с другом посредством щелевых контактов, которые индуцируются воспалительными цитокинами (Еидешп е1 а1. Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А, Уо1. 98, 4190-4195, 2001). Это было показано в следующих экспериментах. При колотых ранах микроглии постепенно накапливались в течение нескольких дней и образовывали агрегаты, которые часто проявляли иммуноактивность Сх43 на границах раздела между клетками. В первичной культуре микроглии проявляли низкие уровни активности Сх43, что определялось методом вестерн-блоттинга, методом диффузной внутриклеточной иммуноактивности Сх43 и по низкой вероятности связывания красителя. Обработка иммуностимулятором бактериальным липолисахаридом или цитокинами интерфероном-гамма (ИФгамма) и фактором некроза опухоли альфа (ФНО-альфа) поодиночке не привела к увеличению связывания красителя. Однако обработка микроглии с помощью ИФ-гамма в сочетании с бактериальным липолисахаридом показала значительное усиление связывания красителя, которому препятствовало совместное применение антитела анти-ФНО-альфа, что указывало на высвобождение и аутокринное действие ФНО-альфа. Обработка с помощью ИФ-гамма в сочетании с ФНО-альфа также значительно увеличивала вероятность связывания красителя и уровни Сх43 с транслокацией межклеточных контактов в Сх43. Индуцированное цитокинами связывание обратимо ингибировалось 18-глицирретовой кислотой, которая является блокатором щелевых контактов. Культивированные микроглии мыши также экспрессировали Сх43 и связывали краситель при обработке цитокинами, однако микроглии от гомозиготных мышей, у которых Сх43 отсутствует, не вызывали значительного связывания красителя после обработки ИФ-гамма плюс бактериальный липополисахарид или после обработки ИФ-гамма плюс ФНО-альфа.
Усиленная экспрессия белков щелевых контактов, коннексинов, позволяет клеткам с дефицитом щелевых контактов передавать межклеточные волны кальция. Со1ппа е1 а1. показали, что экспрессия коннексина от пяти до пятнадцати раз усиливает секрецию АТФ слабо связанными клеточными линия
- 14 006860 ми, С6 глиомой, НеБа и И373 глиобластомой. Эти наблюдения показывают, что передача сигналов от клетки к клетке, связанная с экспрессией коннексина, является следствием повышенного высвобождения АТФ посредством гемиканалов коннексина (ί,’οίπηα М.Б. еί а1., Ргос. №111. Асай. 8сй И8А, 1998 Бес. 22; 95(26): 15735-40; СЫпца еί а1.: I. №иго8с1. 2000, Арг. 15; 20(8): 2835-44). Более того, в условиях метаболического стресса (в частности, при ишемии) опосредованное гемиканалами высвобождение АТФ из астроцитов может воздействовать на соседние нейроны и вызывать повышение уровня внутриклеточного кальция, что, в свою очередь, может привести к апоптозу и вызвать смерть нейронов.
Благодаря фосфорилированию, например, тирозина в Сх43 соединением 1 и соединением 2, введение указанных соединений способствует закрытию гемиканалов и облегчает межклеточное взаимодействие микроглии и тем самым усиливает или ускоряет процесс исцеления вышеуказанных заболеваний (воспалительной ответной реакции мозга, включая ранения головы и ишемию, нейродегенеративные заболевания, аутоиммунные заболевания, инфекционные заболевания, вызываемые прионами заболевания и опухоли мозга). Более того, предполагают, что закрытие гемиканалов способно предотвратить высвобождение АТФ и, таким образом, уменьшить распространение первичного повреждения.
B. Легочная ткань: клетки альвеол.
Межклеточные альвеолярные связи посредством щелевых контактов между клетками альвеол важны для осуществления ионного транспорта, передачи механохимических сигналов, регуляции роста клеток и секреции поверхностно-активного фактора (Λδΐιίηο Υ, еί а1. (Ат. I. Р11У8Ю1. Бинд Μο1. Р11У8Ю1. 2000; 279: Б5-Б13)). Ση νΐνο восстановление после острого и хронического воспалительного повреждения альвеолярного участка легкого включает в себя формирование фибронектина как части внеклеточного матрикса (Сйагакй ^.Е. еί а1. (Ат. Κ^ν. Ве8р1г. Ό18. 1993; 148: 467-476) и Το^^каίа С., еί а1. (БаЬ. Чуек!. 1985; 52: 399-408)). Изучение культур альвеолярных эпителиальных клеток показало увеличение количества щелевых контактов параллельно увеличению концентрации внеклеточного фибронектина (АНогй Ай., Вате18 Ό.Ε. (Ат. Б Р11У8Ю1. Биид Се11 Μο1. Р11У8Ю1. 2001; Б680-Б688)). Ш νΐνο исследования на животных моделях показали уменьшение количества щелевых контактов после индуцированного диоксидом азота тяжелого воспаления легких как в клетках альвеол, так и в стенках концевых бронхиолей, альвеолярных проходах и перибронхиальных альвеолах. Было показано, что эти признаки зависят от дозы. Однако если предварительно провести нагревание совместно с таурином, то это прерывание щелевых контактов предотвращается, при этом одновременно воспалительные реакции становятся менее остро выраженными. Аналогичные наблюдения были сделаны после облучения легких у крыс с последующей обработкой химиотерапевтическим соединением - блеомицином.
Таким образом, поддержание взаимодействия посредством щелевых контактов в тканях легкого важно для предотвращения фиброза легких, и меньшее количество коннексина наблюдается как ответная реакция на воспалительный процесс, различные токсические стимулы, такие как газовая ингаляция, деструктивные вещества из воздуха и радиация. Предварительная обработка соединением согласно изобретению, которое фосфорилирует остатки тирозина в Сх43 и способствует закрытию гемиканала и/или возникновению щелевого контакта или взаимодействию посредством щелевых контактов, должна быть предписана перед проведением терапевтического облучения в тех случаях, когда поражаются легкие, в частности, при раке легких, лечении рака груди, рака щитовидной железы и рака желудка.
Лечение с применением соединения, которое выступает посредником при закрытии гемиканала и/или возникновении щелевого контакта, будет препятствовать дальнейшему ухудшению функции легких при эмфиземе, асбестозе, силикозе, фиброзе легких, пневмоните, медикаментозном фиброзе легких и у пациентов, подвергавшимся действию токсических легочных газов, таких как диоксид азота. Лечение предпочтительно проводят в дополнение к обычному лечению указанных состояний. Соединение согласно изобретению может вводиться перорально, парентерально, интраназально или путем ингаляции легких.
C. Гладкие мышцы.
1. Сосудистая система.
Межклеточное взаимодействие посредством щелевых контактов играет фундаментальную роль в регуляции и модулировании тонуса миоцитов сосудов по всему дереву сосудов (С11П81 С. Б еί а1., С1гс. Век. 1996; 79: 631-646). Еще одной важной ролью взаимодействия щелевых контактов является распространение гиперполяризации среди клеток гладких мышц, которые участвуют в релаксационной ответной реакции сосудов (Вету ББ., еί а1., РЬ.у8ю1. Неай С1гс. РЬ.у8ю1. 1994; 266: Н1465-72).
Специальные функции эндотелия требуют межклеточного взаимодействия посредством щелевых контактов между клетками эндотелия внутри монослоя и между эндотелием и другими клетками, находящимися в стенке сосуда. Взаимодействие между указанными различными типами клеток посредством щелевых контактов в коронарных капиллярах, а также во всех других сосудах было документально подтверждено в ряде исследований. Подтверждено также их участие в адаптивном артериогенезе (Са1 ^.-Б е1 а1., Б Μο1. Се11 Сагйю1. 2001; 33: 957-67, №аид Н.-Ζ. Εί а1., Ат. Б РЬу8ю1. Се11 РЬу8ю1. 2001; 281: С7588, 8с1и.181ег А. Εί а1. Ат. Б РЬ.у8ю1. Неай Спс. РЬ.у8ю1. 2001; 280: Н1088-96).
В различных патологических ситуациях с сосудами, когда повреждается слой эндотелия, например, при гиперхолестеринемических поражениях, вызванных питанием, взаимодействие щелевых контактов в
- 15 006860 гладких мышцах сосудов снижается (Ро1асек Ό. с! а1., I. Уакс. Кек. 1997; 34: 19-30). Рана в слое клеток эндотелия наблюдается при венозном застое и при развитии тромбофлебита. Катек В.К. е! а1. в публикации Мо1ес. Βίο1. Се11 2001; 12: 831-845 достоверно продемонстрировали, что взаимодействие посредством щелевых контактов служит для координации миграции клеток при восстановлении эндотелия, а также имеет важное значение для образования отростков капилляров при ангиогенезе.
Лечение с применением соединений согласно изобретению, которые способствуют закрытию гемиканалов и/или способствуют взаимодействию посредством щелевых контактов, будет устранять нарушения в межклеточных взаимодействиях в пораженной части сосудов и будет особенно полезно при ишемии органа, в частности, при перемежающейся хромоте сердца и инфаркте миокарда.
Однако после повреждения сонной артерии у человека, вызванного баллонным катетером, процесс заживления сосудов характеризуется усилением взаимодействия посредством щелевых контактов (Уе11 Н.к е! а1. Аг1егюкс1е. ТИготЬ. Уаке. Βίο1. 1997; 17: 3174-84). Подходящие соединения согласно изобретению вводят перед баллонным вмешательством, и предпочтительно их используют в качестве дополнительной терапии к обычному медикаментозному лечению указанного состояния. Введение соединения согласно изобретению преимущественно осуществляют парентерально. Эффект может быть проверен в образце ткани, взятой до и в различное время после нанесения повреждения баллонным катетером. Более быстрое заживление поверхности эндотелия можно наблюдать в обычный микроскоп. Обнаруживается также улучшение взаимодействия посредством щелевых контактов. См. также Апегюкс1е. ТИготЬ. Уакс. Βίο1. 1997; 17: 3117-84.
2. Эректильная дисфункция.
В пещеристых телах посредством щелевых контактов образуется сеть синцитиальных клеток, что является критическим для эректильной функции и создает условия для однородной и координированной реакции клеток пещеристых тел и артериальных клеток гладких мышц пениса (С11пк1 С.1. (ΙηΣ. 1. [ιπροΐ. Кек. 2000; 12 кирр1. 4: 815-25), Ме1тап Α. СИпк! 1.С. (υτο1ο§. С1ш. ΝοΠίι Атепса 2001; 28: 217-31)). Нарушение эректильной функции наблюдается при диабете, артериосклерозе, различных неврологических заболеваниях и многих хронических заболеваниях. При изучении диабета обратная корреляция между иннервацией нейронов и межклеточным связыванием указывает на потенциальную функциональную пластичность окружения телец, хотя и не устанавливает функциональное межклеточное взаимодействие посредством щелевых контактов.
Лечение с применением соединения, которое способствуют закрытию гемиканалов и/или способствует установлению щелевых контактов, будет улучшать взаимодействие посредством щелевых контактов и тем самым нормализовать комплексную координацию между клетками гладких мышц в пещеристых телах и сосудами.
1η νίνο фармакологическое тестирование соединений согласно изобретению при эректильной дисфункции может быть проведено через 10 недель после того, как у крыс (в возрасте 8 недель) вызывают диабет действием стрептозотоцина (35 мг/кг внутрибрюшинно), как описано в публикации Ке11тап 1. е! а1. (Ат. 1. РЬукю1. 1997; 272: Н1960-71). Измеряют рефлексы полового члена и внутриполостное давление при локальном и системном введении различных доз различных соединений, модулирующих гемиканалы, с использованием измерений и методик, которые описаны той же самой исследовательской группой. Можно наблюдать усиление на 25% и более рефлексов полового члена и увеличение внутриполостного давления.
Лечение эректильной дисфункции можно проводить либо местно для полового члена в виде подкожных инъекций, либо вводить лекарство перорально. Лечение может представлять собой самостоятельную терапию или же дополнительную терапию к обычным способам лечения указанного состояния.
3. Недержание.
Гладкие мышцы мочевого пузыря характеризуются фазовым сокращением и обладают способностью к спонтанному фазовому сокращению. Тем не менее, мочевой пузырь в здоровом состоянии способен содержать несколько сотен миллилитров мочи без увеличения внутрипузырного давления. В противоположность нормальному мочевому пузырю, в неустойчивом мочевом пузыре самопроизвольно развивается внутрипузырное давление, вызванное острым недержанием (Титет \У.Н.. Втадшд А.Р. (РИатта^! ТИегар. 1997; 75: 77-110)). По сравнению с гладкими мышцами желудочно-кишечного тракта, гладкие мышцы мочевого пузыря не могут спонтанно генерировать координированные сокращения (Хегенк К.1. е! а1. (Ат. 1. РИукю1. 199; 2777: С448-60), НакЫ!аш Н. е! а1. (1. РИукю1. 2001; 530: 273-86)). Недавно были установлены как электрические, так и морфологические взаимодействия посредством щелевых контактов между клетками гладких мышц в мочевом пузыре (НакЫ!аш Н. е! а1. (1. Р11укю1. 2001; 530: 273-86), XV а мд Н.-Ζ. е! а1. Шгокду 2001; 8ирр1. 6А: 111)). Важность указанных щелевых контактов была продемонстрирована с помощью специфического ингибирования взаимодействий. Волны спонтанного возбуждения в гладких мышцах мочевого пузыря передаются посредством щелевых контактов.
Неконтролируемое острое недержание, таким образом, можно регулировать путем лечения с использованием соединения, закрывающего гемиканал, или соединения, устанавливающего щелевой контакт. Введение осуществляют парентерально, перорально или непосредственно в мочевой пузырь. Ука
- 16 006860 занное введение может быть проведено в качестве дополнения к медикаментозному лечению, направленному на нормализацию сокращений мышц в мочевом пузыре.
Миоэпителиальные клетки, расположенные в подчелюстных железистых протоках, в мочеточнике, в желчных протоках, поджелудочной железе, слезных канальцах объединены с помощью щелевых контактов, и межклеточные взаимодействия важны для синхронизации сократительных функций миоэпителиальных клеток (Таиднет Я., 8сЬт11ет А. (Се11 Т1ззие Яез. 1980; 206: 65-72)). Нарушение сокращения в указанных протоках может быть нормализовано лечением с использованием соединений, закрывающих гемиканалы, или соединений, устанавливающих щелевой контакт, которые водят как парентерально, так и перорально.
Ό. Заживление.
Профилактический эффект от лечения с применением агента, закрывающего гемиканал, или агента, открывающего щелевой контакт, такого как соединение 1 или соединение 2, может быть протестирован с помощью экспериментального устройства, которое описано Уе11 Η.Σ. еί а1. (Айетюзс1е. ТИгошЬ. Уазс. Βίο1. 1997; 17: 3174-84). Соединение 1 или соединение 2 можно вводить до проведения баллонного вмешательства, с помощью доз в интервале от 10-11 до 10-8 в зависимости от биокинетики соединения согласно изобретению, в частности, определяемой в модели с применением индуцированной кальцием аритмии, которая рассмотрена ранее. Образцы ткани могут быть взяты до и через разные промежутки времени после повреждения баллонным катетером. Быстрое заживление поверхности эндотелия можно наблюдать в обычный микроскоп. Введение соединения согласно изобретению можно осуществить, в частности, парентерально.
Заживление протекает в виде серии перекрывающихся фаз, которые начинаются с гемостаза (коагуляции). Вторая стадия процесса заживления представляет собой каскад воспалительных ответов, когда микрофаги накапливаются по месту раны, и начинается образование грануляционной ткани, в котором, среди прочих компонентов, принимают участие фибробласты и лимфоциты. Затем клетки эпителия начинают мигрировать от границ раны и покрывают всю ее поверхность. Происходит также образование отростков капилляров в направлении от нормальной ткани в сторону раны, с тем, чтобы обеспечить поступление питательных веществ, кислорода и различных клеток. Все клетки в целом и клетки эндотелия капилляров осуществляют активные межклеточные взаимодействия посредством щелевых контактов (АЬки11аИ К.М. еί а1. (Έηάο^ίικ. 1999; 10: 35-41)). Области с низким поступлением кислорода и/или высокой концентрацией свободных радикалов часто видны в ранах с некротическими тканями, при диабете, при артериосклерозе, хирургических ранах, эдеме, инфекции, ожоговых ранах и при венозной недостаточности с ослабленным взаимодействием посредством щелевых контактов (Наду Σ.Ρ еί а1. Се11 Οτο\νί1ι Όίί£. 1996; 7: 745-51).
Лечение с применением соединения, закрывающего гемиканал, или соединения, открывающего щелевой контакт, обеспечивает максимальное взаимодействие посредством щелевых контактов между различными клетками, которое, как полагают, играет важную роль в сложном процессе заживления, а потому ускоряет заживление раны. Соединения согласно изобретению вводят местно, системно или перорально.
Е. Диабетическая ретинопатия.
Диабетическую ретинопатию можно диагностировать очень рано после возникновения заболевания путем определения изменений в скорости потока крови крыс (Вигзе11 8.-У., еί а1. (Сигг. Еуе Яез. 1992; 11: 287-95), разрушения гематоретинального барьера (Синка-Уах Σ.Ο. еί а1. (Вг. Σ. Οрйίйа1тο1. 1975; 59: 64956), Όο Сатю А., еί а1. (Ехр. Еуе Яез. 1998; 67: 569-75)) и/или потери авторегуляции (Κοίιικτ Е.М., Ρаίе1 V., Яаззат 8.М.В. (^^аЬеίез 1995; 44: 603-607)). С помощью методики переноса радиоактивного индикатора или методики точечной фиксации потенциала на мембране с использованием двойной ячейки Оки Н., еί а1. (Iηνезί Ορ1ιί1ιη1ιηο1. У1з. 8ск 2001; 42: 1915-1920) продемонстрировали наличие интенсивного взаимодействия по типу клетка-клетка. Закрытие путей щелевых контактов разрушает многоклеточную организацию микрососудов сетчатки и способствует диабетической дисфункции сосудов сетчатки. Ζΐιοιι Ζ.Υ., еί а1. (№ι.ιτο3^ι^ 2001; 102: 959-67), кроме того, показали, что при введении глутатиона в процессе разрывания и повторного образования щелевых контактов принимает участие активный кислород.
Воздействие соединений, закрывающих гемиканалы, на диабетическую ретинопатию можно изучать ίη νίίτο, применяя описанную ранее мышиную модель с индукцией диабета с помощью стрептозотоцина. Свежевыделенные микрососуды сетчатки (8акадатт К., еί а1., ί. Р11узю1 (Ροηά). 1999; 521: 637-50) переносят на покровное стекло, как описано у Оки Н., еί а1. (Iηνезί Ορ1ιί1ιη1ιηο1. У1з. 8ск 2001; 42: 19151920). В полученном препарате с помощью красителя или радиоактивной метки измеряют межклеточное взаимодействие между клетками в стенке сосуда. Могут быть исследованы различные концентрации в диапазоне 10-10-10-7 М соединений согласно изобретению, в частности, соединения 1 или соединения 2, которые открывают щелевые контакты, при этом в пораженной диабетом сетчатке наблюдается значительное усиление межклеточных взаимодействий по сравнению с базовым уровнем. Аналогичные улучшения наблюдаются, когда сравнивают с контролями (здоровые животные). Лечение может быть системным, местным или пероральным. Терапия преимущественно является дополнением к обычному лечению диабета.
- 17 006860
Повышение степени закрытия гемиканалов или улучшение взаимодействия посредством щелевых контактов, которые вызываются лечением с применением соединений, которые способствуют фосфорилированию тирозина в Сх, оказывает благотворное воздействие не только на диабетическую ретинопатию, но и на другие сосудистые аномалии в сетчатке, например, на артериосклероз.
Р. Сердечные расстройства.
1. Предсердно-желудочковая блокада.
Межклеточные взаимодействия в предсердно-желудочковом узле сердца поддерживаются с помощью щелевых контактов. Снижение их функции приводит к снижению проводимости и может привести к полной предсердно-желудочковой блокаде.
Предсердно-желудочковая блокада наблюдается при остром инфаркте миокарда, при ишемической болезни сердца, интоксикации при отравлении препаратами наперстянки, интоксикации блокаторами кальциевых каналов, и соединения, закрывающие гемиканалы, улучшают предсердно-желудочковую проводимость. Введение соединения, закрывающего гемиканалы, должно осуществляться парентерально или перорально.
2. Фибрилляция предсердий.
Ναηο е! а1. 2001 обнаружили пониженное фосфорилирование серина в коннексине 40 в клетках миокарда пациентов, страдающих от хронической фибрилляции предсердий. Известно, что пониженное фосфорилирование серина в коннексине связано с разрывом во взаимодействии клеток, которое может привести к фибрилляции предсердий. Если это состояние хронической фибрилляции предсердий одновременно характеризуется пониженным фосфорилированием тирозина в коннексине, то лечение с применением такого соединения, как приведенные в настоящем описании соединения 1 или 2, может увеличить фосфорилирование тирозина, закрыть гемиканал, открыть щелевые контакты и устранить причины возникновения фибрилляции предсердий.
3. Ишемия/повреждение, вызванное реперфузией.
При региональной ишемии сердце подвергается метаболическому стрессу, который вызывает набухание клеток, что, в свою очередь, приводит к росту давления в ткани и снижает перфузию тканей, граничащих с зоной ишемии. Полагают, что уменьшение перфузии пограничной с ишемией зоны способствует постепенному распространению инфаркта, что сопровождается дальнейшим ухудшением сердечной функции. Как показано в примерах 7 и 8, соединение 1 препятствует набуханию клеток при ишемии, уменьшает область инфаркта и предупреждает ухудшение сердечной функции после инфаркта миокарда.
Далее у пациентов с инфарктом миокарда коронарная перфузия восстанавливается либо после введения тромболитического агента, либо с помощью чрескожной транслюминальной коронарной ангиопластики (РТСА). Хотя восстановление потока крови является необходимым условием для восстановления функции миокарда, сама реперфузиия после ишемии может привести к дополнительному повреждению тканей помимо того, которое возникло под действием ишемии - это явление известно как повреждение, вызванное реперфузией. Механизмы, которые предположительно вносят свой вклад в повреждение, вызванное реперфузией, включают в себя повышенное содержание свободных радикалов кислорода, опосредованное нейтрофилами повреждение миокарда, повышенное содержание внутриклеточного кальция и осмотические изменения в клеточном окружении (\Уапд е! а1., Сатбюуакс. Вех. 2002 Л.11; 55(1): 25-37. Обзор).
Считается, что осмолярность жидкостей в организме строго контролируется, так что большинство клеток в нормальных условиях не испытывает изменений в осмотическом давлении, однако осмотические изменения могут происходить во время патологических состояний, таких как ишемия, септический шок и диабетическая кома. Первичный эффект от изменения осмолярности проявляется в остром изменении объема клетки. Если осмолярность в окружении клетки понижается, то она набухает, если осмолярность повышается, то клетка сжимается. Для того, чтобы выдерживать изменения в осмолярности, клетки выработали механизм, регулирующий их объем, который активируется осмотическим изменением, с целью нормализовать объем клетки и поддерживать ее нормальные функции. С осмотическим стрессом сердца сталкиваются в период ишемии миокарда, когда внутри клеток и в определенной степени вне клеток накапливаются метаболиты, такие как лактат, которые вызывают разбухание клетки. Это набухание может затем обостряться при реперфузии, когда гиперосмотическая внеклеточная среда заменяется нормальной осмотической кровью, и даже может привести к разрыву мембран клеток сердца (\Угщ111 А.В., Веех Б.Л. Рйаттасо1. Тйет. 1998 Ос!; 80(1): 89-121. Обзор). Таким образом, полагают, что соединения, отобранные в соответствии с настоящим изобретением, будут предотвращать повреждение миокарда в процессе реперфузии, например, по механизму, аналогичному эффекту, описанному в примере 7 (фиг. 9А).
Далее, сообщалось, что в процессе обычно применяемой операции чрескожной транслюминальной коронарной ангиопластики атеросклеротическая бляшка разрывается, что приводит к микроэмболизации в микроциркуляции дистально по отношению к месту проведения операции чрескожной транслюминальной коронарной ангиопластики и сопровождается быстрым развитием сердечной недостаточности и повышенной смертностью (Неппсщех Е Р. е! а1. Еиг. Неаг! Е 2002 Ди1; 23(14): 1112-7). Как показано в примерах 7 и 8, соединение 1 предотвращает набухание клеток при ишемии, уменьшает размер инфаркта и
- 18 006860 препятствует ухудшению сердечной функции после инфаркта миокарда, и указанные свойства соединений снижают повреждение после реперфузии.
Таким образом, в настоящем изобретении предлагается способ цитозащиты ткани или органа млекопитающего, нуждающегося в подобном лечении. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ включает в себя введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного соединения, выбранного из группы, включающей в себя соединения, представленные формулами I и II. Под выражением цитозащита понимают снижение, предотвращение или облегчение симптомов, связанных с нежелательным набуханием клетки. Конкретные ткани или органы, на которые благоприятное воздействие оказывает указанный способ, включают в себя ткани или органы, которые ограничены фиброзными капсулами или на которые каким-либо другим образом воздействуют фиброзные капсулы, т.е. такие органы, как сердце или почка. Сюда же относятся ткани, связанные с костями, такие как мозг, спинной мозг и костный мозг.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ далее включает в себя воздействие на ткань или орган млекопитающего ишемических условий, подобных тем, которые рассматриваются в настоящем описании. Примером является инфаркт миокарда (сердечный приступ), в котором ишемия связана с пагубным набуханием клеток миокарда. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения подобное набухание можно уменьшить или предупредить путем введения млекопитающему по меньшей мере одного соединения Αο-0-ΤγΓ-Ό-ΡΓο-0-4Ηγρ-61γ-Ό-Α1α-61γ-ΝΗ2 (соединение 1) и Αο-61γ-Αδη-ΤγΓ-ΝΗ2 (соединение 2).
Как уже обсуждалось, в настоящем изобретении предлагается способ предотвращения или лечения повреждения после восстановления перфузии у млекопитающего. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ включает в себя введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного соединения, выбранного из группы, включающей в себя соединения, которые представлены формулами I или II. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения способ далее связан с сердцем млекопитающего в состоянии инфаркта. В соответствии с указанным способом, обычно необходимо как можно быстрее восстановить коронарную перфузию. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способ включает в себя также введение тромболитического агента (например, тканевого активатора плазминогена (ТРА)) или проведение коронарной ангиопластики, с целью установления коронарной перфузии в сердце, пораженном инфарктом. В одном из способов осуществления настоящего изобретения соединение является по меньшей мере одним из Ле-Э-ТугΌ-ΡΓο-Ό-4Ηγρ-61γ-Ό-Α1α-61γ-ΝΗ2 (соединение 1) и Αс-61у-Α8η-Τу^-NΗ2 (соединение 2).
С. Иммунология: созревание клеток.
Взаимодействия типа клетка-клетка имеют решающее значение для созревания и активации лимфоцитов. Большое количество молекул мембраны обеспечивает межклеточную адгезию и дает возможность передачи сигнала от клетки к клетке в процессе миграции клеток и их активации в иммунной системе. Циркулирующие Т-, В- и ΝΚ-лимфоциты экспрессируют Сх43, и с помощью методов с использованием красителей, как уже указывалось ранее, были продемонстрированы активные щелевые контакты между клетками. Было также показано, что уменьшение межклеточного взаимодействия посредством щелевых контактов заметно снижает секрецию ЦМ, ЦС и [βΑ, указывая на то, что передача сигнала через щелевые контакты является важным компонентом механизма, лежащего в основе метаболической кооперации в иммунной системе (Ο\Κάο-ΟΠ;·ι Е., еί а1. (Iттиηο1οду, 2000; 99: 578-90), Оν^еάο-О^ίа Е., еί а1. (ΡΑ8ΕΒ, 2001; 15: 768-774)).
При субхроническом или хроническом воспалении желательно локальное усиление синтеза иммуноглобулинов независимо от этиологии. Во время воспаления ткань часто отличается от нормальной здоровой ткани, и низкое парциальное давление кислорода вызывает разрыв межклеточного взаимодействия посредством щелевых контактов. Важное значение низкого давления кислорода для разрыва СЛС было доказано в нескольких различных клеточных системах и заставляет предположить, что давление кислорода является универсальным регулятором СЛС. Указанное прерывание взаимодействия является результатом измененного фосфорилирования тирозина, и/или серина, и/или треонина коннексина в щелевых соединительных каналах, и введение соединения согласно изобретению, такого как рассматриваемое в настоящем описании соединение 1 или 2, будет противодействовать этому эффекту, закрывать гемиканалы и восстанавливать СЛС.
Н. Улучшение 6ЛС.
Существуют в основном два пути поддержания СЛС - либо путем поддержания щелевых соединительных каналов в открытом состоянии, либо путем облегчения стыковки гемиканалов. При лечении или предупреждении болезненных состояний, которые характеризуются наличием условий ишемии, оба эти пути являются предпочтительными или рекомендуемыми.
В первичных культурах желудочковых кардиомиоцитов новорожденных крыс кислородная недостаточность или недостаток глюкозы приводят к уменьшению приблизительно на 50% индуцированной норадреналином стимуляции оборота фосфоинозита по отношению к уровню при нормальных атмосферных условиях и нормальных условиях питания. Было показано, что соединение 1, являющееся модификатором щелевых контактов, нормализует указанное ухудшение индуцированной норадреналином
- 19 006860 стимуляции оборота фосфоинозита при кислородной недостаточности и недостатке глюкозы путем повышения оборота фосфоинозита до уровня приблизительно 90% от нормального уровня. Более того, было показано, что соединение 1 не изменяет индуцированный норадреналином уровень оборота фосфоинозита при нормальных атмосферных условиях и нормальных условиях питания (Ме1ег Е. апб Веск М.М.: 2001 1п!егпа!юпа1 Сар бипс!юп СопГегепсе, Аид 4-9, 2001, На\\'аи. И8А, аЬк!гас! по. 132). Аналогично, в выращенных культурах остеобластов человека и в клеточной линии остеосаркомы остеобластов крыс гипоксия уменьшает волну внутриклеточного продвижения кальция, что измеряют путем переноса красителя после инъекции флуорофора ЬисгГег Уе11о\\\ Уменьшение можно полностью обратить лечением с применением соединения 1 (Тейтапп 8.С. е! а1.: 2001 1п!егпа!юпа1 Сар бипсбоп СопГегепсе, Аид 4-9, 2001, Натай, И8А, аЬк!гас! по. 176).
Вследствие разрыва клеточных взаимодействий, например, при воспалении, соединение, которое закрывает гемиканалы и открывает щелевые контакты, будет улучшать синтез иммуноглобулинов при воспалении.
1. Заболевание периферической нервной системы и невропатическая боль.
Сообщалось, что при заболевании периферической нервной системы и при невропатической боли, проявляющихся при диабете, при диализе, при циррозе печени и многих других условиях, принимают участие как соматические нервы, так и пучки вегетативных нервных волокон. Точный механизм поражения периферических нервов в различных условиях в настоящее время изучается, однако было описано разрушение нервных окончаний, уменьшенная проводимость, разрушение миелинового слоя и усиление воспалительной ответной реакции. Общим для различных состояний в условиях проведения эксперимента является то, что наблюдается повышенное содержание свободных радикалов, повышенное содержание оксида азота, наличие кислородного стресса и отсутствие поглотителей свободных радикалов, а также регистрируется ослабление взаимодействия посредством щелевых контактов (Рйге Э.А. е! а1. (№игоксй Ьей. 2001; 303: 67-71), Во1апок ЕР., Мебта ЕМ. (1. Ыеигосйет. 1996; 66: 2019-9), Ьоте Р.А., Мскапбег К.К. (Э1аЬе!ек 1991; 40: 873-7), Ьеуу Ό. е! а1. (Ыеигокс1. Ьей. 1999; 260: 207-9), Вгпххопе В., Векко! С. 1. Еиг. Ыеигоксй 1997; 9: 1-6)). Таким образом, соединение согласно изобретению, которое способствует закрытию гемиканалов путем фосфорилирования коннексина гемиканала, будет оказывать благотворное воздействие при лечении заболевания периферической нервной системы. Соединение назначают парентерально.
1. Ослабление слуха.
Потеря слуха, вызванная шумом, и старческая тугоухость, которые, как известно, вызываются продуцированием свободных радикалов, связаны с ингибированием взаимодействия посредством щелевых контактов между клетками Генсена и ядром Дейтерса и органом Корти в улитке внутреннего уха (Тоб! I. е! а1. (1. МетЬгапе Вю1. 2001; 181: 107-114), В1акйк 8. е! а1. (РЫцпдегк Агсй. 2000; 440: 710-12), Ьадок!епа Ь. е! а1. (б. Рйукю1. 2001; 531: 693-707)). Взаимодействие посредством щелевых контактов между указанными стромальными клетками улитки обеспечивает важный гомеостаз сенсорных нейронов и, таким образом, обеспечивает нормальную нейронную активность волосковых сенсорных клеток (внутреннего уха) (бо11пк!опе В.М. е! а1. (б. Рйукю1. 1989; 408: 77-92)). Указанные взаимодействия прерываются при окислительном стрессе (Тоб! I. е! а1. (б. МетЬгапе Вю1. 2001; 181: 107-114)). Приобретенная или возрастная потеря слуха предупреждается при лечении соединением, которое может увеличивать фосфорилирование остатков тирозина в гемиканалах коннексина (закрывает гемиканалы) и поддерживать взаимодействия посредством щелевых контактов в клетках стромы. Подходящее соединение согласно изобретению можно назначать парентерально.
Меланоциты в вестибулярном лабиринте участка темных клеток эпителия интенсивно взаимодействуют посредством щелевых контактов и могут играть роль при транспортировке вещества между эндолимфой и перилимфой, а также могут иметь важное значение для поддержания гомеостаза микроокружения внутреннего уха (Макиба М. е! а1. (Апа!. Век. 2001; 262: 137-146)). Эндолимфатическая водянка связана с различными клиническими состояниями, которые характеризуются головокружением и ослаблением слуха. Пониженная способность взаимодействий посредством щелевых контактов может играть важную роль при регулировании трансмембранного транспорта нескольких веществ, изначально секретируемых и выделяемых при посредничестве специфических типов транспортеров.
К. Возрастная анемия и трансплантация костного мозга.
Данные о существовании функциональных щелевых контактов между кроветворными клеткамипредшественниками и клетками стромы в микроокружении кроветворных тканей в течение многих лет были противоречивыми, однако исследования доказали существование у человека взаимодействий посредством щелевых контактов (Вокепбаа1 М. е! а1., Тйкие Се11. 1991; 23: 457-470), Энид б. е! а1. (Вгй. б. Наета!о1. 2000; 111: 416-25)). Было также показано, что взаимодействие является бинаправленным, что подтверждает гипотезу о том, что клетки стромы контролируют пролиферативное поведение кроветворных клеток-предшественников, но их функциональный статус может также регулироваться незрелыми кроветворными клетками (Сир!а Р. е! а1. (В1ооб, 1998; 91: 3724-3733)).
С возрастом функциональность кроветворных тканей понижается, и часто у пожилых людей наблюдается анемия.
- 20 006860
Сниженная способность кроветворных тканей наблюдается также при злокачественном развитии болезней кроветворных тканей и после лечения химиотерапевтическими средствами. Для предотвращения пангемоцитопении применяют трансплантацию донорского костного мозга.
Воздействие соединения согласно изобретению, которое помогает закрывать гемиканалы и/или облегчает взаимодействие посредством щелевых контактов, будет исследовано для прошедших предварительную обработку крыс, которым вводили большие дозы циклофосфамида. У этих животных костный мозг перестает продуцировать зрелые кроветворные клетки. Количество ретикулоцитов в разные промежутки времени после действия циклофосфамида будет значительно больше у животных, которым предварительно вводили соединение 1, фосфорилирующее тирозин коннексина, в виде раствора в количестве 100 мкл, в котором концентрация соединения 1 составляла приблизительно от 10-10 М до 10-8 М, по сравнению с животными, не проходившими лечение соединением 1. Походящие соединения согласно изобретению назначают парентерально.
Ь. Гипофункция гипофиза и гипоталамуса.
Гормонам из железы аденогипофиза свойственны циркадные вариации в секреции в течение минут, часов, дней и времен года. Часть нервной системы, которая отвечает за биологический ритм, локализуется в парной структуре, расположенной в гипоталамусе, известной как супрахиазматическое ядро. В этом центре биологические часы являются свойством индивидуальных клеток. Тем не менее, координированная электрическая активность соседних клеток опосредована взаимодействием через щелевые контакты (Со1^е11 С.8. (I. №игоЫо1. 2000; 43: 379-88)). Поскольку в аденогипофизе отсутствует прямая иннервация, то опосредованные щелевыми контактами взаимодействия клеток друг с другом в железе должны быть незаменимыми для их адекватной координации и синхронизации, которые необходимы для обеспечения соответствующей и своевременной секреции гормонов (Уйа1е Μ. Ь. е! а1. (Βίο1. Верого. 2001; 64: 625-633)). биеппеаи КС. е! а1. (I. Вю1. СНет. 1998; 273: 10389-95) сделали вывод, что спонтанно активные эндокринные клетки представляют собой либо отдельные единицы, либо организованы в синхронизированные ансамбли, взаимодействующие посредством щелевых контактов, которые разбросаны по всей железе аденогипофиза. Синхронность между спонтанно возбуждаемыми клетками может помочь сформировать конфигурацию базовой секреции. В железе аденогипофиза гормон роста, пролактин, гормон коры надпочечников, тиреотропный гормон и гонадотропный гормон гонадотропин синтезируются под контролем со стороны стимулирующего гормона гипоталамуса. Поэтому один из механизмов возникновения аритмии в одной из систем сложных гипоталамо-гипофизарно-эндокринных желез также связан с ослаблением взаимодействия посредством щелевых контактов. Соответствующие заболевания включают в себя протекающий без явных симптомов диабет, гипогонадотропный синдром, микседему, гипофункцию надпочечников и карликовость. Симптомы могут быть улучшены за счет лечения с применением подходящего соединения согласно изобретению, которое предпочтительно открывает щелевые контакты.
От оптимального взаимодействия посредством щелевых контактов зависят также нейроны в супрахиазматическом ядре. В указанной выше системе соединение, открывающее щелевой контакт и активное в данной области, также окажет благотворное действие на пациентов, у которых нарушен биологический ритм (ЫипоНага К. е! а1. (№игозс1. Ье!!. 2000; 286: 107-10)).
М. Вазоренальная гипертензия и нефротоксичность.
Специфические почечные и эндотелиальные щелевые контакты широко распространены в почке и обнаруживаются в клубочках, трубочках и сосудистой сети, включая внутриклубочковые капилляры и юкстагломерулярные артериолы (НаеШпдег Σ.-А. е! а1. (Кйпеу Ση!. 2001; 60: 190-201)). В этом исследовании авторы показали присутствие щелевых контактов, соединяющих секретирующие ренин клетки чувствительных артериол. Роль щелевых контактов могла бы заключаться в определении и продвижении возникающих в крови сигналов, таких как сигналы, вызываемые повышенным кровяным давлением. Внутри почки подобные сигналы должны быть превращены в аутокринные, паракринные и эндокринные стимулы эндотелиальными клетками чувствительных артериол и переданы секретирующим ренин клеткам. Взаимодействие посредством щелевых контактов играет, таким образом, важную роль при формировании взаимосвязанного юкстагломерулярного аппарата. Быстрый переход из открытого состояния к закрытому состоянию в щелевых соединительных каналах означает быстрый ответ на локальное изменение сосудов, что обеспечивает ответную реакцию, необходимую для соответствия гломерулярной и тубулярной функции, а также секреции ренина физиологическим потребностям. Лечение с применением соединения согласно изобретению, предпочтительно соединения, специфически открывающего щелевые соединительные каналы, которое назначают либо перорально, либо парентерально, оказывает благотворное воздействие на болезни, связанные с ухудшением взаимодействия посредством щелевых контактов в почке.
Тяжелые металлы обладают нефротоксичностью и вызывают поражение почек. Было показано, что токсические металлы кадмий (Рикито!о Μ. е! а1. (Ь1£е 8с1епсе 2001; 69: 247-54)), а также ртуть (УозЫДа Μ. е! а1. (АгсН Тох1со1. 1998; 72: 192-96)) в первичных культурах клеток, взятых из проксимальных канальцев крыс, прерывают щелевые контакты, и обе группы исследователей высказали предположение, что почечная дисфункция вызвана снижением межклеточного взаимодействия. Лечение отравления тя
- 21 006860 желыми металлами с применением соединений, фосфорилирующих тирозин в коннексине, снижает поражение тканей и предупреждает прогрессирующее разрушение тканей.
Ση νίίτο тест может быть проведен в клеточной культуре из клеток канальцев, и может быть исследована способность соединений (соединения 1 или соединения 2 с концентрацией приблизительно от 10-10 М до 10-7 М) предотвращать прерывание щелевых контактов при воздействии тяжелых металлов. Взаимодействие посредством щелевых контактов исследуют по методу, в котором применяют краситель Ьисйег, как это уже указывалось ранее.
После системного введения тяжелого металла экспериментальным животным (крысам) определяют функцию почек с помощью 3Н-инсулина как маркера клиренса для скорости гломерулярной фильтрации, содержащего метку С тетраэтиламмония как маркера клиренса для потока почечной плазмы и лития как маркера функции проксимальных канальцев (РеЮгкев Σ. δ. еί а1. Σ. РΗа^тасο1. Екр. ТНег. 1991, 258: 1-7) до и по прошествии различных периодов времени после хронического воздействия тяжелыми металлами. Хроническое лечение с применением специфических соединений согласно изобретению, таких как соединение 1, начинают в том случае, когда функция почек подвергается риску, и после лечения наблюдается значительное улучшение функции почек (гломерулярная фильтрация и кровяное давление). Подходящее соединение согласно изобретению назначают парентерально.
Неинфекционное воспаление, а также инфекции, вызываемые различными микробами, приводят к значительным неспецифическим хроническим изменениям в функции почек, которые также сопровождаются снижением скорости гломерулярной фильтрации, уменьшением выделения электролитов и воды и изменениями в кровяном давлении. Некоторые из этих симптомов также можно лечить с применением специфических соединений, фосфорилирующих тирозин коннексина, при этом указанные симптомы ослабляются.
Ν. Развитие и реконструкция зубов.
Мигакат1 δ. авй Мигата1ки Т. (АпиЕ ΕιηόΓνοΙ. 2001; 203: 367-374) подтвердили предварительные исследования, в которых было установлено, что между одонтобластами существует взаимодействие посредством щелевых контактов и что клеточная активность координируется посредством этих межклеточных мостиков ДдисЫ Υ. еί а1. (Л1с11. Ога1. Βίο1. 1984; 29: 489-497)), однако в своем последнем исследовании они также показали, что указанные взаимодействия посредством щелевых контактов возникают на ранней стадии развития зубов (преодонтобластов), а также в одонтобластах у молодых и в старых одонтобластах. Кроме того, щелевые контакты имеют также клетки пульпы, лежащие под одонтобластами. Эти открытия указывают на то, что межклеточные взаимодействия посредством щелевых контактов имеют важное значение как при развитии зубов, так и в течение жизни, когда происходит реконструкция и истирание зубов.
Лечение с применением соединений согласно изобретению, фосфорилирующих коннексин, таких как соединение 2, тестирование которых ίη νίίτο на предмет их воздействия на межклеточные взаимодействия одонтобластов можно провести с помощью анализа, в основном совпадающего с приведенным в настоящем описании анализом для остеобластов, нормализует нарушение развития зубов. Лечение также облегчает реконструкцию зубов и делает зубы более устойчивыми к кариесу.
О. Стволовые клетки.
Ьите18ку еί а1. (2001) генерировали клетки, экспрессирующие инсулин и другие эндокринные гормоны поджелудочной железы, из эмбриональных стволовых клеток мыши (См. №1йуа Ьите18ку еί а1. в ^^ίίе^еηί^аί^οη οί ЕтЬ^Ыс δίет Се11к ίο δΙπκΙιιΐΌΚ δίт11аг ίο Раасгеа11с НШк. δс^еηсе,
292, 1389-1394, 2001). Клетки самоорганизуются с образованием трехмерных кластеров, имеющих топологию, близкую к топологии нормальных островков поджелудочной железы, в которой клетки типа панкреатических клеток тесно связаны с нейронами. Глюкоза запускает механизм высвобождения инсулина из указанных клеточных кластеров по механизму, аналогичному тем, которые наблюдаются ίη νίνο. После инъекции мыши, страдающей диабетом, продуцирующие инсулин клетки претерпевают быструю васкуляризацию и сохраняют кластерную островковоподобную организацию.
С клинической точки зрения указанная системы, основанная на эмбриональных стволовых клетках, позволяет одновременно генерировать и сгруппировывать секретирующие инсулин и другие клетки островкового типа, которые, как известно, играют важную роль в регулировании секреции инсулина в функциональные структурные узлы. Эти узлы могут поставлять вещества, с целью оптимизации продукции инсулина и осуществления точного контроля над гомеостазом глюкозы. Эмбриональные стволовые клетки являются идеальными для проведения подобных исследований, поскольку для определения молекулярной базы развития и функционирования островков могут быть применены методы генетики. Потенциальные возможности клеточной терапии, несомненно, привлекательны для применений, включающих эмбриональные стволовые и эмбриональные зародышевые клетки человека, а также указанные клетки, полученные не от человека. Взрослые ткани также могут быть источниками функциональных островков поджелудочной железы для лечения диабета. Это первое сообщение, в котором показано, что несколько типов эндокринных клеток поджелудочной железы могут быть в условиях ίη νίίτο генерированы из эмбриональных стволовых клеток. Хотя островки поджелудочной железы, полученные из трупов, могут функционировать в печени после имплантации, проблемы отторжения ткани и доступности еще в
- 22 006860 полной мере не решены. Очевидно, что инженерия эмбриональных стволовых клеток с целью получения неиссякаемого источника иммуносовместимых тканей для трансплантации сулит большие перспективы, позволяющие преодолеть указанные и другие проблемы, связанные с диабетом.
Инфаркт миокарда приводит к потере ткани и ухудшению работы сердца. Оставшиеся миоциты не в состоянии восстановить некротическую ткань, и работа сердца, перенесшего инфаркт миокарда, с течением времени все больше ухудшается. Отдаленные стволовые клетки чувствуют повреждение тканимишени и начинают мигрировать к месту повреждения, где стволовые клетки претерпевают череду дифференцировок; указанные события ускоряют структурное и функциональное заживление. Эта высокая степень пластичности стволовых клеток навела ОгНс е! а1 (№!ите 410, 701-705 (2001)) на мысль исследовать, может ли мертвый миокард быть восстановлен путем имплантации клеток костного мозга мыши, у которой индуцируют инфаркт. Авторы отобрали клетки с отрицательным направлением дифференцировки (Ыи-) из костного мозга трансгенных мышей, экспрессирующие повышенные количества зеленого флуоресцирующего белка, путем активированного флуоресценцией клеточного сортинга на основе экспрессии с-к1!. Сразу же после перевязки коронарных сосудов проводили инъекцию клеток Ыи- с-кИРО8 в сокращающуюся стенку, которая граничит с инфарктом. Исследователи установили, что через 9 дней после имплантации клеток костного мозга вновь сформировавшийся миокард составил 68% от подвергшейся инфаркту части желудочка. Развивающаяся ткань состояла из миоцитов и сосудистых структур. Их исследование показало, что местно доставляемые клетки костного мозга могут генерировать бе иоуо миокард, тем самым ослабляя последствия болезней коронарных артерий.
Для дальнейшего описания свойств этих миоцитов исследователи определили экспрессию коннексина 43. Этот белок отвечает за межклеточные связи и осуществление электрических взаимодействий посредством создания каналов между плазматическими мембранами миоцитов; коннексин 43 был обнаружен в клетках цитоплазмы и на поверхности плотно выстроенных дифференцирующихся клеток. Полученные результаты находились в согласии с ожидаемой функциональной компетентностью фенотипа сердечной мышцы.
Поскольку функциональные клетки генерируются из эмбриональных стволовых клеток и поскольку коннексины действительно экспрессируются указанными клетками в подверженной инфаркту ткани сердца, полагают, что такая же ситуация может возникнуть и для других клеток, полученных путем дифференцировки из эмбриональных стволовых клеток. Так как коннексины играют доминирующую роль в функции указанных тканей (в том числе бета-клеток поджелудочной железы и клеток сердечной мышцы), то соединения согласно изобретению, такие как соединение 1 и соединение 2, которые усиливают фосфорилирование тирозина в коннексине и способствуют закрытию гемиканалов (что одновременно приводит к усилению взаимодействия посредством щелевых контактов), будут усиливать пролиферацию эмбриональных стволовых клеток в функциональные клетки в тех органах, куда стволовые клетки были имплантированы.
Таким образом, целью настоящего изобретения являются соединения, такие как соединение 1 и соединение 2, фосфорилирующие тирозин в коннексине, с тем, чтобы стимулировать переход стволовых клеток в функциональные клетки тех органов, куда они были имплантированы, таких как поджелудочная железа при лечении сахарного диабета, сердца при лечении инфаркта миокарда и базального ядра мозга при лечении болезни Паркинсона.
В целом, полагают, что указанные соединения будут ускорять дифференцировку стволовых клеток, которые могут ускорять процесс заживления во всех органах, таких как сердце, мозг, кожа, кость, поджелудочная железа, печень и другие внутренние органы. Можно провести исследования инфаркта миокарда с применением обычных методов планирования эксперимента, как описано ранее ОтНс е! а1. (см. выше), например, для соединения 1 и соединения 2, которые многократно вводят в течение процесса пролиферации. Полагают, что эти эксперименты доказывают усиление экспрессии коннексина под действием соединения 1 и соединения 2 или ускорение процесса пролиферации.
Р. Рак.
1. Развитие опухоли.
В процессе онкогенеза прерывание физиологического взаимодействия нормальных клеток с соседствующими с ними клетками, а также потеря свойств дифференцировки являются общими факторами развития опухоли. Полагают, что изменение во взаимодействии посредством щелевых контактов является одним из ранних изменений при онкогенезе клеток ((^о1Ьитд Н., КоЫтаии А. 1и!. Кеу. Су!о1. 1995; 157: 315-73), К1аишд 1.Е., КисЬ К.1. 1990; 135-46).
Куиид-8ии Каид е! а1. (Саисег Ье!!етк 166 (2001) 147-153) показали, что предобработка и совместная инкубация с СеО2 эпителиальных клеток печени крысы, обработанных промотором опухолевого роста, устраняет снижение регуляции СЛС под действием промотора опухолевого роста, указывая на то, что вещество, которое устраняет ингибирование СЛС, может применяться с целью предупреждения или подавления развития опухоли. 8ιιζι.ι1<ί 1., №1 Н.-К. е! а1. (№!п!юи аиб Саисег, уо1. 36, №. 1, р. 122-8) показали, что пищевая добавка лямбда-коррагенана ингибирует СЛС в эпителиальных клетках печени крысы, аналогично действию, которое оказывает форболовый эфир, являющийся надежно документально подтвержденным промотором опухолевого роста, а потому может играть роль в развитии рака в качестве
- 23 006860 агента, промотирующего рост опухоли. Таким образом, соединения согласно изобретению могут применяться для предупреждения и лечения рака, вызванного агентами, промотирующими рост опухоли, такими как промотор опухолевого роста и лямбда-каррагенан.
2. Устойчивость к действию лекарств.
Усиление взаимодействия посредством щелевых контактов улучшает микроокружение в опухолях. См. Сйеп е! а1.: Сйет. ΒίοΙ. 1п1етас!. 1998 Арг. 24; 111-112: 263-75.
3. Метастазирование.
Потеря межклеточного взаимодействия посредством щелевых контактов связана с высоким метастатическим потенциалом при всех видах рака с высоким метастатическим потенциалом ((Заибегк М.М. е! а1. Сапсег Ке8. 2001; 61: 1765-1767), №со1коп 6.1. е! а1. Ргос. Май. Асаб. 8с1. ИЗА 1988; 85: 473-6). Предотвращение метастазирования осуществляют путем лечения с применением соединения, фосфорилирующего тирозин в коннексине, которое помогает сохранить взаимодействия посредством щелевых контактов в опухолях. Подобное лечения является дополнением к обычной химиотерапии.
Полагают, что назначение одного соединения или комбинации соединений согласно изобретению в терапевтически эффективном количестве (в частности, соединения 1 и соединения 2) будет способно предотвратить или вылечить рак.
О. Различные клетки.
Щелевые контакты играют также важную роль в межклеточных взаимодействиях, пролиферации и дифференцировке мукоидных клеток желудка. Вещество, открывающее щелевой контакт, будет стимулировать регенеративный процесс после индуцированного повреждения (Епбо К. е! а1. (1. 6ак!тоеп1его1. Нера!о1. 1995; 10: 589-94)).
Цитоархитектура менискоцитов частично зависит от взаимодействия посредством щелевых контактов. Фиброхрящевая часть мениска, а также фиброхрящевая структура сухожилий зависит от межклеточных взаимодействий. При повреждениях вещество, устанавливающее щелевой контакт, будет повышать скорость заживления.
К. Эпилепсия.
Может потребоваться лечение таких болезненных состояний как эпилепсия, характеризующихся аномально высоким 6ЛС, с применением вещества, открывающего гемиканал, предпочтительно в качестве вспомогательной терапии, с тем, чтобы позволить усвоить лекарства или небольшие молекулырегуляторы, которые служат для прерывания щелевых соединительных каналов.
Целью настоящего изобретения являются способы лечения или предупреждения одного или нескольких медицинских симптомов или состояний, которые приводятся в настоящем описании. Подобные способы - не исключительно, но как правило - включают в себя введение по меньшей мере одного из рассмотренных ранее соединений, предпочтительно одного из них, в количестве, достаточном для лечения, предупреждения или снижения остроты симптома или состояния. Предпочтительные соединения выбраны с помощью одного анализа или комбинации анализов ίη νίΙΐΌ и ίη у1уо, приведенных в настоящем описании. Конкретные стратегии назначения лекарств должны быть очевидны для специалистов в данной области техники и будут варьировать в зависимости, например, от пола, веса, общего состояния здоровья пациента и специфических симптомов или состояния, лечение или предупреждение которых проводится. Как уже обсуждалось, приведенные в настоящем описании соединения могут применяться в способах согласно изобретению в качестве единственного активного агента. В качестве альтернативы соединения согласно изобретению могут применяться в качестве дополнительной терапии, в частности, такой терапии, при которой показано применение соединений согласно изобретению в сочетании с признанными методами лечения. Предпочтительные симптомы или состояния, лечение которых проводится и предупреждается в соответствии с настоящим изобретением, в общем случае связаны с ухудшением клеточного взаимодействия или с ухудшением функций щелевых контактов. Более специфические симптомы или состояния, относящиеся к настоящему изобретению, уже были рассмотрены ранее.
В методах лечения в соответствии с настоящим изобретением в качестве единственного активного агента может применяться одно или несколько приведенных в настоящем описании соединений. Преимущественно применяют одно соединение. Если необходимо, указанное соединение может применяться в профилактических целях, т.е. для предупреждения и снижения остроты конкретного симптома или состояния. В качестве альтернативы соединения согласно изобретению могут применяться в сочетании с общепринятыми терапевтическими подходами. В качестве иллюстрации, в вариантах осуществления настоящего изобретения, когда применяют облучение, в общем случае является предпочтительным, чтобы метод лечения был дополнительным, т.е. проводился в сочетании с общепринятой терапией для лечения данного состояния. Подобные дополнительные методы лечения согласно изобретению могут проводиться в то же самое время или в разное время, когда требуется проведение общепринятой терапии. Установленные терапевтические подходы для разнообразных болезней и медицинских состояний уже описаны в литературе. См. общие сведения, например, в Наткоп'к Рппс1р1ек о! I п!егпа1 Мебюте (1991) 12 еб., Мс6га\\-НШ. 1пс. и Тйе Рйаттасо1одюа1 Вак1к о! Тйетареийск (1996) бообтап, Йошке З. 94Ь еб. Регдатоп Ргекк; описание которых приводится здесь в виде ссылки.
- 24 006860
Концентрация оного или нескольких лечебных соединений в терапевтической композиции будет варьировать в зависимости от ряда факторов, в том числе дозы вводимых соединений, модулирующих гемиканалы, химических свойств (например, гидрофобности) применяемой композиции и предполагаемого способа и пути введения. В общем случае одно или несколько соединений, модулирующих гемиканалы, может поставляться в водном физиологическом буферном растворе, содержащем приблизительно от 0,1 до 10% масс./об. соединения для парентерального введения.
Следует понимать, что действительные предпочтительные количества активных соединений, используемых в данной терапии, будет варьировать, например, в соответствии с конкретным применяемым соединением, конкретной приготовленной композицией, способом введения и параметрами субъекта, в частности, пола, общего состояния здоровья и возраста пациента. Оптимальная частота введения для данного режима введения лекарства может быть легко установлена специалистами в данной области с использованием обычных тестов на определение дозы в соответствии с ранее приведенным описанием. Интервал подходящих доз может включать в себя приблизительно от 1 мкг/кг до приблизительно 100 мг/кг массы тела в день (терапевтически эффективное количество).
Терапевтические соединения согласно изобретению обычно вводят в протонированной и водорастворимой форме, например, в виде фармацевтически приемлемой соли, как правило, кислотноаддитивной соли, такой как кислотно-аддитивная соль неорганической кислоты, в частности, солянокислая, сернокислая и фосфатная соль, или как кислотно-аддитивная соль органической кислоты, такой как соль уксусной, малеиновой, фумаровой, винной или лимонной кислоты. Фармацевтически приемлемые соли терапевтических соединений согласно изобретению также включают в себя соли металлов, в частности соли щелочных металлов, таких как соль натрия или соль калия; соли щелочно-земельных металлов, такие как соль магния или соль кальция; аммониевые соли, такие как соль аммония или тетраметиламмония; или соли присоединения аминокислоты, такие как соли лизина, глицина или фенилаланина. Дополнительные приемлемые соли указаны ниже.
Более конкретные соединения согласно изобретению, модулирующие гемиканалы, применяют в форме фармацевтически приемлемой соли, алкилового сложного эфира, амида, алкиламида, диалкиламида или гидразида, образованного с С-концевой карбоксильной группой в линейном соединении или свободной карбоксильной группой, если она присутствует, в циклическом соединении. Амиды и низшие акиламиды линейных соединений являются одними из предпочтительных соединений согласно изобретению. Соли включают в себя фармацевтически приемлемые соли, такие как кислотно-аддитивные соли и соли с основаниями. Примеры кислотно-аддитивных солей уже были приведены выше и включают в себя соли соляной кислоты, соли натрия, соли кальция, соли калия и т.п. Примерами основных солей являются соли, в которых катион выбирают из щелочных металлов, таких как натрий и калий, щелочноземельных металлов, таких как кальций, и аммониевых ионов 4Ν(Κ3)3(Κ4), где К3 и К4 независимо означают необязательно замещенный С1-6-алкил, необязательно замещенный С2-6-алкенил, необязательно замещенный арил или необязательно замещенный гетероарил. Другими примерами фармацевтически приемлемых солей являются, например, соли, приведенные в Кет^ηдΐοη'8 РйаттасеиДса1 8аег1се5 17 Еб. А1ίοηκο К. бетаго (Еб.), Магк РнЫМинд ^тра^, ΕηδΙοη. РА, И8А и более поздних изданиях, и приведенные в Еηсус1οреб^а ο£ Рйаттасеийса1 ТескшЕ^у.
В терапевтических методах согласно изобретению лечебное соединение можно вводить субъекту одним из нескольких путей. Например, соединение, модулирующее гемиканал, отобранное с помощью одного из способов ίη νίΐτο и/или ίη νίνο или комбинации способов ίη νίΐτο и/или ίη νίνο, приведенных в настоящем описании, могут назначаться в качестве профилактического средства с целью предупреждения возникновения или с целью облегчения тяжести соответствующего заболевания. В качестве альтернативы соединение можно назначать во время курса лечения соответствующего заболевания.
Лечебное соединение можно назначать субъекту как самостоятельно, так и в сочетании с одним или несколькими терапевтическими агентами, в виде фармацевтической композиции в смеси с обычным наполнителем, в частности, фармацевтически приемлемыми органическими или неорганическим веществами-носителями, которые пригодны для парентерального, энтерального, интраназального применения, которые не вступают в неблагоприятное взаимодействие с активными соединениями и не оказывают вредного воздействия на получающего их реципиента. Подходящие фармацевтические носители включают в себя, не ограничиваясь ими, воду, солевые растворы, спирт, растительное масло, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремневую кислоту, вязкий парафин, ароматическое масло, моноглицериды и диглицериды жирной кислоты, сложные эфиры нафтеновых кислот, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и т. д. Фармацевтические препараты можно стерилизовать и, если необходимо, смешивать со вспомогательными агентами, в частности, смазывающими веществами, консервантами, стабилизаторами, смачивающими агентами, эмульгаторами, солями, влияющими на осмотическое давление, буферными растворами, красителями, отдушками и/или ароматическими веществами и т.п., которые не оказывают пагубного воздействия на активные соединения.
Указанные композиции могут быть получены для применения при парентеральном введении, в частности, в форме жидких растворов или суспензий; при оральном введении, в частности, в форме таблеток или капсул; при интраназальном введении, в частности, в форме порошков, носовых капель или аэ
- 25 006860 розолей; при вагинальном введении; при местном применении, в частности, в форме крема; при ректальном введении, в частности, в форме суппозитория; и т.д.
Фармацевтически агенты могут назначаться в форме обычной единичной дозы и могут быть получены с использованием одного из методов, хорошо известных из области фармации, в частности, как это описано в РеттдЮгА Рйагтасеибса1 Зае^ек (Магк РиЬ. ^., ΕαδΙοη. РА, И8А, 1980). Составы для парентерального введения могут содержать обычные наполнители, такие как стерильная вода или физиологический раствор, полиалкиленгликоль, такой как полиэтиленгликоль, масла растительного происхождения, гидрированный нафталин и т. п. В частности, применимыми наполнителями для контроля над высвобождением определенных соединений, модулирующих гемиканалы, могут быть биосовместимый, биоразрушаемый сополимер лактида/глицерида или сополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена.
Другие потенциально пригодные парентеральные системы доставки включают в себя частицы сополимера этилена-винилацета, осмотические насосы, пригодные к имплантации системы для инфузии и липосомы. Составы для ингаляторного назначения содержат в качестве наполнителя, например, лактозу, или же могут быть водными растворами, содержащими, например, полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир, гликоколят и дезоксиколят, или масляные растворы для назначения в виде капель в нос, или в виде геля, которые вводят интраназально. Составы для парентерального назначения могут также включать в себя гликоколят для трансбуккального введения, метоксисалицилат для ректального введения или лимонную кислоту для вагинального введения. Другие системы доставки реагентов вводят терапевтический(ие) агент(ы) непосредственно в место проведения хирургической операции, например, после баллонной ангиопластики соединение, модулирующее гемиканалы, может(гут) вводиться с помощью стентов.
Сокращения и формулы.
По тексту описания и формулы изобретения для обозначения природной аминокислоты применяют трехбуквенный код, а также обычно применяемые трехбуквенные коды для других α-аминокислот, таких как саркозин (8аг), α-аминоизобутановая кислота (А1Ь), нафтилаланин (Να1), включая 1-нафтилаланин (Ша1) и 2-нафтилаланин (2Να1), фенилглицин (РЬд), 2,4-диаминобутановая кислота (ЭаЬ), 2,3-диаминопропановая кислота (Пара) и гидроксипролин (Нур). Если дополнительно не оговаривается, то Нур означает 4-гидроксипролин. Природные или важнейшие аминокислоты являются аминокислотами, которые входят в состав белков. Ароматическими аминокислотами являются РЬе, Туг, Тгр, ΙΝη1, 2№11 и Н18. В тех случаях, когда Ь- или Ό-форма не указана, следует понимать, что рассматриваемая аминокислота имеет природную Ь-форму, см. Риге & Арр1. СЬет. νο1. 56(5), рр. 595-624 (1984). Если специально не оговаривается, следует понимать, что С-концевая аминокислота в соединении согласно изобретению существует в виде свободной карбоновой кислоты, что может быть также обозначено как -ОН. Может быть также показано, что С-концевая аминокислота в соединении согласно изобретению имеет терминальную функцию -ΟΗ/ΝΗ2, и это означает, что существуют две предпочтительные формы указанного соединения: свободная карбоновая кислота и амидное производное.
Если не оговорено иначе, используются следующие специальные определения: А8АЕ относится к 4-азидосалицилоильному радикалу; АВ относится к 4-азидобензоильному радикалу; Εтοс относится к 9флуоренилметилоксикарбонильному радикалу; Ас относится к ацетильному радикалу. По тексту настоящего описания, если специально не оговаривается, используются следующие определения: Аст означает ацетамидометильный радикал; Т4с означает радикал Ь-тиазолидин-4-карбоновой кислоты; Рс означает радикал Ь-пипеколиновой кислоты; ΩΝΓ означает динитрофенил; ЭВЕ означает 2-аминоэтил-6дибензофуранпропионовую кислоту; Аст означает ацетамидометил; и 8аг означает саркозинильный радикал; ΰΝΓ выполняет функцию гаптена для распознавания антитела, и соединения согласно изобретению, которые содержат фрагмент ϋΝΓ, могут предпочтительно применяться в качестве реагентов для исследовательских целей.
Дополнительную информацию можно найти в заявках РСТ/ОК 01/00127 (АО 01/62775) и РСТ/ϋδ 02/05773 (АО 02/077017).
Все приведенные ссылки включены в настоящее описание. Следующие примеры поясняют настоящее изобретение.
Сравнительный пример 1. Стандартный тест ίη νΐνο на наличие аритмии у мышей.
Можно провести тестирование наличия эффектов, связанных с аритмией, применяя модель индуцированной кальцием аритмии у мышей.
Если коротко, то влияние соединений согласно изобретению на эффекты, связанные с аритмией, можно тестировать ίη νΐνο на модели индуцированной кальцием аритмии у мышей, согласно 1.1. Е-уиск К.С. еί а1. 1. С’агбюуакс. РИата^Е 1981, 3, 49-60. Мышей анестезируют, используя комбинацию нейролептик плюс анестетик (Нурют® (фентанилцитрат 0,315 мг/мл и фуанизон 10 мг/мл) + мидазолам (5 мг/мл)). Коммерческие растворы гипнорма и мидазолама разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:1, при этом одну часть разбавленного Нурмгт® смешивают с одной частью мидазолама.
Анестезирование проводят путем подкожной инъекции дозы 0,05-0,075 мкл на 10 г веса мыши. В хвостовую вену внутривенно вводят канюлю. Поступающий сигнал II ЭКГ непрерывно регистрируют, закрепив ЭКГ-электроды из нержавеющей стали на правой передней конечности и левой задней конеч
- 26 006860 ности. Заземляющий электрод закрепляют на правой задней конечности. Сигнал усиливают (х500010000) и фильтруют (0,1-150 Гц) с помощью ЭКГ модуля фирмы Ηι.ι§ο 8ас115 Ε^ΐτοηκ, модель 689. Аналоговый сигнал оцифровывают на 12-битовой рабочей станции (фирма Эа1а Т^аη81аΐ^οη, модель ИТ321), и проводят испытания на частоте 1000 Гц, используя программное обеспечение Νοΐο^Μ НЕМ 3.1 для \νίη6ο\ν5 ΝΤ. После 10 мин уравновешивания тестовый образец лекарства вводят в хвостовую вену. С целью определения контрольного уровня у не подвергавшихся лечению животных используют мышей, которым предварительно вводили носитель. Объем инъекции во всех экспериментах составляет 100 мкл. Инфузию СаС12 (30 мг/мл, 0,1 мл/мин ~100 мг/кг/мин (гидрат хлорида кальция, фирма К1ебе1-бе-Наеп, Германия)) начинают через 3 мин после внутривенной инъекции лекарства или носителя. Задержку во времени наступления предсердно-желудочковой блокады 2-й степени определяют как время, прошедшее с момента начала инфузии СаС12 до первого признака аритмии. Наступление предсердно-желудочковой блокады 2-й степени определяют по скачкообразному возникновению недостаточности предсердножелудочковой проводимости, которая характеризуется наличием Р-волны без сопутствующего комплекса ОР8.
Ответные сигналы выражают по отношению ко времени наступления предсердно-желудочковой блокады 2-й степени у мышей, которым вводили носитель. Суммируют максимальное действие каждого испытуемого соединения.
Более конкретные способы обнаружения соединений-кандидатов с хорошей активностью по отношению к модификации щелевых контактов далее включают в себя отбор соединений-кандидатов, которые удлиняют время начала индуцирования предсердно-желудочковой блокады по меньшей мере приблизительно на 20% (количество баллов 2) в стандартном анализе аритмии у мышей ίη νίνο. Более предпочтительные соединения при проведении анализа обладают способностью удлинять время начала индуцированной предсердно-желудочковой блокады по меньшей мере приблизительно на 60% (по меньшей мере 3 балла).
В приведенных ниже примерах приводится функциональный анализ, который показывает способность соединения 1 как устанавливать щелевые контакты, так и закрывать гемиканалы кардиомиоцитов у новорожденных крыс. Таким образом, можно осуществить дифференцированное регулирование СЛС путем фосфорилирования тирозина как гемиканалов, так и щелевых соединительных каналов.
Пример 1. Антиаритмические соединения.
Соединения, которые применяют согласно изобретению, включают в себя Ас-О-Туг-О-Рго-О-4Нур61у-И-А1а-61у^Н2 (соединение 1) и Ас-С1у-Л5п-Туг^Н2 (соединение 2). Соединения синтезируют в соответствии со стандартной методикой твердофазного синтеза, приведенной в заявке νθ 01/62775. Другим примером соединения, применимого в соответствии с настоящим изобретением, является трансресвератрол и САРЕ (фенилэтиловый эфир каффеиновой кислоты). Способы получения соединений описаны. См. заявки РСТ/ИК 01/00127 (νθ 01/62775) и РСТ/И8 02/05773 (νθ 02/077017).
Анализ 2. Анализ метаболического стресса, индуцированного путем удаления глюкозы.
Сердечная аритмия может быть вызвана нарушением как образования, так и проводимости потенциала действия. Распространение потенциала действия от клетки к клетке опосредуется щелевыми соединительными каналами. Указанные щелевые соединительные каналы состоят из каналов, которые образованы специальными белками, называемыми коннексинами. Несколько независимых источников подтверждают, что снижение экспрессии и/или нарушение в распространении коннексинов может оказать пагубное воздействие на нормальное распространение импульса и тем самым явиться причиной возникновения аритмии. Одним из примером являются изменения, которые наблюдаются во время и после ишемии. Полагают, что во время острой ишемии разрывание контактов между клетками в основном вызывается увеличением кислотности во внутриклеточной среде, повышением внутриклеточного содержания ионов Са2+, снижением внеклеточного содержания АТФ и повышенными концентрациями длинноцепочечных ацилкарнитинов и жирных кислот [1, 2]. После острой фазы ишемии происходит реконструкция, во время которой изменяется структура подвергшейся инфаркту зоны и пограничной области. Указанная реконструкция связана с областями неупорядоченного расположения коннексинов и развитием цепей с циркуляционным возбуждением потенциала, которые, как полагают, действуют как аритмогенные субстраты [3]. Исследования ίη νίνο и ίη νίΐτο показали, что группа антиаритмических пептидов может отсрочить или подавить возникновение аритмии, а последующие исследования показали, что указанные пептиды усиливают электрическое взаимодействие между клетками [2].
А. Методики.
1. Клеточная культура: Коротко, в стерильных условиях иссекают сердца у 20 новорожденных крыс (в возрасте 1-2 дня). Отделяют желудочки и разрезают их на 4-6 кусочков, которые в несколько стадий подвергают ферментации в забуференном средой Хенкса физиологическом растворе, вместе с трипсином и ДНКазой. Клетки затем центрифугируют и вновь суспендируют в модифицированной среде Игла (МЕМ), содержащей 5% сыворотки плода коровы. Для отделения немышечных клеток суспензию предварительно на 30 мин переносят в чашки Петри и выдерживают при температуре 37°С. Клетки суспензии затем высевают на покрытые коллагеном покровные стекла. Плотность высевания регулируют таким образом, чтобы получить конфлуэнтную культуру.
- 27 006860
2. Электрофизиология. Покровные стекла с конфлуэнтными кардиомиоцитами помещают в открытую камеру на столик конвертационного микроскопа и модифицированным по методу Дульбекко забуференным фосфатом солевым раствором (РВ8) в градиенте силы тяжести со скоростью потока 1 мл/мин при 37°С. Раствор (РВ8) содержит (мМ): Νη' 152, К+ 4,2; С1- 141,5; РО4 3- 9,5, Са2+ 0,9, Мд2+ 0,5, рН 7,4. Пипетки для точечной фиксации потенциала вытягивают из 1,5 мм стеклянных капилляров (СС150Е-15, Натоагб Аррага!и8) с использованием вытягивателя микроэлектродов 8ийег Е1аттд-Вго\уп Р-87 и полируют огневой обработкой до сопротивления 4-6 Μ\ν. Пипетки заполняют раствором, напоминающим внутриклеточный раствор, который содержит (в мМ): К+ 150, Ыа+ 15, С1- 5, глюконат- 150,2, ЕСТА 5, Нерек 5, Са2+ 2 мМ, Мд2+ 1,6, рН 7,2.
Устройство для точечной фиксации потенциала состоит из синхронизованного дискретного усилителя (8ЕС-05БХ, фирма ΝΓΙ Е1ес1гошс5). а данные оцифровывают с помощью интерфейса ΙΝΤ-10 (ΝΈΙ Е1ес!гошс8) и рабочей станции РС1200 (фирма №йюпа1 Шйгитепй). Как значения тока, так и значения напряжения отфильтровывают при частоте 1 кГц с помощью внутренних фильтров усилителей и оцифровывают при частоте 10 кГц.
К клетке подводят электрод с помощью миниманипулятора Ра1сНМап 5173 (ЕррепбогГ). После того, как контакт с клеткой установлен (наблюдается внезапное увеличение сопротивления на входе), проводят всасывание до тех пор, пока не установится конфигурация с изоляцией С1да. После этого, с целью разрушения мембраны под пипеткой, прикладывают короткий импульс всасывания. Далее усилитель устанавливают в режим нулевого тока на зажиме и измеряют потенциал мембраны.
На некотором расстоянии (>>1 см) устанавливают биполярный платиновый электрод, чтобы задать темп скорости. Задержка между искусственным стимулом и появлением потенциала действия в клетках с точечным мембранным контактом является, таким образом, мерой скорости проводимости.
Проводят перфузию клеток контрольным раствором, содержащим 0,1 г/л бычьего сывороточного альбумина, до тех пор, пока не установится устойчивая базовая линия интервала стимул активация. Затем перфузат на 15 мин меняют на раствор без глюкозы, а вслед за этим в течение последних 20 минут проводят обработку соединением 1 (10-8 М). Параллельно проводят контрольный эксперимент, который спланирован по аналогичному временному расписанию, однако соединение 1 не добавляют. Данные выражают в процентном изменении относительно базовой линии, полученной до удаления глюкозы из раствора.
В. Результаты.
Как показано на фиг. 2, метаболический стресс, вызванный удалением глюкозы, вызывает слабое увеличение интервала стимул-активация, указывая на то, что удаление глюкозы снижает скорость проводимости. Напротив, суперфузия соединением 1 в концентрации 10 нМ уменьшает величину интервала стимул активация, т. е. соединение 1 увеличивает скорость проводимости в культуре выращенных первичных кардиомиоцитов. Полученные данные показывают, что соединение 1 усиливает взаимодействие кардиомиоцитов.
Ссылки:
[1] СагтеНеЕ Е. Сагб1ас юшс сиггепЮ апб аси!е БсНепиа: Ггот сНаппеЕ !о аггНубшиак РНу5^ο1Кеν.. 1999, 79: 917-1017.
[2] ОПеш, 8. Сагб1ас дар щпсбощ. Рйу8ю1оду, геди1айоп, ра!йорйу8ю1оду апб рйагтасо1оду. Кагдег, Ва§е1, 1998.
[3] Ре!ег8, N. 8. апб νίΐ, А. Ь. Муосагб1а1 агсййесШге апб уеп1пси1аг аггНубиподепекБ. С1гси1айоп, 1998, 97:1746-1754.
Пример 3. Иммуноосаждение и анализ фосфорилированных коннексинов.
Соединения, которые используют в данном примере, получают с использованием стандартных методов Етос химии. См. предыдущие примеры. Идентификацию проводят с помощью масс-спектрометрии, а чистоту определяют методом ВЭЖХ с обращенной фазой. Исследование связывания ш δίΐιι и исследование на животных моделях показали, что следующий пептид (соединение 1) связывается с рецептором в наномолярном диапазоне. Первичные эксперименты с соединением 1 в концентрации 1 нМ, 10 нМ, 50 нМ и 100 нМ будут определять то, следует ли проводить исследования со следующим пептидным соединением 3 (Н-САС-4-Нур-РУ^Н2) и соединением 4 (Η-6ΝΥ-ΝΗ2).
Эти исследования также будут определять, следует ли проводить изучение, включая специфичные ингибиторы киназы.
Клетки Н9с2 отбирают в 24-луночные планшеты, с плотностью 7900 клеток/см2 (~15000 клеток на лунку), и выращивают в течение 3 дней в среде МЕМ, с добавлением 10% сыворотки плода коровы и 1000 единиц пенициллина/1000 мкг стрептомицина (реп/йгер) в атмосфере 5% СО2 и 100% влажности при температуре 37°С.
Содержащие метку клетки инкубируют в буферном растворе для лизиса, содержащем тритон Х-100 (~5*107 клеток на мл), при температуре 4°С в течение 1 ч. Полученный лизат центрифугируют в течение 30 мин. Проводят предварительно осветление супернатанта, добавляя 10 мкл сефарозы на 200 мкл супернатанта. Затем к осветленному супернатанту добавляют фосфотирозиновые или фосфосериновые антитела (компания 81дта) в количестве 0,5-1 мкг и инкубируют в течение 1,5 ч при температуре 4°С на
- 28 006860 орбитальной качалке. Комплекс антитела затем захватывается при инкубации с 50 мкл суспензии 1:1 белка С БерНагохе в течение 1,5 ч. Наконец, комплекс интенсивно промывают 0,1%-ным (мас./об.) раствором Тритон Х-100, 50 мМ Тпх с рН 7,4, 300 мМ №1с1 и 5 мМ ЭДТК.
Комплексы помещают на колонку с 12%-ным БЭБ гелем и наносят пятно на мембрану из поливинилидендифторида. Мембрану блокируют в течение не менее 2 ч в растворе, содержащем 0,1% Тетееп 20, 50 мМ Тпх с рН 7,4, 300 мМ №С1, 5% сухого молока (ТВБТ, забуференный с помощью Тпх солевой раствор, содержащий Тетееп). Затем инкубируют мембрану со специфическими антителами коннексина (компания Ζνιικά) в течение 1,5 ч при комнатной температуре и проявляют с помощью ЕСЬ+ (АтегхНат).
На фиг. 3А-В показаны иммуноблоты, в которых используют антитело против фосфотирозина. Показано фосфорилирование фрагмента Сх43 как функция концентрации соединения 1 (3А-В) и соединения 2 (3В).
На фиг. 4А-В приведены иммуноблоты, в которых используют антитело против фосфосерина (4А) или антитело против фосфотирозина (4В).
Пример 4. Действие пептида соединения 1 на активность гемиканала в конфлуэнтных миоцитах сердца.
1. Клеточная культура: Если коротко, то в стерильных условиях иссекают сердца у 20 новорожденных крыс (в возрасте 1-2 дня). Отделяют желудочки и разрезают их на 4-6 кусочков, которые в несколько стадий подвергают ферментации в забуференном средой Хенкса солевом растворе вместе с трипсином и ДНКазой. Клетки затем центрифугируют и вновь суспендируют в МЕМ, содержащей 5% сыворотки плода коровы. Для отделения немышечных клеток суспензию предварительно на 30 мин переносят в чашки Петри и выдерживают при температуре 37°С. Клетки суспензии затем высевают на покрытые коллагеном покровные стекла.
2. Поглощение красителя: Покровные стекла с кардиомиоцитами инкубируют с контрольным раствором (РВБ), содержащим в мМ: №1' 152, К+ 4,2, С1- 141,5, РО4 3- 9,5, Са2+ 0,9, Мд2+ 0,5, глюкозы 6, рН 7,4 или вызывающим ишемию (повреждающим) раствором (в качестве контрольного, который содержит лишь К+, без глюкозы, 10 мМ дезоксиглюкозы, рН 6,5), при этом оба раствора содержат 200 мкМ кальцеина. Затем клетки промывают в течение 10 мин контрольным раствором.
Покровные стекла размещают в открытой камере на столике инвертированного микроскопа. Выбирают 10 произвольных полей зрения, и в каждом из них с помощью обычного светового микроскопа выбирают по три клетки. Затем клетки возбуждают светом с длиной волны 480 нм, а флуоресцентное излучение регистрируют при длине волны 510 нм, при этом интенсивность излучения является мерой поглощения красителя.
Влияние соединения 1 на поглощение красителя исследуют в двух разных условиях.
Эксперимент 1. В этой серии экспериментов клетки инкубируют с контрольным раствором, содержащим кальцеин, в течение 30 мин и промывают в течение 10 мин без красителя. В парном эксперименте применяют ту же методику, но через 30 мин инкубации добавляют пептид.
Эксперимент 2. Все происходит так же, как и в эксперименте 1, но вместо контрольного раствора применяют повреждающий раствор.
3. Результаты.
Эксперименты, в которых изучают поглощение кальцеина культурой кардиомиоцитов, взятых от новорожденных крыс, показывают, что поглощение на 38% выше, чем в контрольных клетках, в том случае, когда клетки подвергают метаболическому стрессу (в форме с низким значением рН, повышенным внеклеточным содержанием К+ и дезоксиглюкозы в концентрации 5-10 мМ).
Этот эффект может быть значительно снижен до 5%, если клетки совместно инкубируют с соединением 1 (10 нМ, Р<0,017 в парном !-тесте по сравнению с клетками, на которых действуют одной лишь дезоксиглюкозой, η=6). Полученные результаты показывают, что повышенная проницаемость мембраны через гемиканалы коннексина, которая наблюдается после метаболического стресса, может быть игибирована соединением 1. Этот эффект, вероятно, оказывает благотворное влияние на функционирование и выживаемость клеток. Далее, эксперименты по фосфорилированию на культуре Н9с2 кардиомиоцитов показывают, что соединение 1 выступает посредником при фосфорилировании тирозина в коннексине 43. Более того, в кардиомиоцитах, которых в течение 4 ч повергали обработке соединением 1 с концентрацией 0, 1, 10, 50 и 100 нМ, наблюдается усиление фосфорилирования тирозина в коннексине 43. Сообщалось, что фосфорилирование тирозина является посредником при прерывании межклеточных взаимодействий с помощью щелевых контактов, что легко может объяснить уменьшение проницаемости мембран, которое наблюдают в экспериментах с кальцеином. В некоторых экспериментах было показано, что соединение 1 снижает фосфорилирование серина.
На фиг. 5 показано влияние 10 нМ соединения 1 на вызванное ишемией поглощение кальцеина в культурах кардиомиоцитов.
Пример 5. Анализ методом ЕЫБА сайт-специфического фосфорилирования коннексина.
Разработан сэндвич-анализ ЕЫБА, который позволяет провести измерение сайт-специфического фосфорилирования коннексина в тканях образца, а также в клеточных культурах на планшете многолу
- 29 006860 ночного формата (24-96 лунок). Лунки покрывают антителом (захватывающим антителом) против исследуемого типа коннексина. Клетки или экстракты тканей затем оставляют на ночь взаимодействовать при температуре 4°С с планшетами, покрытыми антителом. Те из захваченных коннексинов, которые были фосфорилированы, обнаруживают с помощью антитела против специфических сайтов фосфорилирования, связанного либо с биотином, либо с НТС, либо с ТЯПС. либо с пероксидазой.
Количество антитела, связавшегося со специфическим сайтом фосфорилирования, можно измерить альтернативным способом с помощью антитела, содержащего радиоактивную метку, или связанного с ферментом антитела против разновидности используемого детектирующего антитела.
Принцип проведения анализа продемонстрирован с применением мышиного антитела против Сх43 в качестве захватывающего антитела, кроличьего антитела против Туг-Р (анти-Туг-Р) (сайт фосфорилирования тирозина) в качестве детектирующего антитела и антитела против кролика, меченного либо 125Σ, либо пероксидазой хрена для измерения количеств связанного анти-Туг-Р.
Принцип проведения анализа может быть также продемонстрирован с применением кроличьих антител против Сх43 (5 мкг/мл, номер по каталогу 710700, компания Ζίιικά ЬаЬ. Шс., Калифорния, США) в качестве захватывающего антитела, мышиного моноклонального против фосфотирозина (50 мкг/мл; номер по каталогу Р-3300, клон ρί66, компания 81дта, Миссури, США) в качестве детектирующего антитела и полного анти-мышиного антитела, меченного либо 125Σ (анти-мышиный овечий ^; номер по каталогу ГМ 131, компания АтегзИат ВОзЛенсе, Уэльс, Великобритания), либо пероксидазой (анти-мышиный осла; номер по каталогу 715-035-151) для измерения количества связанного анти-фосфотирозина.
На фиг. 6А схематично показан режим проведения ЕЫ8А. На фиг. 6В и 6С представлены результаты данного эксперимента.
Из данного примера и обсуждения ясно, что метаболический стресс открывает гемиканалы коннексина в клетках сердца, и это открытие можно исследовать путем инкубирования с соединением 1. Более того, примеры 2-5 показывают, что соединение 1 закрывает гемиканалы при метаболическом стрессе. В соответствии с ингибирующим действием соединения 1 на поглощение кальцеина гемиканалами, т.е. закрытием гемиканалов, примеры также показывают, что соединение 1 оказывает помощь при модулировании состояния коннексина 43 с фосфорилированным тирозином. Известно, что соединение 1 открывает щелевые контакты (см. заявку \УО 01/62775) и что ингибирование дефосфорилирования коннексина препятствует закрытию щелевых соединительных каналов. Таким образом, авторы полагают, что приведенные в настоящем изобретении соединения, для которых может быть показано, что они обладают свойством соединения 1 оказывать благотворное действие на образование щелевых контактов или обладают модулирующей способностью, т.е. все антиаритмические пептиды, приведенные в заявке XVО 01/62775, и известные пептиды ААР, ААР10, НР5 и т.п., могут применяться в настоящем изобретении в качестве модуляторов открытия или закрытия гемиканалов. Авторы также полагают, что соединение 1 поддерживает или усиливает фосфорилирование тирозина в Сх43 и тем самым модулирует функцию гемиканала.
Пример 6. Поглощение красителя кардиомиоцитами.
1. Методика.
Миоциты желудочка выделяют у новорожденных крыс путем ферментации с помощью трипсина и наносят на покровные стекла со слоем коллагена. Через четыре дня миоциты образуют пленки слитых и синхронно сокращающихся клеток. Для измерения поглощения красителя клетки в течение 30 мин инкубируют при комнатной температуре в буферном растворе, содержащем 200 мкМ кальцеина. Затем покровные стекла тщательно промывают контрольным буферным раствором, помещают в открытую кювету и проводят суперфузию контрольным буферным раствором (при комнатной температуре). Клетки возбуждают светом с длиной волны 480 нм с помощью ксеноновой лампы и монохроматора. Картины флуоресценции, излучаемой на длине волны 510 нм, коллекционируют с помощью охлаждаемой ССЭкамеры (^ещюат). Контроль возбуждения и получения изображения осуществляют с помощью оптической линейки (Λχοη).
Под световым микроскопом на кардиомиоциты на изображении накладывают три области. Затем измеряют среднюю интенсивность флуоресценции, и процедуру повторяют до тех пор, пока не будут проведены замеры 30 областей на 10 изображениях. Среднее значение из этих измерений принимают за значение для данных экспериментальных условий, т.е. η=1. В каждой серии проводят одну контрольную инкубацию, и все экспериментальные значения приводят как отношение к этой величине.
Растворы: Контрольный буферный раствор (в мМ): №1С’1 136, КС1 4, МдС12 0,8, СаС12 1,8, НЕРЕ8 5, МЕ8 5, глюкоза 6, рН 7,3. Поражающий буферный раствор (в мМ): ЫаС1 136, КС1 8, МдС12 0,8, СаС12 1,8, НЕРЕ8 5, МЕ8 5, дезоксиглюкоза 10, рН 6,2.
2. Результаты.
Инкубация клеток с кальцеином в контролируемых условиях приводит к некоторому флуоресцентному окрашиванию, которое в основном носит локализованный характер окрашивания отдельных частиц (см. фиг. 7А-С, панель В). В верхней части культивированных миоцитов часто наблюдаются сморщенные клетки, которые мгновенно окрашиваются красителем трипановым голубым. Эти клетки сильно окрашиваются кальцеином, и следует каждый раз проявлять осторожность, чтобы измеряемые области не
- 30 006860 попадали на эти клетки. Когда клетки подвергают метаболическому ингибированию, картина окрашивания меняется и диффузное окрашивание наблюдается по всему цитозолю (фиг. 7С). Средняя интенсивность при стрессе на 36,2±4,18% выше по сравнению с контролем (п=5, Р<0,001 в парном !-тесте).
Это подтверждают наблюдения, сделанные для сердечных клеток и клеток других типов, что метаболическое ингибирование активирует поглощение флуоресцентных красителей, вероятно, за счет гемиканалов коннексина. Авторы высказали гипотезу, что один из механизмов, посредством которых пептиды семейства ААР оказывают свое положительное влияние на ткань сердца, может состоять в прерывании активации гемиканалов, при этом улучшается гомеостаз клеток. Для того, чтобы изучить это предположение, клетки подвергают стрессу в присутствии ΖΡ123 в концентрации от 0,1 пМ до 10 нМ. Результаты представлены на фиг. 8, где каждая точка является средним значением из пяти экспериментов. Как видно, ΖΡ123, в зависимости от дозы, снижает поглощение кальцеина. Используя сигмоидальную функцию, получают оценочное значение ЕЭ50, которое составляет 3,3±5,3 пМ с коэффициентом Хилла, составляющим 2,5±1,0. Средняя интенсивность при максимальном ингибировании под действием соединения 1 составляет на 6,9±1,7% выше, чем в контроле.
Пример 7. Измерение объема кардиомиоцитов.
1. Методика.
Миоциты желудочка выделяют у новорожденных крыс путем ферментации с помощью трипсина и наносят на покровные стекла со слоем коллагена. Через четыре дня миоциты образуют пленки слитых и синхронно сокращающихся клеток. Для измерения клеточного объема клетки в течение 15 мин при температуре 37°С обрабатывают кальцеином-АМ (5 мкМ в контрольном буферном растворе), и покровные стекла помещают в открытую кювету. Следующие эксперименты проводят при комнатной температуре. С помощью лазерного конфокального микроскопа фирмы Ьеюа получают оптический срез через каждые 20 с в течение всего эксперимента.
Оптические срезы анализируют с помощью пакета Μе!атο^рй (ипКегза1 Ипадтд). Площадь клеток определяют как площадь пикселов, интенсивность флуоресценции которых выше, чем пороговое значение, выбранное для минимизации индуцированных фоновых флуктуаций. Данные представляют в виде относительных объемов путем деления каждого значения на среднюю площадь в контрольных условиях (последнее измерение перед метаболическим стрессом).
Растворы: Контрольный буферный раствор (в мМ): №1С1 136, КС1 4, Μ§Ο2 0,8, СаС12 1,8, НЕРЕ8 5, ΜΕ8 5, глюкоза 6, рН 7,3. Вызывающий стресс буферный раствор (в мМ): ЫаС1 136, КС1 8, Μ§Ο2 0,8, СаС12 1,8, НЕРЕ8 5, ΜΕ8 5, дезоксиглюкоза 10, рН 6,2.
2. Результаты.
В контролируемых условиях клетки в среднем стремятся со временем слегка сокращать свой объем (фиг. 9В показывает усредненные данные 5 экспериментов). Когда в клетках вызывают ингибирование метаболических процессов, уменьшение объема обращается в итоговое увеличение (закрашенные квадраты на фиг. 9А). Усредненный относительный объем составляет 1,06±0,02 (последние пять минут стресса, п=5), в то время как объем контрольных клеток в этот период составляет 0,94±0,04.
Измерения поглощения красителя в миоцитах показывает, что соединение 1 ингибирует открытые гемиканалы коннексина. Полагают, что гемиканалы вносят свой вклад в наблюдаемое разбухание. Для изучения этого соединение 1 (0,1 нМ) вводят в стрессовую среду и контролируют объем. Данные шести экспериментов показаны на фиг. 9А (не закрашенные квадраты), где видно, что индуцированное стрессом набухание предотвращается. Средний относительный объем во время стресса в присутствии соединения 1 составляет 0,93±0,05.
При сравнении данных в контроле, в состоянии стресса и при стрессе в присутствии соединения 1, с применением однонаправленного анализа вариаций обнаруживаются существенные различия (см. фиг. 10). РоЧ.Нос. тестирование (Ь8Э) показывает, что стрессовое состояние существенно отличается от контрольного (Р<0,05) и стрессового состояния с добавлением соединения 1 (Р<0,05), в то время как данные контроля не отличаются от стресса плюс соединение 1 (Р>0,76).
Пример 8. Уменьшение размера инфаркта после инфаркта миокарда у крыс.
1. Методики.
Самцов крыс Ьетаз (300-350 г; М&В, Ь1. 8кеηά5νеά, Дания) анестезируют, используя комбинацию нейролептик плюс анестетик (Нурпогт® (фентанил цитрат 0,315 мг/мл и флуанизон 10 мг/мл) + мидазолам (5 мг/мл)). Коммерческий раствор мидазолама разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:2. Три части разбавленного мидазолама смешивают с одной частью Нурпогт®. Анестезирование проводят подкожной инъекцией 0,2 мкл указанного раствора на 100-граммовую крысу. После наступления анестезии вводят эндотрахеальную канюлю и животным проводят искусственное дыхание с помощью дыхательного аппарата для грызунов фирмы НагоагД, установленного таким образом, чтобы в процессе операции значение рН в артерии поддерживалось на уровне 7,3-7,5.
Соединение 1 вводят с помощью осмотического мининасоса (А1хе1. модель 2ΜΕ4), который помещают в забрюшинную полость непосредственно перед индуцированием инфаркта миокарда. Насос заполняют носителем (изотонический физиологический раствор) или соединением 1 и примируют перед операцией в течение 24 ч при температуре 37°С. С целью обеспечения того, чтобы терапевтическая кон
- 31 006860 центрация в плазме была уже достигнута ко времени наступления инфаркта, введение ударной дозы соединения 1 проводят подкожно перед перевязкой левой передней нисходящей артерии. При подкожном введении ударной дозы устойчивая концентрация лекарства в плазме достигается уже через 3 мин.
После подкожного введения ударной дозы соединения 1 и после внутрибрюшинного размещения осмотического мининасоса, проводят дренаж левой плевральной полости, и левую переднюю нисходящую артерию перевязывают шелковой шовной ниткой с номером 6-0. Грудную клетку послойно закрывают и, чтобы раскрыть легкие, в плевральной полости создают отрицательное давление. С животными, которым делают ложную операцию, проводят те же процедуры за исключением перевязки левой передней нисходящей артерии. После проведения операции животным до следующего утра дают восстановиться в подогреваемой камере с температурой 30°С и содержанием кислорода 50%. Чтобы предотвратить дегидратацию в течение реабилитационного периода, крысам сразу же по окончании операции подкожно водят 5 мл 5%-ного раствора глюкозы и еще 5 мл 5%-ного раствора глюкозы в 4 ч пополудни. Чтобы снизить послеоперационную боль, крысам назначают бупренорфин (20 мкг/100 г подкожно или внутрикожно) и мелоксикам (0,1 мг/100 г подкожно раз в день) в течение трех дней после инфаркта миокарда. Во время проведения этого исследования дозу инфузии, которую вводят крысам с инфарктом миокарда, подбирают таким образом, чтобы концентрация в плазме составила 0 [носитель = изотонический физиологический раствор], 1,7±0,4 нМ [доза 1], 5,7±0,4 [доза 2] или 93,7±12,3 нМ [доза 3]. Концентрацию соединения 1 в плазме измеряют с помощью масс-спектрометра после твердофазной экстракции. Использованные дозы приведены в табл. I.
Таблица I
Группа Концентрация в плазме через 3 недели, нМ Подкожная ударная доза соединения 1 (нмоль/кг) Внутрибрюшинная инфузия дозы соединения 1 (пмоль/кг/мин)
Имитация инфаркта миокарда 0 0 0
Инфаркт миокарда 0 0 0
Инфаркт миокарда 1,7+0,4 0,25 11
Инфаркт миокарда 5,7±0,4 2,5 110
Инфаркт миокарда 93,7+12,3 25 1100
Через три недели после перевязки левой передней нисходящей артерии крыс анестезируют внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала (50 мг/кг). Животных помещают в обогреваемое одеяло, так чтобы температура их тела поддерживалась на уровне 37°С. Вскрывают трахею, проводят искусственное дыхание кислородом с помощью дыхательного аппарата для грызунов фирмы Напуагб. Искусственное дыхание проводят таким образом, чтобы значение рН в артерии поддерживалось на уровне 7,35-7,45. Катетеры РЕ50 помещают в бедренную вену и артерию, соответственно, для внутривенного введения и для измерения артериального давления. После размещения катетера в бедренной вене, животных парализуют внутривенным введением панкурония, 1 мг/кг. Анестезию и дыхательный паралич поддерживают продолжительной внутривенной инфузией пентобарбитала (2,5 мг/кг/ч) и панкурония (1 мг/кг/ч), растворенных в изотоническом физиологическом растворе (50 мкл/мин). Катетер из тигона помещают в левый желудочек через правую сонную артерию, с целью определения конечного диастолического давления в левом желудочке. После регистрации конечного диастолического давления в левом желудочке сердца извлекают из тел, перерезав вены и артерии в нескольких миллиметрах от сердец. Сердца тщательно промывают от крови изотоническим физиологическим раствором, взвешивают и помещают в 4%-ный нейтральный забуференный раствор формалина.
После фиксации большие сосуды отрезают вплотную к сердцу. После этого сердца разрезают параллельными срезами толщиной 1,5 мм с помощью устройства с расположенными параллельно на расстоянии 1,5 мм друг от друга лезвиями. Срезы перпендикулярны длинной оси сердца.
Срезы помещают в две гистологические капсулы таким образом, чтобы первый срез попал в одну капсулу с произвольным номером, второй срез в другую капсулу, третий срез в первую капсулу и т.д. После размещения срезов их разрезают на кусочки толщиной 4 мкм, которые окрашивают гематоксилинэозином и красителем МаззоиЧпсйготе.
С помощью микроскопа, столик которого может перемещаться на определенное количество шажков, исследуют оба окрашенных красителем Маззои-йтсйтоте среза и подсчитывают количество точек,
-32006860 пораженных фиброзной тканью (голубое окрашивание под действием Маккои-йгсйтоте), и точек нормальной ткани. Микроскоп подсоединяют к видеокамере, и изображение отображают на экране. В качестве морфометрической системы используют Сак!2 от компании О1утрик, Дания. Размер инфаркта рассчитывают как % фиброзной ткани в сердце.
2. Результаты.
Как показано на фиг. 11, отношение массы сердца к массе тела уменьшается для двух самых больших доз соединения 1, указывая на то, что указанное соединение уменьшает гипертрофические последствия (т.е. реконструкцию) инфаркта миокарда.
Как показано на фиг. 12, лечение соединением 1 в течение трех недель уменьшает размер инфаркта на 20-50% по сравнению с размером инфаркта у крыс, у которых вызывали инфаркт миокарда, но вводили лишь носитель. Как указано ТуЫк, соединение оказывает цитозащитное действие при ишемии миокарда. В соответствии с настоящим описанием, полученные данные свидетельствуют о том, что соединение 1 уменьшает размер инфаркта миокарда по механизму, который может включать в себя предотвращение набухания клеток. Следовательно, предотвращение набухания клеток может предотвращать сжатие окружающей здоровой ткани и тем самым предупреждать компрессию микроциркуляции в окружающей здоровой ткани. Таким образом, авторы настоящего изобретения заявляют, что указанный принцип может предотвратить последствия любого ишемического поражения в любом органе, предпочтительно, однако этими примерами не ограничиваясь, в органах, ограниченных фиброзной капсулой (в частности, сердце, почках) или органах, окруженных костью (в частности, мозге, спинном мозге, костном мозге).
Как показано на фиг. 13, у крыс, у которых индуцируют инфаркт миокарда, но лечат дозой соединения 1 в течение трех недель, наблюдают лучшее восстановление функции сердца с меньшей закупоркой в левом желудочке, о чем свидетельствует меньшая величина конечного диастолического давления в левом желудочке. Эти данные указывают на то, что соединение предотвращает ухудшение сердечной функции после инфаркта миокарда.
Все приведенные в настоящем описании ссылки даны для справки. Изобретение описано со ссылкой на предпочтительные способы его осуществления. Однако должно быть понятно, что специалист в данной области, после ознакомления с настоящим описанием, может провести модификации и улучшения, которые соответствуют сути настоящего изобретения и входят в объем притязаний согласно настоящему изобретению.

Claims (7)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ закрытия гемиканала в подверженной стрессу клетке, ткани или органе, который включает в себя контактирование находящейся в состоянии стресса клетки, ткани или органа с терапевтически эффективным количеством по меньшей мере одного соединения, выбранного из группы, состоящей из соединений, представленных формулами I или II, при этом указанный контакт достаточен для закрытия гемиканала в находящейся в состоянии стресса клетке, ткани или органе.
    2. Способ по п.1, который дополнительно включает в себя фосфорилирование тирозинового остатка в коннексине 43 (Сх43) и закрытие гемиканала.
    3. Способ открывания гемиканала в клетке, ткани или органе, который включает в себя контактирование клетки, ткани или органа с терапевтически эффективным количеством по меньшей мере одного соединения, выбранного из группы, состоящей из соединений, представленных формулами I или II, при этом указанный контакт достаточен для открытия гемиканала в клетке, ткани или органе.
    4. Способ по п.3, который дополнительно включает в себя дефосфорилирование серинового остатка в коннексине 43 (Сх43) и открытие гемиканала.
    5. Способ предотвращения или лечения стресса в ткани или органе у млекопитающего, который включает в себя введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного соединения, выбранного из группы, состоящей из соединений, представленных формулами I или II, как указано выше, при этом указанный контакт достаточен для предотвращения или лечения стресса в ткани или органе.
    6. Способ по п.5, который дополнительно включает в себя фосфорилирование тирозинового остатка в коннексине 43 (Сх43) и закрытие гемиканала.
    7. Способ усиления межклеточных взаимодействий посредством щелевых контактов (СЛС) в клетке, ткани или органе, который включает в себя введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного соединения, выбранного из группы, состоящей из соединений, которые представлены формулами I или II, при этом контакт достаточен для усиления СЛС в клетке, ткани или органе.
    8. Способ лечения ожогов, включающий в себя назначение пациенту, нуждающемуся в подобном лечении, терапевтически эффективного количества соединения формул I или II, которое блокирует открытие гемиканала коннексина.
    - 33 006860
    9. Способ лечения тромбоза, включающий в себя назначение пациенту, нуждающемуся в подобном лечении, терапевтически эффективного количества соединения формул I или II, которое блокирует открытие гемиканала коннексина.
    10. Способ лечения респираторного или метаболического ацидоза, включающий в себя назначение пациенту, нуждающемуся в подобном лечении, терапевтически эффективного количества соединения формул I или II, которое блокирует открытие гемиканала коннексина.
    11. Способ лечения фокальной аритмии, включающий в себя назначение пациенту, нуждающемуся в подобном лечении, терапевтически эффективного количества соединения формул I или II, которое блокирует открытие гемиканала коннексина.
    12. Способ лечения и предотвращения повреждения клетки и ткани, вызванного повышенными уровнями глюкозы в крови, включающий в себя назначение пациенту, нуждающемуся в подобном лечении, терапевтически эффективного количества соединения формул I или II, которое блокирует открытие гемиканала коннексина.
    13. Способ лечения хронической фибрилляции предсердия, включающий в себя назначение пациенту, нуждающемуся в подобном лечении, терапевтически эффективного количества соединения формул I или II, которое блокирует открытие гемиканала коннексина.
    14. Способ лечения эпилепсии, включающий в себя назначение пациенту, нуждающемуся в подобном лечении, терапевтически эффективного количества соединения формул I или II, которое способствует открытию гемиканала коннексина.
    15. Способ отбора соединений-кандидатов, модулирующих функцию гемиканала, который включает в себя контактирование клетки по меньшей мере с одним соединением, выбранным из группы, состоящей из антиаритмических пептидов и соединений, которые представлены формулами I или II, при этом контактирование осуществляют в условиях, способствующих модулированию фосфорилирования коннексина 43 (Сх43); и определение изменения в фосфорилировании Сх43, при этом изменение в фосфорилировании рассматривают как показатель того, что соединение модулирует гемиканал.
    16. Способ по п.15, где стадия тестирования дополнительно включает в себя тестирование соединения-кандидата в иммунологическом анализе или анализе на основе клеточного сортинга.
    17. Способ по п.16, где иммунологический анализ включает в себя контактирование клеток с соединением-кандидатом в условиях, достаточных для увеличения или уменьшения фосфорилирования Сх43, получение лизата этих клеток и определение увеличения или уменьшения фосфорилирования Сх43 в лизате клеток как показателя того, что соединение модулирует гемиканал.
    18. Способ по пп.16-17, где иммунологическим анализом является анализ ΕΟδΑ.
    19. Способ по п.18, где метод ΕΗδΑ дополнительно включает в себя:
    a) нанесение на твердый носитель первого антитела, которое специфически связывает коннексин,
    b) контактирование лизата клеток с указанным твердым носителем в условиях, способствующих формированию комплекса связывания между указанным первым антителом и указанным коннексином,
    c) контактирование указанного комплекса связывания первое антитело - коннексин со вторым антителом, при этом контактирование проводят в условиях, достаточных для образования специфического комплекса связывания между вторым антителом и любым фосфорилированным коннексином в связующем комплексе первое антитело - коннексин,
    й) контактирование указанного комплекса связывания первое антитело - коннексин - второе антитело с содержащим обнаруживаемую метку третьим антителом, которое связывает второе антитело; и
    е) обнаружение присутствия содержащего обнаруживаемую метку третьего антитела на твердом носителе как дополнительный индикатор соединения.
    20. Способ по п.19, где третье антитело содержит по меньшей мере одну из обнаруживаемых меток биотин, флуоресцеинизотиоцианат (НТС), тетраметилродаминизотиоцианат (ТК1ТС), радиоактивный йод или пероксидазу.
    21. Способ по пп.19-20, где второе антитело является антителом против фосфотирозина.
    22. Способ по пп. 19-21, где второе антитело является антителом против фосфосерина.
    23. Способ по пп.19-22, где содержащее обнаруживаемую метку третье антитело детектируют с помощью радиосцинтилляционного счетчика.
    24. Способ по п.16, где иммунологическим методом является радиоиммунный анализ (Κ1Α).
    25. Способ по п.24, где иммунологическим методом является радиоиммунный анализ, а метод дополнительно включает в себя:
    a) введение обнаруживаемой метки в клетки перед получением клеточного лизата, при этом введение метки проводят в условиях, способствующих мечению фосфорилированного коннексина,
    b) контактирование клеточного лизата с антителом, которое образует специфический комплекс связывания с коннексином,
    c) отделение комплекса связывания от клеточного лизата, содержащего обнаруживаемую метку,
    й) обнаружение содержащего метку и фосфорилированного коннексина как дополнительного индикатора соединения, модулирующего щелевой контакт.
    26. Способ по п.25, где антителом является антитело против коннексина.
    - 34 006860
    27. Способ по пп.25-26, где стадия обнаружения дополнительно включает в себя проведение анализа методом Вестерн-иммуноблоттинга.
    28. Способ по пп.25-27, где обнаруживаемой меткой является радиоактивный фосфор.
    29. Способ по пп.15-28, где осуществляют высокопроизводительный или ультравысокопроизводительный режим проведения отбора.
    30. Способ по пп.1-29, где соединение облегчает фосфорилирование внутриклеточной С-концевой области Сх43.
    31. Способ по пп.1-29, где соединение облегчает дефосфорилирование С-концевой области Сх43.
    32. Способ по п.31, где сайтом фосфорилирования является остаток тирозина.
    33. Способ по п.32, где сайтом дефосфорилирования является остаток серина.
    34. Способ отбора соединений-кандидатов, модулирующих функцию гемиканала, который включает в себя:
    1) культивирование популяции клеток, ткани или органа, взятых, например, из сердца или мышцы,
  2. 2) индуцирование стресса клеток, ткани или органа предпочтительно за счет кислородной недостаточности или за счет подавления метаболических процессов, например, путем добавления производного глюкозы,
  3. 3) добавление известного соединения или соединения-кандидата, модулирующего гемиканал, представленного формулами I или II,
  4. 4) добавление обнаруживаемого репортера, такого как флуоресцентное, хемилюминесцентное или фосфоресцентное соединение, такое как флуоресцентный краситель, такой как кальцеин и родственные соединения,
  5. 5) детектирование изменения в поглощении обнаруживаемого репортера клеткой, тканью или органом по отношению к подходящему контролю; и
  6. 6) необязательно измерение изменения как показателя того, что соединение модулирует функцию гемиканала.
    35. Способ отбора соединений-кандидатов, модулирующих функцию гемиканала, который включает в себя:
    1) культивирование популяции клеток, ткани или органа, взятых, например, из сердца или мышцы,
    2) введение в клетки, ткань или орган обнаруживаемого репортера, такого как флуоресцентное, хемилюминесцентное или фосфоресцентное соединение, такое как флуоресцентный краситель, такой как кальцеин, или родственные соединения,
    3) оценка объема клеток, ткани или органа путем обнаружения и количественного определения сигнала от обнаруживаемого репортера,
    4) добавление известного соединения или соединения-кандидата, модулирующего гемиканал, представленного формулами I или II,
    5) индуцирование стресса клеток, ткани или органа предпочтительно за счет кислородной недостаточности или за счет подавления метаболических процессов, например, путем добавления производного глюкозы,
    6) детектирование изменения объема клетки относительно подходящего контроля; и
  7. 7) необязательно измерение изменения как показателя того, что соединение модулирует функцию гемиканала и необязательно модулирует функцию щелевого контакта.
    36. Способ цитозащиты ткани или органа млекопитающего, нуждающегося в подобном лечении, который включает в себя введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного соединения, выбранного из группы, состоящей из соединений, представленных формулами I или II.
    37. Способ по п.36, который дополнительно включает в себя воздействие на ткань или орган млекопитающего ишемических условий.
    38. Способ по п.37, где орган, защиту клеток которого осуществляют, ассоциирован с фиброзной капсулой или костью.
    39. Способ по п.38, где органом является сердце, почка, мозг, спинной мозг или костный мозг.
    40. Способ по п.39, где вызывают инфаркт сердца, а ишемия ассоциирована с набуханием клеток миокарда.
    41. Способ по п.40, где соединением является Ас-О-Туг-О-Рго-О-4Нур-С1у-П-А1а-С1у-№Н2 (соединение 1) или (Ас-С1у-А8и-Туг-ИН2) соединение 2.
    42. Способ предотвращения или лечения реперфузионного повреждения у млекопитающего, который включает в себя введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного соединения, выбранного из группы, состоящей из соединений, которые представлены формулами I или II.
    43. Способ по п.42, который дополнительно включает в себя действие на сердце млекопитающего условий, вызывающих инфаркт, и установление коронарной перфузии.
    44. Способ по п.43, который дополнительно включает в себя введение тромболитического агента или проведение коронарной ангиопластики с целью облегчения коронарной перфузии в сердце, пораженном инфарктом.
EA200400984A 2002-01-29 2003-01-29 Композиции и способы модулирования гемиканалов коннексина EA006860B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35271702P 2002-01-29 2002-01-29
PCT/DK2003/000056 WO2003063891A1 (en) 2002-01-29 2003-01-29 Compositions and methods for modulating connexin hemichannels

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200400984A1 EA200400984A1 (ru) 2005-02-24
EA006860B1 true EA006860B1 (ru) 2006-04-28

Family

ID=27663122

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200400984A EA006860B1 (ru) 2002-01-29 2003-01-29 Композиции и способы модулирования гемиканалов коннексина

Country Status (15)

Country Link
US (2) US7153822B2 (ru)
EP (1) EP1469875A1 (ru)
JP (1) JP2005516054A (ru)
KR (1) KR20040094677A (ru)
CN (2) CN1638790A (ru)
BR (1) BR0307279A (ru)
CA (1) CA2474788A1 (ru)
CO (1) CO5611159A2 (ru)
EA (1) EA006860B1 (ru)
EC (1) ECSP045211A (ru)
HR (1) HRP20040784A2 (ru)
MX (1) MXPA04007252A (ru)
NO (1) NO20043590L (ru)
WO (1) WO2003063891A1 (ru)
ZA (1) ZA200405896B (ru)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1469875A1 (en) * 2002-01-29 2004-10-27 Wyeth Compositions and methods for modulating connexin hemichannels
DE10236528A1 (de) * 2002-08-09 2004-02-19 Bayer Ag Vorrichtung und Methoden zur Durchführung von elektrischen Messungen an Membrankörpern
DE10339597A1 (de) * 2003-08-26 2005-03-31 Bayer Technology Services Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis biochemischer Aktivität enthaltend Gap Junctions
WO2005061437A2 (en) * 2003-12-23 2005-07-07 Wyeth Isopeptide gap junction modulators
KR101840445B1 (ko) * 2005-02-03 2018-05-04 코다 테라퓨틱스 (엔지) 리미티드 항-코넥신 화합물 및 그의 용도
GB0514071D0 (en) 2005-07-07 2005-08-17 Zealand Pharma As N- or C- terminally modified small peptides
CN101965193A (zh) 2006-11-15 2011-02-02 科达治疗公司 用于伤口愈合的改进方法和组合物
PL2101791T3 (pl) 2006-12-11 2015-04-30 Coda Therapeutics Inc Preparaty i metody leczenia ran z nieprawidłowym przebiegiem gojenia
WO2008079412A2 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods and compositions to treat arrhythmias
JP2010533690A (ja) * 2007-07-15 2010-10-28 ジーランド・ファーマ・ア／エス ペプチドギャップ結合モジュレーター
WO2009020613A1 (en) * 2007-08-06 2009-02-12 Fred Hutchinson Cancer Research Center Modulation of cell junctions
US20110300130A1 (en) * 2007-12-11 2011-12-08 Becker David L Impaired wound healing compositions and treatments
US20100279921A1 (en) * 2007-12-11 2010-11-04 Coda Therapeutics, Inc. Impaired wound healing compositions and treatments
AU2008343843A1 (en) * 2007-12-21 2009-07-09 Coda Therapeutics, Inc. Improved medical devices
US20110217313A1 (en) * 2007-12-21 2011-09-08 Becker David L Treatment of orthopedic conditions
AU2008343756A1 (en) * 2007-12-21 2009-07-09 Coda Therapeutics, Inc. Use of anti-connexin polypeptide agent in combination with anti-connexin polynucleotide agent for the treatment of fibrotic conditions
JP2011507859A (ja) * 2007-12-21 2011-03-10 コーダ セラピューティクス， インコーポレイテッド 外科的癒着の治療のための抗コネキシンポリヌクレオチドの使用
JP2011507857A (ja) * 2007-12-21 2011-03-10 コーダ セラピューティクス， インコーポレイテッド 線維症性の状態の処置のためのコネキシン４３の阻害剤の使用
US20110038920A1 (en) * 2008-01-07 2011-02-17 Ryoichi Mori Wound healing compositions and treatments
RU2457862C1 (ru) * 2011-07-07 2012-08-10 Федеральное государственное учреждение "Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Способ лечения низкодифференцированных глиом
EP3036005A4 (en) 2013-08-21 2017-04-26 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for targeting connexin hemichannels
CA2958879A1 (en) 2014-08-22 2016-02-25 Auckland Uniservices Limited Channel modulators
US10889637B2 (en) 2016-02-26 2021-01-12 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods of treating an osteolytic tumor and spinal cord injury by administering connexin (Cx) 43 hemichannel-binding antibodies
WO2017180896A1 (en) * 2016-04-14 2017-10-19 Cedars-Sinai Medical Center Gja1 isoforms protect against metabolic stress
JP2020517714A (ja) 2017-04-28 2020-06-18 オークランド ユニサービシズ リミテッド 処置方法および新規構築物
US11344603B2 (en) 2017-07-19 2022-05-31 Auckland Uniservices Limited Cytokine modulation
EP3958886A4 (en) * 2019-04-23 2023-01-25 Ocunexus Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR PROTECTING EPITHELIAL AND BARRIER PROPERTIES

Family Cites Families (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US107308A (en) * 1870-09-13 Improvement in safety-valvs
US59608A (en) * 1866-11-13 Improved drill or well tube
US3740438A (en) 1971-05-27 1973-06-19 Stanley Drug Products Inc Methods and compositions for inducing resistance to bacterial infections using certain lysine derivatives
CH577464A5 (ru) 1972-09-22 1976-07-15 Ciba Geigy Ag
US4725582A (en) 1978-11-14 1988-02-16 Fujisawa Pharmaceutical Company, Ltd. Peptide, process for preparation thereof and use thereof
US4340592A (en) 1980-03-14 1982-07-20 Adibi Siamak A Nutrient compositions and method of administering the same
US4636492A (en) 1984-08-29 1987-01-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Inhibition of viral protease activity by peptide halomethyl ketones
US4652552A (en) 1984-09-10 1987-03-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Tetrapeptide methyl ketone inhibitors of viral proteases
US5047401A (en) 1985-09-09 1991-09-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Use of dipeptide alkyl esters to treat GVHD
DE3544338A1 (de) 1985-12-14 1987-06-19 Hoechst Ag Peptid-derivate mit inhibitorischer wirkung auf hydroxylierende enzyme, verfahren zu ihrer herstellung, diese enthaltende mittel und ihre verwendung
EP0254032A3 (en) 1986-06-20 1990-09-05 Schering Corporation Neutral metalloendopeptidase inhibitors in the treatment of hypertension
SE8702550D0 (sv) 1987-06-18 1987-06-18 Anders Grubb Cysteinproteashemmare
US5223486A (en) 1988-11-01 1993-06-29 University Research Corporation Inhibition of cancer procoagulant
US6075121A (en) 1990-05-15 2000-06-13 Chiron Corporation Modified peptide and peptide libraries with protease resistance, derivatives thereof and methods of producing and screening such
US5637618A (en) 1990-06-01 1997-06-10 Bioresearch, Inc. Specific eatable taste modifiers
DE4022267C2 (de) 1990-07-12 1994-09-15 Degussa N-Acyldipeptide und deren Verwendung
DE69130605T2 (de) 1991-02-27 1999-05-20 Lacer Sa Antihypertensive N-(alpha-substituiertes Pyridyl)-carbonyldipeptide
US5492894A (en) 1991-03-21 1996-02-20 The Procter & Gamble Company Compositions for treating wrinkles comprising a peptide
EP0520573A1 (en) 1991-06-27 1992-12-30 Glaxo Inc. Cyclic imide derivatives
DE4122885A1 (de) 1991-07-11 1993-01-21 Hoechst Ag Verfahren zur diastereoselektiven reduktiven pinakol-kupplung von homochiralen (alpha)-aminoaldehyden
HU220098B (hu) 1991-08-30 2001-10-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Interleukin-1 béta proteáz enzim, és interleukin-1 béta proteáz inhibitorok
US6235929B1 (en) 1991-12-27 2001-05-22 Georgia Tech Research Corporation Tripeptide α-ketoamides
US5650508A (en) 1991-12-27 1997-07-22 Georgia Tech Research Corporation Peptide ketoamides
AU3479593A (en) 1992-01-31 1993-09-01 Merck & Co., Inc. Peptidyl derivatives as inhibitors of interleukin-1beta converting enzyme
US5602102A (en) 1992-05-29 1997-02-11 Board Of Regents, The Univ. Of Tx System Dipeptidyl peptidase-I inhibitors and uses thereof
FR2694559B1 (fr) 1992-08-06 1994-10-28 Atta Nouveaux dérivés amphiphiles d'aminoacides ou de peptides, leur procédé de préparation et leur utilisation dans des préparations à usage biomédical.
US5514694A (en) 1992-09-21 1996-05-07 Georgia Tech Research Corp Peptidyl ketoamides
WO1994012181A1 (en) 1992-12-01 1994-06-09 Merck & Co., Inc. Fibrinogen receptor antagonists
IL107719A0 (en) 1992-12-21 1994-02-27 Du Pont Imidazolones their manufacture and their use as herbicides
WO1994015908A1 (en) 1993-01-14 1994-07-21 Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd. Propionamide derivative and medicinal use thereof
DE4311021A1 (de) 1993-03-31 1994-10-27 Diagnostikforschung Inst Bifunktionelle Chelatbildner, deren Technetium- und Rhenium-Komplexe, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende radiopharmazeutische Mittel
DE4314260A1 (de) 1993-04-30 1994-11-03 Hoechst Ag Peptide zur Behandlung von Hypoglykämie, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
US20040167106A1 (en) 1993-06-04 2004-08-26 Rodriguez Gustavo C. Prevention of ovarian cancer by administration of a Vitamin D compound
US6342481B1 (en) 1993-10-12 2002-01-29 Italfarmaco S.P.A. Oligopeptides derived from C-reactive protein fragments
US5494919A (en) 1993-11-09 1996-02-27 Merck & Co., Inc. 2-substituted piperidines, pyrrolidines and hexahydro-1H-azepines promote release of growth hormone
CN1174504A (zh) 1993-11-09 1998-02-25 麦克公司 促进生长激素释放的哌啶、吡咯烷和六氢－1h－吖庚因
US5492920A (en) 1993-12-10 1996-02-20 Merck & Co., Inc. Piperidine, pyrrolidine and hexahydro-1H-azepines promote release of growth hormone
US5492916A (en) 1993-12-23 1996-02-20 Merck & Co., Inc. Di- and tri-substituted piperidines, pyrrolidines and hexahydro-1H-azepines promote release of growth hormone
JPH09509404A (ja) 1993-12-23 1997-09-22 オークランド ユニサービシズ リミテッド 神経アウトカムを改良するための組成物及び方法
GB9425582D0 (en) 1994-12-19 1995-02-15 Iaf Biochem Int Peptides having immunomodulatory activity
US6017887A (en) 1995-01-06 2000-01-25 Sibia Neurosciences, Inc. Peptide, peptide analog and amino acid analog protease inhibitors
DE19500990A1 (de) * 1995-01-14 1996-07-18 Stefan Dr Med Dhein Neues Peptid, seine Herstellung und Verwendung
WO1996030395A2 (en) 1995-03-31 1996-10-03 Takeda Chemical Industries, Ltd. Cysteine protease inhibitor
US5798442A (en) 1995-04-21 1998-08-25 Merck Frosst Canada, Inc. Peptidyl derivatives as inhibitors of pro-apoptotic cysteine proteinases
US5849711A (en) 1995-06-06 1998-12-15 Athena Neurosciences, Inc. Cathepsin and methods and compositions for inhibition thereof
AU6416596A (en) 1995-07-11 1997-02-10 Degussa A.G. Process for preparing peptides and n-carbamoyl-protected peptides
WO1997005889A1 (en) 1995-08-03 1997-02-20 Slesarev Vladimir I Non-specific vaccination by d-amino-acid containing compounds
US20030202989A1 (en) * 1995-12-13 2003-10-30 R. John Collier Use of toxin peptides and/or affinity handles for delivering compounds into cells
US5877182A (en) 1996-09-13 1999-03-02 Merck & Co., Inc. Piperidines promote release of growth hormone
WO1998010653A1 (en) 1996-09-13 1998-03-19 Merck & Co., Inc. Piperidines, pyrrolidines and hexahydro-1h-azepines promote release of growth hormone
US6191166B1 (en) 1997-11-21 2001-02-20 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods and compounds for inhibiting β-amyloid peptide release and/or its synthesis
DE69728164D1 (de) 1996-12-27 2004-04-22 Boehringer Ingelheim Ca Ltd Peptidomimetische inhibitoren von der protease des menschlichen cytomegalovirus
US6017925A (en) 1997-01-17 2000-01-25 Merck & Co., Inc. Integrin antagonists
CA2277273C (en) 1997-01-17 2008-03-25 Merck & Co., Inc. Integrin antagonists
US6187906B1 (en) 1997-08-11 2001-02-13 Aukland Uniservices Limited Methods to improve neural outcome
TW460478B (en) 1997-08-15 2001-10-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Phenethylamine derivatives
ATE268750T1 (de) 1997-08-28 2004-06-15 Biovitrum Ab Proteintyrosinphosphatase inhibitoren
US6410585B1 (en) 1997-08-28 2002-06-25 Scott D. Larsen Inhibitors of protein tyrosine phosphatase
US6150378A (en) 1997-10-07 2000-11-21 Cephalon, Inc. Peptidyl-containing α-ketoamide cysteine and serine protease inhibitors
GB9726569D0 (en) 1997-12-16 1998-02-11 Univ Southampton Neuroprotective agents
DE19816932A1 (de) 1998-04-16 1999-10-21 Boehringer Ingelheim Pharma Neue Peptide, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Peptide enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen
EP1084138B1 (fr) 1998-06-05 2002-01-30 Aventis Pharma S.A. Procede de preparation de l'aspartyl cyclohexylalaninamide
DE19828113A1 (de) 1998-06-24 2000-01-05 Probiodrug Ges Fuer Arzneim Prodrugs von Inhibitoren der Dipeptidyl Peptidase IV
DE19828114A1 (de) 1998-06-24 2000-01-27 Probiodrug Ges Fuer Arzneim Produgs instabiler Inhibitoren der Dipeptidyl Peptidase IV
US20030176357A1 (en) 1998-10-06 2003-09-18 Pospisilik Andrew J. Dipeptidyl peptidase IV inhibitors and their uses for lowering blood pressure levels
JP2002531576A (ja) 1998-12-10 2002-09-24 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー プロコラーゲンｃ−プロテイナーゼ阻害剤
JP2002539190A (ja) 1999-03-15 2002-11-19 アクシス・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド プロテアーゼ阻害剤としての新規化合物および組成物
AU784149B2 (en) 1999-06-03 2006-02-09 National Research Council Of Canada 3-dimensional in vitro models of mammaliam tissues
ATE301651T1 (de) 1999-06-23 2005-08-15 Aventis Pharma Gmbh Substituierte benzimidazole
US6756511B2 (en) 2000-01-24 2004-06-29 Merck Sharp & Dohme Limited Gamma-secretase inhibitors
US7585839B2 (en) * 2000-02-23 2009-09-08 Zealand Pharma A/S Medical uses of intercellular communication facilitating compounds
WO2001062775A2 (en) 2000-02-23 2001-08-30 Zealand Pharma A/S Novel antiarrhythmic peptides
US7250397B2 (en) * 2000-02-23 2007-07-31 Zealand Pharma A/S Antiarrhythmic peptides
WO2001092236A1 (de) 2000-05-26 2001-12-06 Basf Aktiengesellschaft 4-halogenalkyltriazinverbindungen als herbizide
WO2001090085A2 (de) 2000-05-26 2001-11-29 Basf Aktiengesellschaft 6-methyl-4-trihalogenmethyltriazinverbindungen
WO2001098362A2 (en) 2000-06-16 2001-12-27 Hercules Incorporated Chemically-modified antimicrobial peptides, compositions and methods of production and use
AU2001277908A1 (en) 2000-07-18 2002-01-30 Cornell Research Foundation Inc. Medicinal uses of mu-opioid receptor agonists
JP2005506295A (ja) 2001-02-22 2005-03-03 ジーランド ファーマ アクティーゼルスカブ 細胞間連絡促進化合物の新規医薬使用
GB0107924D0 (en) 2001-03-29 2001-05-23 Angeletti P Ist Richerche Bio Inhibitor of hepatitis C virus NS3 protease
US20030236198A1 (en) 2001-06-13 2003-12-25 Genesoft, Inc. Antipathogenic benzamide compounds
IL159321A0 (en) * 2001-06-15 2004-06-01 Ca Nat Research Council Methods for modulating intercellular gap junctions
GB0115517D0 (en) 2001-06-25 2001-08-15 Ferring Bv Novel antidiabetic agents
US20030135023A1 (en) 2001-06-27 2003-07-17 Hans-Ulrich Demuth Peptide structures useful for competitive modulation of dipeptidyl peptidase IV catalysis
CA2462200A1 (en) 2001-08-10 2003-02-20 Palatin Technologies, Inc. Peptidomimetics of biologically active metallopeptides
WO2003032964A2 (en) * 2001-10-17 2003-04-24 University Of Wales College Of Medecine Gap junctions and endothelial-derived hyperpolarizing factor (edhf)
US20030194445A1 (en) 2001-11-12 2003-10-16 Kuhner Carla H. Compositions and methods of use of peptides in combination with biocides and/or germicides
FI20012242A0 (fi) 2001-11-19 2001-11-19 Orion Corp Uudet farmaseuttiset yhdisteet
AU2003210722B9 (en) 2002-01-28 2008-05-01 Keraplast Technologies, Ltd. Bioactive keratin peptides
EP1469875A1 (en) * 2002-01-29 2004-10-27 Wyeth Compositions and methods for modulating connexin hemichannels
US7429560B2 (en) 2002-09-25 2008-09-30 Georgia Tech Research Corporation Ketoamide inhibitors in chronic nerve disease
US20040005304A1 (en) 2002-07-08 2004-01-08 Mak Wood, Inc. Novel compositions and methods for treating neurological disorders and associated gastrointestinal conditions
US20040121964A1 (en) 2002-09-19 2004-06-24 Madar David J. Pharmaceutical compositions as inhibitors of dipeptidyl peptidase-IV (DPP-IV)

Also Published As

Publication number Publication date
EP1469875A1 (en) 2004-10-27
WO2003063891A1 (en) 2003-08-07
HRP20040784A2 (en) 2005-04-30
MXPA04007252A (es) 2005-03-31
US20040092429A1 (en) 2004-05-13
CO5611159A2 (es) 2006-02-28
KR20040094677A (ko) 2004-11-10
ZA200405896B (en) 2006-07-26
NO20043590L (no) 2004-08-27
US20070042964A1 (en) 2007-02-22
ECSP045211A (es) 2004-09-28
CN1939529A (zh) 2007-04-04
US7153822B2 (en) 2006-12-26
BR0307279A (pt) 2004-12-28
EA200400984A1 (ru) 2005-02-24
CN1638790A (zh) 2005-07-13
JP2005516054A (ja) 2005-06-02
CA2474788A1 (en) 2003-08-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA006860B1 (ru) Композиции и способы модулирования гемиканалов коннексина
US5847007A (en) Prevention and treatment of pathologies associated with abnormally proliferative smooth muscle cells
JP2010529128A (ja) レット症候群および他の障害の処置
BR112013018898B1 (pt) Uso de ácido glicil-l-2-metilprolil-l-glutâmico e análogos do mesmo para o tratamento de transtornos do espectro do autismo
JP2009518392A (ja) バレット食道の処置法
US20200054629A1 (en) Therapeutic agent composition and method of use, for treatment of mild congnitive impairment, depression, and psychological disorders
JP2006239169A (ja) 胚性幹細胞から分化誘導した腸管様細胞塊における壁内神経系の形成方法
JP2012232982A (ja) 動物の体重および大きさをグリシンで調節する方法
US20060234919A1 (en) Use
CN114668831A (zh) 一种内皮素-1a型受体拮抗剂的应用
Sukhotnik et al. Beneficial Effects of Oral Insulin on Intestinal Recovery Following Ischemia-Reperfusion Injury in Rat1
US20110034559A1 (en) Cell Repair And Regeneration By Suramin And Related Polysulfonated Naphthylureas
CA2549863A1 (en) Use of relaxin as adjuvant in the differentiation of stem cells for the reconstruction of tissues
WO2014085480A1 (en) Treatment of autism spectrum disorders using glycyl-l-2-methylprolyl-l-glutamic acid
JP7328696B2 (ja) 角膜上皮細胞走化促進剤
JP2018039748A (ja) 変異を有するｉ型コラーゲンの小胞体内過剰蓄積正常化剤
AU2003203144A1 (en) Compositions and methods for modulating connexin hemichannels
CN114712364A (zh) 一种瞬时受体电位锚蛋白1离子通道拮抗剂的应用
Abbasi Kisspeptin regulation of oxytocin neuron activity in late pregnancy
SAPARBAEVA et al. BULLETIN OF SCIENCE AND PRACTICE
KR20220090313A (ko) 엘립티신을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 촉진용 조성물
WO2018137701A1 (zh) 靶向cxcr7的药物组合物和方法
Ke et al. The Effects of Progressive Heart Failure on the Na/K ATPase and Intracellular Calcium Regulation
CN1988914A (zh) 胞间通讯易化化合物的新医学用途
KR20190137786A (ko) 뇌 오스테오칼신 수용체 및 인지 장애

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU