BR112013018898B1 - Uso de ácido glicil-l-2-metilprolil-l-glutâmico e análogos do mesmo para o tratamento de transtornos do espectro do autismo - Google Patents

Abstract

tratamento dos transtornos do espectro do autismo empregando ácido glicil-l-2-metilprolil-l-glutâmico essa invenção provê compostos, composições e métodos para tratamento de transtornos do espectro do autismo (asd) empregando ácido 2-glicil-2-metilpropil-glutâmico (g-2-mepe) e análogos dos mesmos. os transtornos de espectro do autismo incluem autismo,transtorno do autismo, síndrome de asperger, transtorno desintegrativo da infância e transtorno invasivo do desenvolvimento sem outra especificação (pdd-nos), síndrome do cromossomo x frágil e síndrome de rett. as composições contendo compostos incluem formulações solúveis em água, micro-emulsões de água em óleo, emulsões grosseiras de água em óleo, cristais líquidos de água em óleo, nanocápsulas, comprimidos e géis administrados oralmente. os compostos e composições dessa invenção podem ser administrados intravenosa, intraventicular ou oralmente e podem ser eficazes no tratamento da neurodegeneraçáo, promoção da função neurológica, tratamento da atividade de crise nas doenças e outros sintomas de asd e podem prolongar a vida nos animais incluindo os seres humanos que apresentam transtornos do espectro do autismo.

Description

Reivindicação de Prioridade

[001] Esse pedido reivindica a prioridade para o Pedido de Patente US Pro-visório Número 61/462.141 intitulado "Rett Syndrome Therapy Using Glycyl-2- Methylpropyl-L-Glutamate", Larry Glass e outros, Inventores, depositado em 27 de janeiro de 2011, e Pedido de Patente US Provisório número 61/492.248, intitulado "Treatment of Autism Spectrum Disorders Using Glycyl-2-L-Methylprolyl-L- Glutamate", Michael John Bickerdike e outros inventores, depositado em 1 de junho de 2011. Ambos os pedidos são incorporados ao presente pedido integralmente co-mo se incorporados separadamente.

Campo da Invenção

[002] Esta invenção se refere de modo geral ao tratamento de transtornos do espectro autista (ASD), incluindo autismo, Síndrome do X Frágil, Síndrome de Rett (RTT), Transtorno do Autismo, Síndrome de Asperger, Transtorno Desintegrativo da Infância e Transtorno Invasivo do Desenvolvimento Sem Outra Especificação (PDD- NOS), e Evitação de demanda patológica (PDA). Em particular, essa invenção se refere ao tratamento de ASD empregando Glicil-2-Metil-Prolil-Glutamato (G-2- MePE).

ANTECEDENTES Descrição da Técnica Correlata

[003] Transtornos do espectro do autismo estão se tornando cada vez mais diagnosticados. Transtornos do espectro do autismo (ASD) são um conjunto de transtornos do desenvolvimento ligados, caracterizados por anormalidades na inte-ração social e comunicação, interesses restritos e respectivos comportamentos. A classificação atual de ASD reconhece cinco formas distintas: autismo clássico ou Transtorno do autismo, síndrome de Asperger, síndrome de Rett, transtorno desin- tegrativo da infância e transtornos invasivos do desenvolvimento sem outra especifi-cação (PDD-NOS). A sexta síndrome, evitação de demanda patológica (PDA), é mais um transtorno invasivo do desenvolvimento específico.

[004] O EP 0 366 638 revela GPE (um tri-peptídeo constituído por aminoáci- dos Gli-Pro-Glu) e os seus derivados di-peptídeos Gli-Pro e Pro-Glu. O EP 0 366 638 revela que GPE é eficaz como um neuromodulador e é capaz de afetar as proprie-dades elétricas dos neurônios.

[005] O WO95/172904 descreve que o GPE tem propriedades neuroproteto- ras e que a administração de GPE pode reduzir os danos ao sistema nervoso central (SNC) por prevenção ou a inibição da morte de células neuronais e gliais.

[006] O WO 98/14202 descreve que a administração de GPE pode aumentar a quantidade eficaz de colina-acetiltransferase (ChAT), descarboxilase do ácido glu- tâmico (GAD), e óxido nítrico sintase (NOS), no sistema nervoso central (SNC).

[007] O WO99/65509 descreve que aumentando a quantidade eficaz de GPE no SNC, tal como por administração de GPE, pode-se aumentar a quantidade eficaz de tirosina-hidroxilase (TH) no sistema nervoso central para aumentar a produção de dopamina mediada por TH no tratamento de doenças tais como a doença de Parkin-son.

[008] WO02/16408 revela certos análogos de GPE que possuem substitui-ções de aminoácidos e certa outra modificação que são capazes de induzir um efeito fisiológico equivalente ao GPE dentro de um paciente. As aplicações dos análogos de GPE incluem o tratamento de lesão cerebral aguda e doenças neurodegenerati- vas, incluindo a lesão ou doença no SNC.

SUMÁRIO

[009] Não há tratamento atual eficaz para ASD e cuidado do paciente é limi-tado ao gerenciamento dos sintomas.

[0010] Essa invenção se refere a análogos sintéticos e peptidomiméti- cos de ácido glicil-L-prolil-L-glutâmico (GPE). Em particular, esta invenção se refere- os análogos de GPE e peptidomiméticos que são antiapoptóticos e antinecróticos, a os métodos para a preparação dos mesmos, às composições farmacêuticas que os contêm, e à sua utilização para melhorar a função cognitiva e/ou tratamento de transtornos da memória e para melhorar conectividade neuronal em animais. Mais especificamente, esse pedido se refere aos métodos de utilização do GPE analógico, o ácido G-2-metil-prolil-glutâmico (G-2-MePE) no tratamento do autismo.

[0011] A Patente US número. 7.041.314 descreve composições de matéria e métodos de utilização de G-2-MePE.

[0012] Em um aspecto, esta invenção proporciona compostos da fórmula 1 e da fórmula 2:

em que m é 0 ou 1; n é 0 ou 1; X é H ou -NR6 R7; Y é H, alquila, - CO2R5, ou -CONR6 R7; Z é H, alquila, - CO2R5 ou -CONR6 R7; R1 é H, alquila ou aralquila; R2, R3, e R4 são, independentemente, H ou alquila; cada R5 é independentemente H, alquila, ou um resíduo de álcool graxo; cada R6 e R7 é independentemente H, alquila, ou aralquila, ou -NR6 R7 é pir- rolidina, piperidina, ou morfolina; ou uma lactona formada quando um composto em que Y é -CO2 (alquila) e Z é -CO2H ou onde Y é - CO2H e Z é -CO2 (alquila) é lactonizado; e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, desde que o composto não seja GPE, N-Me-GPE, amida de GPE, APE, GPQ ou um sal do mesmo.

[0013] Outro aspecto da invenção fornece métodos para o tratamento de um animal com um transtorno do espectro do autismo compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de ácido Glicil-L-2-metilproliloL-glutâmico (G-2- MePE) ao animal.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0014] Esta invenção é descrita com referência às modalidades específicas da mesma. Outros aspectos e características da presente invenção podem ser entendidas com referência às figuras, em que:

[0015] A figura 1 é um esquema geral para a preparação de análogos sintéticos de GPE da invenção.

[0016] As figuras 2 e 3 mostram esquemas para modificar os resíduos de glicina no GPE.

[0017] As Figuras 4 a 9 descrevem esquemas para modificar resíduos de ácido glutâmico de GPE.

[0018] As figuras 10 e 11 ilustram esquemas para modificar as ligações peptídicas de GPE.

[0019] As figuras 12-15 mostram gráficos que resumem os resultados dos testes de neurônios in vitro com GPE ou G-2-MePE e ácido ocadáico.

[0020] A figura 12 mostra um gráfico que ilustra os efeitos e o GPE em neurônios corticais lesionados com ácido ocadáico.

[0021] A figura 13 representa um gráfico que mostra os efeitos de G-2- MePE sobre os neurônios corticais lesionados com ácido ocadáico.

[0022] A figura 14 representa um gráfico que mostra os efeitos de G-2- MePE, GPE sobre microexplantes cerebelares lesionados com ácido ocadáico.

[0023] A figura 15 representa um gráfico que mostra os efeitos de G-2- MePE ou GPE nas células do corpo estriado lesionadas com ácido ocadáico.

[0024] A figura 16 mostra os efeitos da injeção subcutânea de G-2- MePE (em doses de 0,012, 0,12, 1,2 e 12 mg/kg) sobre o número de neurônios ChAT-positivos no corpo estriado de ratos de 18 meses de idade.

[0025] A figura 17 mostra os efeitos do tratamento G-2-MePE sobre a retenção de memória espacial em ratos de 12 meses de idade de meia-idade.

[0026] As figuras 18A e 18B mostram efeitos do G-2-MePE na memória de trabalho espacial de ratos de 17 meses de idade em um labirinto radial de 8 braços após três semanas de tratamento e nove dias de resistência. A figura 18A mostra os perfis de aquisição de labirinto através dos dias para os diferentes grupos. A figura 18B mostra a proporção de escolhas corretas em média entre dias para os grupos.

[0027] A figura 19A mostra os efeitos de uma única administração in-traperitoneal de quatro doses de G-2-MePE sobre a proliferação de neuroblastos como avaliado pelo número de células PCNA positivas na zona subventricular (SVZ) de ratos envelhecidos.

[0028] A figura 19B mostra os efeitos de uma única administração in-traperitoneal de quatro doses de G-2-MePE sobre a co-localização de PCNA e colo-ração de cortina dupla em um rato tratado com a dose mais elevada de G-2-MePE (painel direito) em comparação com os ratos tratados com veículo (painel esquerdo).

[0029] A figura 19C mostra os efeitos de G-2-MePE sobre a proliferação de neuroblastos PCNA como avaliado por coloração imuno-histoquímica em ra- tos de meia-idade.

[0030] A figura 20A mostra um aumento significativo no número de as- trócitos reativos, tal como avaliado por coloração GFAP no hipocampo de ratos ido-sos em comparação com ratos jovens (* p <0,01) e os ratos de meia idade (* p <0,01).

[0031] A figura 20B mostra uma fotografia de uma seção do córtex cerebral de um rato envelhecido, mostrando os astrócitos como avaliado com coloração GFAP, alguns dos quais estão associados com a formação de capilares (setas).

[0032] A figura 20C mostra os efeitos dependentes da dose do tratamento de G-2-MePE (em doses de 0,12, 0,12, 1,2 e 12 mg/kg/dia) sobre a redução do número de astrócitos como ensaiado utilizando coloração GFAP na sub-região CA4 do hipocampo em ratos idosos.

[0033] A figura 20D mostra os efeitos dependentes da dose do tratamento de G-2-MePE (em doses de 0,12, 0,12, 1,2 e 12 mg/kg/dia) sobre a redução do número de astrócitos como ensaiado utilizando coloração GFAP no córtex cere- belar.

[0034] A figura 21 mostra as propriedades farmacocinéticas de GPE e G-2-MePE na circulação de ratos após injeção intravenosa.

[0035] A figura 22 mostra os efeitos de G-2-MePE no aumento da duração de sobrevivência em camundongos deficientes de MeCP2 em comparação com camundongos deficientes de MeCP2 tratados com solução salmoura.

[0036] A figura 23 mostra os efeitos de G-2-MePE na potenciação do hipocampo a longo prazo, tal como medido pela inclinação fEPSP em camundongos deficientes de MeCP2, em comparação com camundongos deficientes de MeCP2 tratados com solução de salmoura.

[0037] A figura 24 representa um gráfico que mostra os efeitos de G-2- MePE em comprimento de dendrito como uma função da distância a partir da soma das células.

DESCRIÇÃO DETALHADA Definições

[0038] O termo "cerca de", com referência a uma dose ou tempo se refere a uma determinada variável e uma faixa em torno dessa variável que está dentro do erro de medição normal é de 20% do valor da variável. O termo "cerca de", com referência a um resultado observado significa que a variação está dentro de 20% do valor da variável observada.

[0039] O termo "alquila" significa um grupo hidrocarboneto linear saturado tendo desde um até seis átomos de carbono, ou um grupo hidrocarbila saturado, ramificado ou cíclico possuindo de três a seis átomos de carbono. Os grupos alquila exemplares incluem cadeia linear ou ramificada, ou grupos alquila cíclicos, metila, etila, isopropila, ciclopropila, terc-butila, ciclopropilmetila, e hexila.

[0040] O termo "animal" inclui seres humanos e animais não humanos, tais como animais domésticos (cães, gatos, e semelhantes) e animais de criação (gado, cavalos, ovelhas, cabras, porcos, e semelhantes).

[0041] O termo "aralquila" significa um grupo de fórmula geral -(CH2) 1- 2Ar, onde Ar é um anel aromático carbocíclico ou heterocíclico de 5 ou 6 elementos, opcionalmente substituído com 1 a 3 substituintes selecionados de Cl, Br, -OH, -O- alquila, -CO2R8 (onde R8 é H ou alquila) ou -NR8R9 em que R8 é conforme descrito anteriormente e R9 é H ou alquila. Exemplos de grupos aralquila incluem benzila, 2-clorobenzila, 4-(dimetilamino) benzila, fenetila, 1-pirrolilmetila, 2 - tienilmetila, 3- e piridilmetila.

[0042] O termo "doença" inclui qualquer condição não saudável de um animal, incluindo, em particular a doença de Parkinson, doença de Huntington, do-ença de Alzheimer, esclerose múltipla, diabetes, transtornos motores, convulsões, disfunções cognitivas devido ao envelhecimento e transtornos do espectro autista, incluindo autismo, Síndrome do X Frágil, Síndrome de Rett (RTT), Transtorno do Autismo, Síndrome de Asperger, Transtorno Desintegrativo da Infância e Transtorno Invasivo do Desenvolvimento Sem Outra Especificação (PDD-NOS), e Evitação de Demanda Patológica (PDA).

[0043] O termo "resíduo de álcool graxo" é um grupo hidrocarbila linear possuindo de sete a vinte átomos de carbono, contendo opcionalmente até três liga-ções duplas carbono-carbono. Resíduos de álcool graxo exemplares incluem decila, pentadecila, hexadecila (cetila), octadecila (estearila), oleíla, linoleíla, e eicosila.

[0044] O termo "fator de crescimento" significa uma molécula de poli- peptídeo de sinalização extracelular que estimula uma célula a crescer ou proliferar.

[0045] O termo "lesão" inclui qualquer lesão aguda de um animal, incluindo acidente vascular cerebral não hemorrágico, lesão cerebral traumática, asfixia perinatal associada com sofrimento fetal, tal como aquela seguindo descolamento, oclusão do cordão ou associada ao retardo do crescimento intrauterino, asfixia peri-natal associada com insuficiência de reanimação adequada ou respiração, graves insultos do SNC associados ao quase afogamento, quase morte no berço, inalação de monóxido de carbono, amônia ou outra intoxicação gasosa, parada cardíaca, coma, meningite, hipoglicemia e estado epiléptico, episódios de asfixia cerebral as-sociada à cirurgia de revascularização do miocárdio, episódios de hipotensão e cri-ses hipertensivas, trauma cerebral e lesão tóxica.

[0046] "Transtornos de memória" ou "transtornos cognitivos" são transtornos caracterizados por incapacidade permanente ou temporária ou perda da capacidade de aprender, memorizar ou recordar informações. Distúrbio de memória pode resultar do envelhecimento normal, lesão do cérebro, tumores, doenças neuro- degenerativas, doenças vasculares, doenças genéticas (doença de Huntington), hi-drocefalia, outras doenças (doença de Pick, doença de Creutzfeld-Jakob, AIDS, me-ningite), substâncias tóxicas, deficiência nutricional, transtornos bioquímicos, disfun- ções psicológicas ou psiquiátricas. A presença de distúrbio de memória em um ser humano pode ser estabelecida análise aprofundada da história do paciente, exame físico, exames laboratoriais, exames de imagem e testes neuropsicológicos. Testes neuropsicológicos padrão incluem mas não estão limitados ao Teste Revisto de Memória Visual Breve (BVMT-R), Bateria Cambridge de Testes Neuropsicológicos Automatizados (CANTAB), Escala de Memória das Crianças (CMS), Teste de Me-mória Contextual, Teste de Memória de Reconhecimento Contínuo (CMRT), Teste de Associação da Palavra Oral Controlada e Questionário de Funcionamento da Memória, Escala de Memória em Neuropisicologia de Denman, Subteste de Sequência Numérica e Alfabética e Dígitos da Escala III de Inteligência de Adultos Wechster, Avaliação de Memória para Objetos de Fuld (FOME), Memória Graham-Kendall para Testes de Projeto, Teste de Memória de Guild, Teste de Aprendizado Verbal de Hopkins, Bateria de Testes de Memória e Aprendizado (LAMB), Escala de Auto- classificação Clínica de Avaliação da Memória (MAC-S), Escalas de Avaliação de Memória (MAS), Teste de Memória de Randt, Teste de Memória de Reconhecimento (RMT), Teste de Auditório e Aprendizado Verbal de Rey (RAVLT), Teste de Memória Comportamental Rivermead, Escala de Memória de Wechsler segundo a Adaptação de Russell (RWMS), Memória de Trabalho Espacial, Teste de Memória e Aprendizado (TOMAL), Escala de Memória de Vermont (VMS), Escala De Memória de Wechsler, Avaliação da Memória e da Aprendizagem de Amplo Alcance - (WRAML).

[0047] O termo "excipiente farmaceuticamente aceitável" significa um excipiente que é útil na preparação de uma composição farmacêutica que é geral-mente segura, não tóxica, e desejável, e inclui excipientes que são aceitáveis para utilização veterinária bem como para utilização farmacêutica humana. Tais excipien- tes podem ser sólidos, líquidos, semissólidos ou, no caso de uma composição em aerossol, gasosos.

[0048] O termo "sal farmaceuticamente aceitável" significa um sal que é farmaceuticamente aceitável e possui as propriedades farmacológicas desejadas. Esses sais incluem sais que podem ser formados quando prótons ácidos presentes nos compostos reagem com bases inorgânicas ou orgânicas. Tais sais inorgânicos adequados incluem aqueles formados com os metais alcalinos, por exemplo sódio e potássio, magnésio, cálcio e alumínio. Os sais orgânicos adequados incluem os for-mados com bases orgânicas, tais como aminas, por exemplo, etanolamina, dietano- lamina, trietanolamina, trometamina, N-metilglucamina, e semelhantes. Os sais tam-bém incluem os sais de adição de ácidos formados por reação de um grupo amina ou grupos presentes no composto com um ácido. Os ácidos adequados incluem áci-dos inorgânicos (por exemplo, os ácidos clorídrico e bromídrico) e ácidos orgânicos (por exemplo ácido acético, ácido cítrico, ácido maleico, e de ácidos alcano-e areno- sulfônicos tais como ácido metanossulfónico e ácido benzenossulfônico). Quando existem dois grupos ácidos presentes em um composto, um sal farmaceuticamente aceitável pode ser um mono ácido mono sal ou di-sal, e, igualmente, quando existem mais do que dois grupos ácidos presentes, alguns ou todos esses grupos podem ser salificados. O mesmo raciocínio se aplica quando dois ou mais grupos amina estão presentes em um composto.

[0049] O termo "grupo protetor" é um grupo que bloqueia seletivamente um ou mais locais reativos em um composto multifuncional, tal que uma reação química pode ser realizada seletivamente em outro sítio reativo não protegido e tal que o grupo pode ser facilmente removido após a reação seletiva estar completa.

[0050] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" significa a quantidade de um agente que, quando administrada a um animal para tratamento de uma doença, é suficiente para efetuar o tratamento para a doença, tal como medido usando um sistema de teste reconhecido na técnica.

[0051] O termo "tratar" ou "tratamento" de uma doença pode incluir a prevenção que a doença ocorra em um animal que pode estar predisposto à doença, porém que ainda não experimentou ou exibiu sintomas da doença (tratamento profi-lático), inibição da doença (retardo ou interrupção do seu desenvolvimento), forne-cendo alívio dos sintomas ou os efeitos colaterais da doença (incluindo o tratamento paliativo) e alívio da doença (causando a regressão da doença).

[0052] O termo "déficit funcional" significa um déficit comportamental associado ao dano neurológico. Tais déficits incluem déficits da marcha, como foi observado em pacientes com doença de Parkinson, anormalidades motoras obser-vadas em pacientes com doença de Huntington. Déficit funcional também inclui a colocação anormal do pé e transtornos da memória descritos no presente documen-to.

[0053] Os termos "G2-MePE" e "NNZ-2566" significam L-glicil-2-metil-L- prolil-L-glutamato.

[0054] O termo "convulsão" significa um padrão anormal de atividade neural no cérebro que resulta em um déficit motor ou falta de controle motor, resultando em movimento anormal, incluindo movimento espasmódico. "Convulsão" inclui anormalidades do eletroencefalograma, acompanhadas ou não por atividade motora anormal.

[0055] Átomos de hidrogênio implícitos (tais como os átomos de hidrogênio sobre um anel de pirrolidina, etc.) são omitidos das fórmulas, por questões de clareza, mas deverá ser entendido como estando presentes.

Transtornos do Espectro do Autismo

[0056] Transtornos do espectro do autismo (ASD) são um conjunto de transtornos do desenvolvimento ligados, caracterizados por anormalidades na inte-ração social e comunicação, interesses restritos e comportamentos repetitivos. A classificação atual de ASDs reconhece cinco formas distintas: autismo clássico ou Transtorno do Autismo, síndrome de Asperger, síndrome de Rett, transtorno desin- tegrativo da infância e transtornos invasivos do desenvolvimento sem outra especifi-cação (PDD-NOS). A sexta síndrome, evitação à demanda patológica (PDA), é mais um transtorno invasivo do desenvolvimento específico. No entanto, enquanto PDA é cada vez mais reconhecido como um ASD, ainda não faz parte do Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (Manual Diagnóstico e Estatístico de Trans-tornos Mentais) (DSM-IV), publicado pela Associação Psiquiátrica Americana, nem faz parte da proposta de revisão, o DSM- V.

Autismo

[0057] Autismo clássico é um distúrbio neurológico altamente variável. Ele é tipicamente diagnosticado durante a infância ou início da infância, com sintomas evidentes, muitas vezes aparentes a partir da idade de 6 meses, e tornando-se estabelecido por 2-3 anos. De acordo com os critérios estabelecidos no DSM-IV, o diagnóstico de autismo requer a presença de uma tríade de sintomas incluindo (a) deficiências na interação social, (b) deficiências na comunicação e (c) os interesses e comportamentos restritos e repetitivos. Outras disfunções, como o comer atípico, também são comuns, mas não são essenciais para o diagnóstico. Destas deficiên-cias, as deficiências de interação social são particularmente importantes para o di-agnóstico, e duas das seguintes deficiências devem estar presentes para um diag-nóstico de autismo: (i) deficiências no uso de múltiplos comportamentos não verbais (por exem-plo, o contato visual) para regular a interação social; (ii) incapacidade de desenvolvimento de relacionamentos com seus pares apropriados ao nível de desenvolvimento; (iii) falta de procura espontânea de compartilhar prazer, interesses ou reali-zações; (iv) falta de reciprocidade social ou emocional.

[0058] Deficiências de comunicação no autismo podem se manifestar em uma ou mais das seguintes formas: atraso (ou falta total) no desenvolvimento da linguagem falada; acentuado prejuízo na capacidade de iniciar ou manter uma con-versa, uso estereotipado e repetitivo da linguagem, e/ou a falta de faz de conta es-pontâneo. Padrão restrito, repetitivo e estereotipado de comportamento também é necessário para o diagnóstico, tal como a preocupação com um ou mais interesse considerado anormal em intensidade, adesão inflexível a rotinas ou rituais, manei-rismos motores repetitivos e/ou foco persistente em partes de objetos.

[0059] Por fim, para o diagnóstico do autismo, é necessário que a insu-ficiência no funcionamento de pelo menos uma área (isto é, a interação social, lin-guagem, ou reprodução imaginativa) tenha início em menos de 3 anos de idade.

[0060] O autismo é comumente associado com epilepsia ou atividade epileptiforme no eletroencefalograma (EEG). Tantos quantos 60 por cento dos paci-entes com autismo têm atividade epileptiforme em seus EEGs (Spence e Schneider, 2009 Ped Res 65: 599-606).

[0061] Autismo também está associado aos transtornos na função do IGF-1, o qual é esgotado no Sistema Nervoso Central (SNC) em pacientes com autismo (Riikonen e outros, 2006 Devel Med. Child. Neurol 48:.751 -755). Os níveis de IGF-1 no CNS aumentam nos pacientes com autismo após o tratamento com agentes que reduzem os sintomas, tais como a fluoxetina (Makkonen e outros, 2011 Neu-ropediatrics 42:207-209).

[0062] É importante ressaltar que o autismo compartilha características da Síndrome de Rett e Síndrome do X Frágil em relação à conectividade neuronal. Todos os três transtornos são caracterizados por defeitos na função neuronal e co-nectividade sináptica. Isso se reflete em estudos de post-mortem do cérebro humano neste grupo de doentes, que todos mostram falha em formar conexões sinápticas normais. Isso se reflete em características morfológicas alteradas, sendo tanto uma redução na densidade de espinha dendrítica dos neurônios, ou densidade da espi-nha dendrítica melhorada porém associada à sinapses imaturas. Isto se reflete em modelos animais de autismo, síndrome de Rett e Síndrome do X frágil, que se ba-seiam em alterações genéticas conhecidas como patológica nesses transtornos. Nesses modelos animais, os defeitos de conectividade neuronal são revelados mor-fologicamente, e também como uma falha de Potenciação de Longo Prazo (LTP). Isto é importante uma vez que o IGF-1, IGF-1 [1 -3] e G-2-MePE aumentam a formação de sinapses.

Síndrome de Asperger

[0063] A Síndrome de Asperger ou transtorno de Asperger é semelhante ao autismo, e compartilha certas características. Como o autismo, a síndrome de Asperger também é caracterizada pelo comprometimento na interação social e isso é acompanhado por interesses e comportamento restrito e repetitivo. Assim, o diag-nóstico de síndrome de Asperger é caracterizado pela mesma tríade das deficiências como o autismo. No entanto, ela difere dos outros ASDs por não ter nenhum atraso geral na linguagem ou do desenvolvimento cognitivo e sem déficit do interesse no ambiente do indivíduo. Além disso, a síndrome de Asperger é geralmente menos grave em sintomatologia de autismo clássico e os doentes de Asperger podem funcionar com auto-suficiência e levar uma vida relativamente normal.

Transtorno Desintegrativo da Infância

[0064] O transtorno desintegrativo da infância (CDD), também conhecido como síndrome de Heller, é uma condição na qual as crianças se desenvolvem normalmente até a idade de 2-4 anos (ou seja, mais tarde que o autismo e síndrome de Rett), mas, em seguida, demonstram uma grave perda social, de comunicação e outras habilidades. O transtorno desintegrativo da infância é muito parecido com o autismo e ambos envolvem o desenvolvimento normal seguido por uma perda signi-ficativa da linguagem, o jogo social e habilidades motoras. No entanto, o transtorno desintegrativo da infância geralmente ocorre mais tarde que o autismo, envolve uma perda mais dramática de habilidades e é muito menos comum.

[0065] O diagnóstico do CDD é depende da perda dramática de habilidades anteriormente adquiridas em duas ou mais das seguintes áreas: linguagem, habilidades sociais, brincadeiras, habilidades motoras (tal como um declínio dramá-tico na capacidade de caminhar, escalar, agarrar, etc.), controle do intestino ou con-trole da bexiga (apesar de já ser treinado em ir ao banheiro). A perda das habilidades de desenvolvimento pode ser abrupta e ter lugar ao longo de dias ou semanas, ou pode ser mais gradual.

Transtorno Invasivo do Desenvolvimento - Sem Outra Especificação (PDD- NOS)

[0066] O transtorno Invasivo do Desenvolvimento - Sem Outra Especificação (PDD-NOS) é um ASD que descreve pacientes que exibem alguns, mas não todos, os sintomas associados com outros ASDs bem definidos. Os principais critérios para o diagnóstico de um ASD incluem dificuldade em socializar com os outros, comportamentos repetitivos e sensibilidades elevadas a determinados estímulos. Estes são todos encontrados nos ASDs acima descritos. No entanto, autismo, sín- drome de Asperger, síndrome de Rett e o transtorno desintegrativo da infância todos têm outras características que permitem o seu diagnóstico específico. Quando o di-agnóstico específico de um desses quatro transtornos não pode ser feito, porém o ADS é aparente, um diagnóstico de PDD-NOS é feito. Tal diagnóstico pode resultar de sintomas a partir de uma idade mais avançada que é aplicável a outras condições no espectro.

Síndrome de Rett

[0067] Síndrome de Rett (RTT) é um transtorno neurológico que afeta quase exclusivamente mulheres (1 em 10:000 nascidos vivos). A RTT é classificada como um transtorno do espectro do autismo (Diagnostic and Statistical Manual of mental Disorders, Fourth Edition - Revised (DSM-IV-R). Cerca de 16 mil pacientes são atualmente afetados por ela nos USA {Rett Syndrome Research Trust data). Para um diagnóstico de síndrome de Rett, os seguintes sintomas são característicos: desenvolvimento prejudicado a partir de 6-18 meses; desaceleração da taxa de crescimento da cabeça a partir de idade entre 3 meses e 4 anos; linguagem seve-ramente prejudicada, movimentos repetitivos da mão e estereotipados; e anormali-dades da marcha, por exemplo, andar apoiado nos dedos dos pés ou andar com as pernas instáveis e rígidas Há, além disso, um certo número de critérios de apoio que podem ajudar diagnóstico de síndrome de Rett, mas não são essenciais para o di-agnóstico. Estes incluem dificuldades respiratórias, anomalias de EEG, convulsões, rigidez muscular e espasticidade, escoliose (curvatura da coluna vertebral), ranger de dentes, mãos e pés pequenos em relação à altura, retardo do crescimento, dimi-nuição da gordura corporal e massa muscular, padrões de sono anormais, irritabili-dade ou agitação, dificuldades de mastigação e/ou de deglutição, má circulação e constipação.

[0068] O início do RTT geralmente se dá entre 6-18 meses de idade, com uma desaceleração das taxas de crescimento e desenvolvimento. Isto é seguido por uma fase de regressão (normalmente em crianças com idade entre 1-4 anos de idade), a fase pseudo-estacionária (2 -10 anos de idade) e um estado de deterioração motora posterior progressivo subsequente. Sintomas de RTT incluem desaceleração brusca do crescimento e regressão na linguagem e habilidades motoras incluindo movimentos manuais sendo substituídos por movimentos estereotipados, características autistas, ataques de pânico, tais como, transtornos do ciclo do sono, tremores, convulsões, disfunções respiratórias (apnéia episódica, hiperapnéia), apraxia, distonia, discinesia, hipotonia, escoliose ou cifose progressiva e grave com-prometimento cognitivo. A maioria dos pacientes RTT sobrevivem até a idade adulta com deficiências graves e necessitam de cuidados 24 horas por dia.

[0069] Entre 85% e 95% dos casos de TTR são relatados como sendo causados por uma mutação do gene MeCP2 (Amir e outros, 1999. Nat Genet 23: 185-188; Rett Syndrome Research Trust) - um gene que codifica a proteína 2 de ligação de metil-CpG- (MeCP2). Mecp2 mapeia o cromossomo X (localização Xq28) e, por essa razão, as mutações no gene em machos são geralmente letais. Enquanto RTT é uma doença genética, menos de 1% dos casos registrados são hereditários; quase todas as mutações de Mecp2 ocorrem de novo, com dois terços causadas por mutações em oito dinucleotídeos CpG (R106, R133, T158, R168, R255, R270, R294 e R306), localizado no terceiro e quarto éxons.

[0070] MeCP2 é uma proteína que liga dinucleótideos de CpG metila- dos para exercer o silenciamento transcricional do DNA no CNS. O principal efeito de uma redução ou a ausência de MeCP2 parece ser uma deficiência no desenvol-vimento da espinha dendrítica e a formação de sinapses. A expressão de MeCP2 parece correlacionar-se temporalmente com a maturação cerebral, explicando porque os sintomas geralmente aparecem com cerca de 18 meses de idade.

Apresentação das Características Comuns a ASDs

[0071] Tomando os ASDs em conjunto, fica claro que existem semelhanças na apresentação de sintomas entre todas as 5 formas. Essas características comuns são lesões nas competências sociais normais, e comportamentos repetitivos. Em todos, exceto a síndrome de Asperger, há também uma apresentação consistente de desenvolvimento intelectual retardado mais comumente se manifestando como um déficit nas habilidades linguísticas. A perda cognitiva em relação aos parâmetros normais para a idade muitas vezes é bastante acentuada no autismo, Sín- drome de Rett, CDD e PDD-NOS. A presença de epilepsia ou atividade anormal no EEG também é comum no autismo, Síndrome de X Frágil e Síndrome de Rett. Epilepsia surge em situações de conectividade neuronal anormal. A conectividade neuronal diminuída e função sináptica demente é uma característica comum do autismo, Síndrome de X Frágil e Síndrome de Rett e de modelos animais dessas condições.

Modelos genéticos de ASD

[0072] Para oferecer validade, modelos animais de ASDs devem demonstrar sintomas similares às condições clínicas e apresentarem um grau razoável de validade de face em relação à etiologia desses sintomas. Sabe-se que o autismo clássico pode ser causado por muitas deficiências genéticas diferentes e nenhum defeito genético único é responsável por mais de uma pequena porcentagem de ca-sos de autismo. De fato, estudos recentes revelaram inúmeras variações estruturais de novo de locais cromossômicos que se acredita fundamentem o ASD, além de anomalias genéticas hereditárias (Marshall e outros, 2008; Sebat e outros, 2007). Assim, a variação do número de cópias (CNV), translocação e inversão de seqüên- cias genéticas em 20 pontos-chave ou mais, incluindo 1p, 5q, 7q, 15q, 16p, um 7P e Xq, foram mapeados como locais ASD.

[0073] No entanto, apesar da poligenética subjacente fundamentar o ADS e a complexidade da sua etiologia, é sabido que certos defeitos genéticos podem produzir ASD. Alguns dos melhores defeitos caracterizados surgem a partir de genes de aberrações cromossômicas que codificam um conjunto de proteínas da densidade pós-sináptica, incluindo neuroliguina-3 (NLGN3), neuroliguina-4 (NLGN4), neuroxina NRXN-la (1) e SHANK3 (Sebat e outros, 2007). É importante ressaltar que esses defeitos apontam para a função sináptica alterada e, portanto, a conectividade neuronal perturbada como uma via final comum no autismo e transtornos relaciona-dos (Minshew e Williams 2007 Arch Neurol. 64:945-950; Gilman e outros, 2011 Neu-ron.. 70:898-907). Tais déficits de conectividade são refletidos em alterações morfo-lógicas no exame post mortem, que revelam o aumento da densidade das espinhas dendríticas no autismo (HUTSLER e Zhang 2010 Brain Res. 1309:83-94).

[0074] NLGN3 e NLGN4 são moléculas de adesão celular pós- sinápticas presentes nas sinapses glutamatérgicas. Elas desempenham um papel importante na coordenação de contato pré-sináptico com o sítio pós-sináptico e tam-bém interagem com a proteína shank3 scaffolding pós sináptica.. Mutações para NLGN3 e NLGN4 foram observadas na população ASD e representam talvez 1% de todos os casos de ASD (Lintas & Persico, 2008). Jamain e colegas relataram pela primeira vez uma mutação missense para NLGN3 e uma mutação frameshift para NLGN4 em duas disciplinas não relacionadas, resultando em síndrome de Asperger e autismo clássico respectivamente (Jamain e outros, 2003). Embora a incidência de mutações de NLGN3 ou NLGN4 na população ASD seja baixa (na verdade, não fo-ram observadas muitas mutações em um estudo de 96 pacientes com autismo em um estudo de Canadian; Gauthier e outros, 2005), foi confirmado em estudos pré- clínicos que mutações de neuroligina podem realmente produzir de modelo de sin-tomas autistas. Assim, a introdução de camundongos da mesma missense R451C para NLGN3 que foi relatado clinicamente resulta em uma cepa mutante do camun-dongo mostrando a interação social reduzida e maior transmissão sináptica inibitória (Tabuchi e outros, 2007).

[0075] O mutante R451C de camundongo, portanto, representa um modelo para ASD com base em mutação de NLGN3. Nesse caso, a mutação na posição de R451 NLGN3 resulta na mutação de "ganho de função "

[0076] Em contraste, a modelagem da mutação clínica de NLGN4 em camundongos é obtida por uma mutação de "perda de função" de NLGN4 (um mo-delo clássico e de nocaute). Neste modelo, os ratos mutantes exibem um déficit de interação social e de redução da vocalização ultra-sônica (Jamain e outros, 2008). Déficits de comunicação são fundamentais para ASDs clínicos e nos camundongos nocauteados com NLGN4 uma redução nas vocalizações ultra-sônicas de camun-dongos machos expostos a contrapartes fêmeas do tipo selvagem suporta a validade de face da cepa como um modelo de ASD.

[0077] Proteínas neurexina pré-sinápticas induzem diferenciação pós- sináptica em dendritos opostos através de interações com contrapartes neurolignina pós-sinápticas. As mutações do gene neuroxinas-l α (NRXNl) têm sido relatadas em numerosos estudos (Sebate e outros, 2007; Marshall e outros, 2008; Kim e outros, 2008; Yan e outros, 2008) e estes foram observados na forma de variantes no número de cópias. Tal como com as mutações NLGN, quando uma mutação do gene NRXN é introduzida nos camundongos (sob a forma de gene nocaute), uma cepa mutante com certas características semelhantes ao ASD é produzido (Etherton e outros, 2009). Esses camundongos nocauteados com NRXNI mostram uma diminuição na frequência da corrente pós-sináptica em miniatura excitatória do hipocampo (mEPSC) e uma relação de entrada-saída diminuída das correntes evocadas. Esses efeitos eletrofisiológicos se relacionam a diminuição da transmissão excitatória no hipocampo. Além da diminuição da neurotransmissão excitatória, os camundongos nocauteados NRXNI apresentam uma diminuição da inibição pré-pulso, embora o comportamento social pareça ter sido afetado (Etherton e outros, 2009).

[0078] O compartilhamento de certas características com o construto trans-sináptico da neuroxina-NLGN, uma molécula de adesão celular I (CADMl) é uma proteína da família imunoglobulina apresentando ambas pré- e pós-sináptica, que também está envolvida na atividade de adesão de trans-células sinápticas (Bie- derer e outros, 2002). As mutações ao gene CADMI foram detectadas em pacientes com ASD e parecem representar uma causa possível adicional dessas condições (Zhiling e outros, 2008).

[0079] Análise dos camundongos nocauteados CADMl revela que esses animais mostram aumento de comportamento relacionado à ansiedade, interação social prejudicada e memória social e reconhecimento prejudicados. Além disso, camundongos nocauteados CADMI demonstram as habilidades motoras mais fra-cas. (Takayanagi e outros, 2010). Essas disfunções são mais consistentes com a sintomatologia do ASD.

[0080] A síndrome de deleção de 22ql3 (também conhecida como Sín- drome de Phelan-McDermid), é um transtorno genético raro causado por uma micro- deleção na extremidade terminal q13,3 do cromossomo 22. Essa microdeleção ra-ramente é descoberta por rastreamento genético típico e uma fluorescência em teste de hibridização in situ é recomendada para confirmar o diagnóstico. Trabalhos re-centes indicam que a síndrome é causada por erros no gene shank3, uma proteína de densidade pós-sináptica crítica para o funcionamento neuronal normal. Curiosa-mente, os erros nesse gene têm também sido associados ao ASD e a síndrome de deleção 22q13 pode comumente conduzir a um diagnóstico de ASD (Durand e ou-tros, 2007; Moessner e outros, 2007; Sykes e outros, 2009). Dada a estreita associ-ação da síndrome de deleção de 22q 13 e o conseqüente diagnóstico de ASD, foi desenvolvido um modelo de camundongo mutante dessa mutação.

[0081] O camundongo shank3 nocauteado exibe várias deficiências que espelham os sintomas de ASD, incluindo a redução de vocalizações ultrassônicas (ou seja, a comunicação social, diminuída), bem como diminuição do tempo de inte-ração social entre os camundongos. Além disso, esses camundongos tiveram a transmissão excitatória CAI do hipocampo prejudicada, medida por relação de en- trada-saída de correntes evocadas e potenciação de longo prazo prejudicada (LTP). Acredita-se que LTP seja um processo de formação e consolidação da memória fisi-ológica subjacente. Assim, o modelo exibe um fenótipo semelhante ao NLGN4 no- cauteado, consistente com ASD.

[0082] Como já foi observado, a síndrome de deleção 22q 13 propriamente é muito rara. No entanto, ela fornece informações importantes que envolvem genes específicos que podem ter envolvimento na etiologia de ASDs. Além do shank3, este transtorno revela um defeito gênico possível adicional no ASD. Dos 50 ou mais casos de 22q 13 síndrome de deleção descritos, todos têm uma deleção de um gene que se estende além shank3 para incluir um gene adicional, conhecido como o gene da ilhota Cérebro-2 (IB2) (Sebate e outros, 2007). A proteína IB2 inte-rage com muitas outras proteínas, incluindo MAP quinases e proteína precursora de amilóide, parece influenciar o tráfico de proteína nos neuritos, e é enriquecida com densidades pós-sinápticas (Giza e outros, 2010). Camundongos sem a proteína (IB2-/- camundongos nocauteados) exibem interação social prejudicada (farejamento reduzido social e tempo de interação), exploração reduzida e defeitos cognitivos e motores reduzidos (Giza e outros, 2010). Esse fenótipo comportamental foi associado à transmissão excitatória reduzida nas células do cerebelo. Tal como com shank3 nocauteado, o fenótipo de mutação de IB2 é, portanto, também consistente com ASD.

[0083] Além dos modelos animais de defeitos de proteína de densidade pós-sináptica descritos acima, outras síndromes monogenéticas que compartilham várias características com ASDs podem levar ao autismo oferecendo outra via para alvejamento do medicamento para ASD. Um exemplo excelente disso é a Síndrome de X Frágil.

[0084] A síndrome de X frágil (SXF) é provocada pela expansão de uma única sequência de gene trinucleotídeo (CGG) no cromossoma X que resulta na incapacidade de expressar a proteína codificada pelo gene fmrl. FMR1 (retardo mental X frágil 1) é uma proteína necessária para o desenvolvimento neural normal. FXS pode levar uma criança a ter autismo (Hagerman e outros, 2010), em 2-6% de todas as crianças diagnosticadas com autismo a causa é mutação genética FXS. Além disso, aproximadamente 30% das crianças SXF têm algum grau de autismo e mais de 30% são diagnosticadas com PDD-NOS (Hagerman e outros, 2010). Na verdade, a Síndrome do X Frágil é a mais comum causa conhecida de gene único do autismo. Os camundongos nocauteados FMR1 foram desenvolvidos como um modelo de SXF e, portanto, como outro modelo de ASD. Mutação de nocauteado do gene FMR1 foi mostrada como resultando em déficits de conectividade neuronal, tais como o desenvolvimento anormal da espinha dendrítica e poda (Comery e ou-tros, 1997), juntamente com uma desregulação de proteínas associada às proteínas scaffold dendítricas (incluindo haste 1) e das subunidades do receptor de glutamato em densidades pós-sinápticas (Schiitt e outros, 2009). Estes efeitos sobre a morfo-logia dendrítica resultam em déficits em medidas funcionais de conectividade como diminuição LTP no córtex e na amígdala (Zhao e outros, 2005) e no hipocampo (Lauterborn e outros, 2007), bem como a cognição diminuída (Kreuger, e outros, 2011) e um aumento na ansiedade social (Spencer e outros, 2005). Estes déficits de conectividade são espelhados em pacientes FXS, que mostram maior densidade das espinhas dendríticas em análises pós mortem (Irwin e outros, 2000 Cereb Cortex 10:. 1034-1048). Essa maior densidade das espinhas dendríticas é acompanhada por sinapses imaturas (Klemmer e outros, 2011 J Biol Chem. 286:25495-25504), ou seja, pode representar um estado funcionalmente imaturo.

[0085] Em contraste aos ASDs de autismo, Asperger, CDD e PDD- NOS, a síndrome de Rett aparenta ter uma base quase monogenética e pode ser modelada em camundongos com uma boa validade de face. Acredita-se que a Sín- drome de Rett seja causada, em até 96% dos casos, por um defeito no gene da MECP2 (Zoghbi, 2005). Como resultado, camundongos mutantes MeCP2 nocautea- dos fornecem um modelo animal com todas as características da síndrome de Rett clínica, com um fenótipo mostrando alguma sobreposição com modelos de nocaute NLGN4, shank3 e IB2 de ASD. Assim, camundongos nocauteados MeCP2 exibem uma deficiência clara na LTP no hipocampo, juntamente com uma diminuição cor-respondente na memória social e espacial (Moretti e outros, 2006) e reconhecimento de objeto prejudicado (Schaevitz e outros, 2010). Essa deficiência na LTP é acom-panhada por uma diminuição na densidade da espinha dendrítica. Pacientes com Síndrome de Rett mostram redução da densidade das espinhas dendríticas (Beli-chenko e outros, 1994 Neuroreport 5: 1509-1513).

[0086] Assim, ASDs em seres humanos, partilham muitas características de transtornos cognitivos ou de desenvolvimento em animais, incluindo os roedores. Portanto, os estudos de terapias de ASD em roedores, tais como camundongos e ratos são razoavelmente preditivos dos resultados obtidos em seres humanos. Uma característica comum observada no autismo, Síndrome de X Frágil e Síndrome de Rett é a presença de déficits de conectividade neuronal, refletidos em qualquer diminuição da densidade das espinhas dendríticas ou maior densidade das espinhas dendríticas com sinapses imaturas. As consequências funcionais destas alterações morfológicas são semelhantes em modelos animais destas doenças, que se refletem como deficiências na LTP, por exemplo.

Tratamento de ASD e Modelos de Animais com ASD com CIA G-2-MePE

[0087] Como descrito acima, uma patologia conservada é observada em ASD, que compreende o desenvolvimento prejudicado dos neuritos, conectividade sináptica deficiente e uma deficiência correspondente no funcionamento social e cognitivo como resultado. Tais disfunções sinápticas resultam de funções genetica-mente alteradas de proteínas de densidade pós-sináptica. Crescimento normal do neurito e desenvolvimento pós-sináptico podem ser regulados e aumentados por fatores de crescimento, tais como, fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF; Chapleau e outros, 2009) e fator-1 de crescimento semelhante a insulina (IGF-1; Riikonen e outros, 2006; Tropea e outros, 2009). Com efeito, o IGF-1 é essencial para o crescimento normal da espinha dendrítica e formação de sinapses (Cheng e outros, 2003 J Neurosci Res. 73: -1-9). Os medicamentos que promovem a função do fator de crescimento são, portanto, de uso no tratamento de transtornos progressivos do desenvolvimento, tais como ASDs. G-2-MePE é um análogo metilado de molécula pequena do tripeptídeo terminal do IGF-1, IGF-1 (1 -3). Como um análogo mimético de IGF-1, G-2-MePE exerce efeitos tróficos e neuroprotetores em vários modelos animais. G-2-MePE, portanto, é eficaz no tratamento dos sintomas de ASD, tais como, os relacionados com disfunções sinápticas resultantes das mutações ge-néticas descritas acima.

[0088] Em termos clínicos, pacientes com autismo, apresentando com autismo a síndrome de Asperger, síndrome de Rett, transtorno desintegrativo da in-fância e PDD-NOS, assim como pacientes com síndrome de deleção de 22q13, Sín- drome do X Frágil e evitação de demanda patológica são tratados com G-2 MePE. Pacientes apresentam deficiências sociais e de comunicação, bem como déficit cog-nitivo. Observa-se que o tratamento com G-2-MePE, por exemplo, em uma base diária e em outro exemplo, por via oral, induz uma melhora na movimentos estereotípi- cos repetitivos, melhora o funcionamento social e melhora o desempenho cognitivo seguindo-se o tratamento com o medicamento.

[0089] Em modelos animais de ASDs, o tratamento diário com G-2- MePE por gavagem oral ou injeção intraperitoneal nos camundongos nocauteados melhorará os sintomas semelhantes a ASD. G-2-MePE é eficaz nos seguintes modelos de camundongos mutantes ASD: NLGN3 (R451C) mutante, NLGN4 nocauteado, NRXN1 nocauteado, CADM1 nocauteado, shank3 nocauteado, IB2 nocauteado, FMR1 nocauteado e MeCP2 nocauteado. Quando administrado sub-cronicamente (1 -10 semanas) em uma base diária, G-2-MePE é eficaz na melhoria de LTP no hipo-campo após a estimulação de ruptura ou estimulação de alta frequência. Da mesma forma, G-2-MePE aumenta a neurotransmissão excitatória medida pelos registros eletrofisioilógicos de potencial pós-sináptico extracelular de campo no córtex, hipo-campo e cerebelo. Como resultado da neurotransmissão excitatória aperfeiçoada (reversão do déficit de neurotransmissão semelhante à ASD observado), é observado que G-2-MePE aperfeiçoa os testes cognitivo e de resultado motor do desempenho cognitivo. Assim, G-2-MePE melhora o desempenho no teste de labirinto aquático de Morris e teste de labirinto radial de braços. Em modelos de interação social, G- 2-MePE, administrado aos ratos mutantes ASD, aumenta o tempo gasto pelos ma chos nocauteados na interação social com as fêmeas do tipo selvagem. Além disso, vocalizações ultrassônicas para camundongos fêmea do tipo selvagem são aumen-tadas. Nos modelos em que a longevidade é observada como sendo reduzida em camundongos mutantes em comparação com controles de tipo selvagem (tal como o modelo de camundongo nocauteado MeCP2 de síndrome de Rett), tratamento com G-2-MePE aumenta o tempo de vida dos animais.

[0090] Foi verificado que G-2-MePE inibe as convulsões não- convulsivas (NCS) em animais com lesão hipóxico-isquêmica causada pela oclusão da artéria cerebral média (MCAO; Patente US número 7.714.020, Lu e outros, NNZ- 2566, a glypromate analog, attenuates brain ischemia-induced nonconvulsive seisu- res in rats, 3 Cerebral Blood FLow metabolism (2009) 1-9) and inhibits neuroinflammation in animals with penetrating ballistic injury (pTB1; Wei e outros, NNS-2366 treatment inhibits neuroinflammation and pro-inflammatory cytokine expression induced by experimental penetrating ballistic-like brain injury in rats, J. Neuroinflammation (2009) 6:19, 1-10).

[0091] As nossas descobertas de que G-2-MePE também são eficazes no tratamento da síndrome de Rett e ASD, o que é completamente inesperado com base na técnica anterior. Isto porque o NCS no modelo MCaO é causado por hipó- xia-isquêmia e a expressão de citoquinas inflamatórias no modelo pTBI é causada por trauma de penetração, os quais são insultos agudos, que são muito diferentes dos efeitos crônicos do MECP2 ou de outras mutações na maturação sináptica.

[0092] Uma vez que G-2-MePE é um elemento dos compostos análogos de GPE revelados no presente documento, qualquer um dos compostos descritos também pode ser eficaz no tratamento dos sintomas de ASDs. Além disso, já que os compostos e métodos dessa invenção se dirigem aos mecanismos neurológicos subjacentes (por exemplo, diminuir a inflamação neural através da inibição da liberação de citocinas inflamatórias), a presente invenção pode fornecer mais que o monitoramento dos sintomas a curto prazo. Pelo contrário, compostos e métodos da presente invenção podem melhorar a função neuronal, promover a migração da cé-lula neuronal, promover a neurogênese, promover a diferenciação de células esta- minais neuronais, promover crescimento axonal e dendrítico e promover a transmis-são sináptica, aliviando assim os sintomas adversos das ASDs.

Compostos da Invenção

[0093] Embora a definição mais ampla da invenção seja definida no Sumário, determinados compostos da presente invenção são descritos presente-mente.

[0094] Em um aspecto, essa invenção proporciona compostos da fórmula 1 e da fórmula 2:

em que m é 0 ou 1; n é 0 ou 1; X é H ou -NR6 R7; Y é H, alquila, - CO2R5, ou -CONR6 R7; Z é H, alquila, - CO2R5 ou -CONR6 R7; R1 é H, alquila ou aralquila; R2, R3, e R4 são, independentemente, H ou alquila; cada R5 é independentemente H, alquila, ou um resíduo de álcool graxo ; cada R6 e R7 é independentemente H, alquila, ou aralquila, ou -NR6 R7 é pir- rolidina, piperidina, ou morfolino; ou uma lactona formada quando um composto em que Y é -CO2 (alquila), e Z é -CO2H ou onde Y é - CO2H e Z é -CO2 (alquila) é lactonizado; e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, desde que o composto não seja GPE, N-Me-GPE, amida de GPE, APE, GPQ ou um seu sal.

[0095] Em alguns aspectos, a presente invenção inclui: (a) os compostos são compostos de fórmula 1; (b) m é 0; (c) n é 1; (d) pelo menos um de X, Y, R1, R2, R3, R4 e R5 não é hidrogênio; (e) X é -NR6 R7; e (f) Y é -CO2R5 ou -CO2NR6 R7; e (g) Z é -CO2R5 ou -CO2NR6 R7.

[0096] Outros compostos da invenção são compostos de fórmula 1 em que X é -NR6 R7 e R6 e R7 são, independentemente, alquila ou aralquila. A modalidade mais preferida é um composto de fórmula I em que X é -NR6 R7 e ambos R6 e R7 são alquila.

[0097] Ainda outro composto da invenção é G-2-MePE, um composto de fórmula 1, em que m é 0, n é 1, R1 = R3 = R4 = H. R2 é metila, X é NR6 R7 onde R6 = R7 = H, Y é CO2R5, em que R5 = H, Z é CO2R5, em que R5 = H.

Farmacologia e Utilidade

[0098] Os compostos dessa invenção podem ter efeitos anti- inflamatórios, anti-apoptóticos, anti-necrótico e neuroprotetor. A sua atividade in vivo pode ser medida por contagem de células, de coloração específica dos marcadores desejados, ou através de métodos tais como aqueles discutidos em Klempt ND e outros: hipóxia-isquemia induz o fator de crescimento transformador β1 mRNA no cérebro de camundongo infantil. Molecular Brain Research: 13: 93-101. A sua ativi- dade pode também ser medida in vitro utilizando métodos conhecidos na arte ou descritos no presente documento.

[0099] Condições que afetam o funcionamento do cérebro tornam-se predominantes no envelhecimento da população. A perda de memória e perda de memória são angustiantes para os pacientes afetados e suas famílias. A perda de memória ou de redução pode resultar do envelhecimento normal, lesão do cérebro, doenças neurodegenerativas e transtornos psiquiátricos ou psicológicos. Por isso, é de grande benefício para os pacientes, suas famílias e a sociedade que os novos compostos sejam identificados e caracterizados os quais melhoram a memória e/ou a função cognitiva e tratem ou previnam a perda ou prejuízo da memória.

[00100] É desejável estudar os efeitos em potencial dos agentes terapêuticos em sistemas animais. Tal sistema útil é o camundongo. Sabe-se que, com o envelhecimento, camundongos e outros animais (incluindo seres humanos) podem apresentar sintomas de perda de memória, disfunção da memória e outras disfun-ções cognitivas. Além disso, sabe-se que os estudos em ratos de agentes terapêuti-cos são preditivos de efeitos terapêuticos em seres humanos. Assim, os estudos dos efeitos de GPE e G-2-MePE e a função cognitiva em ratos idosos são razoavelmente preditivos dos efeitos terapêuticos desses agentes no envelhecimento dos seres humanos que possuem ou estão propensos a adquirir os déficits de memória ou ou-tras disfunções cognitivas. Os compostos da presente invenção podem melhorar a função cognitiva e/ou tratar os transtornos de memória. A atividade da melhora cog-nitiva e atividade terapêutica in vivo pode ser medida por testes neuropsicológicos ou comportamentais padrão conhecidos dos versados na técnica. Tais testes podem ser escolhidos entre uma vasta faixa de testes disponíveis descritos acima, e variarão dependendo da função cognitiva a ser testada e da condição do animal.

[00101] Testes comportamentais padrão úteis para testar a função cognitiva em modelos animais incluem, mas não estão limitados ao teste de labirinto aqu- ático de Morris, teste de resposta de evitação passiva, novo teste de reconhecimento de objeto, teste de discriminação olfativa, teste de labirinto radial de 8 braços e o teste de labirinto em T. Estes testes são diretamente aplicáveis aos estudos dos efeitos de GPE e G-2-MePE sobre a função cognitiva em ratos idosos.

[00102] Também é esperado que os compostos dessa invenção tenham atividades farmacológicas e terapêuticas semelhantes às do GPE, e estas atividades podem ser medidas pelos métodos conhecidos na técnica, e discutidos nos docu-mentos citados aqui, e os métodos usados para medir a atividade do GPE.

[00103] A razão terapêutica de um composto pode ser determinada, por exemplo, comparando-se a dose que proporciona atividade anti-inflamatória, antia- poptótica e antinecrose eficaz em um modelo in vivo adequado, como uma lesão hipóxico-isquêmica (Sirimanne ES, Guan J. Williams CE e Gluckman PD: Dois mo-delos para determinar os mecanismos de lesão e reparação após lesão hipóxico- isquêmica no cérebro do rato em desenvolvimento (Journal of Neuroscience Me-thods: 55:7-14, 1994), em uma espécie de animal adequada, tal como o rato, com a dose que fornece efeitos colaterais significativos nas espécies animais de teste.

[00104] A razão terapêutica de um composto pode também ser determinada, por exemplo, comparando a dose que fornece melhoria da função cognitiva efetiva ou trata um distúrbio de memória em um modelo in vivo adequado (Exemplos 4, 5 e 6 abaixo), em uma espécie de animal adequada, tais como, rato, com a dose que proporciona a perda de peso significativa (ou outros efeitos colaterais observáveis) nas espécies animais de teste.

[00105] Os compostos dessa invenção podem ser úteis no tratamento de uma variedade de transtornos neurodegenerativos, incluindo hipóxia/isquemia e de-generação neuronal (Patente US número 7.041.314), traumatismo crânio-encefálico, transtornos motores e convulsões, acidente vascular cerebral, e cirurgia de revascu- larização cardíaca (Patente US número 7.605.177), ataques não convulsivos (Paten- te US número 7.714.020) e transtornos da função cognitiva (Patente US número 12/903.844). Além disso, como descrito mais completamente a seguir no presente documento, os compostos da presente invenção podem ser úteis para o tratamento da síndrome de Rett, incluindo o prolongamento da vida, aumentando a atividade neuronal e tratamento de convulsões associadas com a síndrome de Rett.

[00106] Em um estudo da Síndrome de Rett em camundongos (usando o modelo de MeCP2 nocauteado), foi verificado que GPE foi tem efeito de prolongar a vida e aumentar a função neuronal (Publicação US número 2009/0099077). No en-tanto, tal como descrito adicionalmente no presente documento, GPE, sendo um peptídeo que ocorre naturalmente, é rapidamente degradado in vivo e in vitro, e a sua utilidade na terapia crônica de pacientes com síndrome de Rett, por conseguinte, é incerta.

Composições Farmacêuticas e Administração

[00107] Em geral, os compostos dessa invenção podem ser administrados em quantidades terapeuticamente eficazes, por qualquer um dos modos habituais conhecidos na técnica, quer isoladamente ou em combinação com pelo menos um outro composto desta invenção e/ou pelo menos um outro agente terapêutico convencional para a doença a ser tratada. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode variar amplamente dependendo da doença ou lesão, da gravidade da doença, da idade e da saúde relativa do animal a ser tratado, da potência do composto (s), e de outros fatores. Como, quantidades terapeuticamente anti-inflamatórias, antiapop- tóticas, antinecróticas, antineurodegenerativas eficazes de compostos da presente invenção podem variar entre cerca de 0,001 miligramas por quilograma (mg/kg) a cerca de 100 (mg/kg) do animal , por exemplo, cerca de 0,1 a cerca de 10 mg/kg, com doses mais baixas, tais como cerca de 0,001 a cerca de 0,1 mg/kg, por exemplo cerca de 0,01 mg/kg, sendo apropriada para a administração através do fluido cerebrospinal, tal como por administração intracerebroventricular, e doses mais ele vadas, tais como cerca de 1 a cerca de 100 mg kg, por exemplo cerca de 10 mg kg, sendo adequadas para administração por meio de métodos, tais como por via oral, sistêmica (por exemplo transdérmica), ou parentérica (por exemplo intravenosa). Uma pessoa com conhecimentos comuns na técnica será capaz, sem experimentação desnecessária, tendo em conta sua habilidade e esta divulgação, de determinar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção para uma determinada doença ou lesão.

[00108] Em geral, os compostos desta invenção podem ser administrados como composições farmacêuticas por uma das seguintes vias: oral, tópica, sistêmica (por exemplo, transdérmica, intranasal ou por supositório), ou parentérica (por exemplo, por via intramuscular, subcutânea ou intravenosa), por administração ao sistema nervoso central (por exemplo, por injeção intraespinal ou intercisternal); por implantação, e por infusão através de dispositivos, tais como, bombas osmóti- cas, bombas implantáveis, emplastros transdérmicos e semelhantes. As composições podem tomar a forma de comprimidos, pílulas, cápsulas, semissólidos, pós, formulação de liberação prolongada, soluções, suspensões, elixires, aerossóis, géis solúveis ou quaisquer outras composições apropriadas e compreendem pelo menos um composto da presente invenção em combinação com pelo menos um excipiente farmacêutica ou fisiologicamente aceitável.

[00109] Os excipientes adequados são bem conhecidos dos versados nas técnicas comuns e eles e os métodos de formulação das composições, podem ser encontrados em referências padrão, tais como, Gennaro AR: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20 "'ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2000. Os veículos líquidos apropriados, especialmente para soluções injetáveis, incluem água, solução aquosa de salmoura, solução aquosa de dextrose, glicóis, e semelhantes, com as soluções isotônicas, sendo preferidas para administração intravenosa, intraespinal, intracistérmica e administração e veículos, tais como, fluido cerebrospinal artificial, sendo também especialmente adequados para a administração do compos-to ao SNC. O texto acima é expressamente incorporado integralmente como refe-rência.

[00110] Os compostos da presente invenção podem ser administrados por via oral, em comprimidos ou cápsulas. Em algumas modalidades, os compostos dessa invenção podem ser preparados em emulsões de água em óleo, na forma de microemulsões, emulsões grosseiras, cristais líquidos ou nanocápsulas (Pedido US número 12/283 de 684, agora Pedido US número 7.887.839, concedido em 15 de fevereiro de 1201). Uma vez que os compostos da presente invenção podem apre-sentar uma biodisponibilidade substancialmente oral, eles podem ser vantajosamen-te utilizados para a administração crônica conveniente. Além disso, as composições orais disponíveis incluem hidrogéis solúveis que contêm compostos ativos, permitin-do, assim, a administração oral dos compostos neuroprotetores, sem a necessidade de um paciente engolir um comprimido ou uma cápsula. Estes materiais de liberação lenta e géis são conhecidos na técnica.

[00111] Os compostos dessa invenção podem ser administrados antes ou depois de início de uma condição que é susceptível de provocar neurodegenera- ção ou de sintoma da mesma. Por exemplo, sabe-se que a hipóxia/isquemia pode ocorrer durante a cirurgia de revascularização do miocárdio (CRM) Assim, um paciente pode ser pré -tratado com um composto da presente invenção antes de ser colocado em um sistema de oxigenação extracorporal. Em algumas modalidades, pode ser desejável administrar um composto da presente invenção iniciando com cerca de 4 horas antes da cirurgia, ou antes de um evento, que é susceptível de conduzir a uma lesão neurológica traumática ou outra lesão. Em outras modalidades, pode ser desejável infundir um composto da presente invenção durante a cirurgia ou durante o procedimento cirúrgico para reparar um dano neurológico. Os compostos da pre-sente invenção também podem ser usados em situações de emergência, por exem- plo, em um paciente que tenha experimentado apenas um acidente vascular cere-bral, acontecimento hipóxico, lesão cerebral traumática ou outro insulto agudo. Em tais situações, um composto da presente invenção pode ser administrado imediata-mente após o diagnóstico de lesão neural ser feito.

[00112] Em algumas situações, os kits que contêm o composto da presente invenção podem ser preparados antes da utilização no campo. Um kit pode apresentar um frasco que contém um composto da invenção em uma formulação farmaceuticamente aceitável (por exemplo, para injeção ou administração oral), jun-tamente com uma seringa ou outro dispositivo de liberação, e as instruções para uti-lização. Em situações em que uma convulsão é diagnosticada, um composto da pre-sente invenção pode ser administrado juntamente com um anticonvulsivo. Muitos anticonvulsivos são conhecidos na arte e não necessitam ser descritos em detalhes no presente documento.

[00113] Além disso, as lesões neurológicas "secundárias" podem ocorrer após um insulto primário, como uma lesão traumática, acidente vascular cerebral ou procedimento cirúrgico. Por exemplo, depois de um acidente vascular cerebral, lesão cerebral penetrante ou um procedimento CABG, inflamação do tecido neural pode conduzir à neurodegeneração. Lesões secundárias podem ser refletidas por aumen-to da ativação de células inflamatórias (por exemplo, os astrócitos e/ou microglios), e ações de mediadores inflamatórios podem causar danos neurológicos. Assim, em algumas modalidades, pode ser desejável administrar um composto da presente in-venção em períodos anteriores ao insulto a até cerca de 100 horas após o insulto. Em outras modalidades, pode ser desejável administrar um composto da presente invenção com início antes do insulto, durante o insulto e após o insulto, quer conti-nuamente, como uma infusão, ou em doses separadas por um intervalo de tempo desejado.

[00114] Os compostos dessa invenção também podem ser adequada- mente administrados por um sistema de liberação controlada ou material de gel com G-2-MePE incorporado ao mesmo. Exemplos adequados de composições de liberação prolongada incluem matrizes semi-permeáveis de polímeros sob a forma de artigos moldados, por exemplo, películas ou microcápsulas. As matrizes de liberação prolongada incluem polilatídeos (Pedido US número 3.773.919; EP 58.481), copolí- meros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato (Sidman e outros, 1983), po- li(metacrilato de 2-hidroxietila) (Langer e outros, 1981), acetato de vinil etileno (Langer e outros, acima.), ou ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133.988). Além disso, as composições de gel à base de polissacarídeos (por exemplo, carboximetil celulose, carboxietil celulose, quitosano ou outros derivados de celulose) e derivados de óxido de polietileno (por exemplo, polietileno-glicóis) podem ser usadas. Essas composições de gel são solúveis em soluções aquosas, são biocompatíveis, não-tóxicas e, por conseguinte, podem ser usadas para administrar compostos da presente invenção para qualquer superfície mucosa, incluindo a cavidade oral, orofaringe, trato urogenital, intestino ou reto.

[00115] As composições de liberação prolongada incluem também um composto aprisionado em lipossomas. Os lipossomas contendo o composto são preparados por métodos propriamente conhecidos: DE 3.218.121; Epstein e outros, 1985; Hwang e outros, 1980; EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949, EP 142.641, Pedido de Patente Japonesa 83-118008; Pedidos de Patente números 4.485.045 e 4.544.545 e EP 102.324. Normalmente, os lipossomas são do tipo pe-queno (a partir de ou cerca de 200 a 800 Angstroms) unilamelar em que o teor de lipídeos é superior a cerca de 30 porcento molar de colesterol, a proporção selecio-nada sendo ajustada para a terapia mais eficaz. Cada uma das publicações acima identificada é incorporada ao presente documento expressamente como referência em sua totalidade, como se cada um ativesse sido assim incorporada separadamen-te.

[00116] Os compostos da presente invenção também podem ser ligados ao polietilenoglicol ("PEGuilado") para aumentar o seu tempo de vida in vivo, com base, por exemplo, na tecnologia de conjugado descrita no WO 95/32003.

[00117] De modo desejável, se possível, quando administrado como um anti-inflamatório, um agente antiapoptótico, um agente antinecrótico, ou um agente antineurodegenerativo, os compostos da presente invenção podem ser administra-dos por via oral. A quantidade de um composto da presente invenção na composição pode variar amplamente dependendo do tipo de composição, tamanho de uma dosagem unitária, espécie de excipiente e outros fatores bem conhecidos dos ver-sados na técnica. Em geral, a composição final pode compreender cerca de 0,0001 por cento em peso (% em peso) a cerca de 10% em peso do composto da presente invenção, de preferência cerca de 0,001% em peso a cerca de 1% em peso, com o restante sendo um excipiente ou excipientes.

[00118] A composição pode conter, opcionalmente, além de um composto da presente invenção, pelo menos um agente selecionado a partir de, por exemplo, fatores de crescimento e seus derivados associados (fator de crescimento se-melhante à insulina I (IGF-I), fator de crescimento semelhante à insulina II (1GF-II), fator de crescimento transformante-β1, ativina, hormônio do crescimento, fator de crescimento do nervo, fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), hormônio de crescimento, proteínas de ligação a proteínas de ligação a IGF (IGFBP-3 especial-mente), fator de crescimento de fibroblasto básico, fator de crescimento de fibroblas- tos ácido, o produto do gene de hst/Kfgk, FGF-3, FGF-4, FGF-6, fator de crescimento de queratinócito, fator de crescimento induzido por androgênio. Outros elementos da família FGF incluem, por exemplo, int-2, homólogo ao fator de crescimento de fibroblastos 1 (FHF-1), FHF-2, FHF-3 e FHF-4, fator de crescimento ceratinócito 2, fator de ativação de células gliais, FGF-10 e FGF-16, o fator neurotrófico ciliar, fator de crescimento derivado do cérebro, neurotrofina 3, neurotrofina 4, proteína morfo- genética óssea 2 (BMP-2), fator neurotrófico derivado de linhagem de célula glial, fator neurotrófico dependente de atividade, fator inibidor de leucemia, citocina, on- costatina M, interleucina), α, β, Y ou inferferon de consenso e TNF-α. Outras formas de agentes terapêuticos neuroprotetores incluem, por exemplo, clometiazol, ácido cinurênico, Semax, tacrolimus, L-treo-P-fenil-2-decanoilamino-3-morfolina-l-propanol, andrenocorticotropin-(4-9) analógico [ORG 2766] e dizolcipina (MK-801), selegilina, antagonistas de glutamato, tais como, mematina (Namenda) NPS1506, GV 105260, MK-801, GV150526; antagonistas de AMPA, tais como, 2,3-di-hidróxi-6-nitro-7- sul- famoilbenzo(f)quinoxalina (NBQX), LY303070 e LY300164, agentes anti- inflamatórios dirigidos contra a adressina MAdCAM-1 e/ou os seus receptores dein- tegrida α4 (α4β1 e α4β7), tais como o anti-MAdCAM-l mAb MECA-367 (ATCC número de acesso HB-9478). A terapia de combinação com antagonistas dos receptores de glutamato metabotrópico, tal como, fenobam, pode também ser úttil. Além disso, em adição a um composto da presente invenção, uma composição pode incluir um inibidor seletivo da reabsorção da serotonina, tal como fluoxetina, uma norepinefrina seletiva da reabsorção da serotonina, tal como viloxazina, ou um antipsicótico atípico como risperidona. A maioria destes agentes, em especial os peptídeos, tais como os fatores de crescimento, etc., não são oralmente ativos, e precisarão de administração por injeção ou infusão.

Preparação das Composições

[00119] Os materiais de partida e reagentes utilizados na preparação desses compostos ou estão disponíveis de fornecedores comerciais tais como Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wisconsin), Bachem (Torrance, Califórnia), Sigma (St. Louis, MO), ou são preparados por métodos bem conhecidos de um versado na técnica geral seguindo os procedimentos descritos nas referências, tais como, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, vols. 1-17, John Wiley and Sons, New York, N.Y. 1991; Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, vols. 1-5 e suplementos, Elsevier Science Publishers, 1989; Organic Reactions, volumes 1-40, John Wiley and Sons, New York, N.Y. 1991; March J.; Advanced Organic Chemistry, 4a ed. John Wiley and Sons, New York, N. Y., 1992, e Larock: Comprehensive Or-ganic Transformations, VCH Publishers, 1989. Na maioria dos casos, os aminoáci- dos e os seus ésteres ou amidas e aminoácidos protegidos estão largamente dispo-níveis comercialmente, e a preparação de aminoácidos modificados e seus ésteres ou amidas é amplamente descrita na literatura química e bioquímica e, assim, bem conhecida dos versados na técnica comum. Por exemplo, o ácido N-pirrolidina acé-tico é descrito em Dega-Szafran Z e Pryzbylak R. Synthesis, IR, e de estudos de RMN de ácidos α-(l-pirrolidina) alcanocarboxílicos zwitteriônicos e seus derivados N- metila. J. Mol. Struct:. 436-7, 107-121, 1997, e ácido N-piperidineacético é descrito em Matsuda S, Ito S e Sekiya M. A reação de N-(alcoximetil)dialquilaminas com iso- cianidas. Chem. Pharm. Bull.: 23 (1), 219-221, 1975. Cada uma das publicações acima identificadas é aqui expressamente incorporada como referência como se ti-vesse sido individualmente incorporada.

[00120] Os materiais de partida, intermediários e compostos dessa invenção podem ser isolados e purificados utilizando técnicas convencionais, incluindo filtração, destilação, cristalização, cromatografia e similares. Eles podem ser caracte-rizados por utilização de métodos convencionais, incluindo constantes físicas e da-dos espectrais.

[00121] Os compostos dessa invenção podem ser preparados pelos métodos descritos a seguir e, como determinado nos Exemplos.

[00122] Os compostos de fórmula 1 são os análogos de GPE, ou modifi-cações destes, tais como ésteres ou amidas. Em geral, eles podem ser preparados por métodos tais como os que são já bem conhecidos dos versados na técnica co-mum da síntese de peptídeos e peptídeos modificados, seguindo os esquemas de reação estabelecidos nas figuras 1-11 que acompanham o presente relatório descri- tivo ou seguindo outros métodos bem conhecidos dos versados na técnica da sínte-se dos peptídeos e análogos.

[00123] Convenientemente, a produção sintética de polipeptídeos da in-venção pode ser de acordo com o método de síntese em fase sólida descrito por Merrifield. e outros. The synthesis of a tetrapeptide: J. Amer. Chem. Soc: 85, 214921 56, 1 963. Esta técnica está bem compreendida e é um método comum para a preparação de peptídeos. O conceito geral deste método depende da ligação do primeiro aminoácido da cadeia a um polímero sólido por uma ligação covalente. Aminoácidos protegidos em sucessão são adicionados, um de cada vez (estratégia em etapas), ou em blocos (estratégia de segmento), até que a sequência desejada esteja montada. Finalmente, o peptídeo protegido é removido do suporte de resina sólida e os grupos protetores são clivados. Por este procedimento, os reagentes e subprodutos são removidos por filtração, eliminando assim a necessidade de purifi-cação dos intermediários.

[00124] Os aminoácidos podem ser anexados a qualquer polímero adequado como uma resina. A resina deve conter um grupo funcional ao qual o primeiro aminoácido protegido possa ser firmemente ligado através de uma ligação covalente. Vários polímeros são adequados para este fim, tal como a celulose, álcool polivi- nílico, polimetacrilato de metila e o poliestireno. As resinas adequadas estão comer-cialmente disponíveis e são bem conhecidas dos versados na técnica. Os grupos protetores apropriados utilizáveis em tal síntese incluem terc-butiloxicarbonila (BOC), benzila (Bzl), t-amiloxicarbonila (AOC), tosila (Tos), o-bromo-fenilmetoxicarbonila (BrZ), 2,6-diclorobenzila (BzlCl2) e fenilmetoxicarbonila (Z ou CBZ). Os grupos prote-tores adicionais estão identificados no Merrifield, citados acima, bem como em Me- Omie JFW: Protetive Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, Nova Iorque, 1973, ambas as referências aqui expressamente incorporadas em sua totalidade.

[00125] Procedimentos gerais para a preparação de peptídeos da pre sente invenção envolvem, inicialmente, anexação de um aminoácido protegido no terminal carboxila à resina. Após a anexação da resina ser filtrada, lavada e o grupo de proteção (desejavelmente BOC) no grupo I-amino do aminoácido do terminal carboxila é removido. A remoção deste grupo protetor deve realizar-se, evidentemente, sem quebrar a ligação entre o aminoácido e a resina. O próximo amino, e, se necessário, aminoácido protegido de cadeia lateral, é então acoplado ao grupo I- amino livre do aminoácido na resina. Esse acoplamento ocorre através da formação de uma ligação amida entre o grupo carboxila livre do segundo aminoácido e o grupo amino do primeiro aminoácido ligado à resina. Esta sequência de acontecimentos é repetida com aminoácidos sucessivos até que todos os aminoácidos estejam ligados à resina. Finalmente, o peptídeo protegido é clivado a partir da resina e os grupos protetores removidos para revelar o peptídeo desejado. As técnicas de clivagem usadas para separar o peptídeo da resina e para remover os grupos protetores dependem da seleção da resina e os grupos protetores e são conhecidos dos versados na técnica de síntese de peptídeos.

[00126] Técnicas alternativas para a síntese peptídica são descritas em Bodanszky e outros, Peptide Synthesis, 2a ed, John Wiley and Sons, Nova Iorque, 1976. Por exemplo, os peptídeos da invenção podem também ser sintetizados utili-zando metodologias de síntese de peptídeos em solução padrão, envolvendo tanto o acoplamento passo a passo ou de blocos de aminoácidos ou dos fragmentos peptí- dicos através de métodos enzimáticos de formação da ligação amida ou químicos. (Vide, por exemplo, HD Jakubke in the Peptides, Analysis Synthesis, Biology, Aca-demic Press, New York, 1987, p.103-165; J.D. Glass, ibid, pp 167-184,. e a Patente Européia 0324659 A2, que descreve métodos de síntese de peptídeos enzimáticos). Esses métodos de síntese em solução são bem conhecidos na arte. Cada uma das publicações acima identificadas é expressamente incorporada ao presente docu-mento de modo integral, como referência, como se individualmente incorporados por isso.

[00127] Sintetizadores de peptídeos comerciais, tais como the Applied Biosystems, Modelo 430A, estão disponíveis para a prática destes métodos.

[00128] Um versado na técnica não terá de fazer uma experimentação indevida tendo em conta a habilidade e o conhecimento disponível nessa revelação, no desenvolvimento de um ou mais dos métodos sintéticos adequados para os com-postos da presente invenção.

[00129] Por exemplo, os análogos nos quais o resíduo de glicina de GPEé substituído por um aminoácido alternativo, ou por um não aminoácido, podem ser convenientemente preparados pelos métodos de preparação de um dipeptídeo de ácido glutâmico-prolina protegido em C (tal como o éster de dibenzila ) e aco-plamento daquele dipeptídeo com um análogo de glicina protegido N, tal como, BOC-N-metilglicina, BOC-L-valina, ácido N-pirrolidina acético, e outros semelhantes, seguido por desproteção, tal como ilustrado nas figuras 2 e 3. Os análogos nos quais o resíduo de ácido glutâmico de GPE é substituído por um aminoácido alternativo ou uma amida de aminoácido ou éster podem ser convenientemente preparados pela preparação de um dipeptídeo de glicina-L-prolina protegido N (tal como BOC- glicil-L- prolina) e o acoplamento daquele dipeptídeo com um ácido glutâmico protegido C ou análogo do mesmo, tal como, terc-butil Y—aminobutirato, 4-amino-4- dimetilcarbamoil butirato de metila, éster L-glutamina metílico, 1-metiglutamato, etc. As lactonas podem ser preparadas pelos métodos de preparação de um derivado de mono-ácido mono-éster apropriado e análogos de redução, nos quais R2 é alquila podem ser convenientemente preparados simplesmente pelo uso de 2-alquilprolina apropriada na síntese e análogos semelhantes nos quais R3 representa um grupo alquila podem ser convenientemente preparados através da utilização do ácido N- alquilglutâmico ou análogo na síntese. Quando modificações devem ser feitas a dois ou mais aminoácidos, as técnicas de acoplamento ainda serão as mesmas, apenas com mais de um aminoácido modificado ou análogo sendo empregado na síntese. A escolha de grupos protetores apropriados para o método escolhido (em fase sólida ou em fase de solução), e de substratos apropriados, se a síntese em fase sólida for utilizada estará dentro das capacidades de um versado na técnica comum.

[00130] Os compostos de fórmula 2 podem ser preparados a partir de 5- oxo-L-prolina adequadamente protegida ou seus análogos ou derivados, de acordo com métodos, tais como, o acoplamento do grupo carboxila de prolina com um ácido glutâmico protegido ou análogo ou derivado, para fornecer um análogo do interme-diário A da figura 2, comparável com a reação de acoplamento apresentada na figura 2 e, em seguida alquilando o nitrogênio da pirrolidina com um grupo de fórmula A- ---(CH2) m-CH(R1)---CH2R, protegido em, se necessário, em que R é um grupo de abandono sob condições de alquilação. Alternativamente, a 5-oxo-L-prolina adequa-damente protegida pode ser primeiro alquilada no nitrogênio da pirrolidina para pro-duzir um análogo do intermediário B da figura 4, e em seguida, o acoplamento desta com um ácido glutâmico adequadamente protegido ou análogo ou derivado da ma-neira representada nas figuras 4 a 9.

EXEMPLOS

[00131] Os exemplos que se seguem se destinam a ilustrar modalidades da presente invenção, e não se destinam a limitar o âmbito a esses exemplos espe-cíficos. Os versados na técnica comum podem aplicar as revelações e ensinamentos revelados no presente documento para desenvolver outras modalidades, sem expe-rimentação indevida e com uma probabilidade de sucesso, todas essas modalidades sendo consideradas como parte dessa invenção.

Exemplo 1: Síntese de ácido N,N-dimetilglicil-L-proliI)-L-glutâmico

[00132] O exemplo não limitativo que se segue ilustra a síntese de um composto da invenção, o ácido N, N-dimetilglicil-L-prolil-L-glutâmico

[00133] Todos os materiais de partida e outros reagentes foram adquiridos na Aldrich; BOC = terc-butoxicarbonila; Bn = benzila.

Éster benzílico do ácido BOC-L-proIina-(e-benzil)-L-glutâmico

[00134] A uma solução de BOC-prolina [Anderson GW e McGregor AC: J. Amer. Chem. Soc: 79, 6810, 1994] (10 mmol) em diclorometano (50 mL), resfriada a 0°C, foram adicionados trietilamina (1,39 mL, 10 mmol) e cloroformato de etila (0,96 mL, 10 mmol). A mistura resultante foi agitada a 0°C durante 30 minutos. Uma solução de dibenzil-L-glutamato (10 mmol) foi então adicionada e a mistura agitada a 0°C durante 2 horas e depois aquecida até à temperatura ambiente e agitada durante a noite. A mistura de reação foi lavada com solução aquosa de bicarbonato de sódio e ácido cítrico (2 mol I1), em seguida seca (MgSO4) e concentrada à pressão reduzida para fornecer éster dibenzílico do ácido BOC-L-prolina-L-glutâmico, (5,0 g , 95%).

Éster dibenzílico do ácido L-prolina-L-glutâmico

[00135] Uma solução de éster dibenzílico de BOC-L-glutamil-L-prolina (3,4 g, 10 mmol), resfriada a 0°C, foi tratada com ácido trifluoroacético (25 mL) du- rante 2 horas à temperatura ambiente. Após a remoção dos voláteis, sob pressão reduzida o resíduo foi triturado com éter para fornecer o éster dibenzílico do ácido L- prolina-L-glutâmico..

Ácido N,N-Dimetilglicil-L-prolil-L-glutâmico

[00136] Uma solução de diciclohexilcarbodiimida (10,3 mmol) em diclo- rometano (10 mL) foi adicionada a uma solução agitada e resfriada (0°C) de éster dibenzílico do ácido L-prolina-L-glutâmico (10 mmol), N,N-dimetilglicina (10 mmol) e trietilamina (10,3 mmol) em diclorometano (30 mL). A mistura foi agitada a 0°C du-rante a noite e depois à temperatura ambiente durante 3 horas. Após a filtração, o filtrado foi evaporado a pressão reduzida. O produto bruto de éster dibenzílico resul-tante foi dissolvido em uma mistura de acetato de etila (30 mL) e metanol (30 mL) contendo paládio a 10% sobre carvão (0,5 g) e depois hidrogenado à temperatura e pressão ambiente, até a absorção de hidrogênio ter cessado. A solução filtrada foi evaporada e o resíduo recristalizado a partir de acetato de etila para se obter o deri-vado de tripeptídeo.

[00137] Pode notar-se que, seguindo o método dos Exemplos,e utilizando aminoácidos alternativos ou as suas amidas ou ésteres serão produzidos outros compostos de Fórmula 1. Exemplo 2: Síntese de Glicil-L-2-metilI-L-prolil-L-glutamato Ácido Glicil-L-2-metilprolil-L-glutâmico (G-2M e PE)

[00138] Esquema 1, reagentes, condições e rendimentos, (i) SOCI2, MeOH, 79°C, N2, 24 horas (104%), (ii) Et3N, DCC, CH2Cl2, 0°C até à temperatura ambiente, N2, 20 horas, (iii) 1M NaOH aquoso, 1,4-dioxano, 19 horas (60%, 2 etapas), (iv) Et3N, BoPCI, CH2Cl2, Temperatura ambiente, N2, 17 horas (89%), (v) H2, 10% Pd/C, 91:9 MeOH-H2O, Temperatura ambiente, 23 horas (86%).

[00139] L-2-etilprolina e éster dibenzílico do ácido L-glutâmico foram ad-quiridos na Bachem, N-benzilaxicarbonil-glicina na Acros Organics e cloreto de bis (2-oxo-3-oxazolidinil)fosfínico (BoPCI, 97%) da Aldrich Chem.Co.

Cloridrato 2 de metil L-2-metilprolinato

[00140] Cloreto de tionila (5,84 cm3, 80,1 mmol) foi cuidadosamente adi-cionado, gota a gota, a uma solução agitada de (L)-2-metilprolina 1 (0,43 g, 3,33 mmol) em metanol anidro (30 cm3) a -5°C sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura de reação foi aquecida sob refluxo durante 24 horas e a solução de cor amarela pálida resultante foi concentrada até à secura em vácuo. O resíduo foi dissolvido em uma mistura 1:1 de metanol e tolueno (30 cm3), em seguida, concentrada até à se-cura para remover o cloreto de tionila residual. Esse procedimento foi repetido mais duas vezes, obtendo-se cloridrato 2 (0,62 g, 104%) como um sólido esbranquiçado higroscópico, espectroscopicamente puro: ponto de fusão: 127-131°C; [α]D -59,8 (c 0,24 em CH2Cl2); vmax (película)/cm-1 3579, 3398 br, 2885, 2717, 2681, 2623, 2507, 1743, 1584, 1447, 1432, 1374, 1317, 1294, 1237, 1212, 1172, 1123, 981 , 894, 861 e 764; δH (300 MHz; CDCl3; Me4Si) 1,88 (3H, s, Proα-CH3), 1,70-2,30 (3H, br m, Proβ-HAHB, 2,30-2,60 (1 H, br m, Proβ-HAHB), 3,40-3,84 (2H, br m, Proβ-H2), 3,87 (3H, s, CO2CH3), 9,43 (1 H, br s, NH) e 10,49 (1H, br s, HCl); (75 MHz; CDCl3) 21,1 (CH3, Proα-CH3), 22,4 (CH2, Proy-C), 35,6 (CH2, Proβ-C),45,2 (CH2, Proδ-C), 53,7 (CH3, CO2CH3), 68,4 (quat., Proα-C) e 170,7 (quat., CO); m/z (FAB+) 323,1745 [M2.H35Cl.H+: (C7H13NO2)2. H35CI.H requer 323,1738] e 325,1718 [M2.H35CLH+: (C7H13NO2)2. H37CI.H requer 325, 708].

N-benziloxicarbonil-glicil-L-2-metilprolina 5

[00141] Trietilamina anidra (0,45 cm3, 3,23 mmol) foi adicionada, gota a gota, a uma mistura de cloridrato 2 de L-2-metilprolinato de metila (0,42 g, 2,34 mmol) e N-benzilaxicarbonil-glicina (98,5%) 3 (0,52 g, 2,45 mmol) em cloreto de me- tileno (16 cm3), a 0°C, sob uma atmosfera de nitrogênio. A solução resultante foi agitada durante 20 minutos e a uma solução de 1,3-diciclo-hexilcarbodiimida (0,56 g, 2,71 mmol) em cloreto de metileno (8 cm3) a 0°C foi adicionada, gota a gota e a mistura de reação foi aquecida até à temperatura ambiente e agitada durante mais 20 horas. A mistura branca resultante foi filtrada através de almofada de CeliteTM para remover parcialmente 1, 3 - diciclohexiluréia, e a almofada foi lavada com cloreto de metileno (50 cm3). O filtrado foi lavado sucessivamente com ácido clorídrico aquoso a 10% (50 cm3) e solução aquosa saturada de carbonato de hidrogênio de sódio (50 cm3), seco (MgSO4), filtrado e concentrado até à secura sob vácuo. A purificação do resíduo por cromatografia em coluna flash (35 g de SiO2, 30-70% de acetato de etila - hexano; eluição em gradiente) forneceu, por tentativa, N-benziloxicarbonil-glicil-L-2- metilprolinato de metila 4 (0,56 g), contendo 1,3 -diciclohexiluréia, como um semissó- lido branco: Rf 0,65 (EtOAc): m/z (E1+) 334,1534 (M+, C17H22N2O5 requer 334,1529) e 224 (1,3-diciclo-hexiluréia).

[00142] A uma solução de prolinato impuro 4 (0,56 g, cerca de 1,67 mmol) em 1,4-dioxano (33 cm3) foi adicionado, gota a gota, hidróxido de sódio aquoso (10 cm3, 10 mmol) e a mistura foi agitada por 19 horas a temperatura ambiente. Cloreto de metileno (100 cm3) foi então adicionado e a camada orgânica extraída com carbonato de hidrogênio sódico saturado (2 x 100 cm3). As camadas aquosas combinadas foram cuidadosamente acidificada com ácido clorídrico (32%), extraídas com cloreto de metileno (2 x 100 cm3), e as camadas orgânicas combinadas foram secas (MgSO4), filtradas e concentradas a secura em vácuo. A purificação do resíduo resultante (0,47 g) por cromatografia em coluna flash (17 g de SiO2, 50% de acetato de etila - hexano para metanol - diclorometano a 30%, eluição gradiente) forneceu dipeptídeo N-protegido 5 (0,45 g, 60%) como uma espuma branca em duas etapas a partir de cloridrato 2. Dipeptídeo 5 mostrou ser exclusivamente o confôrme- ro orientado trans por análise de NMR: Rf 0,50 (MeOH a 20% - CH2Cl2), [α]D -62,3 (c 0,20 em CH2Cl2), vmax (película)/cm-1 3583, 332 4br, 2980, 2942, 1722, 1649, 1529, 1454, 1432, 1373, 1337, 1251, 1219, 1179, 1053, 1027, 965, 912, 735 e 698; δH (300 MHz; CDCl3, Me4Si) 1,59 (3H, s, Proα-CH3), 1,89 (1H, 6 linhas, J 18,8, 6,2 e 6,2, Proβ-HAHB), 2,01 (2H, dtt, J 18,7, 6,2 e 6,2, Proy-H2), 2,25-2,40 (1H, m, proβ-HAHB), 3,54 (2H, t, J 6,6, Pr β-H2), 3,89 (1H, dd, J 17,1 e 3,9, glyα-HAHB), 4,04 (1H, dd, J 17,2 e 5,3, glyα-HAHB), 5,11 (2H, s, OCH2Ph), 5,84 (1H, br, t, J4.2, N-H), 7,22-7,43 (5H m, Ph) e 7,89 (1H, br, -COOH), δC (75 MHz, CDCl3) 21,3 (CH3, Proα-CH3), 23,8 (CH2) ProY-C), 38,2 (CH2, Proβ-C), 43,6 (CH2, Glyα-C), 47,2 (CH2, Proδ-C), 66,7 (quat, Proα-C), 66,8 (CH2, OCH2Ph), 127,9 (CH, Ph), 127,9 (CH, Ph), 128,4 (CH, Ph) , 136,4 (quat., Ph), 156,4 (quat., NCO2), 167,5 (quat., Gly-CON) e 176,7 (quat., CO): m/z (EI+) 320,1368 (M+.. C16H20N2O5 requer 320,1372).

N-benziloxicarbonil-glicil-L-2-metilprolil-L-glutamato de dibenzila 7

[00143] Trietilamina (0,50 cm3, 3,59 mmol) foi adicionada, gota a gota, a uma solução de dipeptídeo 5 (0,36 g, 1,12 mmol) e éster dibenzílico do ácido L- glutâmico de p-toluenossulfonato 6 (0,73 g, 1 0,46 mmol) em cloreto de metileno (60 cm3), sob nitrogênio, à temperatura ambiente, e a mistura de reação foi agitada durante 10 minutos. Cloreto bis(2-oxo-3-oxazolidinil) fosfínico (BoPCl, 97%) (0,37 g, 1,41 mmol) foi adicionado e a solução incolor foi agitada durante 17 horas. A solução de cloreto de metileno foi lavada sucessivamente com ácido clorídrico aquoso a 10% (50 cm3) e solução aquosa saturada de carbonato de hidrogênio sódico (50 cm3), seca (MgSO4), filtrada e evaporada à secura em vácuo. A purificação do resíduo resultante com cromatografia em coluna flash repetida (2 vezes) (24 g de SiO2, 3070% de acetato de etila - hexano; gradiente de eluição) permitiu obtenção de um tripeptídeo completamente protegido 7 (0,63 g, 89%) como um óleo incolor. O tripep- tídeo 7 mostrou ser exclusivamente o confôrmero trans orientado por análise de NMR: Rf 0,55 (EtOAc); [α]D -41,9 (c 0,29 em CH2Cl2), vmax (película)/cm-1 583, 3353 br, 2950, 1734, 1660, 1521, 1499, 1454, 1429, 1257, 1214, 1188, 1166, 1051, 911, 737 e 697; δH (400 MHz, CDCl3, Me4Si ) 1,64 (3H, s, Proα-CH3), 1,72 (1 H, dt, J 12,8, 7,6 e 7,6, Proβ-HAHB) 1,92 (2H, 5 linhas, J 6,7, ProY—H2), 2,04 (1H, 6 linhas, J 7,3 Gluβ-HAHB), 2,17-2,27 ( H, m, Gluβ-HAHB), 2,35 -2,51 (3H, m, Proβ-HAHB e GIUY-H2), 3,37-3,57 (2H, m, Proδ-H2), 3,90 (1H, dd, J 17,0 e 3,6, GlyαHAHB) , 4,00 (1H, dd, J 17,1 e 5,1, GliyαHAHB), 4,56 (1H, J 7,7 e 4,9, Gluα-H), 5,05-5,20 (6H, m, 3 x OCH2Ph), 5,66-5,72 (1H,br m, Gly-NH), 7,26-7,37 (15H, m, 3 x Ph) e 7,44 (1H, d, J 7,2, Glu-NH); δC (100 MHz, CDCl3) 21,9 (CH3, Proα-CH3), 23,4 (CH2,. Proy-C), 26,6 (CH2, Gluβ-C), 30,1 (CH2, Gluy-C), 38,3 (CH2, Proβ-C), 43,9 (CH2, Glyα-C), 47,6 (CH2, Proδ-C), 52,2 (CH, Gluα-C), 66,4 (CH2, OCH2Ph), 66,8 (CH2, OCH2Ph), 67,1 (CH2, OCH2Ph), 68,2 (quat, Proα-C), 127,9 (CH, Ph), 128,0 (CH, Ph), 128,1 (CH, Ph), 128,2 (CH, Ph), 128,2 (CH, Ph), 128,3 (CH, Ph), 128,4 (CH, Ph), 128,5 (CH, Ph) , 128,5, (CH, Ph), 135,2 (quat., Ph), 135,7 (quat, Ph), 136,4 (quat., Ph), 156,1 (quat., NCO2), 167,3 (quat., Gly-CO) , 171,4 (quat., CO), 172,9 (quat., CO) e 173,4 (quat., CO), m/z (FAB +) 630,2809 (MH+ C35H40N3O8 requer 630,2815).

Ácido glicil-L-2-metilprolil-L-glutâmico (L-2-MePE)

[00144] Uma mistura de tripeptídeo protegido 7 (0,63 g, 1 0,00 mmol) e 1paládio sobre carbono ativado a 10% em peso (0,32 g, 0,30 mmol) em 91:9 de me-tanol - água (22 cm3) foi agitada sob uma atmosfera de hidrogênio à temperatura ambiente, protegida da luz, durante 23 h. A mistura de reação foi filtrada através de uma almofada de Celite™ e a almofada lavada com metanol 75:25 - água (200 cm3). O filtrado foi concentrado até a secura sob pressão reduzida e o resíduo triturado com éter dietílico anidro para se obter uma mistura de 38:1 de G-2-MePE e tentativamente metilamina 8 (0,27 g, 86%) como um sólido branco muito higroscópico. Estudos analíticos de HPLC em fase reversa sobre a mistura [Coluna Si Altech Econosphere C18, 150 x 4,6 mm, 5 μm; 5 min. fluxada com H2O (0,05% de TFA), em seguida, gradiente firme por 25 minutos para MeCN como eluente a uma vazão de 1 mL/minuto, detecção com fileira de diodos] indicaram que era uma mistura a 38:1 de dois picos de eluição com tempos de retenção de 13,64 e 14,44 minutos a 207 e 197 nm, respectivamente. G-2-MePE mostrou ser uma mistura 73:27 de trans:cis de confôrmeros por análise 1H NMR (a razão foi estimada de intensidades relativas de dupleto duplo e tripleto em δ 4,18 e 3,71, cedido aos prótons Gluα-H dos confôrme- ros maior e menor, respectivamente): ponto de fusão: 144°C; [α]D -52,4 (c 0,19 em H2O), δH (300 MHz, D2O; interno MeOH) 1,52 (3H, s, Proα-CH3), 1,81 a 2,21 ( 6H, m, Proβ-H2, ProY-H2 e Gluβ-H2 ), 2,34 (1,46 H, t, J 7,2, GIUY-H2), 2,42* (0,54H, t, J 7,3, GIUY-H2) , 3,50-3,66 (2H, m, Proδ-H2), 3,71* (0,27H, t, J 6,2, Gluα-H), 3,85 (1H, d, J 16,6, gIiα-HAHB), 3,92 (1H, d, J 16,6, gIyα-HAHB) e 4,18 (0,73H, dd, J 8,4 e 4,7, GIUα- H), (75 MHz, D2O; MeOH interno) 21,8 (CH3, Proα-CH3), 25,0 (CH2, ProY—C), 27,8* (CH2, Gluβ-C), 28,8 (CH2, Gluβ-C), 32,9 (CH2, Gluy-C), 40,8 (CH2, Proβ-C) 42,7 (CH2, gliα-C), 49,5 (CH2, Proδ-C), 56,0* (CH, Gluα-C), 56,4 (CH, Gluα-C), 69,8 (quat, Proα-C), 166,5 ( quat., Gly-CO), 177,3 (quat., Pro-CON), 179,2 (quat., Gluα-CO), 180,2* (quat., GluY-CO) e 180,6 (quat., GluY-CO) : m/z (FAB +) 316,1508 (MH+. C13H22N3O6 requer 316,1509).

Exemplo 3: Neuroproteção In Vitro

[00145] Os efeitos terapêuticos dos análogos GPE foram examinados em uma série de experiências in vitro para determinar os seus efeitos sobre a neu- rodegeneração de células neuronais de origem diferente. Os sistemas in vitro descri-tos no presente documento são bem estabelecidos na técnica e são conhecidos co-mo sendo preditivos dos efeitos neuroprotetores observados in vivo, incluindo os efeitos nos seres humanos que sofrem de transtornos neurodegenerativos.

Material e Métodos

[00146] O seguinte protocolo experimental seguiu diretrizes aprovadas pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Auckland.

Preparação das culturas de astrócitos corticais para a colheita de sobrena- dante da cultura celular metabolizado

[00147] Um hemisfério cortical de um rato de 1 dia de vida foi usado e coletado em 4 mL de DMEM. A trituração foi realizada utilizando uma pipeta de vidro de 5 mL e uma agulha de calibre 18. A suspensão celular foi peneirada através de um crivo de células de 100 μm e lavada em 50 mL de DMEM (centrifugação durante 5 minutos a 250 g). O sedimento foi ressuspenso em 20 mL de DMEM + soro de vitelo fetal 10%. A suspensão foi adicionada a dois frascos de 25 cm3 (10 mL por frasco) e cultivada a 37°C na presença de 10% de CO2, seguido por uma mudança do meio duas vezes por semana. Quando as células alcançaram a confluência, elas foram lavadas três vezes com PBS, ajustadas para Neurobasal/B27 e incubadas durante mais 3 dias. Este sobrenadante foi congelado para armazenamento tempo-rário a -80°C.

Preparação do Tecido Estradial e Cortical de Embriões de camundongo E18/E19

[00148] Uma rata grávida foi sacrificada por tratamento com CO2 e então foi preparada para a cesariana. Após a cirurgia, os embriões foram retirados de suas bolsas amnióticas e decapitados. As cabeças foram colocadas em gelo, em meio DMEM/F12 para estriado e PBS + 0,65% de D (+) - glicose para córtex.

Procedimento de extração de Tecido Estriado e Preparação de Células

[00149] O cérebro inteiro foi removido do crânio com o lado ventral para cima em meio DMEM/F12. O estriado foi dissecado a partir de ambos os hemisférios sob um estereomicroscópio e o tecido estriatal foi colocado em um tubo Falcon sobre gelo. Tecido estriatal foi então triturado usando uma pipeta de PI000 em 1 mL de volume. O tecido foi triturado com cuidado pipetando a solução para cima e para baixo na ponta da pipeta cerca de 15 vezes, usando a força de cisalhamento em flu-xos alternativos. Os pedaços de tecido assentaram no fundo do tubo Falcon dentro de 30 segundos. O sobrenadante contendo uma suspensão de células individuais dissociadas foi então transferido para um novo tubo Falcon estéril sobre gelo. Os pedaços de tecido foram novamente triturados para evitar danificar excessivamente as células já dissociadas, por trituração em excesso. Um mililitro de meio DMEM/F12 gelado foi adicionado aos pedaços de tecido no primeiro tubo e triturados como an-tes. Os pedaços de tecido foram assentados e o sobrenadante foi removido para um novo tubo Falcon estéril sobre gelo. As células foram centrifugadas a 250 g durante 5 minutos a 4°C.

Colocação em Placa e Cultivo de Células Estriatais

[00150] As células estriatais foram colocadas em placas de 96 poços de Poli-L-Lisina (0,1 mg/mL) (apenas os 60 poços internos) a uma densidade de 200.000 células/cm2 em meio Neurobasal/B27 (Invitrogen). As células foram cultiva-das na presença de 5% de CO2 a 37°C com 100% de umidade. O meio foi alterado nos dias 1, 3 e 6.

Procedimento de Extração de Tecido Cortical e Preparação das Células

[00151] Os dois hemisférios corticais foram cuidadosamente removidos de todo o cérebro por uma espátula, com o lado ventral voltado para cima em uma placa de petri contendo PBS + 0,65% D (+) - glicose. Fórceps foram colocados na parte rostral (perto do B.olfatorius) do córtex, a fim de fixar o tecido e dois cortes orientados- lateral-sagital foram feitos para remover os córtex paraforma e entorrinal. Um corte orientado frontal na extremidade posterior foi feito para remover a formação do hipocampo. Um corte final frontal foi feito alguns milímetros de distancia do último corte a fim de obter retenção de área de 17/1 8 do córtex visual.

[00152] Córtices foram colocados em gelo em PBS 0,65% (+) - glicose e centrifugados a 350 g durante 5 minutos. O sobrenadante foi removido e tripsi- na/EDTA (0,.05%/0,53 mm) foram adicionados por 8 minutos a 37°C. A reação foi interrompida pela adição de uma quantidade igual de DMEM e soro fetal de vitelo 10%. O sobrenadante foi removido por centrifugação, seguido por duas lavagens subsequentes em meio Neurobasal/B27.

[00153] As células foram trituradas uma vez com uma pipeta de vidro Pasteur, em 1 mL de meio Neurobasal/B27 e subsequentemente duas vezes, usan-do uma seringa de insulina de 1 mL com uma agulha de calibre 22. A suspensão de células foi passada através de um filtro de células de 100 μm e lavada em 1 mL de meio Neurobasal/B27. As células foram contadas e ajustadas a 50.000 células por 60 μL.

Colocação em Placa e Cultivo de Células Corticais

[00154] Placas de 96 poços foram revestidas com 0,2 mg/mL de poli-L- lisina e, subsequentemente, revestidas com 2 μ g/mL de laminina em PBS, após o que 60 μL de meio condicionado de astrócito cortical foi adicionado a cada poço. Subsequentemente, 60 μL de suspensão de células corticais foram adicionados. As células foram cultivadas na presença de 10% de CO2, a 37°C com 100% de umidade. No dia 1, houve uma mudança de meio completo (1:1 - Neurobasal/B27 e meio condicionado de astrócitos) com a adição de 1 μM de citosina-β-D-arabino- furanosídeo (inibidor da mitose). Nos dias 2 e 5, 2/3 do meio foram alterados.

Microexplantes de cerebelo de Animais P8: Preparação, Cultivo e Fixação

[00155] Córtices do cerebelo laminados dos dois hemisférios foram ex- plantados de um rato P8, cortados em pequenos pedaços em uma solução de PBS+ 0,65% D (+) glicose e triturados com uma agulha calibre 23 e subsequentemente prensados através de um crivo de tamanho de poro de 135 μm. Os microexplantes obtidos foram centrifugados (60 g), duas vezes (variação média) em meio STARTV suplementado com BSA isento de soro (Biochrom). Para o cultivo, foram aderidos 40 μL de suspensão celular por 3 horas sobre uma lâmina com revestimento deslizante com 0,1 mg/mL de Poli-L-Lisina colocada em placas de seis poços dimensionadas em 35 mm, na presença de 5% de CO2 em 100% umidade a 34°C. Subsequente-mente, 1 mL de meio STARTV foi adicionado juntamente com as toxinas e os medi-camentos. As culturas foram monitoradas (avaliadas) após 2-3 dias de cultura, na presença de 5% de CO2 sob 100% de umidade. Para a análise de contagem de cé-lulas, as culturas foram fixadas em aldeído parafórmico em concentrações crescen-tes de (0,4%, 1,2%, 3% e 4%, durante 3 minutos cada), seguido por uma lavagem em PBS.

Administração de Toxinas e Medicamentos às Células Neurais In Vitro e Análise dos Dados

[00156] Para estudar os efeitos neuroprotetores dos análogos GPE, rea-lizamos uma série de experimentos in vitro com ácido ocadáico para causar lesões tóxicas nas células neurais. Ácido ocadáico é uma toxina reconhecida na técnica que é conhecido por causar danos aos neurônios. Além disso, a recuperação das células neurais ou função célula neural após lesão por ácido ocadáico é reconhecida como preditiva de recuperação das lesões causadas por outras toxinas.

[00157] Para causar lesão tóxica aos neurônios, nós expusemos os neu-rônios a 1:100 partes de ácido ocadáico, em concentrações de 30 nM ou 100 nM l e 0,5 mM de ácido 3-nitropropiónico (apenas para microexplantes de cerebelo). GPE (1 nm e 1 mm), ou G-2-MePE (l NM-l mM) foi utilizado 8 dias in vitro (DIV) em culturas corticais e 9DIV para culturas de estriado. O tempo de incubação foi de 24 horas. A taxa de sobrevivência foi determinada através de um ensaio de MTT de ponto final colorimétrico em 595 nm em um leitor de placas de multi-poços. Para os microex- plantes cerebelares quatro janelas (campo de 0,65 mm2) com a maior densidade de células foram escolhidas e células que apresentam o crescimento de neuritos foram contadas.

Resultados

[00158] O análogo ao GPE, G-2-MePE exibiu efeitos neuroprotetores comparáveis em todos os três sistemas testados in vitro (figuras 12-15).

[00159] Culturas corticais responderam a concentrações de 10 μM de GPE (figura 12) ou G-2-MePE (10 μM, figura 13) com 64% e 59% de neuroproteção, respectivamente.

[00160] Os outros dois tipos de culturas demonstraram neuroproteção em doses mais baixas de G-2-(MePE (microexplantes cerebelares: figura 14 e células estriatais: figura 15). Células estriatais demonstraram neuroproteção dentro do intervalo de 1 nM e 1 mM de G-2-MePE (figura 15), enquanto que os microexplantes cerebelares pós natais demonstraram neuroproteção com G-2-MePE na faixa de doses entre cerca de 1 nm e cerca de100 nM (figura 14). Assim, conclui-se que o G- 2-MePE é um agente neuroprotetor e pode ter efeitos terapêuticos em seres huma-nos que sofrem de transtornos neurodegenerais. Uma vez que G-2-MePE pode ser neuroprotetor quando administrado diretamente aos neurônios em cultura, o G-2- MePE pode ser eficaz in vivo quando administrado diretamente ao cérebro dos ani-mais afetados.

Exemplo 4: Efeitos do G-2-MePE nos Neurônios Colinérgicos Estriatais no Envelhecimento de Ratos

[00161] Para determinar se G-2-MePE pode afetar os neurônios colinér- gicos, estudamos o envelhecimento dos ratos. A colina-acetiltransferase (ChAT) é uma enzima que está envolvida na biossíntese do neurotransmissor de acetilcolina dos nervos colinérgicos. É bem sabido que a imunodetecção de ChAT pode ser usada para determinar o número de nervos colinérgicos presentes em um tecido. Sabe-se também que o número de nervos colinérgicos presentes está relacionado com a função fisiológica das vias neurais colinérgicas no cérebro.

[00162] Nesse experimento foram testados os efeitos de G-2-MePE sobre o número de neurônios ChAT-positivos no cérebro de ratos com 18 meses de idade.

Métodos

[00163] Ratos de dezoito meses de idade receberam um total de cinco tratamentos. Um grupo de controle foi tratado com o veículo (solução salmoura ape-nas (n = 4) e quatro grupos foram tratados com uma única dose de G-2-MePE. Doses de 0,012 (n = 4), 0,12 (n = 5), 1,2 (In = 5) e 12 mg/kg (n = 3), respectivamente, foram injetadas subcutaneamente. Os ratos foram sacrificados com uma overdose de pentobarbital 3 dias após o tratamento medicamentoso. Os cérebros foram per-fundidos com solução de salmoura normal e aldeído parafórmico a 4% e fixados em fixador de perfusão durante a noite. Os cérebros foram armazenados em sacarose a 25% em PBS 0,1 M (pH 7,4) até que o tecido afundar. Seções coronais congeladas de estriato foram cortadas com um micrótomo e armazenadas em azida de sódio a 0,1% em PBS 0,1 M a 4°C. Imunorreatividade para colina acetiltransferase (ChAt) foi criada pela coloração usando um método seção de flutuação livre. Resu-midamente, os anticorpos foram diluídos em soro de cabra a 1%. Os cortes foram incubados em 0,2% de triton em 0,1 M de PBS/Triton™ a 4°C. durante a noite antes de coloração imuno-histoquímica. As seções foram pré -tratadas com H2O2 a 1% a 50% de metanol durante 20 minutos. As secções foram então incubadas com anti-corpos de coelho (Rb) anti-ChAT (1: 5000), (os anticorpos primários) em 4D, em um agitador, durante dois dias. As seções foram lavadas usando PBS/Triton™ (15 minu-tos 3d) e depois incubadas com anticorpos secundários biotinilados anti-coelho de cabra (1:1000) à temperatura ambiente durante a noite. As seções foram lavadas e incubadas em ExtrAvidin™ (Sigma) (1:1000), durante 3 horas, e seguido por H2O2 (0,01%) em tetracloridrato de 3,3- diaminobenzina (DAB, 0,05%) para produzir um produto de reação colorido. Estas seções foram montadas em lâminas de cromo- alúmen revestidas, secas, desidratadas e cobertas.

[00164] Os neurônios estriatais em ambos os hemisférios exibindo imu- norreatividades específicas correspondendo à ChAT foram contados utilizando um microscópio de luz e uma grade de 1 mm 2x1000. O tamanho da região estriatal usado para a contagem foi medido utilizando um analisador de imagem. As conta-gens totais de neurônios/mm2 foram comparadas entre os grupos.

[00165] Os dados foram analisados através de um teste-t pareado e apresentados como média +/- SEM. Os resultados são apresentados na figura 16.

Resultados

[00166] A figura 16A mostra que o número de neurônios ChAT- imunopositivos aumentado nos cérebros dos animais tratados com G-2-MePE. Isso indica claramente que a administração de G-2-MePE é eficaz para aumentar o nível de ChAT nos cérebros de ratos envelhecidos. Uma vez que o ChAT é uma enzima envolvida na síntese do neurotransmissor acetilcolina colinérgica, nós concluímos que G-2-MePE pode aumentar a quantidade de transmissor colinérgico no cérebro dos ratos de meia-idade.

Exemplo 5: Efeitos de G-2-MePE na Memória de Referência Espacial nos Ratos

[00167] Tendo demonstrado que o G-2-MePE pode aumentar ChAT e, portanto, tem o potencial de melhorar a função neuronal colinérgica, nós então exa-minamos se G-2-MePE pode ser útil no tratamento de alterações relacionadas com a idade na cognição e/ou de memória. Portanto, realizou-se uma série de estudos em ratos usando testes bem estabelecidos para a memória.

Experimento 1: Teste Aquático do Labirinto de Morris

[00168] O teste aquático do labirinto de Morris é um teste bem reconhecido para avaliar a memória de referência espacial em ratos.

Indivíduos

[00169] Nós empregamos ratos Wistar de 12, 8 ou 4 meses de idade.

Métodos Ambiente de teste e aparelhos

[00170] O teste aquático do labirinto de Morris foi realizado utilizando uma piscina de plástico preto cheia até uma profundidade de 25 cm de altura com água de cor preta com um corante atóxico. A piscina tinha um inserto preto circular de modo que as paredes também apareciam uniformemente pretas. A piscina foi dividida em quatro quadrantes (norte, sul, leste e oeste) por duas linhas perpendicu-lares imaginárias que cruzaram no centro da piscina. Uma plataforma metálica foi colocada no centro geográfico do quadrante SE a 50 centímetros da borda da pisci-na, de modo que estava 2 cm abaixo da superfície da água e invisível. A plataforma permaneceu nessa posição através do treinamento.

[00171] O experimento utilizou pistas de labirinto extras (ou seja, objetos no ambiente ao redor da piscina) assim os ratos poderiam usar para navegar até a plataforma. Cartazes ou pinturas distintas foram pendurados nas paredes. Móveis no ambiente não foram movido durante o período de testes. A colocação da piscina permitiu ao experimentador um fácil acesso a ela de todos os lados. A piscina era esvaziada e renovados diariamente durante os testes, com água a 25°C +/- 2°C.

[00172] O ponto mais distante na piscina (em relação à posição do expe-rimentador) foi designado como "norte", e os outros pontos cardeais "leste", "sul" e "oeste" eram os pontos mais à direita, ponto fundo e mais a esquerda da piscina, respectivamente.

Estes pontos foram marcados com fita adesiva no lado de fora da piscina. Fase de aquisição

[00173] Os ratos em cada grupo foram treinados para nadar até a plataforma submersa. Os ratos receberam seis ensaios de 60 segundos por dia durante quatro dias consecutivos. O experimento começou com a colocação do rato na água voltado para a parede da piscina, em um dos quatro locais de partia (norte, sul, leste, oeste). A sequência dos locais de partida foi escolhida pseudonimamente, de modo que o local de partida de um dado experimento era diferente daquele do experimento anterior, e nenhum local de partida foi usado mais de duas vezes durante o treinamento diário. A mesma sequência de localizações foi utilizada para todos os ratos em um determinado dia, mas variou entre os dias. O experimento terminava quando o rato encontrava a plataforma, ou em 60 segundos, o que nunca ocorreu antes. Os ensaios foram cronometrados com um cronômetro. Se o rato encontrasse a plataforma, ele podia permanecer lá durante 15 segundos antes de ser removido para um recipiente de armazenamento. Se a plataforma não fosse encontrada, o rato era guiado para a mesma manualmente e colocado na plataforma durante 15 segundos. O intervalo entre os experimentos era de 60 segundos. O recipiente de armazenamento estava coberto de forma a minimizar qualquer interferência entre os experimentos. Após a conclusão dos testes diariamente por um rato, o animal era seco com uma toalha e colocado sob a lâmpada de calor na cesta de armazenamen- to até seu pelo estar seco. O tempo necessário para encontrar a plataforma (tempo de latência, segundos) foi obtido para cada rato em cada experimento. Se o rato não encontrasse a plataforma em um determinado teste sua pontuação de latência era a duração máxima daquele experimento (60 segundos).

Tratamento Medicamentoso

[00174] Três dias após a conclusão da fase de aquisição, mini-bombas osmóticas (Alzet) foram implantadas subcutaneamente sob anestesia com halotano) para dispensar medicamento ou veículo continuamente por 1 ou 3 semanas. Após a conclusão da perfusão as bombas foram removidas e as feridas novamente sutura-das.

[00175] Os cinco grupos de tratamento foram: 1. salmoura uma semana (n era originalmente 7, porém um rato que perdeu peso rapidamente foi excluído e depois descobriu-se que tinha um tumor na hipófi-se); 2. salmoura 3 semanas (n = 8); 3. G-2-MePE dose baixa (0,96 mg/dia) 1 semana (n = 8); 4. G-2-MePE dose baixa (0,96 mg/dia) 3 semanas (n = 8); 5. G-2-MePE dose alta (4,8 mg/dia) 3 semanas (n = 7).

[00176] Os ratos de controle de quatro (n = 3) e oito meses de idade (n = 9) não receberam tratamento com medicamento. Os ratos de 12 meses de idade foram cedidos a um dos cinco grupos com base em seus tempos de natação em relação a aquisição, tal que os grupos eram aproximadamente equivalentes em seu desempenho médio antes da recepção de qualquer medicamento.

Fase de Retenção (Memória de Referência)

[00177] A capacidade dos ratos para se lembrar ou reaprender a localização original da plataforma foi testada quatro semanas após o treinamento original. Isto significa que a medicamento residual poderia ter sido retirado por um mínimo de 7 dias, no caso das bombas de 3 semanas, e 21 dias, no caso das bombas de 1 semana. O procedimento de teste de retenção foi idêntico ao da aquisição. Os estu-dos farmacocinéticos indicam que a concentração plasmática de G-2-MePE adminis-trado subcutaneamente se elevou a um pico e então declinou com um padrão cinéti-co de primeira ordem, com uma meia vida do plasma (t [1/2]) entre cerca de 30 e 60 minutos. Assim, até o momento em que o estudo de retenção foi realizado, pelo me-nos 7 dias após a remoção das minibombas contendo G-2-MePE, quase todo G-2- MePE havia sido eliminado da circulação dos animais.

Análise de Dados

[00178] A latência de natação para cada rato foi registrada para cada experimento para cada dia das fase de aquisição e de retenção e as alterações entre as fases foram examinadas pela Análise de Variância.

[00179] O veículo de 3 semanas e a dose elevada de 3 semanas de G-2- MePE foram comparados na aquisição e retenção. A dose elevada de G-2-MePE, fornecida durante 3 semanas melhorou a retenção da tarefa original do labirinto aquático, após um intervalo de 4 semanas.

Resultados

[00180] A figura 17 mostra a comparação entre ratos idosos tratados com G-2-MePE em dose elevada (4,8 mg/dia) e doses baixas (0,96 mg/dia), e ratos idosos tratados com solução de salmoura, com os controles jovens(4 meses) usados como controles. Antes do tratamento com G-2-MePE, não foram observadas diferenças entre os grupos de idosos (12 meses de idade). Em contraste, os animais de 4 meses de idade precisaram de menos tempo para alcançar a plataforma que os animais mais velhos. Após um período de 3 semanas sem testes, durante o qual tempo tanto a salmoura quanto G-2-MePE foram administrados, os animais que receberam apenas salmoura não mostraram capacidade aperfeiçoada de alcançar a plataforma, conforme indicado pelos tempos semelhantes necessários no quarto dia do teste da fase de aquisição e primeiro dia da fase de retenção. Em contraste, os animais que receberam o tratamento com G-2-MePE em qualquer dose elevada ou baixa, haviam melhorado a memória como refletido em uma diminuição do tempo necessário para atingir a plataforma em relação aos controles tratados com solução de salmoura. Além disso, os animais tratados com G-2-MePE tiveram desempenhos semelhantes aos animais jovens de 4 meses de idade (figura 17) e animais de 8 meses de idade (dados não mostrados). Assim, conclui-se que o G-2-MePE pode melhorar a memória em ratos de meia-idade que haviam mostrado previamente défi-cits de memória em relação aos ratos jovens. Além disso, uma vez que no momento do reteste, o G-2-MePE havia sido retirado da circulação, podemos concluir que os efeitos de melhora da memória de G-2-MePE foram provavelmente devido à melhora na função dos neurônios colinérgicos.

Experimento 2: Teste de Labirinto Radial de 8-Braços

[00181] Cinco meses após o experimento inicial, os ratos agora com 17 meses de idade foram testados novamente quanto à memória de trabalho espacial em um labirinto radial do braço.

Métodos Aparelho

[00182] O aparelho é constituído por uma plataforma central comunicando com 8 braços idênticos, cada um com um copo de comida no final do braço.

Procedimento de teste

[00183] Os ratos foram parcialmente privado de comida por pelo menos 10 dias antes, e durante todo o procedimento do labirinto radial.

[00184] O labirinto foi montado e posicionado de modo que o experimentador pudesse observar claramente o comportamento dos ratos a partir de uma localização predeterminada. O experimentador numerou os braços do labirinto de acordo com a sua orientação de um a oito na direção dos ponteiros do relógio.

Pré -Treinamento (Pré -Medicamento)

[00185] No dia um as portas foram inseridas nos braços e cada rato foi confinado na plataforma central, com 20 microesferas de ração por 5 minutos. Isto continuou uma vez por dia durante quatro dias, e todos os ratos foram observados consumindo algumas microesferas. No dia seguinte, foi permitido que os ratos explo-rassem o labirinto por cinco minutos. Todos os braços receberam duas microesferas de ração no copo de alimento localizado ao final de cada braço, e uma microesfera em ambos a entrada e o meio de cada braço. Isso foi repetido por pelo menos cinco, porém até oito dias para ratos que exploraram menos de oito braços em duas seções consecutivas. Todos os ratos tiveram uma seção final no nono dia de pré- tratamento. Nesse ponto foi decidido que um dos ratos idosos que havia feito apenas uma entrada no braço em oito dos nove dias seria excluído dos testes futuros nesse procedimento. Caso contrário, todos os ratos foram incluídos, independentemente da quantidade de exploração que eles realizaram no pré -treinamento.

[00186] Não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos de velhos no número de braços visitados ao final da seção de pré-treinamento (Medicamento: F (2,31) = 0,44, p = 0,65).

Tratamento Medicamentoso

[00187] Trinta dias antes do teste (cinco dias após o pré-treinamento) ratos machos Wistar de 17 meses de idade foram implantados (sob anestesia pelo halotano) com mini-bombas osmóticas subcutâneas (Alzet) para dispensar medica-mento continuamente durante 3 semanas. Após a conclusão da perfusão as bombas foram removidas e as feridas ressuturadas (9 dias sem ingestão de medicamentos sendo permitido).

[00188] Os grupos de tratamento foram os seguintes: 1. controles jovens (4 meses), n = 6; 2. salmoura n = 10; 3. G-2-MePE dose baixa (2,4 mg/kg/dia) n = 13 4. G-2-MePE dose elevada (12,4 mg/kg/dia) n = 5

[00189] Salmoura e os grupos de baixa dose são compostos de todos os ratos que receberam os tratamentos na fase 1 do experimento (quando os ratos ti-nham 12 meses de idade), independentemente se eles tiveram uma ou três semanas de tratamento. Um rato em cada um dos grupos de dose alta e salmouras foi retirado devido a tumores de pele. Um dos ratos de baixa dosagem não participou desta experiência, devido ao fato de que não pode ser pré -treinado (vide abaixo).

Testes (Pós-Medicamento)

[00190] Os testes de memória do trabalho começaram no nono dia do período sem uso do medicamento. Os ratos receberam 10 sessões de treino por dia, durante 12 dias. O procedimento foi o mesmo que para o pré-treinamento, mas apenas os copos de alimento foram colocados como isca. Os ratos tiveram seis minutos para fazer até 16 opções, visitando qualquer um das oito braços. A escolha foi definida como ocorrendo quando todas as quatro patas estavam dentro de um braço. O pesquisador registrou a sequência de entradas nos braços com caneta e papel. Sessões foram encerradas depois que todos os oito braços tinham sido introduzidos, 16 escolhas feitas, ou 6 minutos tivessem decorrido.O tempo necessário para intro-duzir todos os oito braços, quando ocorrido foi registrado.

Análise de Dados

[00191] Uma escolha de braço foi considerada correta quando o rato entra em um braço não visitado anteriormente. O desempenho foi classificado diariamente de acordo com os seguintes parâmetros: 1) A escolha correta (CC) 8-12 é o número de escolhas corretas feitas dividi-do pelo número total de escolhas realizadas. Para os animais que falharam em visi-tar todos os oito braços em um ensaio, n denominador da razão é considerado como sendo 12. 2) Trabalhando a escolha correta (WCC) 8-12 é a medida a partir da qual os dados da memória de trabalho são derivados. Os dados foram coletados como des-crito para a CC 8-12 acima, mas para este parâmetro, foram incluídos apenas os ratos que entraram em todos os 8 braços em uma sessão.

[00192] Os ratos que fizeram menos de 8 entradas nos braços não estavam acostumados à averiguação da memória de trabalho porque não conseguiam se lembrar de quais braços havia visitado anteriormente e, portanto, tinham memória tão prejudicada que não conseguiram completar o teste, ao contrário dos animais que, por qualquer razão, não exploraram o labirinto.

Resultados

[00193] CC8-12: Houve uma melhoria geral de todos os grupos entre os 10 dias (F (9,324) = 4,01, p < 0,0001), mas nenhum efeito significativo no grupo (F (3,36) = 0,19 , ns) ou Grupo X Dias de Interação (F (27,324) = 1,05, ns) (dados não mostrados)

[00194] WCC8-12: A figura 18A mostra o perfil de aquisição de acordo com a pontuação WCC8-12 entre os 10 dias de teste. Houve efeito significativo de Grupo (F (3, 12) = 4,27, p = 0,029) e Dias (F (9, 108) = 2.09, p = 0,036), mas a interação entre esses fatores não foi significativa (F (27,108 ) = 1,06, ns). A dose alta do grupo G-2Me-PE mostrou a maior melhoria entre os dias, seguido pelos controles jovens. Houve muito pouca diferença entre a dose baixa de G-2Me-PE e solução salmoura.

[00195] A figura 18B mostra que os resultados indicam que os ratos expostos a dose mais elevada de G-2-MePE (n = 5) tinham feito mais entradas corretas para obter microesferas de ração em comparação com os ratos tratados com veículo (* p <0,05, n = 10). Conclui-se deste estudo que G-2-MePE melhora a memória espacial em ratos idosos.

Exemplo 6: G-2-MePE aumenta a proliferação neuroblasto e diminui astroci- tose nos cérebros de ratos idosos

[00196] Uma vez que a degeneração neuronal pode resultar em diminuição do número de neurônios, um objetivo terapêutico desejável é aumentar o número de neurônios no cérebro. Neurônios são derivados de neuroblastos, uma célula menos diferenciada que um neurônio, mas dentro da linhagem neural. Tipicamente, um neuroblasto é exposto as condições que causam amadurecimento do mesmo em um fenótipo maduro, com uma soma definida de processos neurais (axônios e den- dritos) e, finalmente, fazendo ligações com outros neurônios (por exemplo, sinap- ses). Assim, a medição da proliferação dos neuroblastos tornou-se um marcador precoce bem conhecido para a proliferação de células nervosas. Assim, a detecção de um aumento na proliferação de neuroblasto induzida por um agente farmacêutico é um método aceito para a previsão do crescimento de células neurais em animais. Uma vez que os ratos e os seres humanos compartilham mecanismos semelhantes de proliferação de células neurais, a detecção de alterações na proliferação de neu- roblastos em ratos in vivo é preditiva de efeitos semelhantes em seres humanos.

[00197] Sabe-se também que uma correlação histológica da função cognitiva deficiente é um aumento no número de células astrócítos no cérebro de animais afetados. Assim, para determinar se o G-2-MePE pode ser útil para estimular a proliferação de neuroblastos e no tratamento astrocitose, realizamos uma série de estudos em ratos idosos.

Métodos e Materiais Imunohistoquímica

[00198] Para realizar estes estudos, os tecidos foram fixados e embebidos em parafina e cortes obtidos utilizando métodos convencionais. Seções coronais (6 μm) contendo o nível do hipocampo foram cortadas e montadas em lâminas revestidas com cromo-alúmen para coloração. Os cortes foram desparafinados em xileno, desidratados em séries de etanol e incubados em 0,1 M de fosfato salino tamponado (PBS).

[00199] Os anticorpos primários contra a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e em antígeno nuclear celular de proliferação (PCNA) foram usados para marcar as células gliais reativas e as células que sofrem apoptose e de proliferação, respectivamente. Para desmascaramento do antígeno (caspase-3 e coloração PCNA), os cortes foram aquecidos em tampão de citrato de sódio 10 mM (pH 6,0) durante 1 minuto em potência alta. Todas as seções foram pré-tratadas com 1% de H2O2 em 50% de metanol por 30 min. para saturar a atividade da peroxidase endó-gena. Em seguida, o soro normal de cavalo 1,5% ou soro de ovelha normal a 2,5% em PBS, foi aplicado durante 1 hora à temperatura ambiente para bloquear a colora-ção de fundo não especifica. As seções foram então incubadas com os seguintes anticorpos primários: anticorpo monoclonal anti-GFAP (Sigma, St. Louis, MO, USA diluído a 1:500); anticorpo anti-PCNA de camundongo (DAKA, A/S, Dinamarca, dilu-ído a 1:100). Após a incubação com os anticorpos primários em 4°C durante 2 dias (exceto para coloração PCNA que foi incubada durante a noite), as seções foram incubadas com o anticorpo anti-camundongo de cavalo biotinilado ou anticorpo se-cundário anti-coelho de cabra (1:200, Sigma) a 4°C durante a noite. O ExtrAvidin™ (Sigma, 1: 200), que tinha sido preparado 1 h antes da sua utilização, foi aplicado durante 3 horas à temperatura ambiente, e, em seguida, reagido em 0,05% de 3,3- diaminobenzidina (DAB) e PBS para produzir uma produto de reação castanho. Se-ções foram desidratadas em uma série de álcoois em xileno e colocadas em lâminas de vidro com revestimento deslizante com meio de montagem.

[00200] Coloração imuno-histoquímica foi realizada em amostras de cérebro tomadas de ambos os grupos de controle e tratados com G-2-MePE de ratos jovens (4 meses de idade),r atos de meia-idade (9 meses de idade) e idosos (18 meses).

[00201] Seções de controle foram tratadas da mesma maneira exceto que o anticorpo primário foi omitido da solução de incubação. O número de células PCNA positivas foi contado na zona subventricular e as células positivas para GFAP foram marcadas no córtex cerebral.

Experimento 1: G-2-MePE estimula a proliferação de neuroblastos no cére-bro de ratos envelhecidos

[00202] A zona subventricular (SVZ) e o giro denteado (DG) são duas regiões do cérebro hospedando neurogênese adulta. A redução da neurogênese em ambos SVZ e DG foi bem reportada como sendo correlacionada ao declínio de me-mória com o envelhecimento e efeitos do fator de crescimento do nervo e fator de crescimento epidérmico e na melhoria da memória sendo relatados como sendo de-vidos ao aumento na proliferação de SVZ dos progenitores. O emprego de PCNA como marcador de proliferação celular, proliferação celular em SVZ foi examinado por meio da contagem do número de células que são positivas para PCNA. Em ani-mais selecionados, pelo menos algumas das células em proliferação, foram identifi-cadas como os neuroblastos, como coradas com o agente específico da célula neu-ral, doublecortina.

[00203] Ratos machos de dezoito meses de idade foram tratados intra- peritonealmente com dose única de G2-MePE (doses de 0, 0,012, 0,12. 1,2, 12 mg/kg). Os cérebros foram recolhidos 3 dias após os tratamentos e a coloração imu- no-histoquímica de PCNA e GFAP foram realizados. O número de células PCNA positivas foi contado no SVZ e o número de células foi, em seguida, calculada como células/mm, dependendo do comprimento da parede do ventrículo usada para con-tagem (figura 19A). O grupo tratado com a dose mais elevada (12 mg/kg, n = 5) mostrou um aumento significativo no número de células PCNA positivas em compa-ração com o grupo tratado com veículo (* p < 0,05, n = 7). Os dados indicaram um efeito dependente de dose de G-2PE na melhoria da neurogênese.

[00204] Fluorescência de marcação dupla indicou co-localização de PCNA com marcador doublecortina empregado em neuroblastos. A figura 19B é uma fotografia de uma porção do cérebro do rato exibindo um aumento tanto em PCNA (verde, 20 vezes) e doublecortina (vermelho, 20 vezes) em ratos tratados com a dose mais elevada de G-2-MePE (painel direito) em comparação com ratos tratados com veículo (painel da esquerda). Os dois marcadores foram claramente co- localizados (figura 19B, foto, 100 vezes). Concluímos que G-2-MePE pode estimular a proliferação de células do cérebro, incluindo neuroblastos. Uma vez que os neu- roblastos são células precursoras de neurônios, podemos concluir ainda que G-2- MePE pode aumentar a população de neurônios nos cérebros dos animais tratados com o composto dessa invenção.

Experimento 2: G-2-MePE estimula a proliferação de neuroblastos no ZSV do cérebro de ratos de meia idade

[00205] Efeitos de G-2-MePE (1,2 mg/kg) foram estudados em um grupo de ratos de nove meses de meia-idade. L-2-MePE (1,2 mg/kg) ou veículo foi admi-nistrado por via intraperitoneal (i.p.). A proliferação de células no SVZ foi examinada três dias após o tratamento, utilizando a coloração imuno-histoquímica PCNA. A fi-gura 19C mostra um aumento significativo no número de células PCNA positivas após o tratamento de G-2-MePE (** p < 0,005, n = 4). Como algumas das células em proliferação coradas com PCNA foram identificadas como neuroblastos (vide Expe-rimento 1 acima), podemos concluir que o G-2-MePE pode estimular a proliferação de neuroblastos em cérebros de ratos de meia-idade.

Experimento 3: Astrocitose no Envelhecimento de Cérebros

[00206] A crescente evidência sugere que a disfunção de astrócitos em idade avançada pode provocar inflamação, levando à degeneração neuronal adicio-nal. A suprarregulação dos astrócitos ativados tem sido bem relatada e está intima-mente associada ao declínio da memória com o envelhecimento, talvez através da depressão na neurogênese endógena

[00207] O emprego de GFAP como um marcador para astrócitos reativos, o número de células GFAP-positivas foi contado na subregião do hipocampo de ratos de idade tratados com G-2MeP ou veículo. Descobrimos um aumento significativo nos astrócitos reativos no hipocampo de animais idosos (figura 20A), e no córtex cerebral. Alguns dos astrócitos foram associados aos capilares (foto na figura 20B setas) em ratos idosos em comparação com ambos os ratos jovens (* p <0,01) e em ratos de meia idade (* # p <0,01).

[00208] Como parte do componente vascular, astrócitos GFAP positivo também desempenham um papel na angiogênese (figura 20B, setas), que também contribuem para a resposta inflamatória no cérebro. Portanto, os astrócitos de GFAP elevados observados em cérebros envelhecidos podem indicar um estágio crônico de degeneração cerebral.

Experimento 4: G-2-MePE Reduz a Astrocitose em Cérebros Envelhecidos

[00209] Também foram avaliados os efeitos de G-2-MePE em astrocito- se na subregião CA4 do hipocampo em ratos idosos. Ratos Wistar machos, de 18 meses de idade foram divididos em cinco grupos de tratamento como se segue: veículo, 0,12 mg/kg/dia, 0,12, 1,2 e 1,2 mg/kg/dia (n = 6 cada).

[00210] Células GFAP-positivas foram contadas utilizando um programa computadorizado (Discovery 1). Os resultados são mostrados nas figuras 20C e 20D. G-2-MePE foi administrado intraperitonealmente e o número de células GFAP- positivas foram avaliadas 3d após a injeção. Usando um sistema de pontuação visual (0 = sem astrócitos, 1 = poucos astrócitos, 2 < 50%, 3 > 50%) estimou o número de astrócitos em cinco diferentes regiões corticais.

[00211] O tratamento com G-2-MePE reduziu o número de astrócitos reativos na região CA4 do hipocampo, em comparação com o grupo tratado com veículo (figura 20C, * p <0,05), em especial os grupos tratados com as doses de 0,12 e 12 mg/kg. Um efeito semelhante foi observado para o G-2-MePE no córtex cerebral (figura 20D).

[00212] Normalmente são poucos os astrócitos de GFAP positivas locali-zados na camada profunda do córtex do cérebro de ratos e os que estão presentes estão geralmente em associação próxima com as faixas de matéria branca. No en-tanto, descobrimos que havia células GFAP-positivas na camada do meio do córtex, intimamente associadas com os vasos sanguíneos.

[00213] Os resultados dos estudos apresentados no presente documento indicam que o envelhecimento está associado a várias modificações no cérebro. Em primeiro lugar, existe uma perda dependente da idade, da memória e função cognitiva. Em segundo lugar, existe um aumento dependente da idade nos astróci- tos. Todas estas descobertas nos ratos são consistentes com outras e as funções conhecidas de nervos colinérgicos na manutenção da função cognitiva e da memória em animais experimentais e em humanos.

[00214] Nós verificamos, inesperadamente, que um análogo de GPE, G- 2-MePE, liberado aos animais idosos, inverte, pelo menos parcialmente, tudo o que precede alterações associadas à idade. Em primeiro lugar, G-2-MePE aumenta a quantidade de ChAT presente nas células do cérebro de animais expostos às neuro- toxinas, ácido ocadáico ou 3-NP. Este efeito de G-2-MePE mimetizou um agente neuroprotetor bem conhecido, o GPE. Estes efeitos foram observados em células corticais, células do cerebelo e em células do corpo estriado, o que indica que os efeitos foram generalizados em diferentes porções do cérebro. Em segundo lugar, G-2-MePE aumentou a quantidade de ChAT no corpo estriado, o que indica que os neurônios colinérgicos são sensíveis ao G-2-MePE. Essas alterações químicas e histológicas observadas foram acompanhadas por mudanças comportamentais. Animais idosos tratados com G-2-MePE exibiram melhoria da memória em dois sis-temas de ensaio bem conhecidos em comparação com controles tratados com veí-culo. Em seguida, G-2-MePE induziu proliferação de neuroblasto em cérebros enve- lhecidos. Finalmente, o tratamento com G-2-MePE inverteu o aumento da astrocito- se observado no hipocampo e no córtex de cérebros envelhecidos. Os efeitos de G- 2-MePE não foram devidos aos efeitos agudos do agente; porque em muitos dos estudos citados no presente documento, tempo suficiente havia decorrido desde a cessação da liberação do medicamento para o ensaio, havendo pouco ou nenhum medicamento presente.

Exemplo 7: Comparação entre a farmacocinética de GPE e G-2-MePE

[00215] O propósito desses estudos era comparar os perfis farmacociné- ticos de GPE e G-2-MePE em animais in vivo, utilizando métodos farmacocinéticos convencionais.

Métodos

[00216] Ratos machos adultos Wistar pesando entre 180 e 240 g foram utilizados para determinar a farmacocinética de GPE e G-2-MePE. Para facilitar a injeções em bolus intravenosas e amostragem de sangue, os ratos foram implanta-dos com uma cânula jugular residente, sob anestesia com halotano, três dias antes do experimento. Grupos de seis ratos receberam uma única injeção intravenosa de bolus ou 30 mg/kg de GPE ou 10 mg/kg G-2-MePE dissolvido em tampão de succi- nato 0,1 M (pH 6,5). Amostras de sangue (cerca de 220 μL cada) foram recolhidas em tubos heparinizados contendo cocktail de inibidores de protease para tecidos de mamíferos da Sigma em 0 a 10 min. antes da injeção de qualquer GPE ou G-2- MePE, e 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 e 128 minutos após a injeção de qualquer GPE ou G- 2-MePE. As amostras foram centrifugadas a 3.000 g durante 15 min. a 4°C e o plasma removido e armazenado a -80°C até a extração e ensaio por qualquer ra- dioimunoensaio ("RIA") ou HPLC de fase reversa. Os métodos RIA e HPLC utiliza-dos foram os convencionais.

[00217] Eliminação do medicamento após uma única injeção intravenosa em bolus foi verificada como sendo um processo de primeira ordem, seguindo a equação C = Coe-kt em que C representa a concentração do medicamento, em qual-quer ponto do tempo, Co representa a concentração quando o tempo (t) for igual a zero e k for a constante de taxa de primeira ordem, expressa em unidades de con-centração por hora. O k e meia-vida (t1/2) foram calculados a partir da inclinação da linha de regressão linear na fase de eliminação do gráfico semi-logarítmico da con-centração de plasma versus tempo como: Log C = -kt/2.3 + log Co. Resultados foram expressos como média ± desvio padrão.

Resultados

[00218] A figura 21 mostra um gráfico das concentrações plasmáticas in vivo de GPE2 e G-MePE após a injeção intravenosa (iv). Quadrados cheios representam as concentrações de GPE, em cada ponto de tempo, e triângulos cheios representam as concentrações de G-2-MePE em cada ponto de tempo.

[00219] As concentrações plasmáticas de GPE e G-2--MePE foram mar- cadamente aumentadas dentro de um minuto após a injeção. Após injeção de 30 mg kg de GPE, um pico de concentração de 40,0 ± 10,8 mg/mL foi observado. As con-centrações plasmáticas de GPE, em seguida, diminuíram rapidamente de acordo com um processo de cinética de primeira ordem. A constante de taxa de primeira ordem para o GPE foi encontrada como sendo de 0,15 ± 0,014 ng/mL/min., foi verificado que t1/2 seria de 4,95 ± 0,43 min. e a depuração estimada de GPE do plasma foi verificada como sendo de 137,5 ± 12,3 mL/hora.

[00220] Após injeção de 10 mg/kg de G-2-MePE, a concentração de pico foi verificada como sendo de 191 ± 16,1 mg/mL. As concentrações plasmáticas de G-2-MePE então declinaram de acordo com um processo de cinética de primeira ordem. A constante de taxa de primeira ordem para o G-2-MePE foi verificada como sendo de 0,033 ± 0,001 ng/mL/min., foi verificado que t % era de 20,7 ± 0,35 min. e a depuração estimada foi de 30,1 ± 0,5 mL/hora.

[00221] Depois da injeção, a concentração plasmática máxima de G-2- MePE era cerca de 4,8 vezes maior que a concentração plasmática máxima de GPE, apesar da maior dose de GPE liberada (30 mg/kg) em comparação com a dose de G-2- MePE liberada (10 mg/kg).

[00222] A descoberta de concentrações plasmáticas superiores de G-2- MePE em relação às de GPE em todos os pontos de tempo inferiores a 125 minutos, apesar de uma dose de liberação mais baixa de G-2-MePE, foi totalmente inespera-da, com base nas concentrações de plasma conhecidas de GPE. O t% para G-2- MePE foi mais de 4 vezes mais longo que o t1/2 para GPE.

[00223] A constatação de uma meia-via maior de G-2-MePE em comparação àquela de GPE foi completamente inesperada com base em t % de GPE. O t % aumentado de G-2-MePE significa que G-2-MePE é claramente mais lento a partir da circulação. Essa verificação é totalmente inesperada com base na taxa de depuração de GPE.

[00224] Nós concluímos desses estudos que G-2-MePE é um agente potente capaz de reverter muitos dos efeitos adversos do envelhecimento nos cérebros de animais, incluindo seres humanos. Análogos de GPE, incluindo G-2-MePE portanto, podem produzir efeitos terapêuticos desejados, incluindo a neuroproteção, a melhoria da memória, o aumento da proliferação de neuroblastos e redução da astrocitose, e podem ser úteis para reverter ou atenuar os efeitos adversos do enve-lhecimento nos seres humanos.

[00225] Embora a presente invenção tenha sido descrita em termos de certas modalidades preferidas, será evidente para um versado na técnica comum tendo em conta que o conhecimento e esta revelação que os equivalentes do composto da presente invenção podem ser preparados e administrados nas condições descritas no presente pedido, e todos esses equivalentes se destinam a inclusão no âmbito das reivindicações do presente pedido.

Exemplo 8: Tratamento da Síndrome de Rett 1 Efeitos de G-2-MePE na vida útil e potenciação de longa duração no Modelo de Síndrome de Rett (RTT)

[00226] Para determinar se o tratamento de G-2-MePE pode ter impacto no desenvolvimento e progressão da síndrome de Rett, em um modelo murino do transtorno, foi utilizado camundongo macho hemizigótico MeCP2 (1 lox). O sistema de camundongo MeCP2 nocauteado (MeCP2-KO) é amplamente aceito na técnica como mimetizando de forma muito próxima a faixa e a gravidade das características das anormalidades neurológicas do transtorno humano, Síndrome de Rett.

[00227] Todos os experimentos foram realizados na University of Texas Southwestern Medical Center e aprovados pela University of Texas Southwestern Medical Center Animal Care and Use Committee. G-2-MePE foi sintetizado no Al-bany Molecular Research Inc. (Albany, NY) e fornecido pelo Neuren Pharmaceuti-cals Limited.

Métodos Tratamento

[00228] Nós tratamos camundongos machos hemizigotos MeCP2 (l lox) com 20 mg/kg/dia de G-2-MePE ou solução de salmoura (0,01% de BSA, n = 15 por grupo no experimento de sobrevivência e n = 20 no experimento LTP). Os tratamentos foram administrados por via intraperitoneal a partir de 4 semanas após o nascimento. Para os experimentos de sobrevivência, o tratamento foi mantido durante o curso do experimento.. Para o experimento LTP os camundongos foram tratados até a 9a semana quando foram usados para a preparação da lâmina.

Sobrevivência

[00229] Os camundongos mutantes deficientes de MeCP2 desenvolvem sistemas de RTT em cerca de 4-6 semanas de idade e morrem entre 10-12 semanas (Chen e outros De 2001. Nat Genet 27: 327-331). Foi comparada a sobrevivência de controles do tipo selvagem e animais deficientes em MeCP2 em grupos tratados com veículo e G-2-MePE.. A sobrevivência foi medida semanalmente a partir do início do tratamento (4 semanas) e utilizada para produzir curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier que mostram a proporção de camundongos que sobreviveram (eixo Y) em cada intervalo semanal (eixo x) (vide figura 22.).

Potenciação de Longa Duração (Eletrofisiologia)

[00230] Camundongos deficientes de MeCP2 foram previamente reportados como sofrendo de disfunções sinápticas funcionais e ultraestruturais, compro-metimento significativo da memória dependente do hipocampo e potenciação de longo prazo do hipocampo (LTP) (Moretti e outros The Journal of Neuroscience. 2006. 26 (1) :319-327). Para testar os efeitos do tratamento com G-2-MePE na função sináptica no modelo RTT, comparamos LTP do hipocampo em ambos animais com tratamento com veículo e com G-2-MePE de 9 semanas de idade. Para fazer isso, foram medidos o declive da fEPSP como uma porcentagem da linha de base em potencial no neurônio em fatias de hipocampo a partir de camundongos deficientes de MeCP2 tratados tanto com salmoura quanto com G-2-MePE (figura 23).

Resultados

[00231] A figura 22 mostra que o tratamento com G-2-MePE aumentou a sobrevivência de camundongos deficientes de MeCP2. Camundongos de tipo selva-gem (linha superior) são animais de controle e, portanto, a sua sobrevivência foi de 100% em cada ponto de tempo. Camundongos deficientes de MeCP2 tratados com solução de salmoura apenas morreram muito mais rapidamente (linha pontilhada) em relação aos camundongos de tipo selvagem, de tal modo que cerca de 11 sema-nas, apenas 50% dos camundongos deficientes em MeCP sobreviveram. Em fla-grante contraste, no entanto, inesperadamente, nos verificamos surpreendentemente que os camundongos deficientes de MeCP2 tratados com G-2-MePE sobreviveram muito mais tempo que os camundongos tratados com solução salmoura. Em cerca de 1 5 semanas, 50% dos animais sobreviveram. Os dados apresentados ini- cialmente mostraram que camundongos MeCP2 foram afetados em termos de so-brevivência tal que 50 por cento dos animais morreram em 11 semanas no caso não tratado. Animais tratados com G-2-MePE mostraram melhora na sobrevida, com 50 por cento tendo morrido em 16 semanas. Neste estudo, os dados de longevidade foram comprometidos por procedimentos veterinários inconsistentes, tal que os ca-mundongos não tiveram seus dentes serrados consistentemente - um requisito nos camundongos MeCP2 não reconhecido no início do experimento. Uma conseqüên- cia foi a observação de mortes de animais precoces não relacionadas à Síndrome de Rett (particularmente no grupo controle). Um novo exame dos dados mostrou que o efeito de G-2-MePE persistiu quando o grupo de controle foi operado novamente, embora a diferença nos grupos fosse menor (tempo para 50% de morte, 13,5 sema-nas nos controles, 16 semanas nos animais tratados com G-2-MePE). Nenhuma questão de segurança foi levantada por tratamento de camundongos MECP2 com G-2-MePE.

[00232] Estes resultados demonstraram que o G-2-MePE pode aumentar substancialmente a sobrevivência de camundongos deficientes MeCP2. Uma vez que os camundongos deficientes MeCP2 podem prever a patologia e eficácia tera-pêutica em seres humanos com Síndrome de Rett, nós concluímos que G-2-MePE pode aumentar a expectativa de vida dos seres humanos com a síndrome de Rett.

[00233] A figura 23 mostra os resultados dos nossos estudos para determinar se o tratamento com G-2-MePE aumento de potenciação do hipocampo a longo prazo (LTP), como medido pela inclinação fEPSP MeCP2 em animais deficientes em comparação com camundongos mutantes tratados com solução de salmoura. Como mostrado na figura 23, nós verificamos inesperadamente, que G-2-MePE aumentou a inclinação da fESPS em camundongos deficientes MeCP2 em comparação com os animais tratados apenas com solução de salmoura.

[00234] Estes resultados demonstraram que o G-2-MePE pode ser efi- caz no tratamento de camundongos deficientes em MeCP2 in vivo. Uma vez que os camundongos deficientes em MeCP2 são preditivos da eficácia patologia e terapêutica em seres humanos com a síndrome de Rett, concluímos que G-2-MePE pode ser uma terapia eficaz para as pessoas com Síndrome de Rett.

Exemplo 9: G-2-MePE Melhora a Arborização Dendrítica e Aumenta o Com-primento da Espinha Dendrítica

[00235] Nós avaliamos os efeitos do tratamento de G-2-MePE em den- dritos. Camundongos nocauteados mecp2 transgênicos (n = 15 a 20), foram administrados por via intraperitoneal com G-2-MePE a uma dose de 20 mg/kg uma vez por dia. Após o sacrifício, a densidade da espinha dendrítica, comprimento da espinha e arborização foram examinados após a coloração de Golgi após nove semanas, de acordo com a Tabela 1 abaixo: Tabela 1: Tamanho da amostra para todas as análises morfológicas de neu- rônios e espinha

[00236] O comprimento dendrítico foi avaliado pela distância da soma de um representante de neurônios CA1 do hipocampo a partir de um camundongo mu-tante macho nulo em mecp2 de 9 semanas de idade tratado com solução salmoura (3 neurônios analisados a partir de três camundongos em separado, n = 9) ou G-2- MePE (20 mg/kg i.p. 1/dia, a partir da semana 4; 3 neurônios analisados a partir de 3 camundongos separados, n = 9).

[00237] Observamos que G-2-MePE melhorou a arborização dendrítica e aumentou o comprimento da espinha dendrítica. A figura 24 ilustra os resultados deste estudo. O comprimento dendrítico em μm (eixo vertical) é registrado em função da distância (em μm; eixo horizontal) a partir da soma das células. Para as células com dendritos estreitos próximo ao corpo da célula (somas), os dendritos eram mais curtos. Contudo, como a distância dos somas aumentou o tratamento com salmoura (quadrados abertos) produziram comprimentos dendríticos que aumentaram a um máximo a uma distância de 70 μm da salmoura e declinou em distâncias fora dos somas. Em contraste, o tratamento com G-2MePE (quadrados cheios) produziu dendritos mais longos em grande parte da faixa de distâncias dos somas.

Exemplo 10: Tratamento de Síndrome de Rett em Camundongos II Acasalamento de Camundongos e Genotipagem

[00238] Os camundongos de alelo nulo de linhagem germinativa MeCP2 são utilizados (Chen e outros, 2001). A genotipagem é realizada como em Chen e outros (Chen e outros, 2001).

Tratamento G-2-MePE

[00239] Para as medições de sobrevivência, a análise da atividade noturna e análise immunoblot, G-2-MePE (sintetizado Albany Molecular Research Inc. (Albany, NY) e fornecido por Neuren Pharmaceuticals Limited) é administrado diariamente por meio de injeções intraperitoneais (20 mg/kg, veículo = salmoura, 0,01% de BSA). O tratamento começa em PI 5 e é mantido durante todo o decurso dos experimentos. Para os experimentos de fisiologia intracelulares, os camundongos são injetados diariamente com G-2-MePE (20 mg/kg de peso corpóreo, veículo = salmoura, 0,01% de BSA) durante 2 semanas, a partir de P15 até P28, P32, quando eles são utilizados para a preparação de lâminas. Para os experimentos de image- amento óptica, os camundongos são injetados com G-2-MePE (20 mg/kg de peso corpóreo, veículo = salmoura, 0,01% de BSA) diariamente desde o dia da sutura da tampa para o dia do imageamento.

Preparação de Fisiologia da Lâmina

[00240] Cortes coronais (300 μm de espessura) em ou perto do córtex sensório-motor são cortados em < 4°C ACSF usando Vibratome. As lâminas foram incubadas a 37°C durante 20 minutos após o corte, e à temperatura ambiente duran-te o restante do experimento. As lâminas são transferidas para uma câmara Warner e os registros são realizados de neurônios piramidais localizados visualmente e identificados na camada 5. Fluido cerebrospinal artificial (ACSF) contendo 126 mM de NaCl, 25 mM de NaHCO3, 1 mM de NaHPO4, 3 mM de KCl, 2 mM de MgSO4, 2 mM de CaCl2 e 14 mM de glicose, são ajustados a 315-320 mOsm e pH de 7,4, e borbulhou com 95% de O2/5% de CO2. A solução para pipeta intracelular continha 100 mM de gliconato de potássio, 20 mM de KCl, 10 mM de HEPES, 4 mM de MgATP, 0,3 mM NaGTP, e 10 mM de Na-fosfatocreatina.

Gravações Intracelulares de Célula Integral

[00241] Pipetas de borossilicato (3-5 MQ, WPI) são puxadas através de um extrator Sutter P-80 (Sutter Instruments). As células são visualizadas com uma lente 40 x de imersão em água Achroplan com lentes infravermelho DIC (Zeiss) e detectadas com uma câmera infravermelha (Hamamatsu) projetando a um monitor de vídeo. Os experimentos são conduzidos por aquisição personalizada e software de análise em tempo real escrito por Matlab (Mathworks, Natick, Massachusetts) utilizando um amplificador Multiclamp 700B (Axon Instruments) ligado a um BNC 2110 bloco de conector e cartão de aquisição de canal duplo Série M (National Ins-truments). Gigaseal e ruptura é alcançada e os registros de célula integral são conti-nuamente verificados por baixos níveis de vazamento e de resistência em série. Para cada registro, um pulso de teste de 5 mV é aplicado em fixador de tensão ~ 10 vezes para medir a resistência em série e de entrada. Então, em pinça de corrente de fuga ~10 pulsos (500 ms, 40-140 pA em incrementos de 10 pA), são aplicados para quantificar taxas de disparo evocadas e excitabilidade celular. A resistência de acesso, vazamento e excitabilidade celular intrínseca são verificados para serem consistentes em todos os grupos. Finalmente, EPSCs espontâneas sob pinças de corrente de fuga a -60 mV são amostradas a 10 kHz e passadas por filtro passa baixo a 1 kHz. A análise é realizada utilizando um pacote de software personalizado escrito em Matlab, com todos os eventos detectados de acordo com os limites automatizados e verificados cegamente para cada evento individualmente pelo experimentador.

Coloração Golgi

[00242] Amostras (<1 cm) dos camundongos P28 são fixadas em formalina a 10% e de nitrato de prata a 2% durante 2 dias no escuro à temperatura ambiente. Seções dessas amostras são então cortadas em 50 μm de espessura em água destilada. As seções correspondendo ao córtex motor são montadas em lâminas, secas ao ar por 10 minutos e então desidratadas através de lavagens sequenciais de álcool a 95%, álcool a 100% e xileno, e depois seladas com uma lâmina com re-vestimento deslizante. As imagens são obtidas a 10x (célula integral) e 100 x (ima- geamento da espinha) empregando um microscópio confocal Zeis Pascal 5 Exciter.

Imageamento óptico de sinais intrínsecos

[00243] Adulto (> P60) do tipo selvagem (SVEV ou BL6) e MeCP2 (+/-) fêmeas mutantes (BL6), são utilizadas para esse experimento. O grupo de controle do tipo selvagem é composto de ambas ninhada do tipo selvagem de fêmeas de MeCP2 +/- ou fêmeas de idade ou tipo selvagem de SVEV combinadas. Para priva-ção monocular, os animais são anestesiados com Avertin (0,016 mL/g) e a pálpebra do olho é suturada durante 4 dias. Antes da imageamento, o fio de sutura é retirado e o olho fechado reaberto. Apenas os animais em que as suturas de privação são intactas e a condição do olho privado parece saudável são utilizados para a sessão de imageamento. Para a ativação de sinalização de G-2-MePE, uma solução con- tendo G-2-MePE é injetada intraperitonealmente (IP) diariamente durante a totalidade do período de privação. Para as sessões de imageamento, os camundongos são anestesiados com uretano (1,5 g/kg, 20% da dose total são administrados IP cada 20-30 minutos até cerca de a dosagem final, 0,02 mL de cloroprotixeno a 1% também é injetado em conjunto com a primeiro administração). O crânio é exposto e uma placa de fabricada sob medida é colada na cabeça para minimizar o movimento. O crânio é reduzido sobre VI com uma broca Dremel e coberto com uma solução de agarose em salmoura (1,5% e uma lâmina de vidro com revestimento deslizante. Durante a sessão de imageamento, o animal é constantemente oxigenado, a sua temperatura é mantida com uma manta de aquecimento e os olhos tratados periodicamente com óleo de silicone, as condições fisiológicas sendo constantemente monitoradas. O camundongo anestesiado é colocado em frente de um monitor que exibe um estímulo periódico apresentado a ambos os olhos, monocularmente; o estímulo consistia em uma barra branca de direcionamento vertical ou horizontal de di-mensões de 9° x 72°, direcionamento a 9 seg./ciclo, em um fundo uniformemente cinza. A superfície do crânio é iluminada com uma luz vermelha (630 nm) e a varia-ção de luminância é capturada por uma câmera CCD (Cascade 512B, Roper Scienti-fic) a uma taxa de 15 quadros/seg. durante cada sessão de estímulo de 25 minutos. Um filtro passa-alto temporal (135 quadros) é empregado para remover o ruído de sinal lento, após o que o sinal é processado pelo computador, a fim de extrair, em cada pixel, o componente de Transformada Rápida de Fourier (FFT) correspondente à frequência de estímulo. A amplitude da FFT é utilizada para medir a resistência da resposta evocada visual para cada olho. O índice de dominância ocular é derivado da resposta de cada olho (R) em cada pixel como ODI = (Rcontra-Ripsi)/(Rcontra + Ripsi). A zona binocular é definida como a região ativada pela estimulação do olho ipsilateral para o hemisfério imageado.

Medições da Frequência Cardíaca

[00244] Pulsação cardíaca em tempo real é medida através de um sensor de clipe de cauda (Oxímetro OX Camundongo - Oakmont, PA). Os camundongos não são anestesiados, mas fisicamente contidos em um tubo de plástico aberto instalado. Antes da sessão de registro o tubo é colocado durante a noite nas gaiolas que abrigam os animais experimentais para permitir a habituação. A temperatura do corpo é mantida a ~ 27,7-28,8°C durante todo o tempo de registro. Registramos 3 experimentos de 15 minutos para cada camundongo, os camundongos têm 8 sema-nas de idade e foram tratados com veículo ou G-2-MePE a partir de Pl 5.

Medições de Atividades Noturnas

[00245] A atividade motora espontânea é medida por meio de uma câmara de monitoramento de movimento ativada por feixe de infravermelho (Opto- Varimax-MiniA; Columbus Instruments, Columbus, Ohio). Para cada experimento, um rato é colocado na câmara, pelo menos, 3 horas antes do registro começar. O movimento é monitorado durante o ciclo normal de 12 horas no escuro (sete horas - sete horas). É coletado um ciclo escuro por animal por ponto de tempo.

Resultados

[00246] Para testar se o tratamento de G-2-MePE impactará o desenvol-vimento das características cardinais da doença RTT, animais mutantes de duas semanas de idade recebem injeções intraperitoneais diárias no curso de sua vida. Medidas de fisiologia sináptica, composição molecular sináptica e plasticidade corti-cal são, então, adquiridas conforme detalhado abaixo, juntamente com as medidas relacionadas a saúde, tais como frequência cardíaca, níveis de atividade locomotora e vida.

Efeitos de G-2-MePE na Fisiologia Sináptica de Camundongos Mutantes MeCP2

[00247] Estudos recentes relataram que os neurônios em várias regiões do cérebro de camundongos MeCP2-/y exibem uma profunda redução na atividade espontânea (Chang e outros, 2006;. Chao e outros, 2007;. Dani e outros, 2005; Nel-son e outros 2006) um fenótipo que é resgatado por superexpressão de BDNF (Chang e outros, 2006). Da mesma forma, a aplicação aguda de um derivado de IGF1 mostrou elevar amplitudes de correntes pós sinápticas excitatórias evocadas (EPSC) por 40%, em culturas de hipocampo de rato (Ramsey e outros, 2005, Xing e outros, 2007). Para testar a eficácia de G-2-MePE no resgate do fenótipo fisiológico MeCP2-/y, adquirimos registros de célula integral intracelular em fatias cerebrais agudas, medindo o acionamento sináptico excitatório (amplitude de EPSC espontânea e frequência) nos neurônios corticais de camada 5. No presente documento as EPSCs registradas a partir dos animais -/y são significativamente reduzidas na amplitude em comparação com as EPSCs medidas em animais de tipo selvagem. A tendência é parcialmente revertida em EPSCs gravadas a partir de animais MeCP2-/ y tratados com G-2-MePE, que são significativamente maiores em amplitude que as EPSCs de camundongos MeCP2-/y tratados com veículo. Essas diferenças também são vistas quando a média se calcula em células. Ao longo dessas medições, a resistência de acesso, vazamento, e excitabilidade celular intrínseca também são verificadas como sendo consistentes através dos grupos. A quantificação dos intervalos de EPSC também mostra um ligeiro aumento no intervalo entre eventos de EPSC (redução da frequência EPSC) entre os animais do tipo selvagem e MeCP2-/y (P = 0,04, teste de Kolmogorov-Smirnov). Os nossos resultados indicam, assim, que a redução da unidade sináptica excitatória em células corticais de camundongos MeCP2-/y e sua recuperação parcial, após o tratamento de G-2-MePE, são devidas, em parte, a uma alteração na amplitude EPSC como uma consequência de uma alteração na resistência das sinapses que mediam a transmissão excitatória nesta região.

Tratamento com G-2-MePE Estimula a Maturação da Espinha Cortical

[00248] Nós usamos a coloração de Golgi para rotular esparsa e distin- tamente os neurônios e imageamento confocal de alta resolução para medir densidade de espinha dendrítica e morfologia nas células marcadas restringindo a análise para os neurônios corticais de camada 5 nas seções de córtex motor a partir de camundongos no período crítico (P28).

[00249] Embora o imageamento de baixa ampliação delineie distintamente a extensão dos dendritos das células piramidais nós usamos ampliações mais altas para contar os contatos sinápticos e determinar a classe morfológica de cada espinha. Nós classificamos espinhas tanto como grandes e bulbosas ("cogumelo" M), curtas e grossas ("corpulentas", S), curtas e finas ("finas", T) ou filopodia (F). A comparação da densidade das espinhas por ramo de unidade apresenta uma ten-dência de diminuição da densidade das espinhas em neurônios desafiados que é muito melhorada no desafio com tratamento.

[00250] Juntos, esses resultados indicam o potencial para os déficits no número e estado de maturação dos contatos dendríticos para sustentar defeitos fun-cionais na transmissão excitatória, de uma maneira que pode ser tratada após a administração de G-2-MePE.

Plasticidade de Dominância Ocular (OD) em Camundongos Adultos MeCP2 +/- é Reduzida por G-2-MePE

[00251] Mudanças de desenvolvimento na plasticidade OD são controladas em parte pela ativação da via IGF-1 e a administração de (1-3)IGF-1 pode reduzir a plasticidade OD em camundongos jovens do tipo selvagem (Tropea e outros, 2006). Por isso, testamos se o tratamento G-2-MePE poderia estabilizar a plasticidade OD prolongada observada em mutantes adultos MeCP2. Camundongos fêmeas MeCP2 +/-, com idade P60 ou mais, são monocularmente privados por 4 dias e concomitantemente tratados com G-2-MePE. O tratamento com G-2-MePE reduz a plasticidade OD nos camundongos adultos MeCP2 +/-, indicando que, de fato, G-2- MePE pode induzir rapidamente a estabilização ou maturação da sinapse.

Bradicardia em Camundongos MeCP2-/ y é Tratada por G-2-MePE

[00252] Além de analisar a eficácia de G-2-MePE em amenizar os sintomas neurofisiológicos, buscamos caracterizar seus efeitos sobre a saúde geral do organismo. Evidência clínica e experimental mostra disfunções do sistema autôno-mo, tais como ritmos respiratórios instáveis e tônus vagal cardíaco de linha de base reduzido em pacientes com Síndrome de Rett (Julu e outros, 2001). A falta de con-trole dos mecanismos de feedback que regulam a homeostase da pressão arterial através do sistema nervoso simpático, por exemplo, diminuição da hiperventilação induzida na frequência cardíaca, é comum em pacientes com Síndrome de Rett e pode causar arritmias cardíacas fatais (Acampa e Guideri, 2006; Julu e outros, 2001).

[00253] A patogênese da disautonomia cardíaca, embora não seja bem compreendida, sugere que as conexões neuronais imaturas no tronco cerebral pode-riam ser a causa. Para analisar anormalidades do ritmo cardíaco nos camundongos MeCP2-/y e o efeito do tratamento com G-2-Mepe, nós monitoramos a taxa de pulso cardíaco em tempo real do tipo animal selvagem não-anestesiados e MeCP2-/y tra-tados com o veículo ou G-2-MePE. Os camundongos do tipo selvagem exibiram uma distribuição regular das medições de frequência cardíaca centradas perto de 750 batimentos por minuto. Em contraste, os camundongos MeCP2-/y exibem uma taxa cardíaca mais irregular, com uma taxa média mais baixa, cuja ocorrência é sig-nificativamente diminuída após tratamento com o G-2-Mepe.

Administração G-2-MePE Melhora a Atividade Locomotora e Expectativa de Vida

[00254] Camundongos MeCP2-/y desenvolvem sintomas semelhantes aos de Rett começando em 4-6 semanas de idade, quando eles progressivamente se tornam letárgicos, desenvolvem ataxia de marcha e morrem entre 10 e 12 semanas de idade (Chen e outros, 2001). Atividade locomotora de base é também regis- trada nos camundongos após 6 semanas, por contagem dos eventos de cruzamento de feixe de infravermelhos noturnos dentro de uma zona vedada. Camundongos no- cauteados MeCP2 (KO) apresenta níveis bastante reduzidos de atividade locomoto- ra em comparação com camundongos do tipo selvagem (WT), mas o tratamento com G-2-MePE (KO-T) eleva esses níveis.

[00255] Finalmente, comparados com ninhadas MeCP2 KO, os camun-dongos MeCP2-/ y ratados com G-2-MePE também mostram um aumento -50% na expectativa de vida (um aumento na taxa de sobrevivência de 0,5 de probabilidade).

[00256] Também medimos o efeito do tratamento com G-2-MePE no tamanho dos neurônios soma no hipocampo. Os camundongos são tratados com G-2- MePE como descrito acima para a atividade locomotora. O tamanho de soma nos neurônios na região CA3 do hipocampo é significativamente prejudicado nos animais MeCP2 KO em relação aos animais do tipo selvagem. O tratamento com G-2-MePE aumenta o tamanho médio do soma nos animais KO, porém tem pouco ou nenhum efeito sobre o tamanho físico em animais de tipo selvagem.

Exemplo 11: Efeito de G-2-MePE Oral sobre a Sobrevivência na Síndrome de Rett em Ratos

[00257] Uma vez que a síndrome de Rett é um transtorno crônico, debilitante, que envolve a perda de habilidades motoras, é desejável tratar a síndrome de Rett usando preparações facilmente administradas.Para este fim, pode-se tirar vantagem das propriedades terapêuticas e farmacocinéticas inesperadamente benéficas dos compostos G-2-MePE e compostos correlatos (Patentes US números 7.041.314, 7.605.177, 7.714.070, 7.863.309 e Pedidos US números 11/315.784 e 12/903.844).

[00258] Portanto, nós administramos G-2-MePE oralmente aos camun-dongos deficientes MeCP2 como descrito no documento US 2009/0074865. Resu-midamente, uma solução aquosa, uma emulsão de água em óleo (microemulsão, emulsão grosseira ou de cristal líquido), ou uma composição em gel contendo uma quantidade farmaceuticamente eficaz de G-2-MePE (20 ou 80 mg/kg por animal) é administrada diariamente. Nos animais de controle deficientes de MeCP2, nós admi-nistramos somente salmoura, e os animais do tipo selvagem são utilizados para ob-tenção de dados da linha de base semelhantes ao projeto de estudos descrito no Exemplo 8, acima.

[00259] Em animais de tipo selvagem, a sobrevivência é definida como sendo de100% em cada ponto de tempo. Em animais deficientes de MeCP2, a so-brevivência é reduzida substancialmente. No entanto, após a administração oral de G-2-MePE aos camundongos deficientes de MeCP2, a sobrevivência é significati-vamente aumentada.

Exemplo 12: Efeito de G-2MePE na Atividade das Convulsões na Síndrome de Rett em Camundongos

[00260] Uma vez que as convulsões são um aspecto de destaque, perigoso e difícil de tratar da Síndrome de Rett, nós determinamos os efeitos de G- 2MePE sobre a atividade de convulsão em animais deficientes de MeCP2. G-2- MePE pode ser eficaz no tratamento de atividade de convulsão em animais com a doença neurodegenerativa, (Patente US número 7.714.020). Portanto, realizamos experimentos para determinar se G-2-MePE também poderia tratar a atividade de convulsão em camundongos deficientes de MeCP2.

[00261] Registros eletroencefalográficos de camundongos do tipo selvagem e camundongos deficientes em MeCP2 tratados tanto com salmoura quanto G- 2-MePE são obtidos utilizando os métodos descritos na Patente US número 7.714.020.

[00262] Descobrimos que o G-2MePE pode ser eficaz na redução de ambas convulsões motoras e convulsões não-convulsivas.

Conclusões

[00263] Com base em nossos estudos in vivo e in vitro, em animais defi- cientes de MeCP2, nós concluímos que o G-2-MePE pode ser uma terapia eficaz para o tratamento de seres humanos com a síndrome de Rett. Além disso, uma vez que G-2-MePE tem uma meia vida inesperadamente mais longa que um composto que ocorre naturalmente ((1-3) IGF-1; a glicil-prolil-glutamato ou GPE) (figura 21), podemos concluir que a utilização de G-2-MePE tem vantagens distintas e substanciais em relação aos outros agentes farmacológicos, incluindo o GPE.

[00264] Por exemplo, G-2-MePE não é degradado pelas células gastrin-testinais, sendo absorvido pelas células gastrintestinais, e é ativo no sistema nervoso central depois da administração oral (Wen e outros, Pedido US número 12/283.684; Patente US número 2009/0074865, Patente US número 7.887.839, incorporada ao presente documento integralmente como referência), Por conseguinte, o G-2MePE não necessita de liberação por via intravenosa, por via subcutânea, por via intraventricular, ou por via parentérica. De fato, as formulações orais que com-preendem as microemulsões, dispersões grosseiras, preparações de cristal líquido, nanocápsulas e hidrogêis podem ser utilizados na fabricação de preparações admi-nistradas por via oral, tais como, comprimidos, cápsulas e géis que podem melhorar a função neurológica e tratar doenças neurodegenerativas (Patente US número 7.887.839). Os compostos da presente invenção podem ser utilizados em situações em que o funcionamento motor de um paciente está abaixo do necessário para en-golir uma comprimido ou uma cápsula. Existem vários tipos de géis solúveis para a administração oral de compostos, e estes podem ser utilizados para fornecer um composto ou composição da presente invenção a um paciente. Uma vez que G-2- MePE pode ser facilmente administrado por via oral e oralmente eficaz no tratamento de transtornos neurodegenerativos, incluindo a síndrome de Rett, nós concluímos que o G-2-MePE pode ser conveniente e vantajoso para a terapia de longa duração em pacientes com a síndrome de Rett.

[00265] Além disso, como a Síndrome de Rett compartilha característi- cas importantes com outros transtornos do espectro do autismo, os compostos desta invenção podem ser úteis para fornecer o benefício terapêutico em animais com outros ASD, e nos seres humanos com autismo, síndrome de Asperger, Transtorno Desintegrativo da Infância e Transtorno Invasivo do Desenvolvimento - Sem Outra Especificação (PDD-NOS).

Exemplo 13: Tratamento de CIA Modelo de Camundongo Deficiente de Shank3

[00266] Camundongos deficientes de shank-3 são utilizados no estudo como modelo de síndrome de deleção de 22q l3 associada com ASD.

[00267] A síndrome de deleção de 22q l3 tem sido associada às dele- ções ou mutações no gene Shank3 (Bonaglia e outros, 2006). Os códigos do gene shank3 de uma proteína scaffolding mestra constitui a estrutura em sinapses gluta- matérgicas (Boeckers e outros, 2006). Shank3 é uma parte essencial do núcleo da densidade pós-sináptica (PSD) e recruta diversos elementos funcionais importantes para o PSD e para a sinapse, incluindo componentes do ácido a-amino-3-hidroóxi-5- metil-4-isoxazol-propiônico (AMPA), glutamato metabotrópico (mGlu), e os receptores de glutamato do ácido N-metil-D-aspártico (NMDA), bem como elementos do citoesqueleto. Estudos recentes que exploram a taxa de eliminações de 22q l3/mutações de shank3 sugerem que a haploinsuficiência de shank3 pode causar uma forma monogênica de ASD com uma frequência de 0,5% a 1% dos casos de ASD (Durand e outros, 2007; Moessner e outros, 2007; Gauthier e outros, 2008).

[00268] A geração do modelo de camundongo com expressão interrompida de shank3 de comprimento total foi anteriormente descrita na arte (Bozdagi e outros, Molecular Autism 2010, 1:15., P4). Resumidamente, as células estaminais embrionárias Bruce4 C57BL/6 foram utilizadas para gerar uma linhagem de camun-dongo que tinha sítios loxP inseridos antes do éxon 4 e o éxon 9. O alelo floxado foi excisado e uma linhagem foi mantida com uma deleção dos éxons 4-9, ou seja, uma eliminação completa dos domínios de repetição de anquirina de Shank3. Camun-dongos heterozigotos (+/-) , do tipo selvagem (+/+) e nocauteados (-/-) foram produ-zidos com freqüências de Mendelianas a partir dos cruzamentos heterozigoto- heterozigoto. Uma redução de 50% do comprimento total do RNAm de Shank3 foi confirmada em heterozigotos (qPCR), bem como uma redução da expressão da pro-teína Shank3 por immunoblotting com anticorpo de Shank3 N69/46).

[00269] Os camundongos heterozigotos gerados pelo cruzamento de camundongos do tipo selvagem com heterozigotos são usados neste exemplo para melhor modelar a haploinsuficiência de Shank3, responsável pela síndrome de dele- ção de 22q l3.

Métodos Tratamento Medicamentoso

[00270] Camundongos do tipo selvagem, deficientes de Shank3 hetero- zigotos, de 1 a 3 meses de são divididos em quatro grupos de tratamento: tipo sel-vagem tratado com placebo, grupo deficiente de Shank3 tratado com placebo e dois grupos tratados com G-2-MePE deficientes de Shank3. Os animais recebem placebo (água) ou G-2-MePE formulado em água e administrado por via oral, b.i.d, durante 14 dias. G-2-MePE é administrado em duas doses: 15 ou 60 mg/kg.

Metodologia

[00271] Uma descrição mais detalhada da metodologia pode ser encontrada em Bozdagi e outros (Molecular Autism 2010, 1:15).

Análises Comportamentais

[00272] Avaliações comportamentais são realizadas em vários momentos, e incluem a análise das interações sociais e na comunicação social, ultrassôni- ca, de acordo com a metodologia descrita por Bozdagi e outros Resumidamente, as interações sociais entre macho e fêmea em cada grupo de tratamento são avaliadas. Os machos são alojados em grupo e testados individualmente em gaiolas limpas e com areia limpa. Cada seção de testes dura 5 minutos. Cada um dos camundongos é emparelhado com uma fêmea não familiar estro C57BL/6J feminino. Uma câmara digital de televisão de circuito fechado (Panasonic, Secaucus, New Jersey, US) é colocada na horizontal a 30 cm do compartimento. Um microfone ultrassônico (Cáp-sula de microfone condensador Avisoft UltraSoundGate CM 15; Avisoft Bioacústica, Berlim, Alemanha) é montado 20 cm acima da gaiola. Frequência de amostragem para o microfone é de 250 kHz, e a resolução é de 16 bits. Embora o equipamento utilizado não possa distinguir entre os sinais emitidos pelo macho ou sua parceira, a preponderância de sinais durante as interações macho-fêmea em camundongos é normalmente emitida pelo sexo masculino. Todo o aparelho estava contido em uma câmara ambiental de atenuação de som (ENV-018V; Med Associates, St Albans, VT, USA), iluminado por uma única luz vermelha de 25 Watt. Vídeos dos indivíduos do sexo masculino são posteriormente marcados por um investigador desinformado do genótipo do indivíduo e grupo de tratamento em medidas de farejamento nariz-a- nariz, farejamento nariz-ao-anogenital e farejamento de outras regiões do corpo usando o software Observer Noldus (Noldus Information Technology, Leesburg, VA, USA). Vocalizações ultrassônicas são identificadas manualmente por dois investiga-dores altamente treinados e sem conhecimento das informações de genótipo/grupo de tratamento, e as estatísticas de resumo são calculadas usando o pacote Avisoft. A confiabilidade interavaliadores é de 95%. Os dados são analisados utilizando test-t de Student não emparelhado.

[00273] Teste de habituação/desabituação olfatória é conduzido em ca-mundongos machos e fêmeas para cada grupo. A metodologia é tal como descrita anteriormente (Silverman e outros, 2010, Yang e outros 2009 e Silverman e outros 2010). Odores não-sociais e sociais são apresentados em uma série de cotonetes inseridos na gaiola sequencialmente, cada um por 2 minutos, na seguinte ordem: água, água, água (água destilada), amêndoa, amêndoa, amêndoa (1:100 diluição do extrato de amêndoa), banana, banana, banana (1:100 diluição de aroma de banana artificial); social 1, social 1, social 1 (varrido do fundo de uma gaiola de alojamento de camundongos B6 sexo combinado, não familiares); e social 2, social 2, social 2 (varrido do fundo e uma segunda gaiola de alojamento de camundongos 129/SvImJ, desconhecidos, sexo combinado). Medidas ANOVA repetidas de uma direção são realizadas dentro de cada grupo de tratamento para cada conjunto de eventos de habituação e cada evento de desabituação, seguido de um teste post hoc de Tukey.

Eletrofisiologia de Fatias Hipocambais

[00274] Fatias hipocambais agudas pós mortem (350 μm) são preparadas a partir de camundongos, usando um cortador de tecidos. As fatias são mantidas e experimentos são realizados em 32°C. As fatias são perfundidas com uma solução de Ringer que contém (em mM): NaCl, 125,0; C1, 2,5; MgSO4, 0,31; NaH2PO4, 0,0 1; NaHCO3, 26,2; CaCl2, 2,5; glicose, 11,0. A solução de Ringer é borbulhada com 95% de O2/5% de CO2, a 32°C, durante os registros extracelulares (solução eletrodo: 3 M NaCl). Fatias são mantidas por 1 hora antes do estabelecimento de uma base de potenciais pós-sinápticos excitatórios de campo (fEPSPs) registrados do estrato radiatum na área de CA1, evocada por estimulação dos aferentes comissurais-colaterais de Schaffer (100 μs pulsos a cada 30 segundos) com eletrodos de tungstênio bipolar colocados na área CA3. A intensidade do estímulo de teste é ajustada para se obter fEPSPs com amplitudes que são metade da resposta máxima. A inclinação inicial de EPSP (mV/MS) é determinada a partir da forma de onda média de quatro respostas consecutivas. Curvas de entrada-saída (I/O) são geradas por colocação em gráfico da inclinação de fEPSP versus amplitude de fibra volley em solução de Mg2+ baixo (0,1 mM). As relações de I/O mediado por receptor NMDA e mediado por receptor AMPA são medidas na presença de antagonistas de receptor de glutamato ionotrópico: ácido 2-amino-2-fosfonopantanóico APV (50 μM) e 6-ciano-7-nitroquinoxalina-2,3-diona CNQX (100 μM). Respostas de pulsos empa- relhados são medidas com intervalos interestímulos de 10 a 200 ms, e são expressas como a razão entre as respostas médias para o segundo pulso de estimulação em relação ao primeiro pulso de estimulação.

[00275] LTP é induzida, quer por um estimulo de alta frequência (quatro trens de 100 Hz, estimulação de 1 seg. separada por 5 min.), ou por estimulação teta-rajada (TBS) (10 rajadas de quatro impulsos a 100 Hz separadas por 200 ms), ou por uma única estimulação de 100 Hz, para camundongos de controle e geneticamente modificados. Para induzir depressão a longo prazo (LTD), colaterais Schaffer são estimulados por uma baixa frequência ou estímulo de frequência baixa (900 pulsos em 1 Hz por 15 min.) para induzir LTD dependente de receptor de mGlu. Os dados são expressos como média ± SD, e análises estatísticas são realizadas através da análise de variância (ANOVA) ou teste t de Student, com ajuste de significân- cia a um nível α de 0,05.

Resultados Comportamental

[00276] Duração cumulativa de farejadas sociais totais por camundongos machos de teste é inferior no grupo deficiente de Shank3 tratado com placebo que no grupo do tipo selvagem tratado com placebo. Além disso, poucas vocalizações ultrassônicas são emitidas pelo grupo deficiente de Shank3 tratado com placebo que pelos controles do tipo selvagem durante as interações sociais de macho-fêmea.

[00277] Tratamento com G-2-MePE nos dois grupos deficientes de Shank-3 resulta em um aumento significativo na duração cumulativa de farejadas sociais totais em comparação com o grupo deficiente de Shank3 tratado com placebo. Além disso, os grupos tratados com G-2-MePE exibem um maior número de vocalizações ultrassônicas que o grupo mutante tratado com placebo.

[00278] No estudo da habituação/desabituação olfativa, destinado a con-firmar que os camundongos são capazes de detectar feromônios sociais, todos os quatro grupos apresentam níveis normais de habituação (indicado pela diminuição do tempo gasto farejando a sequência dos três mesmos odores), e a desabituação esperada (indicada pelo tempo gasto aumentado farejando odores diferentes).

Eletrofisiologia

[00279] A colocação em gráfico da inclinação em potencial pós sináptica excitatória (fEPSP) versus intensidade de estímulo demonstra uma redução nas cur-vas de I/O no grupo deficiente de Shank3 tratado com placebo versus grupo de con-trole. No grupo heterozigoto tratado com placebo observamos também uma diminui-ção nos potenciais de campo mediados por receptor AMPA, refletida em um decrés-cimo de 50% na inclinação média da função I/O em comparação com o grupo de controle do tipo selvagem. Em contraste, quando a relação de IO for analisada na presença do antagonista competidor AMPA/receptor de cainato CNQX para medir a função do receptor de NMDA sináptico, não existe nenhuma diferença entre os gru-pos heterozigotos tratados de tipo selvagem e placebo. Esses resultados indicam que há uma redução específica na transmissão basal mediada por receptor de AMPA nos camundongos heterozigoto Shank3.

[00280] Tratamento com G-2-MePE em ambos os grupos heterozigotos normaliza os potenciais de campo mediados por receptores de AMPA e provoca um aumento da inclinação média da função de I/O em comparação com o grupo defici-ente de Shank3 tratado com placebo.

[00281] A manutenção da LTP no grupo deficiente de Shank3 tratado com placebo é claramente prejudicada em comparação com o controle do tipo selvagem. Testes LTP TBS (10 rajadas de quatro pulsos a 100 Hz separadas por 200 ms) também mostram uma diminuição significativa na potenciação a 60 min. após TBS eno grupo deficiente de Shank3 tratado com placebo. Em contraste com a plas-ticidade sináptica alterada observada com LTP, a depressão de longo prazo (LTD) não foi alterada significativamente no grupo de mutantes. Tratamento com G-2- MePE aumentou a potenciação de longo prazo do hipocampo (LTP) e sua manuten-ção em ambos o grupo deficiente de Shank3 em comparação ao grupo deficiente de Shank3 tratado com placebo.

Discussão

[00282] Competências sociais fracas e comportamentos repetitivos são as características comuns e medidas de diagnóstico fundamentais de todas as formas de ASD. Desenvolvimento intelectual retardado e competências linguísticas subdesenvolvidos também são uma característica comum presente em todos os ASD, excluindo a síndrome de Asperger.

[00283] Os modelos animais descritos acima foram aceitos na técnica como demonstrando sintomas semelhantes às condições clínicas humanas. Todos os modelos mutantes discutidos acima (NLGN3, NLGN4, CADM 1, NRXN 1, FMR1, shank3) exibem habilidades sociais prejudicadas ou aumento da ansiedade social. A transmissão excitatória diminuída no hipocampo foi identificada em modelos animais mutantes NRXN 1, shank3, MeCP2 e FMR1. Atualmente, não foram descritos mode-los poligenéticos ou multifatorial de ASD. Os modelos animais descritos acima, com base em anomalias genéticas que são conhecidas por produção de ASD na popula-ção humana, proporcionam a melhor oportunidade de testar a eficácia das terapias de ASD.

[00284] Por conseguinte, a eficácia de G-2-MePE em modelos animais de ASD é razoavelmente preditiva da sua eficácia em um ser humano que sofre de ASD.

Exemplo 14: Tratamento com G-2-MePE Altera a Morfologia dos Neurônios em um Modelo In vitro de Síndrome de Rett

[00285] Para testar os efeitos de G-2-MePE na morfologia neuronal, foi utilizado um modelo in vitro de RTT descrito em Marchetto e outros, A model for de-velopment and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells, Cell 143:527-539 (2010) (incluindo informação suplementar). O modelo utiliza células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) geradas a partir de fibroblastos de pacientes humanos com RTT transportando diferentes mutações MeCP2.

Métodos Cultura de Células e Infecção por Retrovírus

[00286] Fibroblastos RTT (transportando quatro mutações distintas MeCP2) e fibroblastos de controle são gerados a partir de explantes de biópsias dérmicas. O shRNA contra gene MeCP2 alvo é clonado no vetor lentivírus Lenti- Lox3.7 (como descrito em Marchetto e outros.). Os fibroblastos são infectados com vetores retrovirais (reprogramação Sox2, Oct4, c-Myc e Kl4). Dois dias após a infecção, os fibroblastos são semeados em fibroblastos embrionários de camundongo inativados mitoticamente com meio hESC. Após 2 semanas, as colônias de iPSC que emergem do fundo dos fibroblastos são colhidas manualmente e transferidas para as condições isentas de alimentador nas placas revestidas com matrigel (BD) utilizando meio de cultura de células-tronco embrionárias mTeSR™ (Stem Cell Technologies) e várias passagens manualmente. Perfis de expressão gênica dos clones gerados são medidos através das arrays (séries) de genoma humano Affyme- trix Gene Chip™ para confirmar que a reprogramação é bem sucedida.

Diferenciação Neural: NPCs e Neurônios Maduros

[00287] Para obter células progenitoras neurais (NPCs), corpos embriói- des (EBs) são formados pela dissociação mecânica de grupos de células e colocação em placas de baixa aderência em meio hESC sem FGF2 por 5-7 dias. Depois disso, os EBs são colocados sobre placas revestidas de poli-ornitina/laminina em meio DMEM/F12 mais meio N2 (suplemento isento de soro para o crescimento e expressão de células pós-mitóticas). As rosetas resultantes são coletadas após 7 dias e dissociadas com Accutase e semeadas em placas revestidas com meio NPC (DMEM/F12; 0,5X N2; 0,5X B27 e FGF2). Populações homogêneas de NPCs são alcançadas após 1-2 passagens com Accutase na mesma condição. Para obter os neurônios maduros, aos EBs flutuantes são tratados com 1 μM ou ácido retinóico, durante 3 semanas (fornecendo o tempo total de diferenciação de 4 semanas). Os EBs maduros são dissociados com papaína e DNAse por 1 hora a 37°C e colocados em placas revestidas com poli-ornitina/laminina em meio NPC sem FGF2. Tratamento com G-2-MePE Culturas neuronais de RTT são tratadas com G-2-MePE (1 nM-10 μM) por 1 semana.

Imunocitoquímica e Quantificação de Morfologia Meuronal

[00288] As células são fixadas em aldeído parafórmico a 4% e permeabi- lizadas com 0,5% de Triton X-100 em PBS. As células são então bloqueadas com PBS contendo 0,5% de Triton X-100 e soro de burro a 5% por 1 hora à temperatura ambiente. Sinais fluorescentes são detectados utilizando um microscópio invertido Zeiss e as imagens são processadas com Photoshop CS3. Os seguintes anticorpos primários são utilizados: TRA- -60, TRA-1-81 (1:00), Nanog e Lin28 (1:500), nestina humana (1:100), Tuj-1 (1:500), Map2 (1:100); MeCP2 (1:1000); VGLUT1 (1:200), Psd95 (1:500), GFP (1: 200), Soxl (1: 250), Mushasi l (1: 200) e me3H3 27 (1:500). O tamanho do soma celular é medido utilizando um software adequado (por exemplo, ImageJ), após a identificação de neurônios que utilizam o Syn :: EGFP™. A morfologia dos dendritos neuronais e as espinhas são estudadas a partir de uma projeção individual de seções ópticas de pilhas-z e digitalizadas em incrementos de 0,5 μm que se correlacionam com a resolução avaliada no plano z. Cada seção ópti-ca é o resultado de 3 varreduras em 500 lps seguido de filtragem por Kalman. Para a quantificação da sinapse, as imagens são tomadas por uma etapa z de 1 μm usando microscópio confocal Biorad radiance 2100™. A quantificação da sinapse é realiza-da sem conhecimento em relação ao genótico. Apenas os pontos VGLUTI juntamen-te com processos Map2-positivos são contados. O significado estatístico é testado usando teste ANOVA de dois sentidos e pós-teste Bonferroni.

Imageamento d Cálcio

[00289] Redes neuronais derivadas de iPSCs humanos são infectadas com o vetor lentivírus transportado o construto repórter Syn:DsRed. As culturas celulares são lavadas duas vezes com tampão Krebs HEPES estéril (KHB) e incubadas com 2-5 μm de Fluo-4AM™ (Molecular Probes/Invitrogen, Carlsbad, CA), em KHB durante 40 minutos à temperatura ambiente. O excesso de corante é removido por lavagem duas vezes com KHB, e um adicional de 20 minutos de incubação é realizado para equilibrar a concentração de corante intracelular e permitir desesterifica- ção. Sequências de imagens de tempo decorrido (aumento de 100X) de 5.000 quadros são adquiridas em 28 Hz com uma região de 336 x 256 pixels, usando uma Hamamatsu ORCA-ER™, câmera digital (Hamamatsu Photonics K.K., Japão) com filtro de 488 nm (FITC) em um microscópio confocal de fluorescência invertida Olym-pus (Olympus Optical, Japão). As imagens são adquiridas com MetaMorph 7.7™ (MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA). As imagens são subsequentemente processadas utilizando o ImageJ™ e as rotinas escritas personalizadas em Matlab 7,2 ™ (Mathworks, Natick, MA).

Eletrofisiologia

[00290] Registros patch clamp de célula integral são realizados de células co-cultivadas com astrócitos após 6 semanas de diferenciação. O banho é cons-tantemente perfundido com salmoura tamponada HEPES fresca (vide métodos complementares para a receita). As micropipetas de registro (resistência de ponta 36 MQ) são preenchidos com solução interna descrita nos materiais suplementares. Os registros são realizados usando amplificador Axopatch 200B™ (Axon Instruments). Os sinais são filtrados em 2 kHz e amostrados a 5 kHz. A capacitância de célula integral é totalmente compensada. A resistência em série é descompensada, porém monitorada durante o experimento por a amplitude da corrente capacitiva, em resposta a um pulso de 10 mV. Todos os registros são efetuados à temperatura am-biente e os produtos químicos são adquiridos na Sigma. Frequência e amplitude das correntes pós-sinápticas espontâneas são medidas com o software Mini Analysis Program™ (Synaptosoft, Leonia, NJ). Comparações estatísticas de grupos WT e RTT são feitas usando o teste bicaudal de Kolmogorov-Simirnov não não- paramétrico com um critério de significado de p = 0,05. EPSCs são bloqueados por CNQX e DNQX (10-20 μm) e IPSPs são inibidos por bicuculina (20 μM).

Resultados

[00291] Neurônios derivados de RTT iPSC são caracterizados por diminuição do número de sinapses glutamatérgicas, redução da densidade da espinha e tamanho menor do soma. Os neurônios RTT também mostram certos defeitos eletro- fisiológicos, ou seja, uma diminuição significativa na frequência e na amplitude das correntes sinápticas espontâneas quando comparados aos controles. Os neurônios RTT mostram uma frequência menor de transições de cálcio intracelular.

[00292] Nós testamos G-2-MePE no modelo acima, para testar se alguma das patologias do fenótipo de TTR poderia ser atenuada.

[00293] O tratamento das culturas de células com cada concentração de medicamento melhora todos os parâmetros morfológicos e fisiológicos das culturas celulares de RTT tratadas, em comparação com os controles não tratados TTR. Mais especificamente, observa-se um aumento significativo no número de sinapses glu- tamatérgicas nas células tratadas com RTT L-2-MePE. Todas as concentrações de tratamento com G-2-MePE aumentam o número de pontos de VGLUT1 nos neurô-nios derivados de RTT. O tratamento de G-2-MePE normaliza a frequência e ampli-tude das correntes pós-sinápticas espontâneas, bem como a frequência transitória de cálcio gerada pela atividade sináptica dos neurônios RTT tratados com G-2- MePE.

[00294] No presente modelo in vitro de TTR humano, as iPSCs deriva- das de pacientes RTT e neurônios diferenciados a partir deles são caracterizados por anormalidades na expressão MeCP2. Como foi discutido na descrição detalhada da invenção acima, a grande maioria dos casos RTT está associado a mutações do gene MeCP2. Por conseguinte, a eficácia de G-2-MePE no presente modelo in vitro de TTR no ser humano é razoavelmente preditiva da sua eficácia em um indivíduo humano que sofra de TTR.

Exemplo 15: Efeitos do G-2-MePE em Seres Humanos com Síndrome de Rett Métodos

[00295] Trinta indivíduos com Síndrome de Rett são recrutados. Os indi-víduos são do sexo feminino e com idades compreendidas entre 16 e 29 anos (média = 12,1 SD = 4,4). Todos os indivíduos têm um IQ <60 e mutações do gene MECP2. Indivíduos também mostram atividade spike éter no EEG ou um aumento nas faixas mais baixas de frequência do EEG detectadas por Transformada Rápida de Fourier (FFT). Os indivíduos são instruídos de que medicações concomitantes devem ser estáveis durante pelo menos seis semanas antes do estudo. Indivíduos recebendo medicação para tratar sinais de desatenção são testados na parte da manhã e instruídos para tomar a medicação durante a tarde. Indivíduos com intervalo QTc> 451 mseg. são excluídos.

[00296] O estudo é um duplo-cego placebo controlado, randomizado paralelo com três doses de placebo, 10 mg/kg três vezes por dia por via oral G-2- MePE durante cinco dias, ou de 30 mg/kg, três vezes por dia por via oral de G-2- MePE.

[00297] Os indivíduos são testados na linha de base, utilizando os seguintes instrumentos: The Rett Syndrome Natural Historry/Clinical Severity Scale, Aberrant Behavior Checklist Community Edition(ABC), Vinelands, Clinical Global Impression of Severity (CGI-S) e seus cuidadores preencheram o Caregiver Strain Questionnaire (CSQ).

[00298] Os indivíduos são trazidos para clínica em ambiente hospitalar para permitir os registros de referência iniciais de EEG, ECG e frequência respiratória de forma contínua por 24 horas usando a tecnologia de polissonografia. Os movimentos das mãos também são registrados usando o Q-Sensor™. Medidas de EEG derivadas incluem: espigas por unidade de tempo em EEG, a energia total das faixas de frequência de EEG, QTc e variabilidade de frequência cardíaca (HRV), e as irregularidades respiratórias.

[00299] Os eventos adversos também são registrados usando as medidas de segurança padrão e a elicitação SMURF de eventos adversos

[00300] Estatisticamente, o efeito do tratamento com G-2-MePE é analisado através da realização de uma análise repetida de covariância (ANCOVA) com o efeito do tratamento sobre as alterações das contagens de base.

Resultados

[00301] O tratamento com G-2-MePE não produz mais efeitos adversos que aqueles presentes durante o tratamento com placebo, com todos os efeitos adversos sendo de curta duração e severidade moderada. Não há relato de eventos adversos graves. Não há relato de casos de aumento de QTC. Sem efeitos são vistos na frequência respiratória ou variabilidade da frequência cardíaca.

[00302] O tratamento com G-2-MePE produz uma redução global significativa de espigas por unidade de tempo no EEG. O tratamento com 30 mg/kg, três vezes por dia por via oral de G-2-MePE diminui a atividade de pico comparado com o placebo. Essa dose de G-2-MePE também diminui a potência da banda delta do EEG em comparação com o placebo.

[00303] O tratamento com G-2-MePE também reduz movimentos totais de mão por período de 24 horas como contado utilizando o dispositivo Q-sensor™. Esse efeito é significativo para uma dose de 30 mg de T.I.D comparação com o pla- cebo.

[00304] O tratamento com G-2-MePE não reduz o efeito significativo total no Rett Syndrome Natural Historry/Clinical Severity Score. Contudo, 30 mg/kg de T.I.D. G-2-MePE oral, em comparação ao placebo, produz efeitos significativos nas subescalas que se seguem: "Nonverbal Communication at this visit by exam"; "Epi- lepsy/Seizures at this visit: and "Hand use".

Conclusões

[00305] O tratamento com G-2-MePE produz melhorias significativas na função do sistema nervoso central no presente estudo. Apesar do tratamento de prazo relativamente curto, anormalidades na atividade elétrica do cérebro são redu-zidas, um sinal claro de eficácia. Este efeito é dependente da dose, observado após tratamento com 30 mg/kg, três vezes por dia por via oral de G-2-MePE. Estes efeitos refletem as melhorias na função do CNS vistas no modelo de camundongo transgê- nico nocauteado por MECP2 de síndrome de Rett, após a administração de G-2- MePE.

[00306] Efeitos dependentes de dose também são vistos no uso das mãos, como avaliado por um dispositivo de contagem objetiva e avaliação subjetiva. Isso é de interesse porque a pressão sem importância das mãos é característica tanto para o fenótipo clínico da Síndrome de Rett e é exclusivo para esse transtorno. Essa medida avalia principalmente o contato visual. Isto levanta a possibilidade de que o tratamento a longo prazo com G-2-MePE pode melhorar relacionamento social na população.

[00307] G-2-MePE é bem tolerado nessa população. Nenhum efeito é visto tanto em medidas padrão ou áreas de interesse específico na população de pacientes, tais como prolongamento do intervalo QT ou apnéia.

Exemplo 16: Efeitos do G-2MePE em Seres Humanos com Transtornos do Espectro de Autismo Métodos

[00308] Para determinar se o G-2-MePE pode tratar os sintomas da ASD, realizamos um estudo em seres humanos com ASD. Vinte indivíduos com transtorno do espectro do autismo são recrutados. Os indivíduos são do sexo masculino e com idade entre 16 e 65 anos (média = 18,1 SD = 3,4). Todos os indivíduos têm um IQ > 60 e rigoroso diagnóstico DSM-IV-TR de Transtorno do Autismo ou Transtorno de Asperger. Os indivíduos também satisfazem os critérios para um transtorno do espectro do autismo segundo os documentos ADI-R e ADOS-G e cumpre os critérios propostos de DSM- V ara e transtorno do espectro do autismo. Os indivíduos são instruídos de que medicações concomitantes devem ser estáveis durante pelo menos seis semanas antes do estudo. Indivíduos recebendo medicação para tratar sinais de desatenção são testados na parte da manhã e instruídos para tomar a medicação durante a tarde. Indivíduos que são melhor tratados com medicamentos antipsicóticos atípicos indicados para o autismo são excluídos. Os indivíduos são selecionados quanto a doenças genéticas conhecidas, incluindo e aqueles com Síndrome do X Frágil ou esclerose tuberosa que são excluídos. Indivíduos com epilepsia não controlada são excluídos.

[00309] O estudo é um estudo cruzado controlado com placebo, duplo- cego com três fases. Indivíduos entram em cada fase do cruzamento em uma ordem aleatória. Nas fases de teste, os indivíduos recebem tanto placebo, 10 mg/kg por via oral T.I.D G-2-MePE durante cinco dias ou 30 mg/kg, três vezes por dia por via oral de G-2-MePE. Cada fase do cruzamento é separada por um período de lavagem de 14 dias.

[00310] Os indivíduos são testados na linha de base, utilizando os seguintes instrumentos: Wechsler IQ, Abberant Behavior Checklist Community Edition (ABC), Vinelands, Yale-Brown Obsessive Compulsive Scale (YBOCS) compulsion subscale, Social Responsiveness Scale (SRS), Clinical Global Impressiono of Seve- rity (CGI-S) e seus cuidadores preenchem o Caregiver Strain Questionnaire (CSQ).

[00311] Os indivíduos recebem duas tarefas - a Reading the Mind in the Eyes Test - Revised (RMET) e tarefa de Eye Tracking (ET) bem como Clinical Global Impression of Improvement (CGI-I). As tarefas começam duas horas após a ad-ministração de placebo ou qualquer dose de LG2-MePE. A RMET é uma tarefa ba-seada em computador que avalia a habilidade de ler as emoções dos olhos a partir de expressões faciais sutis e afetivas e é um teste amplamente utilizado de reco-nhecimento de emoções em pacientes com autismo (2001). Importante, a RMET é capaz de detectar a melhoria mesmo com uma dose única de um agente farmacoló-gico (Guastella e outros, 2010). As questões de rastreamento ocular são caracterís-ticas de pacientes com autismo que passam menos tempo a olhar para os olhos de fotografias de rostos humanos. Novamente, uma única administração de uma inter-venção farmacológica pode melhorar os olhos nas faces humana no autismo (Andari e outros, 2010).

[00312] Os eventos adversos também são registrados com as medidas de segurança padrão.

[00313] Estatisticamente, o efeito do tratamento com G-2-MePE é analisado através da realização de uma análise repetida de covariância (ANCOVA) com o efeito do tratamento sobre as alterações das contagens de base.

Resultados

[00314] O tratamento com G-2-MePE não produz mais efeitos adversos que aqueles presentes durante o tratamento com placebo, com todos os efeitos adversos sendo de curta duração e severidade moderada. Não são relatados eventos adversos graves.

[00315] O tratamento com G-2-MePE produz uma melhoria global signi-ficativa no desempenho do teste RMET. O tratamento com 30 mg/kg, três vezes por dia por via oral de G-2-MePE aumenta a porcentagem das respostas corretas no RMET.

[00316] O tratamento com G-2-MePE produz uma melhoria significativa no tempo total gasto olhando para a região do olho no teste de ET. Classificações CGI-I no final de períodos de tratamento mostram uma diferença significativa. Efeitos positivos do tratamento são correlacionados com classificações CSQ da linha de base.

Conclusões

[00317] O tratamento com G-2-MePE produz melhorias significativas no teste de Reading the Mind in the Eyes - Revisto e no desempenho de uma tarefa de rastreamento ocular.Este efeito é dependente da dose, observado após tratamento de 30 mg/kg, três vezes por dia por via oral de G-2-MePE.

[00318] Melhoria nessas medidas é o reflexo de uma melhoria no pro-cessamento de processamento de informação social. Déficits de interação social são um sintoma do núcleo de diagnóstico para transtornos do espectro do autismo, e esta é, portanto, uma descoberta importante.

[00319] G-2-MePE também produz uma melhoria geral na função como indexado por Clinical Global Impression of Improvement. Anotação de texto livre do Case Report Forms do estudo indica que esse efeito está relacionado a um aperfei-çoamento nos relacionamentos sociais. Isto implica que as mudanças observadas em RMET e tarefa ET podem ter relevância para a atividade social na vida cotidiana. G-2-MePE é bem tolerado nesta população.

Exemplo 17: Modelos Animais para a Determinação dos Efeitos de G-2- MePE no s Transtornos do Espectro do Autismo

[00320] Os efeitos do G-2-MePE são ainda testados nos seguintes modelos genéticos de ASD: o camundongo heterozigoto Tbx1, o camundongo nocaute- ado Cntnap2 e o camundongo nocauteado Slc9a6. G-2-MePE também é testado no modelo de camundongo nocauteado fmrl da Síndrome do X Frágil.

[00321] Tbxl. Mutations of the TBXI gene are associated with Autism Spectrum Disorders (Paylor e outros, 2006). Transgenic Tbxl mice are selectively impaired in social interaction, ultrasonic vocalization, repetitive behaviors and work-ing memory (Hiramoto e outros., 2011).

[00322] Cntnap2. Two-thirds of patients with mutations of the contactin associated protein-like 2 (CNTNAP2) gene are diagnosed with an Autism Spectrum Disorder (Alarcon e outros, 2008; Arking e outros, 2008; Bakkaioglu e outros, 2008; Strauss e outros, 2006; Vernes e outros, 2008). Cntnap2 knockout (KO) mice exhibit ASD-related phenotypes in social behavior, ultrasonic vocalization and repetitive be-haviors (Penagarikano e outros, 2011).

[00323] Slc9a6. This gene has been implicated in syndromic ASD and encodes the sodium hydrogen exchanger 6 (NHE6). Mutations in SLC9A6 are asso-ciated with intellectual disability (Gilfillan e outros, 2008) and autistic behavior (Garbem e outros, 2010). On S1c9a6 KO mice exhibit motor hyper-activity and cere-bellar dysfunction (Stromme e outros, 2011).

[00324] Fmrl. Silencing of the FMRI gene produces Fragile X Syndrome, the phenotype of which includes autism; two thirds of patients with Fragile X Syndrome meet screening criteria for an Autism Spectrum Disorder (Harris e outros, 2008). Pediatric patients with Fragile X Syndrome also show lowered seizure threshold. The fmrl knockout mouse replicates much of the phenotype of Fragile X Syndrome, including juvenile seizure susceptibility (Van e outros, 2004).

Métodos

[00325] Os animais em cada um dos modelos acima são gerados de acordo com a metodologia descrita na literatura citada. Equivalentes de tipo selvagem são também obtidos para cada modelo genético.

[00326] Os animais em cada modelo são divididos em três grupos (n = 10 e n = 20): camundongos de tipo selvagem tratados com placebo, o grupo mutante tratado com G-2-MePE e o grupo de controle mutante tratado com placebo. Os tra-tamentos são administrados por via intraperitoneal: placebo (soro fisiológico) ou 20 mg/kg dia de G-2-MePE.

[00327] Medidas de características-chave do ASD como apresentadas em cada modelo são tomadas de acordo com a literatura citada.

Resultados

[00328] O tratamento com G-2-MePE melhora significativamente todas as medidas associadas ao fenótipo ASD.

Referências

[00329] As seguintes referências e todas as patentes, pedidos de patentes e outras publicações citadas aqui estão incorporadas por referência.

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Claims (15)

1. Uso de Glicil-2-metil-L-prolil-L-glutamato (G-2-MePE) CARACTERIZADO pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para tratar um ser humano tendo um transtorno do espectro do autismo (ASD).

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito ASD é selecionado do grupo consistindo em autismo, síndrome do cro-mossomo X frágil, síndrome de Rett (RTT), transtorno do autismo, síndrome de As-perger, transtorno desintegrativo da Infância e transtorno invasivo do desenvolvi-mento sem outra especificação (PDD-NOS), e evitação de exigência patológica (PDA).

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito G-2-MePE é formulado para administração sistêmica, parenteral ou diretamente no cérebro.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito G-2-MePE é formulado para administração em um ventrículo do cére-bro.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito G-2-MePE é formulado para administração através de uma via intrave-nosa, subcutânea ou oral.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito G-2-MePE é formulado para administra-ção oral.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito G-2-MePE está em uma solução aquosa fisiologicamente compatível, micro-emulsão de água em óleo, emulsão grosseira de água em óleo, cristal líquido de água em óleo, nanocápsulas, ou comprimidos.

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito G-2-MePE é incorporado em um gel so-lúvel em uma solução aquosa.

9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito G-2-MePE é formulado para administra-ção em uma mucosa do dito ser humano.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito gel é formulado para ser colocado na boca do dito ser humano.

11. Uso de um composto de Fórmula 1 ou Fórmula 2, CARACTERIZADO pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para tratar um ser humano tendo um transtorno do espectro do autismo (ASD):

onde m é 0 ou 1; n é 0 ou 1; X é H ou -NR6R7; Y é H, alquila, -CO2R5, ou -CONR6R7; Z é H, alquila, -CO2R5 ou -CONR6R7; R1 é H, alquila, ou aralquila; R2, R3 e R4 são, independentemente, H ou alquila; cada R5 é independentemente H, alquila, ou um resíduo de álcool graxo; cada R6 e R7 é independentemente H, alquila, ou aralquila, ou -NR6R7 é pir- rolidina, piperidina, ou morfolina; ou uma lactona formada quando um composto onde Y é -CO2(alquila) e Z é - CO2H ou onde Y é -CO2H e Z é -CO2(alquila) é lactonizado; e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, contanto que o composto não seja GPE, N-Me-GPE, amida de GPE, APE, GPQ ou um sal do mesmo; em que alquila significa um grupo hidrocarbila linear saturado tendo de um a seis átomos de carbono, ou um grupo hidrocarbila saturado cíclico ou ramificado tendo de três a seis átomos de carbono; e em que aralquila significa um grupo da fórmula -(CH2)1-2Ar, onde Ar é um anel aromático heterocíclico ou carbocíclico de 5 ou 6 membros, opcionalmente substituído com 1 a 3 substituintes selecionados de Cl, Br, -OH, -O-alquila, -CO2R8 (em que R8 é H ou alquila), ou -NR8R9, em que R9 é H ou alquila.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que: (a) os compostos são compostos da Fórmula 1; (b) m é 0; (c) n é 1; (d) X, Y, R1, R2, R3, R4 ou R5, ou qualquer combinação dos mesmos, não é hidrogênio; (e) X é -NR6R7; e (f) Y é -CO2R5 ou -CO2NR6R7; e (g) Z é -CO2R5 ou -CO2NR6R7.

13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito medicamento compreende, ainda, um segundo agente terapêutico selecionado a partir de um grupo consistindo em: fator de crescimento semelhante à insulina I (IGF-I), fator de crescimento semelhante à insulina II (IGF-II), glicil-prolil-glutamato (GPE), fator de crescimento transformante- β1, ativina, hormônio do crescimento, fator de crescimento neural, fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), proteína de ligação do hormônio do crescimento, prote-ínas de ligação IGF (especialmente a IGFBP-3), fator de crescimento de fibroblastos básico, fator de crescimento de fibroblastos acídico, o produto do gene de hst/Kfgk, FGF-3, FGF-4, FGF-6, fator de crescimento de queratinócito, fator de crescimento induzido por androgênio, int-2, fator homólogo 1 ao fator de crescimento de fi- broblastos (FHF-1), FHF-2, FHF-3 e FHF-4, fator de crescimento de ceratinócitos 2, fator de ativação de células gliais, FGF-10 e FGF-16, fator neurotrófico ciliar, fator de crescimento derivado do cérebro, neurotrofina 3, neurotrofina 4, proteína morfogené- tica óssea 2 (BMP-2), fator neurotrófico derivado da linhagem de células gliais, fator neurotrófico dependente da atividade, fator inibidor da leucemia citocina, oncostatina M, interleucina, α-, β-, Y- ou interferon de consenso, TNF-α, clometiazol; ácido cinu- rênico, Semax, tacrolimos, L-treo-l-fenil-2-decanoilamino-3-morfolino-1-propanol, análogo a andrenocorticotropina (4-9) [ORG 2766], dizolcipina (MK-801), selegilina; mematina (Namenda) NPS1506, GV1505260, MK-801, GV150526; antagonistas de AMPA, 2,3-dihidroxi-6-nitro-7-sulfamoilbenzo(f)quinoxalina (NBQX), LY303070 e LY300164, fenobam, um inibidor seletivo da recaptação de serotonina, tal como a fluoxetina, ou um antipsicótico atípico, como a risperidona.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 11 CARACTERIZADO pelo fato de que o tratamento do dito ASD resulta em uma melhora de: (a) deficiência na interação social, (b) deficiência na comunicação, (c) interesses e comportamentos restritos e repetitivos, (d) comer atípico, (e) deficiência no uso de múltiplos comportamentos não verbais para regular a interação social; (f) incapacidade de desenvolvimento de relacionamentos com pares apropri-ados ao nível de desenvolvimento, (g) falta de procura espontânea de compartilhar prazer, interesses ou reali-zações, (h) falta de reciprocidade social ou emocional, (i) atraso no ou falta total do desenvolvimento da linguagem falada, (j) deficiência marcada na capacidade de iniciar ou manter uma conversa, (k) uso estereotipado e repetitivo da linguagem, (l) falta de brincadeira de faz de conta espontânea, (m) padrões restrito, repetitivo e estereotipado de comportamento, (n) preocupação com um ou mais interesse(s) considerado(s) anormal(is) em intensidade, (o) aderência inflexível a rotinas ou rituais, (p) maneirismos motores repetitivos, ou (r) foco persistente em partes de objetos.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 11, CARACTERIZADO pelo fa-to de que o dito ASD é Síndrome de Rett.

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