JP2018138606A - グリシル−ｌ−２−メチルプロピル−ｌ−グルタミン酸を用いる自閉症スペクトラム障害の治療 - Google Patents

グリシル−ｌ−２−メチルプロピル−ｌ−グルタミン酸を用いる自閉症スペクトラム障害の治療 Download PDF

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Abstract

【課題】本発明は、グリシル-2-メチルプロリル-グルタミン酸(G-2-MePE)及びその類似体を用いて自閉症スペクトラム障害(ASD)を治療するための化合物、組成物及び方法を提供する。自閉症スペクトラム障害には、自閉症、自閉症性障害、アスペルガー症候群、小児期崩壊性障害、特定不能の広汎性発達障害(PDD-NOS)、脆弱X症候群、及びレット症候群(RTT)が含まれる。【解決手段】G-2-MePE及びその類似体を含有する組成物としては、水溶性製剤、油中水マイクロエマルション、油中水粗エマルション、油中水液晶、ナノカプセル、錠剤、及び経口投与ゲルがある。本発明の化合物及び組成物は、静脈内、脳室内、非経口、又は経口投与可能であり、神経変性の治療、神経機能の増強、発作活動その他のASDの症状の治療に有効であり、かつ自閉症スペクトラム障害を有するヒトを含めた動物の寿命を延長することができる。【選択図】なし

Description

優先権の主張
この出願は、米国仮特許出願第61/462,141号（発明の名称「グリシル-2-メチルプロピル-L-グルタマートを用いるレット症候群療法(Rett Syndrome Therapy Using Glycyl-2-Methylprolyl-L-Glutamate)」、発明者Larry Glass et al.、2011年1月27出願）、及び米国仮特許出願第61/492,248号（発明の名称「グリシル-2-L-メチルプロピル-L-グルタマートを用いる自閉症スペクトラム障害の治療(Treatment of Autism Spectrum Disorders Using Glycyl-2-L-Methylprolyl-L-Glutamate)」、発明者Michael John Bickerdike et al.、2011年6月1日出願）に対する優先権を主張する。これらの両出願は、あたかも別々に完全に本明細書に援用されたかのように、完全に本明細書に援用される。
発明の分野
本発明は、一般的に自閉症スペクトラム障害(ASD)（自閉症、脆弱X症候群、レット症候群(RTT)、自閉症性障害、アスペルガー症候群、小児期崩壊性障害及び特定不能の広汎性発達障害(Pervasive Developmental Disorder Not Otherwise Specified)(PDD-NOS)、及び病理学的要求回避(Pathological Demand Avoidance)(PDA)を含めて）の療法に関する。特に、本発明はグリシル-2-メチル-プロピル-グルタマート(G-2-MePE)を用いるASDの治療に関する。
背景
関連技術の説明
自閉症スペクトラム障害は、ますます診断されるようになっている。自閉症スペクトラム障害(ASD)は、社会的相互作用及びコミュニケーションの異常、限定された興味及び反復行動を特徴とする連鎖的発達障害の集合である。ASDの現分類は5つの異型：古典的自閉症又は自閉症性障害、アスペルガー症候群、レット症候群、小児期崩壊性障害及び特定不能の広汎性発達障害(PDD-NOS)を認めている。6番目の症候群である病理学的要求回避(PDA)はさらなる特有の広汎性発達障害である。
EP 0 366 638は、GPE(アミノ酸Gly-Pro-Gluから成るトリペプチド)とそのジペプチド誘導体Gly-Pro及びPro-Gluを開示している。EP 0 366 638は、GPEが神経調節物質として有効であり、ニューロンの電気的特性に影響を及ぼし得ることを開示している。
WO95/172904は、GPEが神経保護特性を有すること及びGPEの投与がニューロン及びグリア細胞死の防止又は阻害によって中枢神経系(CNS)への損傷を減少させ得ること開示している。
WO 98/14202は、GPEの投与が中枢神経系(CNS)内のコリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD)、及び一酸化窒素シンターゼ(NOS)の有効量を増加させ得ることを開示している。
WO99/65509は、例えばGPEの投与によってCNS内のGPEの有効量を増やすと、CNS内のチロシンヒドロキシラーゼ(TH)の有効量を増やして、パーキンソン病等の疾患の治療でTH媒介ドーパミン産生を増やすことができると開示している。
WO02/16408は、患者内でGPEに等価の生理作用を誘発できるアミノ酸置換及び特定の他の修飾を有する特定のGPE類似体を開示している。GPE類似体の用途としては、CNSの損傷又は疾患を含めた急性脳損傷及び神経変性疾患の治療がある。
概要
現在、ASDの有効な治療はなく、患者ケアは症状の管理に限定されている。
本発明は、グリシル-L-プロピル-L-グルタミン酸(GPE)の合成類似体及びペプチド模倣薬に関する。特に、本発明は、抗アポトーシス性及び抗壊死性であるGPE類似体及びペプチド模倣薬、それらの製造方法、それらを含有する医薬組成物、並びに動物の認知機能を増強し、及び／又は記憶障害を治療し、かつニューロンの結合性を改善するためのそれらの使用に関する。さらに詳しくは、この出願は、ASDの治療におけるGPE類似体、G-2-メチル-プロピル-グルタミン酸(G-2-MePE)の使用方法に関する。
米国特許第7,041,314号は、問題の組成物及びG-2-MePEの使用方法を開示している。
一態様では、本発明は下記式1及び式2：
Figure 2018138606
（式中、
mは0又は1であり；
nは0又は1であり；
XはH又は-NR6R7であり；
YはH、アルキル、-CO2R5、又は-CONR6R7であり；
ZはH、アルキル、-CO2R5又は-CONR6R7であり；
R1はH、アルキル、又はアラルキルであり；
R2、R3、及びR4は独立にH又はアルキルであり；
各R5は独立にH、アルキル、又は脂肪アルコール残基であり；
各R6及びR7は独立にH、アルキル、又はアラルキルであり、或いは-NR6R7はピロリジノ、ピペリジノ、又はモルホリノである）
の化合物；
或いはYが-CO2(アルキル)であり、かつZが-CO2Hであるか又はYが-CO2Hであり、かつZがCO2(アルキル)である化合物がラクトン化されると形成されるラクトン；
及びその医薬的に許容できる塩
（但し、該化合物はGPE、N-Me-GPE、GPEアミド、APE、GPQ又はその塩でない）
を提供する。
本発明の別の態様は、自閉症スペクトラム障害を有する動物の治療方法であって、動物への有効量のグリシル-L-2-メチルプロピル-L-グルタミン酸(G-2-MePE)の投与を含む方法を提供する。
本発明をその具体的実施形態を参照して説明する。本発明の他の態様及び特徴は添付図面を参照して理解できる。
本発明のGPEの合成類似体の調製のための一般スキームである。 GPE上のグリシン残基を修飾するためのスキームを表す。 GPE上のグリシン残基を修飾するためのスキームを表す。 GPEのグルタミン酸残基を修飾するためのスキームを表す。 GPEのグルタミン酸残基を修飾するためのスキームを表す。 GPEのグルタミン酸残基を修飾するためのスキームを表す。 GPEのグルタミン酸残基を修飾するためのスキームを表す。 GPEのグルタミン酸残基を修飾するためのスキームを表す。 GPEのグルタミン酸残基を修飾するためのスキームを表す。 GPEのペプチド結合を修飾するためのスキームを表す。 GPEのペプチド結合を修飾するためのスキームを表す。 オカダ酸で傷害された皮質ニューロンに及ぼすGPEの効果を示すグラフを表す。 オカダ酸で傷害された皮質ニューロンに及ぼすG-2-MePEの効果を示すグラフを表す。 オカダ酸で傷害された小脳の微小外植片(microexplant)に及ぼすG-2-MePE、GPEの効果を示すグラフを表す。 オカダ酸で傷害された線条体細胞に及ぼすG-2-MePE又はGPEの効果を示すグラフを表す。 18月齢ラットの線条体内のChAT陽性ニューロン数に及ぼすG-2-MePEの皮下注射(0.012、0.12、1.2及び12mg/kgの用量で)の効果を示す。 中年期12月齢ラットの空間記憶保持に及ぼすG-2-MePE治療の効果を示す。 3週間の治療及び9日の休薬後に8方向放射状迷路において老齢(17月齢)ラットの空間作業記憶に及ぼすG-2-MePEの効果を示し、異なる群について日を越えた迷路習得プロファイルを示す。 3週間の治療及び9日の休薬後に8方向放射状迷路において老齢(17月齢)ラットの空間作業記憶に及ぼすG-2-MePEの効果を示し、異なる群について日を越えて平均した正しい迷路の選択率を示す。 老齢ラットの脳室下帯(SVZ)内のPCNA陽性細胞数で評価した場合の神経芽細胞増殖に及ぼす4用量のG-2-MePEの単剤腹腔内投与の効果を示す。 ビヒクル処置ラット(左パネル)と比較した最高用量のG-2-MePEで治療したラット(右パネル)におけるPCNA及びダブルコルチン染色の共局在化に及ぼす4用量のG-2-MePEの単剤腹腔内投与の効果を示す。 中年期ラットのPCNA免疫組織化学染色によって評価した場合の神経芽細胞増殖に及ぼすG-2-MePEの効果を示す。 幼若ラット(*p<0.01)及び中年期ラット(*p<0.01)と比較した老齢ラットにおける海馬のGFAP染色で評価した場合の反応性アストロサイト数の有意な増加を示す。 その一部が毛細管の形成(矢印)と関連するGFAP染色で評価した場合のアストロサイトを示す、老齢ラットの大脳皮質切片の写真を示す。 老齢ラットの海馬のCA4小領域のGFAP染色を利用して評価した場合のアストロサイト数の減少に及ぼすG-2-MePE治療(0.012、0.12、1.2及び12mg/kg/日の用量で)の用量依存性効果を示す。 小脳皮質のGFAP染色を利用して評価した場合のアストロサイト数の減少に及ぼすG-2-MePE治療(0.012、0.12、1.2及び12mg/kg/日の用量で)の用量依存性効果を示す。 静脈内注射後のラットの循環内のGPE及びG-2-MePEの薬物動態特性を示す。 生理食塩水処置MeCP2欠失マウスと比較したMeCP2欠失マウスの生存期間の増加に及ぼすG-2-MePEの効果を示す。 生理食塩水処置MeCP2欠失マウスと比較したMeCP2欠失マウスのfEPSP傾きで測定した場合の海馬の長期増強に及ぼすG-2-MePEの効果を示す。 細胞体からの距離の関数としての樹状突起長に及ぼすG-2-MePEの効果を示すグラフを表す。
詳細な説明
定義
薬用量又は時間に関しての用語「約」は、特定の変量及びその変量の値の20%以内である通常の測定誤差内である当該変量周辺の範囲を指す。観測結果に関しての用語「約」は、変動が観測変量の値の20%以内であることを意味する。
用語「アルキル」は、1〜6個の炭素原子を有する直鎖飽和ヒドロカルビル基、又は3〜6個の炭素原子を有する分岐鎖若しくは環式飽和ヒドロカルビル基を意味する。典型的なアルキル基として、直鎖及び分岐鎖、又は環式アルキル基、メチル、エチル、イソプロピル、シクロプロピル、tert-ブチル、シクロプロピルメチル、及びヘキシルが挙げられる。
用語「動物」には、ヒト及び非ヒト動物、例えば飼育動物(ネコ、イヌ等)及び家畜(ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等)が含まれる。
用語「アラルキル」は、式-(CH2)1-2Arの基を意味し、式中、Arは、任意にCl、Br、-OH、-O-アルキル、-CO2R8(R8はH又はアルキルである)、又は-NR8R9(R8は前述したとおりであり、R9はH又はアルキルである)から選択される1〜3個の置換基で置換されていてもよい5員又は6員炭素環式又はヘテロ環式芳香環である。典型的なアラルキル基として、ベンジル、2-クロロベンジル、4-(ジメチルアミノ)ベンジル、フェネチル、1-ピロリルメチル、2-チエニルメチル、及び3-ピリジルメチルが挙げられる。
用語「疾患」には動物のいずれの不健康状態も含まれ、特にパーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、糖尿病、運動障害、発作、加齢に起因する認知機能障害及び自閉症スペクトラム障害（自閉症、脆弱X症候群、レット症候群(RTT)、自閉症性障害、アスペルガー症候群、小児期崩壊性障害及び特定不能の広汎性発達障害(PDD-NOS)、並びに病理学的要求回避(PDA)を含めて）が挙げられる。
用語「脂肪アルコール残基」は、任意に3個までの炭素-炭素二重結合を含んでよい、7〜12個の炭素原子を有する直鎖ヒドロカルビル基である。典型的な脂肪アルコール残基として、デシル、ペンタデシル、ヘキサデシル(セチル)、オクタデシル(ステアリル)、オレイル、リノレイル、及びエイコシルが挙げられる。
用語「成長因子」は、細胞を刺激して成長又は増殖させる細胞外ポリペプチドシグナル伝達分子を意味する。
用語「損傷」は、動物のいずれの急性損傷をも意味し、非出血性脳卒中、外傷性脳損傷、胎児ジストレス（例えば胎盤剥離、臍帯閉塞後の）又は子宮内胎児発育遅延と関連する周産期仮死、十分な蘇生又は呼吸の失敗と関連する周産期仮死、ほぼ溺死、ほぼ乳幼児突然死(cot death)、一酸化炭素吸入、アンモニアその他のガス中毒、心停止、昏睡、髄膜炎、低血糖及び癲癇重積状態と関連する重篤なCNS傷害、冠動脈バイパス手術、低血圧エピソード及び高血圧急性発症と関連する脳仮死のエピソード、脳外傷及び毒性傷害が挙げられる。
「記憶障害」又は「認知障害」は、情報を学習、記憶又は想起する能力の永久的又は一時的な低下又は欠如によって特徴づけられる障害である。記憶障害は、普通の加齢、脳への損傷、腫瘍、神経変性疾患、血管の状態、遺伝子の状態(ハンチントン病)、水頭症、他の疾患(ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、AIDS、髄膜炎)、有害物質、栄養失調、生化学的障害、心理学的又は精神医学的機能障害に起因し得る。ヒトの記憶障害の存在は、患者の病歴検査、身体検査、臨床検査、想像力検査及び神経心理学的検査を通じて確証可能である。標準的な神経心理学的検査としては、限定するものではないが、改訂された短時間視覚記憶検査(Brief Visual Memory Test-Revised(BVMT-R))、ケンブリッジ神経心理学自動バッテリー検査(Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery(CANTAB))、子供用記憶検査(Children's Memory Scale(CMS))、文脈記憶検査(Contextual Memory Test)、連続認知記憶検査(Continuous Recognition Memory Test(CMRT))、管理された口頭単語連想検査及び記憶機能質問票(Controlled Oral Word Association Test and Memory Functioning Questionnaire)、デンマン神経心理記憶検査(Denman Neuropsychology Memory Scale)、ウェクスラー成人知能検査-IIIの桁長及び文字数字列サブ検査(Digit Span and Letter Number Sequence sub-test of the Wechsler Adult Intelligence Scale-III)、フルト物体記憶評価(Fuld Object Memory Evaluation)(FOME)、グラハム-ケンダールのデザイン用記憶検査(Graham-Kendall Memory for Designs Test)、ギルド記憶検査(Guild Memory Test)、ホプキンス言語学習検査(Hopkins Verbal Learning Test)、学習及び記憶バッテリー(Learning and Memory Battery)(LAMB)、記憶評価臨床自己評価検査(Memory Assessment Clinic Self-Rating Scale)(MAC-S)、記憶評価検査(Memory Assessment Scales)(MAS)、ラント記憶検査(Randt Memory Test)、認知記憶検査(Recognition memory Test)(RMT)、レイ聴覚及び言語学習検査(Rey Auditory and Verbal Learning Test)(RAVLT)、ライバーミード行動記憶検査(Rivermead Behavioral Memory Test)、ウェクスラー記憶検査のラッセル版(Russell's Version of the Wechsler Memory Scale)(RWMS)、空間作業記憶(Spatial Working Memory)、記憶及び学習検査(Test of Memory and Learning)(TOMAL)、バーモント記憶検査(Vermont Memory Scale)(VMS)、ウェクスラー記憶検査(Wechsler Memory Scale)、記憶及び学習の広範囲評価(Wide Range Assessment of Memory and Learning)(WRAML)が挙げられる。
用語「医薬的に許容できる賦形剤」は、一般的に安全、無毒、かつ望ましい、医薬組成物の調製で役立つ賦形剤を意味し、ヒト医薬用途のみならず獣医学用途に許容できる賦形剤を包含する。該賦形剤は、固体、液体、半固体であってよく、エアロゾル組成物の場合はガス状であってよい。
用語「医薬的に許容できる塩」は、医薬的に許容性であり、かつ所望の薬理特性を有する塩を意味する。該塩には、化合物に存在する酸性プロトンが無機又は有機塩基と反応して形成され得る塩が含まれる。好適な無機塩には、ナトリウム及びカリウム等のアルカリ金属、マグネシウム、カルシウム、及びアルミニウムと形成される当該塩がある。好適な有機塩には、アミン、例えばエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、N-メチルグルカミン等の有機塩基と形成される当該塩がある。塩には、化合物に存在するアミン基(複数可)と酸との反応によって形成される酸付加塩も含まれる。好適な酸には、無機酸(例えば塩酸及び臭化水素酸)並びに有機酸(例えば酢酸、クエン酸、マレイン酸、並びにアルカンスルホン酸及びアレーンスルホン酸、例えばメタンスルホン酸及びベンゼンスルホン酸)がある。化合物に2個の酸性基が存在する場合、医薬的に許容できる塩は一酸一塩又は二塩であってよく；同様に3個以上の酸性基が存在する場合、該基の一部又は全てが塩化され得る。化合物に2個以上のアミン基が存在するときにも同論理を適用することができる。
用語「保護基」は、化学反応を別の未保護反応サイトで選択的に行ない、かつ選択的反応の完了後に該基を容易に除去できるように、多官能性化合物の1つ以上の反応サイトを選択的にブロックする基である。
用語「治療的に有効な量」は、疾患を治療するために動物に投与するとき、当技術分野で認められている試験システムを用いて測定した場合に当該疾患の治療を達成するのに十分な薬剤の量を意味する。
疾患を「治療する」又は疾患の「治療」という用語は、該疾患に罹りやすいが、まだ該疾患を経験していないか又は症状を示していない動物で該疾患が発症するのを予防するこ(予防的治療)、疾患を阻害すること(その発達の減速又は抑止)、該疾患の症状又は副作用からの解放を与えること(対症的治療を含めて)、及び疾患を軽減すること(疾患の退行を引き起こすこと)を包含し得る。
用語「機能障害」は、神経損傷と関連する行動障害を意味する。該障害には、パーキンソン病患者で観察されるような歩行障害、ハンチントン病患者で観察されるような運動障害がある。機能障害には、異常な足位置及び本明細書に記載の記憶障害も含まれる。
用語「G-2-MePE」及び「NNZ-2566」は、L-グリシル-2-メチル-L-プロピル-L-グルタマートを意味する。
用語「発作」は、痙攣性運動を含めた異常な運動を生じさせる、運動障害又は運動調節の欠如をもたらす脳内の神経活動の異常パターンを意味する。「発作」には、異常な運動活動を伴うか否かにかかわらず、脳波異常が含まれる。
暗黙の水素原子(例えばピロリジン環上の水素原子等)は、明瞭さのため式から省いてあるが、存在するものと解釈すべきである。
自閉症スペクトラム障害
自閉症スペクトラム障害(ASD)は、社会的相互作用及びコミュニケーションの異常、限定された興味及び反復行動を特徴とする連鎖的発達障害の集合である。ASDの現分類は5つの異型：古典的自閉症又は自閉症性障害、アスペルガー症候群、レット症候群、小児期崩壊性障害及び特定不能の広汎性発達障害(PDD-NOS)を認めている。6番目の症候群である病理学的要求回避(PDA)はさらなる特有の広汎性発達障害である。しかし、PDAはASDとしてますます認められているが、PDAは未だにアメリカ精神医学会が発行した精神障害の診断と統計マニュアル第4版(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders)(DSM-IV)の一部でもなく、提案された改訂版、DSM-Vの一部でもない。
自閉症
古典的自閉症は、非常に可変性の神経発達障害である。古典的自閉症は、典型的に乳児期又は幼児期中に診断され、多くの場合6月齢から顕性症状が明らかになり、2〜3年までに確立されてくる。DSM-IVで立案された診断基準によると、(a)社会的相互作用の障害、(b)コミュニケーションの障害及び(c)限定された反復的な興味及び行動を含め、三徴候が存在する必要がある。非定型摂食等の他の機能障害も共通するが、診断にとっては必須でない。これらの障害のうち、診断には社会的相互作用障害が特に重要であり、自閉症の診断では、下記障害の2つが存在しなければならない。
(i)社会的相互作用を調節するための複数の非言語的行動(例えばアイコンタクト)の使用の障害；
(ii)発達水準に相応した仲間関係を作ることの失敗；
(iii)楽しみ、興味、又は達成感を分かち合うことを自発的に求めることの欠如；
(iv)社会的又は情緒的相反性の欠如。
自閉症のコミュニケーション障害は、下記経路の1つ以上によって明らかに成り得る：話し言葉の発達の遅れ(又は完全な欠如)；会話を開始又は継続する能力の著明な障害；常同的かつ反復的な言語の使用；及び／又は自発的なごっこ遊びの欠如。診断には、限定された反復的かつ常同的な行動パターン、例えば強度において異常なほど1つ以上の興味に没頭すること、決められた動作又は儀式への頑固な固執、反復運動の癖及び／又は物体の一部に持続的に集中すること等も必要とされる。
最後に、自閉症の診断には、少なくとも1つの領域(すなわち、社会的相互作用、言語、又は想像的遊び)の機能性の障害が3歳未満で始まる必要がある。
自閉症は、脳波(EEG)で一般的に癲癇又は癲癇様活動を伴う。自閉症患者の60%もが彼らのEEGに癲癇様活動を有する(Spence and Schneider, 2009 Ped Res 65: 599-606)。
自閉症は、自閉症患者の中枢神経系(CNS)で枯渇しているIGF-1の機能の障害とも関連する(Riikonen et al., 2006 Devel Med Child Neurol 48: 751-755)。症状を減少させるフルオキセチン等の薬剤を用いた治療後の自閉症患者では、CNS内のIGF-1レベルが上昇する(Makkonen et al., 2011 Neuropediatrics 42:207-209)。
重要なことに、自閉症は、ニューロンの結合性に関してレット症候群及び脆弱X症候群の特徴を共有する。3つ全ての障害はシナプス機能及びニューロンの結合性の欠陥を特徴とする。このことは、これらの患者群の死後のヒト脳の研究で反映されており、全て正常なシナプス結合形成の失敗を示している。これは、ニューロンの樹状突起スパイン密度の減少、又は樹状突起スパイン密度は高いが未成熟シナプスを伴う、形態学的特徴の変化に反映されている。これは、自閉症、レット症候群及び脆弱X症候群の動物モデルに反映されており、これらの障害の病理学的変化として知られる遺伝子変化に基づいている。これらの動物モデルでは、ニューロン結合性欠陥が形態学的に、かつ長期増強(LTP)の失敗としても明らかである。IGF-1、IGF-1[1-3]及びG-2-MePEはシナプス形成を増やすことからこれは重要である。
アスペルガー症候群
アスペルガー症候群又はアスペルガー障害は自閉症に類似し、一定の特徴を共有する。自閉症と同様に、アスペルガー症候群も社会的相互作用の障害を特徴とし、これに限定された反復的な興味及び行動を伴う。従って、アスペルガー症候群の診断は、自閉症と同じ障害の三徴候によって特徴づけられる。しかしながら、言語及び認知の発達の一般的遅れがないこと及び被験者の環境への興味に欠陥がないことによってアスペルガー症候群は他のASDとは異なる。さらに、アスペルガー症候群は症候学において古典的自閉症より典型的に軽症であり、アスペルガー患者は自立して機能し、比較的正常な生活を導くことができる。
小児期崩壊性障害
ヘラー症候群としても知られる小児期崩壊性障害(CDD)は、子供が2〜4歳まで(すなわち、自閉症及びレット症候群より遅い)は正常に発達するが、その後社会的、コミュニケーションその他のスキルの重度の損失を示す。小児期崩壊性障害は自閉症に非常によく似ており、両方とも正常な発達後に言語、社会的遊び及び運動スキルのかなりの損失を伴う。しかしながら、小児期崩壊性障害は典型的に自閉症より遅く発症し、より劇的なスキルの損失を伴い、自閉症よりずっとまれである。
CDDの診断は、下記領域の2つ以上における既得スキルの劇的損失に依存する：言語、社会的スキル、遊び、運動スキル(例えば歩く、登る、掴む等の能力の劇的低下)、腸又は膀胱の調節(以前にトイレトレーニングしているにもかかわらず)。発達的スキルの損失は急激なことがあり、数日〜数週間にわたって起こるか又は徐々に起こることもある。
特定不能の広汎性発達障害(PDD-NOS)
特定不能の広汎性発達障害(PDD-NOS)は、他の詳細に明らかにされたASDと関連する症状の全てではないが、一部を示す患者を表すASDである。ASD診断の重要な基準として、他人と交際することの困難性、反復行動、及び一定の刺激に対する感受性の高まりが挙げられる。これらは全て上記ASDで見られる。しかしながら、自閉症、アスペルガー症候群、レット症候群及び小児期崩壊性障害は全てそれらの特異的診断を可能にする他の特徴を有する。ASDは明らかであるが、これらの4つの障害の1つの特異的診断を行なえないとき、PDD-NOSと診断される。該診断は、スペクトラムにおいて他の状態に適用できるより遅い年齢で開始する症状に起因し得る。
レット症候群
レット症候群(RTT)は、ほとんど排他的に女性に発症する(出生数10,000中1人)神経発達障害である。RTTは、自閉症スペクトラム障害として分類される(精神障害の診断と統計マニュアル改訂第4版(DSM-IV-R))。米国では現在約16,000人の患者がレット症候群を患っている(Rett Syndrome Research Trust data)。レット症候群の診断では、下記症状が特徴的である；6〜18月齢からの発達障害；3カ月〜4歳から始まる頭部成長速度の減速；重度の言語障害；反復的かつ常同的な手の動き；並びに歩行障害、例えばつま先歩き又は不安定な強直性歩行。さらに、レット症候群の診断を助け得るいくつかの対症的判断基準もあるが、診断にとって必須ではない。これには、呼吸困難、EEG異常、発作、筋固縮及び痙縮、脊柱側弯症(脊椎の湾曲)、歯ぎしり、高さに関して小さい手足、成長遅延、体脂肪及び筋量の減少、異常な睡眠パターン、易刺激性又は激越、咀嚼及び／又は嚥下困難、循環不良及び便秘がある。
RTTの発症は通常6〜18月齢で発達及び成長速度の減速によって始まる。この後に退行期(典型的に1〜4歳の子供)、仮性安定期(pseudo-stationary phase)(2〜10歳)及び引き続く進行性末期運動悪化状態がある。RTTの症状には、成長の突然の減速並びに言語及び運動スキルの退行があり、常同的動作に取って代わられる意図的な手の動作、自閉症的特徴、パニック様攻撃、睡眠周期障害、振戦、発作、呼吸機能障害(突発性無呼吸、過呼吸)、失行症、ジストニア、ジスキネジア、筋緊張低下、進行性脊柱後弯症又は脊柱側弯症並びに重度の認知障害が挙げられる。ほとんどのRTT患者は重度の身体障害を伴って成人期まで生存し、1日24時間のケアを必要とする。
RTTの85%〜95%の症例は、メチル-CpG-結合タンパク質2(MeCP2)をコードする遺伝子であるMecp2遺伝子の突然変異に起因すると報告されている(Amir et al. 1999. Nat Genet 23:185-188; Rett Syndrome Research Trust)。Mecp2はX染色体(位置Xq28)に位置し、そのため、男性ではこの遺伝子の突然変異は通常致死的である。RTTは遺伝性障害であるが、記録された症例の1%未満が遺伝し；Mecp2のほとんんど全ての突然変異は新規に起こり、2/3は第3及び第4エクソン上にある8個のCpGジヌクレオチド(R106、R133、T158、R168、R255、R270、R294及びR306)の突然変異によって起こる。
MeCP2は、CNS内でメチル化CpGジヌクレオチドと結合して転写性サイレンシングを発揮するタンパク質である。MeCP2の減少又は非存在の重要な影響は、樹状突起スパインの発達及びシナプスの形成の障害であると思われる。MeCP2発現は、一時的に脳の突然変異と関係があるようであり、症状が典型的に18月齢付近で現れる理由を説明する。
ASDに共通する提示特徴
ASDを考え合わせると、5つの全ての型の中で提示症状に共通性があることは明らかである。これらの共通の特徴は、正常な社会的適格性の障害、及び反復的行動である。アスペルガー症候群を除く全てにおいて最も一般的に言語スキルの不足として現れる、知力発達遅延の一貫した提示もある。自閉症、レット症候群、CDD及びPDD-NOSでは、年齢に相応したパラメーターに対して認知欠如が非常に顕著なことが多い。癲癇の存在又はEEGの異常な活性も自閉症、脆弱X症候群及びレット症候群で共通する。癲癇は異常なニューロン結合性の状態で起こる。ニューロン結合性の障害及びシナプス機能の混乱は自閉症、脆弱X症候群及びレット症候群並びにこれらの状態の動物モデルの共通の特徴である。
ASDの遺伝的モデル
妥当性を提供するためには、ASDの動物モデルは、臨床状態と同様の症状を示し、かつ当該症状の病因論に関して合理的な程度の表面的妥当性を有しなければならない。古典的自閉症は多くの異なる遺伝子障害に起因し、単一の遺伝子欠陥では自閉症の症例の数パーセントしか説明できないことが知られている。実際に、最近の研究は、まれな遺伝性遺伝子欠陥に加えて、ASDの根底にあると考えられる染色体位置の多数の新規な構造異形を明らかにした(Marshall et al, 2008; Sebat et al, 2007)。このように、1p、5q、7q、15q、16p、17p及びXqを含めた20以上の重要サイトでのコピー数多型(copy number variation)(CNV)、遺伝子配列の転位及び逆位がASD座として位置づけられた。
しかしながら、ASDの根底にあるとポリジーン背景、及び病因論の複雑さにもかかわらず、特定の遺伝子欠陥がASDをもたらし得ることが知られている。最もよく特徴づけられている欠陥のいくつかは、ニューロリジン3(NLGN3)、ニューロリジン4(NLGN4)、ニューレキシン1α(NRXN1)及びシャンク(shank)3を含めたシナプス後肥厚部タンパク質のクラスターをコードする遺伝子の染色体異常から起こる(Sebat et al, 2007)。重要なことに、これらの欠陥は、自閉症及び他の関連障害の最後の共通経路としてシナプス形成の変化、ひいてはニューロン結合性の妨害を指摘する(Minshew and Williams 2007 Arch Neurol. 64:945-950; Gilman et al., 2011 Neuron. 70:898-907)。このような結合性の欠陥は、自閉症では樹状突起スパイン密度の増加を明らかにする死後検査での形態学的知見に反映されている(Hutsler and Zhang 2010 Brain Res. 1309:83-94)。
NLGN3及びNLGN4は、グルタミン酸作動性シナプス内に存在するシナプス後細胞接着分子である。それらは、シナプス後部位へのシナプス前接触を調和させる際に役割を果たし、シナプス後足場タンパク質シャンク3とも相互作用する。ASD集団ではNLGN3及びNLGN4への突然変異が観察され、これらは全てのASD症例のおそらく1%を占める(Lintas & Persico, 2008)。Jamainと研究仲間は最初に2人の非血縁被験者において、それぞれアスペルガー症候群及び古典的自閉症をもたらすNLGN3へのミスセンス及びNLGN4へのフレームシフトを報告した(Jamain et al, 2003)。ASD集団におけるNLGN3又はNLGN4の突然変異の発生率は低いが(実際に、カナダの研究において96名のASD患者の研究で突然変異はあまり観察されなかった；Gauthier et al, 2005)、前臨床研究でニューロリジンの突然変異は実際に自閉症症状のモデルを作り出せることを確認した。従って、臨床的に報告されたNLGN3への同じR451Cミスセンスのマウスへの導入は、社会的相互作用の低減及び抑制性シナプス伝達の増強を示すミュータントマウス株をもたらす(Tabuchi et al, 2007)。
従ってR451Cミュータントマウスは、NLGN3の突然変異に基づいたASDのモデルとなる。この場合、NLGN3のR451位置における突然変異は、「機能獲得(gain-of-function)」突然変異になる。
対照的に、NLGN4の「機能喪失(loss-of-function)」突然変異によって、マウスのNLGN4の臨床突然変異のモデル化が達成される(古典的ノックアウトモデル)。このモデルでは、ミュータントマウスは社会的相互作用の欠陥及び超音波発声の減少を示す(Jamain et al, 2008)。臨床ASDにとってはコミュニケーション欠陥が中心であり、NLGN4ノックアウトマウスでは、野生型雌性対応物にさらした雄性マウスからの超音波発声の減少が該株のASDモデルとしての表面的妥当性を支持する。
シナプス前ニューレキシンタンパク質は、樹状突起に対向する際にシナプス後ニューレキシ対応物との相互作用を通じてシナプス後分化を誘発する。ニューレキシ1α(NRXN1)遺伝子の突然変異は多数の研究で報告されており(Sebat et al, 2007; Marshall et al, 2008; Kim et al, 2008; Yan et al, 2008)、これらはコピー数多型の形で観察された。NLGN突然変異と同様に、NRXN1遺伝子の突然変異がマウスに導入されると(遺伝子ノックアウトの形で)、特定のASD様特徴を有するミュータント株が生成される(Etherton et al, 2009)。これらのNRXN1ノックアウトマウスは海馬の微小興奮性シナプス後電流(hippocampal miniature excitatory postsynaptic current)(mEPSC)周波数の減少及び誘発電流の入出力関係の減少を示す。これらの電気生理学的効果は、海馬における興奮性伝達の減少に関連する。興奮性神経伝達の減少に加えて、NRXN1ノックアウトマウスは、前パルス抑制の減少を示すが、社会的行動は影響されないようである(Etherton et al, 2009)。
ニューレキシン-NLGN経シナプス構成物と一定の特徴を共有する細胞接着分子1(CADM1)は、シナプス前にもシナプス後にも存在し、シナプスの経細胞接着活性にも関与する免疫グロブリンファミリータンパク質である(Biederer et al, 2002)。CADM1遺伝子への突然変異がASD患者で検出された。このことは、これらの状態のさらなる可能な原因を表すようである(Zhiling et al, 2008)。
CADM1ノックアウトマウスの分析は、これらの動物が不安関連行動の増加、社会的相互作用の障害並びに社会的記憶及び認知の障害を示すことを明らかにする。さらにCADM1ノックアウトマウスは、運動スキルの不良を示す(Takayanagi et al, 2010)。これらの機能障害もまたASD総体症状と一致している。
22q13欠失症候群(Phelan-McDermid症候群としても知られる)は、染色体22のq13.3末端における微小欠失に起因する珍しい遺伝的障害である。この微小欠失は、典型的な遺伝子スクリーニングではめったに明らかにされず、診断を確証するためには蛍光インサイツハイブリダイゼーション法が推奨される。最近の研究は、この症候群が正常なニューロン機能にとって重大な意味を持つシナプス後肥厚部タンパク質である遺伝子シャンク3のエラーに起因することを示している。興味深いことに、この遺伝子のエラーはASDとも関連しており、22q13欠失症候群は、一般的にASD診断につながり得る(Durand et al, 2007; Moessner et al, 2007; Sykes et al, 2009)。22q13欠失症候群の密接な関連及び結果としてのASDの診断を前提として、この突然変異のミュータントマウスモデルが開発された。
シャンク3ノックアウトマウスは、超音波発生の減少(すなわち、社会的コミュニケーションの低下)並びにマウス間の社会的相互作用時間の欠如を含めたASD症状に酷似しているいくつかの欠陥を示す。さらに、これらのマウスは、誘発電流の入出力関係により測定される海馬CA1の興奮性伝達の障害及び長期増強(LTP)の障害を有する。LTPは、記憶の形成と固定の根底にある生理プロセスであると考えられる。従って、このモデルは、ASDと一致するNLGN4ノックアウトマウスに類似した表現型を示す。
指摘したように、22q13欠失症候群自体は非常に珍しい。しかしながら、それは、特異的遺伝子がASDの病因論に関与し得るという重要な情報を提供する。シャンク3に加えて、この障害は、ASDでさらに可能性のある遺伝的欠陥を明らかにする。記載された22q13欠失症候群の50くらいの症例のうち、1以外は全てシャンク3を越えて伸長して膵島脳2(Islet Brain-2)遺伝子(IB2)として知られるさらなる遺伝子を含めた遺伝子欠失を有する(Sebat et al, 2007)。IB2タンパク質は、MAPキナーゼ及びアミロイド前駆体タンパク質を含めた多くの他のタンパク質と相互作用し、神経突起内のタンパク質輸送に影響を与えるようであり、シナプス後肥厚部に富んでいる(Giza et al, 2010)。このタンパク質を欠くマウス(IB2-/-ノックアウトマウス)は、社会的相互作用障害(嗅ぐ動作及び相互作用時間の減少)、探求及び認知の減少並びに運動欠陥を示す(Giza et al, 2010)。この行動表現型は、小脳細胞内の興奮性伝達の減少と関連した。従って、シャンク3と同様に、IB2突然変異の表現型もASDと一致する。
上記シナプス後肥厚部タンパク質欠陥の動物モデルに加えて、ASDにつながり得る種々の特徴をASDと共有する他の単一遺伝子症候群は、ASDの薬物ターゲティングの別の手段を提供する。この優れた例は脆弱X症候群である。
脆弱X症候群(FXS)は、X染色体上の単一のトリヌクレオチド遺伝子配列(CGG)の拡大の結果、fmr1遺伝子によってコードされたタンパク質の発現に失敗することが原因である。FMR1(脆弱X精神遅滞タンパク質1(fragile X mental retardation 1))は、正常な神経発達に必要なタンパク質である。FXSは子供に自閉症を引き起こす可能性があり(Hagerman et al, 2010)；自閉症と診断された全ての子供の2〜6%では、その原因がFXS遺伝子の突然変異である。さらに、FXSの子供の約30%はある程度の自閉症を有し、さらなる30%はPDD-NOSと診断される(Hagerman et al, 2010)。実際に、脆弱X症候群は、最も一般的な既知の単一遺伝子原因の自閉症である。FMR1ノックアウトマウスはFXSのモデルとして、従って、ASDのさらなるモデルとして開発された。FMR1遺伝子のノックアウト突然変異は、ニューロンの結合性欠陥、例えば異常な樹状突起スパインの発達と剪定(Comery et al, 1997)、並びにシナプス後肥厚部における樹状突起足場タンパク質(シャンク1を含め)及びグルタミン酸受容体サブユニットの関連する調節異常(Schutt et al, 2009)をもたらすことが示された。樹状突起の形態に及ぼすこれらの効果は、結合性の機能的尺度の欠陥、例えば皮質及び扁桃体(Zhao et al, 2005)及び海馬(Lauterborn et al, 2007)内のLTP障害、並びに認知障害(Kreuger et al, 2011)及び社会的不安の増大(Spencer et al, 2005)に帰する。これらの結合性の欠陥は、死後分析で樹状突起スパイン密度増大を示すFXS患者に酷似している(Irwin et al., 2000 Cereb Cortex 10:1034-1048)。この樹状突起スパイン密度増大は未成熟シナプスを伴い(Klemmer et al., 2011 J Biol Chem. 286:25495-25504)、すなわち機能的に未成熟な状態となり得る。
自閉症、アスペルガー、CDD及びPDD-NOSのASDとは対照的に、レット症候群は、ほとんど単一遺伝子を根拠とするようであり、良い表面的妥当性を有するマウスでモデル化が可能である。レット症候群は、症例の96%まで、Mecp2遺伝子の欠陥に起因すると考えられる(Zoghbi, 2005)。結果として、MeCP2ノックアウトミュータントマウスは、臨床上のレット症候群の全ての顕著な特徴を有し、ASDのNLGN4、シャンク3及びIB2ノックアウトモデルといくらか重なりを示す表現型を備える動物モデルを提供する。従って、MeCP2ノックアウトマウスは、海馬内でLTPの明らかな障害と共に対応する社会的及び空間的記憶の低減(Moretti et al, 2006)並びに物体認識障害(Schaevitz et al, 2010)を示す。このLTPの障害は、樹状突起スパイン密度の減少を伴う。レット症候群の患者は、樹状突起スパイン密度の低減を示す(Belichenko et al., 1994 Neuroreport 5:1509-1513)。
このように、ヒトのASDはげっ歯動物を含めた動物の認知又は発達障害の多くの特徴を共有する。従って、マウス及びラット等のげっ歯動物のASD療法の研究は、ヒトで得られる結果を合理的に予測する。自閉症、脆弱X症候群及びレット症候群で見られる共通の特徴は、ニューロン結合性欠陥の存在であり、樹状突起スパイン密度の減少又は未成熟シナプスを有する樹状突起スパイン密度の増大のどちらかに反映される。これらの形態学的変化の機能的帰結は、例えばLTPの欠陥として反映されるこれらの障害の動物モデルと同様である。
G-2-MePEを用いた臨床ASD及びASD動物モデルの治療
上述したように、ASDでは、神経突起発達障害、シナプス結合性障害並びに結果として対応する社会的及び認知機能障害を含む保存病理学が観察される。このようなシナプス機能障害は、シナプス後肥厚部タンパク質の遺伝的に変化した機能に起因する。正常な神経突起の成長及びシナプス後発達は、脳由来神経栄養因子(BDNF；Chapleau et al, 2009)及びインスリン様成長因子1(IGF-1；Riikonen et al, 2006; Tropea et al, 2009)等の成長因子よって調節及び増強され得る。実際に、IGF-1は正常の樹状突起スパインの成長及びシナプスの形成に必須である(Cheng et al., 2003 J Neurosci Res. 73:1-9)。従って、成長因子の機能を増強する薬物はASD等の進行性発達障害の治療に有用である。G-2-MePEはIGF-1、IGF1(1-3)の末端トリペプチドの小分子メチル化類似体である。IGF-1模倣類似体として、G-2-MePEは種々の動物モデルにおいて栄養的及び神経保護的効果を発揮する。従って、G-2-MePEは、上記遺伝子突然変異に起因するシナプス機能障害に関係する症状等のASD症状の治療で有効である。
臨床用語では、自閉症、アスペルガー症候群、レット症候群、小児期崩壊性障害及びPDD-NOSを呈するASD患者、並びに22q13欠失症候群、脆弱X症候群及び病理学的要求回避の患者がG-2-MePEで治療される。患者は、社会的及びコミュニケーション障害並びに認知欠陥を示す。例えば、毎日を基礎とし、別の例では経口経路によるG-2-MePEを用いた治療は、薬物治療後に、常同的反復動作の改善、社会的機能性の改善及び認知能力の改善を誘導することが観測される。
ASDの動物モデルでは、ノックアウトマウスへの強制経口投与又は腹腔内注射による毎日のG-2-MePE治療がASD様症状を改善するであろう。G-2-MePEは、下記ASDミュータントマウスに有効である：NLGN3(R451C)ミュータント、NLGN4ノックアウト、NRXN1ノックアウト、CADM1ノックアウト、シャンク3ノックアウト、IB2ノックアウト、FMR1ノックアウト及びMeCP2ノックアウト。やや慢性的に(1〜10週間)毎日を基礎として投与すると、G-2-MePEはバースト刺激又は高頻度刺激後に、海馬内のLTPの改善に有効である。同様に、皮質、海馬及び小脳において電場の細胞外シナプス後電位の電気生理学的記録により測定したところ、G-2-MePEは興奮性神経伝達を増やす。興奮性神経伝達の改善(観察されたASD様神経伝達欠陥の逆転)の結果として、G-2-MePEは、認知能力の認知及び運動成績検査を改善することが観測される。従って、G-2-MePEはモーリス水迷路及び放射状迷路検査のパフォーマンスを改善する。社会的相互作用のモデルでは、ASDミュータントマウスに投与したG-2-MePEは、ノックアウト雄が野生型雌と社会的相互作用状態で過ごす時間を増やす。さらに、雌性の野生型マウスへの超音波発声が増加する。野生型コントロールに比べてミュータントマウスで長寿命の減少が観察されるモデル(例えばレット症候群のMeCP2ノックアウトマウスモデル)では、G-2-MePEを用いた治療が動物の寿命を延ばす。
G-2-MePEは、中大脳動脈閉塞に起因する低酸素性虚血性傷害の動物の非痙攣性発作(NCS)を抑制し(MCaO；米国特許第7,714,020号；Lu et al., NNZ-2566, a glypromate analog, attenuates brain ischemia-induced nonconvulsive seizures in rats, J Cerebral Blood Flow metabolism (2009) 1-9)、穿通性弾道傷害の動物の神経炎症を抑制する(pTBI; Wei et al., NNZ-2566 treatment inhibits neuroinflammation and pro-inflammatory cytokine expression induced by experimental penetrating ballistic-like brain injury in rats, J. Neuroinflammation (2009) 6:19, 1-10)ことが分かった。
G-2-MePEがレット症候群及びASDの治療にも有効であるという我々の発見は、従来技術に基づくと完全に予想外である。これは、MCaOモデルのNCSは低酸素性虚血が原因であり、pTBIモデルの炎症性サイトカイン発現は穿通性外傷が原因であり、両方ともシナプスの成熟に及ぼすMECP2その他の突然変異の慢性的作用とは非常に異なる急性発作であるためである。
G-2-MePEは、本明細書で開示するGPE類似体の化合物のメンバーであるため、開示化合物のいずれもがASDの症状の治療に有効であり得る。さらに、本発明の化合物及び方法は、根底にある神経学的機構(例えば、炎症性サイトカインの放出抑制による神経炎症の低減)を取り扱うので、本発明は、症状の短期管理を超える管理を提供することができる。それどころか、本発明の化合物及び方法は神経機能を改善し、神経細胞遊走を促進し、ニューロン新生を促進し、ニューロン幹細胞の分化を促進し、軸索及び神経突起の伸長を促進し、シナプス伝達を促進し、それによってASDの有害な症状を軽減することができる。
本発明の化合物
概要では、本発明の最も広い定義を示してあるが、ここでは本発明の特定化合物について説明する。
一態様では、本発明は下記式1及び式2：
Figure 2018138606
（式中、
mは0又は1であり；
nは0又は1であり；
XはH又は-NR6R7であり；
YはH、アルキル、-CO2R5、又は-CONR6R7であり；
ZはH、アルキル、-CO2R5又は-CONR6R7であり；
R1はH、アルキル、又はアラルキルであり；
R2、R3、及びR4は独立にH又はアルキルであり；
各R5は独立にH、アルキル、又は脂肪アルコール残基であり；
各R6及びR7は独立にH、アルキル、又はアラルキルであり、或いは-NR6R7はピロリジノ、ピペリジノ、又はモルホリノである）
の化合物；
或いはYが-CO2(アルキル)であり、かつZが-CO2Hであるか又はYが-CO2Hであり、かつZがCO2(アルキル)である化合物がラクトン化されると形成されるラクトン；
及びその医薬的に許容できる塩
（但し、該化合物はGPE、N-Me-GPE、GPEアミド、APE、GPQ又はその塩でない）
を提供する。
いくつかの態様では、本発明は下記を包含する：
(a)該化合物は式1の化合物であり；
(b)mは0であり；
(c)nは1であり；
(d)X、Y、R1、R2、R3、R4、及びR5の少なくとも1つは水素でなく；
(e)Xは-NR6R7であり；かつ
(f)Yは-CO2R5又は-CO2NR6R7であり；かつ
(g)Zは-CO2R5又は-CO2NR6R7である。
本発明の他の化合物は、式1の化合物であって、式中、Xは-NR6R7であり、R6及びR7は独立にアルキル又はアラルキルである。さらに好ましい実施形態は、式1の化合物であって、式中、Xは-NR6R7であり、R6とR7は両方ともアルキルである。
本発明のさらに別の化合物は、G-2-MePE、すなわち、mが0であり、nが1であり、R1=R3=R4=H、R2がメチルであり、XがNR6R7（R6=R7=H）であり、YがCO2R5（R5=H）であり、ZがCO2R5（R5=H）である、式1の化合物である。
薬理及び有用性
本発明の化合物は抗炎症、抗アポトーシス、抗壊死及び神経保護作用を有し得る。それらのin vivo活性は、細胞数、所望マーカーの特異的染色によって、又は下記文献に記載の方法等の方法で測定可能である：Klempt ND et al: Hypoxia-ischemia induces transforming growth factor β1 mRNA in the infant rat brain. Molecular Brain Research: 13: 93-101。技術上周知又は本明細書に記載の方法を利用してそれらの活性をin vitroで測定することもできる。
加齢集団では、脳機能を冒す状態が蔓延してくる。冒された患者及びその家族を記憶喪失及び記憶障害が苦しめる。記憶喪失又は記憶障害は、通常の加齢、脳への損傷、神経変性疾患及び心理学的又は精神医学的機能障害から起こり得る。従って、記憶及び／又は認知機能を増強し、かつ記憶喪失又は記憶障害を治療又は予防する新規化合物が同定かつ特徴づけられることは、患者、その家族及び社会にとって非常に有益である。
動物系で可能性のある治療薬の効果を研究するのが望ましい。このような有用な1つの系はラットである。加齢に伴い、ラットその他の動物(ヒトを含めて)は、記憶喪失、記憶障害及び他の認知機能障害の症状を示し得ることが知られている。さらに、ラットでの治療薬の研究はヒトの治療効果を予測することが知られている。さらに、加齢ラットにおけるGPEとG-2-MePEの効果及び認知機能の研究は、獲得記憶欠陥又は他の認知機能障害を有するか又は起こしやすい加齢のヒトにおける当該薬物の治療効果を合理的に予測する。本発明の化合物は認知機能を増強し及び／又は記憶障害を治療することができる。in vivoでの認知増強活性及び治療活性は、当業者に既知の標準的な神経心理学的検査又は行動検査によって測定可能である。該検査は、上述した種々多様の利用可能な検査から選択可能であり、検査すべき認知機能及び動物の状態によって非常に異なるであろう。
実験動物の認知機能を検査するのに有用な標準的行動検査としては、限定するものではないが、モーリス水迷路検査、受動回避応答検査、新規物体認識検査、嗅覚弁別検査、8方向放射状迷路検査及びT迷路検査が挙げられる。これらの検査は、加齢ラットの認知機能に及ぼすGPE及びG-2-MePEの効果の研究に直接適用可能である。
本発明の化合物はGPEの薬理活性及び治療活性に類似した当該活性を有することも期待され、これらの活性は、技術上周知の方法、及び本明細書で引用した文書に記載の方法、及びGPEの活性を測定するために用いられる方法によって測定可能である。
化合物の治療可能比は、例えば、ラット等の適切な動物種において、低酸素性虚血性傷害等の適切なin vivoモデルで有効な抗炎症、抗アポトーシス、抗壊死活性を与える用量を、試験動物種に有意な観測可能な副作用を与える用量と比較することによって決定可能である(Sirimanne ES, Guan J, Williams CE and Gluckman PD: Two models for determining the mechanisms of damage and repair after hypoxic-ischemic injury in the developing rat brain (Journal of Neuroscience Methods: 55: 7-14, 1994))。
化合物の治療可能比は、例えばラット等の適切な動物種において、適切なin vivoモデルで有効な認知機能増強を与えるか又はの記憶障害を治療する用量(下記実施例4、5及び6)を、試験動物種で有意な体重減少(又は他の観測可能な副作用)を与える用量と比較することによっても決定可能である。
本発明の化合物は、種々の神経変性障害、例えば低酸素／虚血及び神経変性(米国特許第7,041,314号)、外傷性脳損傷、運動障害及び発作、脳卒中、並びに冠動脈バイパス移植術(米国特許第7,605,177号)、非痙攣性発作(米国特許第7,714,020号)、及び認知機能の障害(米国特許出願第12/903,844号)等の治療で役に立ち得る。加えて、さらに完全に本明細書で後述するように、本発明の化合物は、レット症候群の治療（寿命の延長、ニューロン活動の増加及びレット症候群と関連する発作の治療を含めて）に役に立ち得る。
マウスでのレット症候群の一研究では(MeCP2ノックアウトモデル使用)、GPEは寿命を延ばし、ニューロンの機能を高める効果を有することが分かった(米国特許出願公開第2009/0099077号)。しかしながら、本明細書でさらに開示するように、天然に存在するペプチドであるGPEは、in vivo及びin vitroで急速に分解するので、レット症候群の患者の慢性治療におけるその有用性は不明である。
医薬組成物及び投与
一般に、本発明の化合物は、治療的に有効な量で、技術上周知のいずれの通常の様式でも、単独で又は本発明の少なくとも1種の他の化合物及び／又は治療する疾患の少なくとも1種の通常の治療薬と併用して投与可能である。治療的に有効な量は、疾患又は傷害、疾患の重症度、治療する動物の年齢及び相対的な健康、化合物の効力その他の要因によって広範に変化する。抗炎症、抗アポトーシス、抗壊死、抗神経変性薬として、本発明の化合物の治療的に有効な量は、動物の質量1kg当たり約0.001ミリグラム(mg/kg)〜約100(mg/kg)、例えば、約0.1〜約10mg/kgに及んでよく、脳室内投与等の脳脊髄液を通じた投与では約0.001〜約0.1mg/kg、例えば約0.01mg/kg等の低用量が適しており、また、経口、全身(例えば経皮)、又は非経口(例えば静脈内)投与等の方法による投与では約1〜約100mg/kg、例えば約10mg/kg等の高用量が適している。当業者は、過度の実験を行なうことなく、当該スキル及びこの開示を考慮して、所定の疾患又は傷害の治療的に有効な本発明の量を決定することができる。
一般に、本発明の化合物を下記経路の1つにより医薬組成物として投与することができる：経口、局所、全身(例えば経皮、鼻内、又は座剤で)、又は非経口(例えば筋肉内、皮下、又は静脈内注射)、CNSへの投与(例えば脊髄内又は大槽内(intercisternal)注射で)；インプラント術、浸透圧ポンプ、埋め込み型ポンプ、経皮パッチ等のデバイスを介した注入。組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、半固体、散剤、徐放製剤、溶液、懸濁液、エリキシル剤、エアロゾル、可溶性ゲルその他の適切な組成物の形をとることができ；本発明の少なくとも1種の化合物を、少なくとも1種の医薬的に許容できるか又は生理学的に許容できる賦形剤と併せて含む。適切な賦形剤は当業者には周知であり、それら及び組成物の配合方法はGennaro AR: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2000のような標準的文献で見つけられる。適切な、特に注射溶液用の液体担体として、水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、グリコール等が挙げられ、静脈内、脊髄内、及び大槽内投与には等張溶液が好ましく、特にCNSへの化合物の投与には人工脳脊髄液等のビヒクルも適している。参照によって明白に上記テキスト全体を本明細書に援用する。
本発明の化合物を錠剤又はカプセル剤で経口投与することができる。一部の実施形態では、本発明の化合物をマイクロエマルション、粗エマルション、液晶、又はナノカプセルの形の油中水エマルションの状態で調製することができる(米国特許出願第12/283,684号、現在は2011年2月15日に発行された米国特許第7,887,839号)。本発明の化合物は、実質的な経口バイオアベイラビリティを有するので、便利かつ慢性投与に有利に使用することができる。さらに、経口利用可能な組成物には、活性化合物を含む可溶性ヒドロゲルがあり、患者が錠剤又はカプセル剤を嚥下する必要なしで神経保護化合物の経口投与を可能にする。このような徐放材料及びゲルは技術上周知である。
神経変性又はその症状をもたらす可能性のある状態の発生の後又は前に本発明の化合物を投与することができる。例えば、冠動脈バイパス移植(CABG)術中に低酸素／虚血が起こり得ることが知られている。従って、体外式人工肺(extracorporeal oxygenation)システムを設置する前に本発明の化合物で患者を前処置することができる。一部の実施形態では、手術の4時間前又は外傷その他の神経損傷につながる可能性のある事象の前に本発明の化合物を投与するのが望ましい。他の実施形態では、手術中又は神経参照を修復するための外科手順中に本発明の化合物を注入するのが望ましいことがある。緊急状況、例えば、脳卒中、低酸素事象、外傷性能損傷その他の急性発作を経験したばかりの患者に本発明の化合物を使用することもできる。該状況では、神経損傷の診断を行なった直後に本発明の化合物を投与することができる。
状況によっては、現場で使用する前に本発明の化合物を含むキットを調製することができる。キットは、医薬的に許容できる製剤(例えば、注射又は経口投与用)中に本発明の化合物を含むバイアルを、注射器又は他の送達デバイス、及び使用説明書と共に含むことができる。発作が診断された状況では、本発明の化合物を抗痙攣薬と共に投与することができる。多くの抗痙攣薬は技術上周知であり、ここに詳述する必要はない。
さらに、外傷性損傷、脳卒中又は外科手段等の一次発作後に「続発性」神経損傷が起こることがある。例えば、脳卒中、穿通性頭部外傷又はCABG手順後に神経組織の炎症が神経変性をもたらす恐れがある。続発性損傷は、炎症細胞(例えば、アストロサイト及び／又はミクログリア)の活性化の増加によって反映され、炎症メディエーターの作用が神経損傷を引き起こし得る。従って、一部の実施形態では、発作の前に開始する期間、発作後約100時間まで、本発明の化合物を投与するのが望ましいことがある。他の実施形態では、発作の前に開始する期間、発作中及び発作後に、点滴として連続的に、又は所望の時間間隔で分離した個別用量で本発明の化合物を投与するのが望ましいことがある。
本発明の化合物を持続放出システム又は中にG-2-MePEを組み入れたゲル材料によって適宜投与することもできる。持続放出組成物の適切な例には、成形品の形をした半浸透性ポリマーマトリックス、例えば、フィルム、又はマイクロカプセルがある。持続放出マトリックスとして、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号；EP 58,481)、L-グルタミン酸及びγ-エチル-L-グルタマート(Sidman et al., 1983)、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリラート)(Langer et al., 1981)、エチレンビニルアセタート(Langer et al., 前出)、又はポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸(EP 133,988)が挙げられる。さらに、多糖類(例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、キトサンその他のセルロース誘導体)及びポリエチレンオキシド誘導体(例えばポリエチレングリコール)に基づいたゲル組成物を使用することができる。これらのゲル組成物は水溶液に溶け、生体適合性であり、無毒なので、本発明の化合物をいずれの粘膜表面、例えば口腔、鼻咽頭、尿生殖路、腸又は直腸に投与するためにも使用可能である。
持続放出組成物には、リポソームに捕捉された化合物も含まれる。本化合物を含むリポソームは、それ自体既知の方法で調製される：DE 3,218,121；Epstein et al., 1985；Hwang et al., 1980；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本国特許出願83-118008；米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号；並びにEP 102, 324。通常、リポソームは小さい(つまり約200〜800Å)単層型のものであり、脂肪分は約30モルパーセントを超えるコレステロールであり、最も効果的な療法に合わせて選択された比率に調整される。上で特定した全ての出版物は、あたかもそれぞれが別々に援用されたかのように、参照によって全て明白に本明細書に援用される。
本発明の化合物を、例えば、WO 95/32003に記載されている抱合技術に基づいて、ポリエチレングリコールに付着させて(「PEG化」)、それらのin vivo寿命を延ばすこともできる。
望ましくは、可能ならば、抗炎症薬、抗アポトーシス薬、抗壊死薬、又は抗神経変性薬として投与するとき、本発明の化合物を経口投与することができる。組成物中の本発明の化合物の量は、組成物のタイプ、単位用量のサイズ、賦形剤の種類、及び当業者に周知の他の要因によって広範に変化し得る。一般に、最終組成物は約0.0001質量%(%w)〜約10%w、好ましくは役0.001%w〜約1%wの本発明の化合物を含み、残りは賦形剤(複数可)である。
組成物は、本発明の化合物に加えて、必要に応じて、例えば、成長因子と関連誘導体(インスリン様成長因子I(IGF-I)、インスリン様成長因子II(IGF-II)、トランスフォーミング成長因子β1、アクチビン、成長ホルモン、神経成長因子、脳由来神経栄養因子(BDNF)、成長ホルモン結合タンパク質、IGF結合タンパク質(特にIGFBP-3)、塩基性線維芽細胞成長因子、酸性線維芽細胞成長因子、hst/Kfgk遺伝子産物、FGF-3、FGF-4、FGF-6、ケラチノサイト成長因子、アンドロゲン誘発性成長因子から選択される少なくとも1種の薬剤を含んでよい。FGFファミリーのさらなるメンバーとして、例えば、int-2、線維芽細胞成長因子相同因子1(FHF-1)、FHF-2、FHF-3及びFHF-4、ケラチノサイト成長因子2、グリア細胞活性化因子、FGF-10及びFGF-16、毛様体神経栄養因子、脳由来成長因子、ニューロトロフィン3、ニューロトロフィン4、骨形成タンパク質2(BMP-2)、グリア細胞系由来神経栄養因子、活性依存性神経栄養因子(activity-dependant neurotrophic factor)、サイトカイン白血病抑制因子、オンコスタチンM、インターロイキン、α-、β-、γ-、又はコンセンサスインターフェロン、及びTNFαが挙げられる。他の型の神経保護治療薬として、例えば、クロメチアゾール；キヌレン酸、Semax、タクロリムス、L-スレオ-1-フェニル-2-デカノイルアミノ-3-モルホリノ-1-プロパノール、アンドレノコルチコトロピン-(4-9)類似体[ORG 2766]及びジゾシルピン(dizolcipine)(MK-801)、セレギリン；グルタミン酸拮抗薬、例えばメマンチン(mematine)(Namenda) NPS1506、GV1505260、MK-801、GV150526；AMPA拮抗薬、例えば2,3-ジヒドロキシ-6-ニトロ-7-スルファモイルベンゾ(f)キノキサリン(NBQX)、LY303070及びLY300164；アドレシンMAdCAM-1及び／又はそのインテグリンα4受容体(α4β1及びα4β7)に対する抗炎症薬、例えば抗MAdCAM-1mAb MECA-367(ATCC受け入れ番号HB-9478)が挙げられる。フェノバム(fenobam)等の代謝型グルタミン酸受容体拮抗薬も役立ち得る。また、本発明の化合物に加えて、組成物は、選択的セロトニン再取り込み阻害薬、例えばフルオキセチン、選択的ノルエピネフリン(norepinephine)再取り込み阻害薬、例えばビロキサジン、又は非定型抗精神病薬、例えばリスペリドンを含んでよい。これらの薬剤の多く、特に成長因子等のペプチドは、経口では活性でないので、注射又は点滴による投与が必要であろう。
組成物の調製
これらの化合物の調製で使う出発物質及び試薬は、Aldrich Chemical Company(Milwaukee, Wis.)、Bachem(Torrance, Calif.)、Sigma(St.Louis, Mo.)等の商業的供給業者から入手可能であり、或いは当業者に周知の方法で、下記文献に記載の手順に従って調製される：Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, vols 1-17, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1991; Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, vols. 1-5 and supplements, Elsevier Science Publishers, 1989; Organic Reactions, vols. 1-40, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1991; March J; Advanced Organic Chemistry, 4th ed. John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1992; and Larock: Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, 1989。ほとんどの場合、アミノ酸及びそれらのエステル又はアミド、及び保護されたアミノ酸は広く市販されており；修飾されたアミノ酸及びそれらのアミド又はエステルの調製は化学及び生化学文献に記載されているので、当業者には周知である。例えば、N-ピロリジン酢酸はDega-Szafran Z and Pryzbylak R. 双性イオンα-(1-ピロリジン)アルカノカルボン酸及びそれらのN-メチル誘導体の合成、IR、及びNMR研究。J. Mol. Struct.: 436-7, 107-121, 1997に記載され；N-ピペリジン酢酸は、Matsuda O, Ito S, and Sekiya M. N-(アルコキシメチル)ジアルキルアミン及びN,N′-メチレンジアルキルアミンとイソシアニドの反応。Chem. Pharm. Bull.: 23(1), 219-221, 1975に記載されている。上述した各出版物は、あたかも個々に参照によって全体が本明細書に援用されたかのように、参照によって全体が本明細書に援用される。
本発明の出発物質、中間体、及び化合物は、ろ過、蒸留、結晶化、クロマトグラフィー等を含め、通常の技術を利用して単離及び精製され得る。それらは、物理的定数及びスペクトルデータを含め、通常の方法を利用して特徴づけし得る。
本発明の化合物は、下記方法により、また実施例で述べるように調製される。
式1の化合物はGPEの類似体、又はその変形、例えばエステル又はアミドである。一般に、それらはペプチド及び修飾されたペプチドの合成の当業者に既に周知の方法によって、或いは本明細書に添付の図1〜11に示す反応スキームに従って、或いはペプチド及び類似体の合成の当業者に周知の他の方法に従って調製可能である。
便宜上、本発明のポリペプチドの合成製造はMerrifield et al. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide: J. Amer. Chem. Soc.: 85, 2149-2156, 1963に記載の固相合成方法に従ってよい。この技術はよく理解されており、ペプチドの一般的調製方法である。この方法の一般概念は、鎖の第1アミノ酸の固体ポリマーへの共有結合による付着に依存する。続いて、1つずつ(段階的策略)、又はブロックで(セグメント策略)、所望の配列が構築されるまで、保護されたアミノ酸を添加する。最後に、保護されたペプチドを固体樹脂支持体から除去し、保護基を切断する。この手順によって、試薬及び副生物をろ過で除去することで、中間体を精製する必要性を排除する。
樹脂としていずれの適切なポリマーにもアミノ酸を付着させてよい。樹脂は第1の保護されたアミノ酸が共有結合によってしっかり連結できる官能基を含まなければならない。この目的には、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリラート及びポリスチレン等の種々のポリマーが適している。好適な樹脂は商業的に入手可能であり、技術上周知である。該合成で使用し得る適切な保護基として、tert-ブチルオキシカルボニル(BOC)、ベンジル(Bzl)、t-アミルオキシカルボニル(Aoc)、トシル(Tos)、o-ブロモ-フェニルメトキシカルボニル(BrZ)、2,6-ジクロロベンジル(BzlCl2)、及びフェニルメトキシカルボニル(Z又はCBZ)が挙げられる。さらなる保護基は、上記Merrifield、及びMcOmie JFW: Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, 1973に特定されている。両文献は、明示的に本明細書に全体が援用される。
本発明のペプチドを調製するための一般手順は最初に、カルボキシル末端が保護されたアミノ酸の樹脂への付着を含む。付着後、樹脂をろ過し、洗浄し、カルボキシル末端アミノ酸のI-アミノ基上の保護基(望ましくはBOC)を除去する。この保護基の除去は、当然に、アミノ酸と樹脂との間の結合を破壊せずに起こらなければならない。次のアミノ、必要ならば、側鎖保護アミノ酸を、樹脂上のアミノ酸のフリーのI-アミノ基にカップリングする。このカップリングは、第2アミノ酸のフリーのカルボキシル基と樹脂に付着した第1アミノ酸のアミノ基との間のアミド結合の形成によって起こる。この一連の事象が連続的アミノ酸により、全てのアミノ酸が樹脂に付着されるまで繰り返される。最後に、保護されたペプチドが樹脂から切断され、保護基が除去されて所望ペプチドが現れる。樹脂からペプチドを分離するため及び保護基を除去するために用いる切断技術は、樹脂及び保護基の選択によって決まり、ペプチド合成の当業者に周知である。
ペプチド合成の代替技術はBodanszky et al, Peptide Synthesis, 2nd ed, John Wiley and Sons, New York, 1976に記載されている。例えば、アミド結合形成の化学的又は酵素的方法を用いるアミノ酸又はペプチドフラグメントの段階的又はブロックカップリングを含む標準的な溶液ペプチド合成方法論を利用して本発明のペプチドを合成してもよい(例えば、H. D. Jakubke in The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Academic Press, New York, 1987, p. 103-165; J. D. Glass, ibid., pp. 167-184；及び酵素的ペプチド合成方法を記載している欧州特許0324659 A2を参照されたい)。これらの溶液合成方法は技術上周知である。上記各出版物は、あたかも個々に本明細書に援用されたかのように、参照によって全体が本明細書に明示的に援用される。
これらの方法を実施するためにApplied Biosystems Model 430A等の市販のペプチド合成機を利用できる。
当業者は、本発明の化合物に適した1つ以上の合成方法を開発する際に、利用可能なスキル及び知識、並びにこの開示を考慮すれば、過度の実験を企てる必要はないだろう。
例えば、GPEのグリシン残基が代替アミノ酸、又は非アミノ酸と置き換わっている類似体は、図2及び3に示すように、C保護プロリン-グルタミン酸ジペプチド(例えばジベンジルエステル)の調製、及び当該ジペプチドとN保護グリシン類似体、例えばBOC-N-メチルグリシン、BOC-L-バリン、N-ピロリジン酢酸等とのカップリング後の脱保護によって便利に調整可能である。GPEのグルタミン酸残基が代替アミノ酸又はアミノ酸アミド若しくはエステルと置き換わっている類似体は、N保護グリシン-L-プロリンジペプチド(例えばBOC-グリシル-L-プロリン)の調製、及び当該ジペプチドとC保護グルタミン酸又はその類似体、例えばγ-アミノ酪酸tert-ブチル、4-アミノ-4-ジメチルカルバモイル酪酸メチル、L-グルタミンメチルエステル、I-メチルグルタミン酸ジメチル等とのカップリングによって便利に調製可能である。ラクトンは、適切な一酸一エステル誘導体の調製及び還元によって調製可能である。R2がアルキルである類似体は、合成で単に適切な2-アルキルプロリンを用いて便利に調製可能であり、同様にR3がアルキルである類似体は、合成で適切なN-アルキルグルタミン酸又は類似体を用いて便利に合成可能である。2つ以上のアミノ酸に修飾を加えるべき場合でも、カップリング技術は同一であり、合成で単に複数の修飾アミノ酸又は類似体を使用するだけである。選ばれた方法(固相又は溶液相)に適した保護基、及び固相合成を利用する場合、適切な基質の選択は当業者のスキルの範囲内であろう。
式2の化合物は、適宜保護された5-オキソ-L-プロリン又はその類似体若しくは誘導体から、図2に示すカップリング反応に匹敵する、図2の中間体Aを与えるためのプロリンカルボキシル基と保護グルタミン酸又は類似体又は誘導体のカップリング、次いでピロリジン窒素をアルキル化条件下で、必要に応じてAで保護された式A----(CH2)m---CH(R1)---CH2Rの基（式中、Rは脱離基である）を用いるアルキル化等の方法に従って調製可能である。或いは、適宜保護された5-オキソ-L-プロリンを最初にピロリジン窒素のところでアルキル化して図4の中間体Bの類似体を得てから、これを適宜保護されたグルタミン酸又は類似体又は誘導体と図4〜9に示す様式でカップリングしてもよい。
実施例
下記実施例は本発明の実施形態を説明することを意図しており、これらの特定の実施例に本発明の範囲を限定するものではない。当業者は、本明細書に示す開示及び教示を適用して、過度の実験を行なわずに、成功の可能性を有して、他の実施形態を開発することができる。このような全ての実施形態は本発明の一部とみなされる。
実施例1：N,N-ジメチルグリシル-L-プロリル)-L-グルタミン酸の合成
下記非限定例は、本発明の化合物、N,N-ジメチルグリシル-L-プロリル-L-グルタミン酸の合成を示す。
Figure 2018138606
全ての出発物質その他の試薬はAldrichから購入した；BOC=tertブトキシカルボニル；Bn=ベンジル。
BOC-L-プロリン-(β-ベンジル)-L-グルタミン酸ベンジルエステル
0℃に冷却したジクロロメタン(50ml)中のBOC-プロリン[Anderson GW and McGregor AC: J. Amer. Chem. Soc.: 79, 6810, 1994](10mmol)の溶液にトリエチルアミン(1.39ml,10mmol)及びクロロギ酸エチル(0.96ml,10mmol)を添加した。結果として生じた混合物を0℃で30分間撹拌した。次にジベンジル-L-グルタマート(10mmol)の溶液を加えて混合物を0℃で2時間撹拌してから室温に戻して一晩撹拌した。反応混合物を炭酸水素ナトリウム水溶液及びクエン酸(2mol l-1)で洗浄してから乾燥させ(MgSO4)、減圧下で濃縮してBOC-L-プロリン-L-グルタミン酸ジベンジルエステルを得た(5.0g,95%)。
L-プロリン-L-グルタミン酸ジベンジルエステル
0℃に冷却したBOC-L-グルタミル-L-プロリンジベンジルエステル(3.4g,10mmol)の溶液をトリフルオロ酢酸(25ml)で2時間室温で処理した。減圧下での揮発物質の除去後、残渣をエーテルと摩砕してL-プロリン-L-グルタミン酸ジベンジルエステルを得た。
N,N-ジメチルグリシル-L-プロリル-L-グルタミン酸
ジシクロヘキシルカルボジイミド(10.3mmol)のジクロロメタン(10ml)中の溶液をL-プロリン-L-グルタミン酸ジベンジルエステル(10mmol)、N,N-ジメチルグリシン(10mmol)と トリエチルアミン(10.3mmol)のジクロロメタン(30ml)中の撹拌かつ冷却(0℃)溶液に添加した。混合物を0℃で一晩撹拌してから室温で3時間撹拌した。ろ過後、ろ液を減圧下でエバポレートした。結果として生じた粗製ジベンジルエステルを、木炭上10%パラジウム(0.5g)を含む酢酸エチル(30ml)とメタノール(30ml)の混合物に溶かしてから、部屋の温度と圧力で水素の取込みが止むまで水素化した。ろ過した溶液をエバポレートし、酢酸エチルから再結晶させてトリペプチド誘導体を得た。
当然に、実施例の方法に従い、かつ代替アミノ酸又はそのアミド若しくはエステルを用いて、式1の他の化合物を得ることもできる。
実施例2：グリシル-L-2-メチル-L-プロリル-L-グルタマートの合成
Figure 2018138606
L-2-メチルプロリン及びL-グルタミン酸ジベンジルエステルp-トルエンスルホナートはBachemから購入し、N-ベンジルオキシカルボニル-グリシンはAcros Organicsから購入し、ビス(2-オキソ-3-オキサゾリジニル)ホスフィン酸クロリド(BoPCl,97%)はAldrich Chem. Co.から購入した。
L-2-メチルプロリンメチル塩酸塩2
塩化チオニル(5.84cm3,80.1mmol)を窒素雰囲気下-5℃で(L)-2-メチルプロリン1(0.43g,3.33mmol)の無水メタノール(30cm3)中の溶液に注意して滴加した。反応混合物を還流させながら24時間加熱し、結果として生じた淡黄色溶液を真空中で濃縮乾固させた。残渣をメタノールとトルエンの1:1混合物(30cm3)に溶かしてから濃縮乾固させて塩化チオニルを除去した。この手順を2回以上繰り返して塩酸塩2(0.62g,104%)を吸湿性の分光学的に純粋なオフホワイトの固体として得た：mp 127-131℃；[α]D -59.8 (c CH2Cl2中0.24); νmax (フィルム)/cm-1 3579, 3398 br, 2885, 2717, 2681, 2623, 2507, 1743, 1584, 1447, 1432, 1374, 1317, 1294, 1237, 1212, 1172, 1123, 981, 894, 861 and 764; δH (300 MHz; CDCl3; Me4Si) 1.88 (3H, s, Proα-CH3), 1.70-2.30 (3H, br m, Proβ-HAHB及びProγ-H2), 2.30-2.60 (1H, br m, Proβ-HAHB), 3.40-3.84 (2H, br m, Proδ-H2), 3.87 (3H, s, CO2CH3), 9.43 (1H, br s, NH)及び10.49 (1H, br s, HCl); δC (75 MHz; CDCl3) 21.1 (CH3, Proα-CH3), 22.4 (CH2, Proγ-C), 35.6 (CH2, Proβ-C), 45.2 (CH2, Proδ-C), 53.7 (CH3, CO2CH3), 68.4 (quat., Proα-C) and 170.7 (quat., CO); m/z (FAB+) 323.1745 [M2.H35Cl.H+: (C7H13NO2)2. H35Cl.Hは323.1738を必要とする]及び325.1718 [M2.H37Cl.H+: (C7H13NO2)2. H37Cl.Hは325.1708を必要とする]。
N-ベンジルオキシカルボニル-グリシル-L-2-メチルプロリン5
無水トリエチルアミン(0.45cm3,3.23mmol)を窒素雰囲気下0℃でL-2-メチルプロリンメチル塩酸塩2(0.42g,2.34mmol)とN-ベンジルオキシカルボニル-グリシン(98.5%)3(0.52g,2.45mmol)の塩化メチレン(16cm3)中の溶液に滴加した。結果として生じた溶液を20分間撹拌し、1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド(0.56g,2.71mmol)の塩化メチレン(8cm3)中の溶液を0℃で滴加し、反応混合物を室温に温めてさらに20時間撹拌した。結果として生じた白色混合物をCeliteTMパッドを通してろ過し、部分的に1,3-ジシクロヘキシル尿素を除去し、パッドを塩化メチレン(50cm3)で洗浄した。ろ液を連続的に10%塩酸水溶液(50cm3)及び炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(50cm3)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、ろ過し、真空中で濃縮乾固させた。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(35gのSiO2；30〜70%の酢酸エチル-ヘキサン；勾配溶出)でさらに精製してとりあえずN-ベンジルオキシカルボニル-グリシル-L-2-メチルプロリンメチル4(0.56g)（1,3-ジシクロヘキシル尿素含有）を白色半固体として得た：Rf 0.65 (EtOAc); m/z (EI+) 334.1534 (M+. C17H22N2O5は334.1529を必要とする)及び224(1,3-ジシクロヘキシル尿素)。
不純なプロリン4(0.56g,約1.67mmol)の1,4-ジオキサン(33cm3)中の溶液に1M水酸化ナトリウム水溶液(10cm3,10mmol)を滴加して混合物を室温で19時間撹拌した。次に塩化メチレン(100cm3)を加えて有機層を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(2×100cm3)で抽出した。混ぜ合わせた水層を塩酸(32%)で慎重に酸性にし、塩化メチレン(2×100cm3)で抽出し、混ぜ合わせた有機層を乾燥させ(MgSO4)、ろ過し、真空中で濃縮乾固させた。結果として生じた残渣(0.47g)をフラッシュクロマトグラフィー(17gのSiO2；50%の酢酸エチル-ヘキサン→30%のメタノール-ジクロロメタン；勾配溶出)で精製してN保護ジペプチド5(0.45g,60%)を、塩酸塩2からの2工程で白色泡として得た。ジペプチド5は、NMR解析により排他的にトランス配向コンフォマーであることが分かった：Rf 0.50 (20% MeOH - CH2Cl2); [α]D -62.3 (c 0.20 in CH2Cl2); νmax (フィルム)/cm-1 3583, 3324 br, 2980, 2942, 1722, 1649, 1529, 1454, 1432, 1373, 1337, 1251, 1219, 1179, 1053, 1027, 965, 912, 735及び698; δH (300 MHz; CDCl3; Me4Si) 1.59 (3H, s, Proα-CH3), 1.89 (1H, 6線, J 18.8, 6.2及び6.2, Proβ-HAHB), 2.01 (2H, dtt, J 18.7, 6.2及び6.2, Proγ-H2), 2.25-2.40 (1H, m, Proβ-HAHB), 3.54 (2H, t, J 6.6, Proδ-H2), 3.89 (1H, dd, J 17.1及び3.9, Glyα-HAHB), 4.04 (1H, dd, J 17.2及び5.3, Glyα-HAHB), 5.11 (2H, s, OCH2Ph), 5.84 (1H, br t, J 4.2, N-H), 7.22-7.43 (5H, m, Ph)及び7.89 (1H, br s, -COOH); δC (75 MHz; CDCl3) 21.3 (CH3, Proα-CH3), 23.8 (CH2, Proγ-C), 38.2 (CH2, Proβ-C), 43.6 (CH2, Glyα-C), 47.2 (CH2, Proδ-C), 66.7 (quat, Proα-C), 66.8 (CH2, OCH2Ph), 127.9 (CH, Ph), 127.9 (CH, Ph), 128.4, (CH, Ph), 136.4 (quat., Ph), 156.4 (quat., NCO2), 167.5 (quat., Gly-CON)及び176.7 (quat., CO); m/z (EI+) 320.1368 (M+. C16H20N2O5は320.1372を必要とする)。
N-ベンジルオキシカルボニル-グリシル-L-2-メチルプロリル-L-グルタミン酸ジベンジル7
トリエチルアミン(0.50cm3,3.59mmol)をジペプチド5(0.36g,1.12mmol)とL-グルタミン酸ジベンジルエステルp-トルエンスルホナート6(0.73g,1.46mmol)の塩化メチレン(60cm3)中の溶液に窒素下室温で滴加し、反応混合物を10分間撹拌した。ビス(2-オキソ-3-オキサゾリジニル)ホスフィン酸クロリド(BoPCl,97%)(0.37g,1.41mmol)を加えて無色溶液を17時間撹拌した。塩化メチレン溶液を連続的に10%塩酸水溶液(50cm3)及び炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(50cm3)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、ろ過し、真空中で蒸発乾固させた。結果として生じた残渣を反復(2×)フラッシュカラムクロマトグラフィー(24gのSiO2；30〜70%の酢酸エチル-ヘキサン；勾配溶出)で精製して完全に保護されたトリペプチド7(0.63g,89%)を無色油として得た。トリペプチド7は、NMR解析により排他的にトランス配向コンフォマーであることが分かった：Rf 0.55 (EtOAc); [α]D -41.9 (c 中CH2Cl20.29); νmax (film)/cm-1 3583, 3353 br, 2950, 1734, 1660, 1521, 1499, 1454, 1429, 1257, 1214, 1188, 1166, 1051, 911, 737及び697; δH (400 MHz; CDCl3; Me4Si) 1.64 (3H, s, Proα-CH3), 1.72 (1H, dt, J 12.8, 7.6及び7.6, Proβ-HAHB), 1.92 (2H, 5線, J 6.7, Proγ-H2), 2.04 (1H, 6線, J 7.3 Gluβ-HAHB), 2.17-2.27 (1H, m, Gluβ-HAHB), 2.35-2.51 (3H, m, Proβ-HAHB及びGluγ-H2), 3.37-3.57 (2H, m, Proδ-H2), 3.90 (1H, dd, J 17.0及び3.6, Glyα-HAHB), 4.00 (1H, dd, J 17.1及び5.1, Glyα-HAHB), 4.56 (1H, td, J 7.7及び4.9, Gluα-H), 5.05-5.20 (6H, m, 3 x OCH2Ph), 5.66-5.72 (1H, br m, Gly-NH), 7.26-7.37 (15H, m, 3 x Ph)及び7.44 (1H, d, J 7.2, Glu-NH); δC (100 MHz; CDCl3) 21.9 (CH3, Proα-CH3), 23.4 (CH2, Proγ-C), 26.6 (CH2, Gluβ-C), 30.1 (CH2, Gluγ-C), 38.3 (CH2, Proβ-C), 43.9 (CH2, Glyα-C), 47.6 (CH2, Proδ-C), 52.2 (CH, Gluα-C), 66.4 (CH2, OCH2Ph), 66.8 (CH2, OCH2Ph), 67.1 (CH2, OCH2Ph), 68.2 (quat, Proα-C), 127.9 (CH, Ph), 128.0 (CH, Ph), 128.1, (CH, Ph), 128.2, (CH, Ph), 128.2, (CH, Ph), 128.3, (CH, Ph), 128.4, (CH, Ph), 128.5, (CH, Ph), 128.5, (CH, Ph), 135.2 (quat., Ph), 135.7 (quat., Ph), 136.4 (quat., Ph), 156.1 (quat., NCO2), 167.3 (quat., Gly-CO), 171.4 (quat., CO), 172.9 (quat., CO)及び173.4 (quat., CO); m/z (FAB+) 630.2809 (MH+. C35H40N3O8は630.2815を必要とする)。
グリシル-L-2-メチルプロリル-L-グルタミン酸(G-2-MePE)
91:9のメタノール-水(22cm3)中の保護トリペプチド7(0.63g,1.00mmol)と活性炭上10wt.%パラジウム(0.32g,0.30mmol)の混合物を水素雰囲気下で室温にて光から保護して23時間撹拌した。反応混合物をCeliteTMパッドを通してろ過し、パッドを75:25のメタノール-水(200cm3)で洗浄した。ろ液を減圧下で濃縮乾固させ、残渣を無水ジエチルエーテルと摩砕して、とりあえずG-2-MePEとメチルアミン8の38:1混合物(0.27g,86%)を極端に吸湿性の白色固体として得た。混合物に関する分析逆相HPLC研究[Altech Econosphere C18 Siカラム、150×4.6mm、5μm；H2O(0.05%TFA)で5分のフラッシュ後、25分にわたって1ml/分の流速で溶出液としてMeCNへの定常勾配；ダイオードアレイを用いて検出]は、それがそれぞれ、207及び197nmで13.64及び14.44分の保持時間を有する2つの溶出ピークの38:1混合物であることを示した。G-2-MePEは、1H NMR解析により、コンフォマーの73:27のトランス：シス混合物であることが分かった(それぞれ多量コンフォマー及び少量コンフォマーのGluα-Hプロトンに割り当てられた、δ 4.18及び3.71における二重の二重線及び三重線の相対強度から比を推定した)：mp 144℃; [α]D -52.4 (c H2O中0.19); δH (300 MHz; D2O; 内部MeOH) 1.52 (3H, s, Proα-CH3), 1.81-2.21 (6H, m, Proβ-H2, Proγ-H2及びGluβ-H2), 2.34 (1.46H, t, J 7.2, Gluγ-H2), 2.42 (0.54H, t, J 7.3, Gluγ-H2), 3.50-3.66 (2H, m, Proδ-H2), 3.71* (0.27H, t, J 6.2, Gluα-H), 3.85 (1H, d, J 16.6, Glyα-HAHB), 3.92 (1H, d, J 16.6, Glyα-HAHB)及び4.18 (0.73H, dd, J 8.4及び4.7, Gluα-H); δC (75 MHz; D2O; 内部MeOH) 21.8 (CH3, Proα-CH3), 25.0 (CH2, Proγ-C), 27.8* (CH2, Gluβ-C), 28.8 (CH2, Gluβ-C), 32.9 (CH2, Gluγ-C), 40.8 (CH2, Proβ-C), 42.7 (CH2, Glyα-C), 49.5 (CH2, Proδ-C), 56.0* (CH, Gluα-C), 56.4 (CH, Gluα-C), 69.8 (quat, Proα-C), 166.5 (quat., Gly-CO), 177.3 (quat., Pro-CON), 179.2 (quat., Gluα-CO), 180.2* (quat., Gluγ-CO)及び180.6 (quat., Gluγ-CO); m/z (FAB+) 316.1508 (MH+. C13H22N3O6は316.1509必要とする)。
実施例3：in vitro神経保護
一連のin vitro実験でGPE類似体の治療効果を調査して、異なる起源の神経細胞の神経変性に及ぼすそれらの効果を決定した。本明細書に記載のin vitroシステムは技術上よく確立されており、神経変性障害を患っているヒトにおける効果を含め、in vivoで観察される神経保護効果を予測できることが知られている。
材料及び方法
下記実験プロトコルは、オークランド大学動物倫理委員会(University of Auckland Animal Ethics Committee)によって認可された指針に従った。
代謝細胞培養上清の収集用の皮質アストロサイト培養の調製
生後1日のラットからの1つの皮質半球を使用し、4mlのDMEMにまとめた。5mlのガラスピペットと18ゲージ針を用いて摩砕を行なった。細胞懸濁液を100μmの細胞ストレーナーで篩過し、50mlのDMEM(250gで5分間遠心分離)で洗浄した。沈降物を20mlのMEM+10%ウシ胎仔血清に再懸濁させた。懸濁液を2つの25cm3フラスコに添加し(10ml／フラスコ)、10%CO2の存在下で37℃にて培養した後、1週間に2回培地を変えた。細胞がコンフルエンスに達したら、細胞をPBSで3回洗浄し、Neurobasal/B27に調整し、さらに3日間インキュベートした。この上清を一時的貯蔵のため-80℃に凍結させた。
ラットE18/E19胎仔からの線条体(Stratial)組織及び皮質組織の調製
雌親をCO2処置により屠殺してから帝王切開の準備をした。手術後、胎仔をそれらの羊膜嚢から取り出して断頭した。頭を氷上で、線条体についてはDMEM/F12培地内に置き、皮質についてはPBS+0.65%D(+)-グルコース内に置いた。
線条体組織抽出手順及び細胞の調製
DMEM/F12培地内で腹側を上にして脳全体を頭蓋骨から取り出した。立体顕微鏡下で線条体を両半球から解体し、線条体組織を氷上のFalconチューブに入れた。容積1mlのP1000ピペッターを用いて線条体組織を摩砕した。溶液をピペット先端まで上下に穏やかに15回ピペット操作し、交互の流出に対するせん断力を用いて組織を摩砕した。30秒以内でFalconチューブの底に組織片が沈殿した。次に、解離した単細胞の懸濁液を含む上清を氷上の新しい無菌のFalconチューブに移した。既に解離した細胞を過剰摩砕することによって過度に損傷しないように組織片を再び摩砕した。1mlの氷冷DMEM/F12培地を最初のチューブ内の組織片に添加し、前述同様に摩砕した。組織片を沈殿させ、上清を氷上の新しい無菌のFalconチューブに取り出した。細胞を4℃で250gにて5分間遠心分離させた。
線条体細胞のプレーティング及び培養
線条体細胞をポリ-L-リジン(0.1mg/ml)被覆96ウェルプレート(内部60ウェルのみ)に200,000細胞/cm2の密度でNeurobasal/B27培地(Invitrogen)に蒔いた。細胞を5%CO2の存在下で37℃にて100%湿度下で培養した。日1、3及び6に培地を変えた。
皮質組織抽出手順及び細胞の調製
腹側を上側に向けて脳全体からスパチュラで2つの皮質半球を慎重に、PBS+0.65%D(+)-グルコース含有ペトリ皿に取り出した。組織を固定するため皮質の吻側部(嗅球近傍)に鉗子を置いて、2つの外側矢状配向カットを行なってパラホルム及び嗅内皮質を除去した。後方端で前頭配向カットを行なって海馬体を取り出した。視覚皮質の領域17/18を手に入れるため最後のカットから数mm離して最後の前頭カットを行なった。
皮質を氷上PBS+0.65%(+)-グルコース内に入れて、350gで5分間遠心分離させた。上清を取り出し、トリプシン/EDTA(0.05%/0.53mM)を37℃で8分間加えた。等量のDMEMと10%ウシ胎仔血清を添加して反応を停止させた。遠心分離により上清を除去した後、Neurobasal/B27培地で2回続けて洗浄した。
細胞を1mlのNeurobasal/B27培地中ガラスPasteurピペットで1回摩砕し、引き続き22ゲージ針を備えた1mlのインスリン注射器を用いて2回摩砕した。細胞懸濁液を100μmの細胞ストレーナーを通過させ、1mlのNeurobasal/B27培地ですすいだ。細胞をカウントし、60μl当たり50,000個の細胞に調整した。
皮質細胞のプレーティング及び培養
96ウェルプレートを0.2mg/mlのポリ-L-リジンで被覆し、引き続きPBS中2μg/mlのラミニンで被覆した後、60μlの皮質アストロサイト条件培地を各ウェルに加えた。引き続き、60μlの皮質細胞懸濁液を添加した。細胞を10%CO2の存在下37℃で100%湿度下で培養した。日1に、1μMのシトシン-β-D-アラビノ-フラノシド(有糸分裂阻害薬)を添加して完全培地交換(1:1-Neurobasal/B27及びアストロサイト条件培地)を行なった。日2及び5には、培地の2/3を交換した。
P8動物由来の小脳微小外植片(Microexplant)：調製、培養及び固定
2つの半球の積層小脳皮質をP8ラットから外植し、小片にカットしてPBS+0.65%D(+)グルコース溶液に入れ、23ゲージ針で摩砕し、引き続き125μm孔径篩いに押し通した。得られた微小外植片を2回(培地交換)、血清フリーのBSA補充STARTV培地(Biochrom)中に遠心分離させてた(60g)。培養のため、100%湿度下34℃にて5%CO2の存在下で35mmサイズの6ウェルプレートに置いた0.1mg/mlのポリ-L-リジン被覆カバーガラスに3時間40μlの細胞懸濁液を接着させた。引き続き、1mlのSTARTV培地を毒素及び薬物と共に添加した。5%CO2の存在下100%湿度下での培養の2〜3日後に培養をモニター(評価)した。細胞計数解析では、培養を増加性濃度(0.4%、1.2%、3%及び4%それぞれ3分間)のパラホルムアルデヒドで固定した後、PBSで洗浄した。
in vitroで神経細胞への毒素及び薬物の投与及びデータの解析
GPE類似体の神経保護効果を研究するため、我々は、オカダ酸を用いて一連のin vitro実験を行なって神経細胞に毒性傷害を引き起こした。オカダ酸は、ニューロンに傷害を引き起こすことが知られている当該技術分野において承認されている毒素である。さらに、オカダ酸による傷害後の神経細胞又は神経細胞機能の回復は、他の毒素に起因する傷害からの回復を予測できると認められている。
ニューロンに毒性傷害を引き起こすため、ニューロンを30nM又は100nM及び0.5mMの3-ニトロプロピオン酸(小脳の微小外植片だけのため)の濃度で1:100部のオカダ酸にさらした。皮質培養ではin vitroで8日(DIV)、線条体培養では9DIV、GPE(1nM〜1mM)又はG-2-MePE(1nM〜1mM)を使用した。インキュベーション時間は24時間であった。マルチウェルプレートリーダーで595nmにて比色終点MTTアッセイにより生存率を決定した。小脳微小外植片では、最高細胞密度の4つの窓(0.65mm2の場)を選択し、神経突起伸長を呈する細胞をカウントした。
結果
GPE類似体G-2-MePEは、試験した全てtのin vitroシステムの範囲内で比較できる神経保護効果を示した(図12〜15)。
皮質培養は10μM濃度のGPE(図12)又はG-2-MePE(10μM、図13)に反応し、それぞれ64%及び59%の神経保護だった。
他の2タイプの培養は、さらに低い用量のG-2-MePEで神経保護を示した(小脳微小外植片：図14及び線条体細胞：図15)。線条体細胞は、G-2-MePEの1nM〜1mMの範囲内で神経保護を示したが(図15)、生後小脳微小外植片は、約1nM〜約100nMの用量範囲のG-2-MePEで神経保護を示した(図14)。従って、我々は、G-2-MePEは神経保護薬であり、神経変性障害を患っているヒトに治療効果があると結論づけた。G-2-MePEは培養内のニューロンに直接投与すると神経保護性であり得るので、罹患動物の脳に直接投与すると、G-2-MePEはin vivoで有効であり得る。
実施例4：加齢ラットの線条体コリン作動性ニューロンに及ぼすG-2-MePEの効果
G-2-MePEがコリン作動性ニューロンに影響を及ぼすかどうかを決定するため、我々は加齢ラットを研究した。コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)は、コリン作動性神経の神経伝達物質であるアセチルコリンの生合成に関与する酵素である。ChATの免疫検出を利用して組織内に存在するコリン作動性神経の数を決定できることは周知である。存在するコリン作動性神経の数は脳内のコリン作動性神経経路の生理機能と関連することも知られている。
この実験で、我々は、18月齢ラットの脳内のChAT陽性ニューロンの数に及ぼすG-2-MePEの効果を試験した。
方法
18月齢雄性ラットは、5種の治療の1つを受けた。コントロール群にはビヒクル(生理食塩水のみ)(n=4)で治療し、4つの群には単一用量のG-2-MePEで治療した。それぞれ、0.012(n=4)、0.12(n=5)、1.2(n=5)及び12mg/kg(n=3)の用量を皮下投与した。薬物投与3日後に過量のペントバルビタールでラットを屠殺した。生理食塩水及び4%パラホルムアルデヒドを脳に灌流し、灌流固定剤で一晩固定した。組織が沈むまで0.1MのPBS(pH7.4)中25%のスクロース内に脳を貯蔵した。線条体の凍結冠状切片をミクロトームでカットして4℃で0.1MのPBS中0.1%のアジ化ナトリウム内で貯蔵した。コリンアセチルトランスフェラー(ChAT)の免疫反応性を自由浮遊切片法(free floating section method)を用いる染色によって確証した。簡単に述べると、抗体を1%ヤギ血清で希釈した。切片を4℃で0.1M PBS/TritonTM中0.2%のトリトン中で一晩インキュベートした後に免疫組織化学染色した。切片を50%メタノール中1%のH2O2で20分間前処理した。次に切片をシェーカー上4D内でウサギ(Rb)抗ChAT(1:5000)抗体(一次抗体)と2日間インキュベートした。切片をPBS/TritonTM(15分×3d)で洗浄してからヤギ抗ウサギビオチン化二次抗体(1:1000)と室温で一晩インキュベートした。切片を洗浄し、ExtrAvidinTM(Sigma)(1:1000)内で3時間インキュベートしてから3,3-ジアミノベンジンテトラヒドロクロリド(DAB,0.05%)中のH2O2(0.01%)で着色反応生成物を生じさせた。これらの切片をクロム・ミョウバン被覆スライドガラスに載せ、乾燥させ、脱水し、カバーした。
光学顕微鏡及び1mmの2×1000グリッドを利用して、2つの両半球内のChATに対応する特異的免疫反応性を示す線条体ニューロンをカウントした。カウントに用いた線条体領域のサイズを画像分析器で測定した。ニューロンの総数/mm2を群間で比較した。
対応t検定を利用してデータを分析し、平均+/-SEMとして表した。結果を図16に示す。
結果
図16Aは、G-2-MePEで治療した動物の脳内ではChAT免疫陽性ニューロン数が増加したことを示している。これは明らかに、G-2-MePEの投与が加齢ラットの脳内でChATのレベルを増やすのに有効であることを示唆している。ChATは、コリン作動性神経伝達物質アセチルコリンの合成に関与する酵素であることから、我々は、G-2-MePEが中年期ラットの脳内のコリン作動性伝達物質の量を増やすことができると結論づけた。
実施例5：ラットの空間参照記憶(Spatial Reference Memory)に及ぼすG-2-MePEの効果
G-2-MePEはChATを増やすことができ、ひいてはコリン作動性神経機能を改善する可能性を有することを実証したので、我々は、認知及び／又は記憶の年齢に関連する変化の治療にG-2-MePEが役立ち得るかを調査した。従って、我々は、記憶についてよく確立された試験を利用するラットの一連の研究を行なった。
実験1：モーリス水迷路試験(Morris Water Maze Test)
モーリス水迷路試験は、ラットの空間参照記憶を評価するためのよく認識された試験である。
対象
我々は、12、8又は4月齢の雄性Wistarラットを使用した。
方法
試験環境及び装置
深さ25cmまで無毒染料で黒に着色した水を満たした黒色のプラスチックプールを用いてモーリス水迷路試験を行なった。プールは、壁も均一の黒色に見えるように円形の黒色インサートを有した。プールの中心で交差する2つの仮想の垂線でプールを4つの四分円に分割した(北、南、東及び西)。プールの端部から50cmのSE四分円の中心に金属プラットフォームを置いた。その結果、プラットフォームは水面下2cmにあって見えなかった。訓練中、プラットフォームは当該位置のままだった。
実験は、ラットがプラットフォームまでナビゲートするために使用できる迷路外手がかり(extra-maze cue)(すなわちプール周囲の屋内の目標)を用いた。壁に弁別的なポスター又は絵画を吊るした。試験期間中、部屋の家具を動かさなかった。実験者が全ての側からプールに容易にアクセスできるようにプールを設置した。プールを空にし、試験中毎日25℃+/-2℃の水を入れ替えた。
プールの最も遠い点(実験者の位置に対して)を「北」と命名し、他のコンパス点「東」、「南」及び「西」は、それぞれプールの最も右の点、基部点及び最も左の点であった。これらの点にプールの外側にテープで印をつけた。
習得段階
各群のラットを液内プラットフォームまで泳ぐように訓練した。ラットは、連続した4日間で1日当たり60秒の試行を受けた。4つの開始位置(北、南、東、西)の1つに、プールの壁に向けて水中にラットを置くことによって試行を始めた。疑似ランダム的に開始位置の順序を選択した結果、いずれの所定の試行の開始位置も前の試行の開始位置とは異なり、1日の訓練中は2回より多く使用する開始位置はなかった。所定日では、全てのラットについて同じ位置順序を使用したが、日間で変えた。ラットがプラットフォームを見つけたか、又は60秒で（どちらが最初に起こっても）試行は終了した。ストップウォッチで試行の時間を計った。ラットがプラットフォームを見つけた場合、15秒間そこに留まらせた後、保持容器に移した。プラットフォームを見つけなかった場合、ラットを手でプラットフォームに導いて15秒間プラットフォームに置いた。試行間の間隔は60秒であった。試行間のいずれのインターフェースをも最小限にするため、保持容器をカバーした。ラットの1日の試行の完了時には、ラットをタオル乾燥させ、ラットの毛が乾くまで保持バケット内で加熱ランプ下に置いた。各訓練試行で各ラットについてプラットフォームを見つけるのに要した時間(潜時、秒)を得た。所定試行でラットがプラットフォームを見つけなかった場合、それらの潜時スコアは、当該試行の最大長(60秒)であった。
薬物治療
習得期の完了3日後にハロタン麻酔下でミニ浸透圧ポンプ(Alzet)を皮下移植して、1又は3週間連続して薬物又はビヒクルを分注した。注入の完了時にポンプを取り出して創傷を再縫合した。
5つの治療群は以下のとおりだった：
1. 生理食塩水1週間(nは最初は7であったが、急激に減量した1匹のラットを除外し、後に下垂体腫瘍を有していたことが分かった)；
2. 生理食塩水3週間(n=8)；
3. G-2-MePE低用量(0.96mg/日)1週間(n=8)；
4. G-2-MePE低用量(0.96mg/日)3週間(n=8)；
5. G-2-MePE高用量(4.8mg/日)3週間(n=7)。
4月齢(n=3)及び8月齢(n=9)のコントロールラットは薬物治療を受けなかった。12月齢ラットを、群がいずれかの薬物を受ける前のそれらの平均能力にほぼ等しくなるように、習得段階の間のそれらの遊泳時間に基づいて5つの群の1つに割り当てた。
保持(参照記憶)段階
最初の訓練の4週間後に、ラットが最初のプラットフォームの位置を思い出すか又は再学習する能力を試行した。これは、残存薬物が3週間ポンプの場合は最低7日間、1週間ポンプの場合は最低21日間で洗い流されたことを意味する。保持試行手順は、習得の手順と同一であった。薬物動態研究は、皮下投与されたG-2-MePEの血漿濃度がピークまで上昇してからほぼ一次反応速度論パターンで低減し、血漿半減期は約30〜約60分の間であることを示した。従って、この時までに保持研究を行ない、G-2-MePE含有ミニポンプの除去後少なくとも7日には、ほとんど全てのG-2-MePEが動物の循環から排除されていた。
データ分析
習得段階及び保持段階の各日の各試行について各ラットの遊泳潜時を記録し、分散分析を利用して段階間の変化を調査した。
3週間ビヒクルと3週間高用量G-2-MePEを習得段階及び保持段階で比較した。3週間にわたって与えられた高用量のG-2-MePEは、4週間遅延後に最初の水迷路タスクの保持を改善した。
結果
図17は、高用量(4.8mg/日)G-2-MePE治療及び低用量治療(0.96mg/日)加齢ラットと生理食塩水治療加齢ラットの間の比較を示し、コントロールとして幼若コントロール(4月齢)を使用した。G-2-MePEで治療する前には、加齢(12月齢)群間には差異がなかった。対照的に、4月齢の動物は、より老齢の動物よりプラットフォームに到達するのに要した時間が短かった。試行のない（この期間に生理食塩水又はG-2-MePEを投与した）3週間後、生理食塩水のみを受けた動物は、習得段階の試行日4及び保持段階の試行日1で同様の時間を要したことによって示されるように、プラットフォームに到達する能力の改善を示さなかった。対照的に、高用量又は低用量のG-2-MePEで治療を受けた動物は、生理食塩水治療コントロールに比べてプラットフォームに到達するのに要した時間の減少で反映されるように、記憶を改善した。さらに、G-2-MePE治療動物は4月齢の幼若動物(図17)及び8月齢動物(データ示さず)と同様の能力を有した。従って、我々は、G-2-MePEが、幼若ラットに対して以前は記憶喪失を示していた中年期ラット動物の記憶を改善できると結論づけた。さらに、再試行の時までに、G-2-MePEは循環から洗い流されているので、我々は、G-2-MePEの記憶増強効果は、コリン作動性ニューロンの機能の改善に起因する可能性があると結論づけた。
実験2：8方向放射状迷路試験
最初の実験から5カ月後に、17月齢になったラットを放射状迷路で空間作業記憶について試験した。
方法
装置
装置は、8個の同一アームと連絡する中心プラットフォームから成り、それぞれアームの末端に食物カップがある。
試験手順
放射状迷路手順の前少なくとも10日間、及びその手順の期間中ずっとラットを部分的に絶食させた。
実験者が所定位置からラットの行動を明瞭に観察できるように、迷路を組み立て配置した。実験者は、迷路のアームにその方向性に応じて時計回りの方向に1〜8の番号を付けた。
事前訓練(事前薬物)
1日目にドアをアームに挿入し、中心プラットフォームに20個の食物ペレットと共に5分間各ラットを閉じ込めた。4日間これを1日1回続け、全てのラットがペレットのいくつかを消費したことを観察した。次の日ラットに迷路全体を5分間探検させた。各アームの末端に位置する食物カップ内の2個の食物ペレット、及び各アームの入口と中央の両方の1個のペレットを全てのアームに仕掛けた。これを少なくとも5日間繰り返したが、2回の連続セッションで8未満のアームを探検したラットについては8日まで繰り返した。事前訓練の9日目に全てのラットで最終セッションを行なった。この時点で、老齢ラットの中で、9日のうち8日で1つのアーム進入しか行なわなかったラットをこの手順で今後の試験から除外すべきことを決定した。それ以外は、事前訓練で果たした探検の量にかかわらず全てのラットを含めた。最後の事前訓練セッションで入ったアームの数では老齢群間で統計的に有意な差異はなかった(Drug：F(2,31)=0.44、p=0.65)。
薬物治療
試験前30日(事前訓練後5日)、17月齢雄性Wistarラットに皮下ミニ浸透圧ポンプ(Alzet)を移植して(ハロタン麻酔下で)3週間連続して薬物を分注した。注入完了時にポンプを取り出し、創傷を再縫合した(9日の洗い流しが認められた)。
治療群は以下のとおりだった：
1. 幼若コントロール(4月齢)、n=6；
2. 生理食塩水、n=10；
3. G-2-MePE低用量(2.4mg/kg/日)、n=13；
4. G-2-MePE高用量(12.4mg/kg/日)、n=5。
生理食塩水及び低用量群は、この実験のフェーズ1(ラットが12月齢だったとき)で当該治療を受けた全てのラットを、1週間治療を受けたか3週間治療を受けたかにかかわらず含んだ。生理食塩水及び高用量の各群の1匹のラットは皮膚腫瘍のため倒れた。低用量ラットのうちの1匹は、事前訓練できなかったという事実のため、この実験に参加しなかった(下記参照)。
試験(薬物投与後)
洗い流しの9日目に作業記憶試験を開始した。ラットは1日10回の訓練セッションを12日間受けた。手順は事前訓練と同一であるが、食物カップのみを仕掛けた。ラットは、8個のアームのいずれにも訪れることによって16回までの選択を行なうために6分有した。アームの内側に4本の足が全て入ったときに選択が起こると定義した。実験者は、ペンと紙でアーム進入の順序を記録した。全て8個のアームに進入し、16回の選択を行ない、又は6分が経過した後、セッションを終了させた。全て8個のアームに進入する（これが起こったとき）のにかかった時間を記録した。
データ分析
前に訪れたことがないアームにラットが進入したときアーム選択は正しいとみなした。下記パラメーターにより毎日パフォーマンスを分類した：
1) 正しい選択(CC)8-12は、行なった選択の総数で除した、正しい選択を行なった数である。試験で8個のアーム全てを訪れることに失敗した動物では、この比の分母を12とみなす。
2) 正しい作業選択(WCC)8-12は、作業記憶データが導かれる尺度である。上記CC8-12について述べたようにデータを収集したが、このパラメーターでは、セッションで8個のアーム全てに進入したラットのみを含めた。
8未満のアームにしか進入しなかったラットは、どんな理由であれ、迷路を探検しなかった動物とは対照的に、アームが前に訪れたことがあるかを思い出せず、従って該試験を完成できないほど記憶障害があるので、作業記憶を確認するためには使用しなかった。
結果
CC8-12：10日にわたって全ての群で一般的改善があった(F(9,324)=4.01、p<0.0001)、しかし有意な群効果(F(3,36)=1.19, ns)又は群X日相互作用(F(27,324)=1.05, ns)はない(データ示さず)。
WCC8-12：図18Aは、試験10日にわたるWCC8-12スコアの習得プロファイルを示す。群の有意な効果(F(3,12)=4.27、p=0.029)及び日の有意な効果(F(9,108)=2.09、p=0.036)があるが、これらの因子間の相互作用は有意でなかった(F(27,108)=1.06、ns)。高用量G-2Me-PE群は、日を越えて最高の改善を示し、幼若コントロールが追随した。低用量G-2Me-PEと生理食塩水間にはほとんど差異がなかった。
図18Bは、高用量のG-2-MePEを受けたラット(n=5)は、ビヒクル治療ラットに比べて(*p<0.05、n=10)、食物ペレットを得るためにより多くの正しい進入を行なったことを示唆する結果を示している。我々は、この研究からG-2-MePEは加齢ラットの空間記憶を改善すると結論づけた。
実施例6：G-2-MePEは加齢ラットの脳内で神経芽細胞の増殖を高め、かつアストロサイトを減らす。
ニューロンの変性はニューロン数の減少をもたらし得るので、1つの望ましい治療目標は、脳内のニューロン数を増やすことである。ニューロンは、ニューロンより低分化細胞であるが、神経系列内にある神経芽細胞に由来する。典型的に、神経芽細胞は、限定細胞体、神経突起(アクソン及び樹状突起)を有し、究極的に、他のニューロンとの結合(例えば、シナプス)を作り上げる成熟表現型へ成熟させる条件にさらされる。そこで、神経芽細胞増殖を測定することが、神経細胞増殖の周知の初期マーカーになった。従って、医薬によって誘発された神経芽細胞増殖の上昇を検出することは動物の神経細胞の成長を予測するための承認されている方法である。ラットとヒトは神経細胞増殖で同様の機構を共有するので、ラットのin vivoでの神経芽細胞増殖の変化の検出はヒトにおける同様の効果を予測する。
認知機能障害の1つの組織学的関連要因が罹患動物の脳内のアストロサイト細胞数の増加であることも知られている。従って、G-2-MePEが神経芽細胞増加の刺激及びアストロサイトの処置に有用であるかを判定するため、我々は加齢ラットで一連の研究を行なった。
方法及び材料
免疫組織化学的検査
これらの研究を行なうため、標準的方法を利用して組織を固定し、パラフィンに封入して切片を得た。海馬のレベルを含む冠状切片(6μm)をカットし、染色のためクロム・ミョウバン被覆スライドガラスに載せた。切片をキシレンで脱パラフィンし、一連のエタノールで脱水し、0.1Mリン酸緩衝食塩水(PBS)内でインキュベートした。
グリア線維酸性タンパク質(GFAP)及び増殖細胞核抗原(PCNA)に対する一次抗体を用いて、それぞれ反応性グリア細胞及びアポトーシスと増殖を受ける細胞を標識した。抗原アンマスキングのため(カスパーゼ3及びPCNA染色)、切片を10mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)内で1分間高パワーで加熱した。全ての切片を50%メタノール中1%のH2O2で30分間前処理して内在性ペルオキシダー活性をクエンチした。次にPBS中1.5%の正常ウマ血清又は2.5%の正常ヒツジ血清を室温で1時間適用して非特異的バックグラウンド染色を遮断した。次に切片を下記一次抗体とインキュベートした：モノクロナールマウス抗GFAP抗体(Sigma, St. Louis, MO, U.S.A. 希釈1:500)；マウス抗PCNA抗体(DAKA, A/S, Denmark, 希釈1:100)。一次抗体と4℃で2日間(一晩インキュベートしたPCNA染色以外)のインキュベーション後、切片をビオチン化ウマ抗マウス又はヤギ抗ウサギ二次抗体(1:200, Sigma)と4℃で一晩インキュベートした。使用1時間前に調製したExtrAvidinTM(Sigma, 1:200)を室温で3時間適用してから0.05%の3,3-ジアミノベンジジン(DAB)及びPBS内で反応させて褐色反応生成物を得た。切片を一連のアルコール乃至キシレンで脱水し、封入剤(mounting medium)を含めてカバーガラスをかぶせた。
幼若(4月齢)、中年期(9月齢)及び老齢(18月齢)ラットのコントロール及びG-2-MePE治療群から採取した脳サンプルについて免疫組織化学的染色を行なった。
インキュベーション溶液から一次抗体を省くこと以外は同様にコントロール切片を処理した。脳室下帯内でPCNA陽性細胞数をカウントし、大脳皮質内でGFAP陽性細胞数をカウントした。
実験1：G-2-MePEは、老齢ラットの脳内で神経芽細胞増殖を刺激する
脳室下帯(SVZ)及び歯状回(DG)は、成体神経新生のホストをする2つの脳領域である。両SVZ及びDGにおける神経新生の減少は加齢に伴う記憶低下と相互に関連があることがよく報告されており、かつ記憶改善に及ぼす神経成長因子及び上皮成長因子の効果は、SVZの前駆体増殖の増加に起因すると報告されている。細胞増殖のマーカーとしてPCNAを用いて、PCNAに陽性の細胞数をカウントすることによって、SVZ内の細胞増殖を調査した。選択動物では、神経細胞特異性薬、ダブルコルチンで染色したところ、増殖細胞の少なくとも一部は神経芽細胞として同定された。
18月齢の雄性ラットを単用量のG2-MePEで腹腔内治療した(0、0.012、0.12、1.2、12mg/kgのいずれかの用量)。治療3日後に脳を採取してPCNA及びGFAPの免疫組織化学的染色を行なった。SVZ内でPCNA陽性細胞数をカウントしてから、細胞数を計数に用いた脳室壁の長さに応じて細胞数/mmとして平均した(図19A)。最高用量で治療した群(12mg/kg、n=5)は、ビヒクルで治療した群に比べて(*p<0.05、n=7)、PCNA陽性細胞数の有意な増加を示した。このデータは、神経新生に及ぼすG-2PEの用量依存性効果を示唆している。
蛍光二重標識試験は、神経芽細胞用マーカーであるダブルコルチンとPCNAの共局在化を示唆した。図19Bは、ビヒクル治療ラット(左パネル)に比べて、最高用量G-2-MePEで治療したラット(右パネル)でPCNA(緑、×20)とダブルコルチン(赤、×20)の両方の増加を示しているラットの脳の一部の写真である。2つのマーカーは明らかに相互に関連した(図19B、写真、×100)。我々は、G-2-MePEが神経芽細胞を含め、脳細胞の増加を刺激できると結論づけた。神経芽細胞はニューロンの前駆体なので、我々は、本発明の化合物で治療した動物の脳内のニューロンのポピュレーションを増やせるとさらに結論づけた。
実験2：G-2-MePEは、中年期ラットの脳のSVZ内の神経芽細胞増加を刺激する
中年期の9月齢ラットの群でG-2-MePE(1.2mg/kg)の効果を研究した。G-2-MePE(1.2mg/kg)又はビヒクルを腹腔内投与した(i.p.)。治療の3日後にPCNA免疫組織化学的染色を利用してSVZ内の細胞の増殖を調査した。図19Cは、G-2-MePEの治療後のPCNA陽性細胞数の有意な増加を示している(**p<0.005、n=4)。PCNAで染色された増殖細胞の一部は神経芽細胞と同定されたので(上記実験1参照)、我々は、G-2-MePEが中年期ラット脳内で神経芽細胞増殖を刺激できると結論づけた。
実験3：加齢脳内のアストロサイト
増えてきた証拠は、高齢におけるアストロサイトの機能障害が炎症を誘発し、さらに神経変性をもたらすことを示唆している。活性化アストロサイトの上方制御はよく報告されており、おそらく抑制された内因性神経新生を通じた、加齢に伴う記憶低下と密接に関連する。
反応性アストロサイトのマーカーとしてGFAPを用いて、G-2MeP又はビヒクルで治療した加齢ラットの海馬のCA4小領域内でGFAP陽性細胞数をカウントした。我々は、加齢動物の海馬(図20A)、及び大脳皮質内の反応性アストロサイトの有意な増加を見い出した。アストロサイトの一部は、加齢ラット(図20B、写真、矢印)では幼若(*p<0.01)及び中年期(*#p<0.01)ラットに比べて毛細血管と関連した。
血管成分の一部として、GFAP陽性アストロサイトは血管新生でも役割を果たし(図20B、矢印)、これも脳内の炎症反応に寄与する。従って老齢脳内で見られるGFAPアストロサイトの増加は、脳変性の慢性状態を示している可能性がある。
実験4：G-2-MePEは老齢脳内でアストロサイトを減少させる
我々は、老齢ラットの海馬のCA4小領域内でアストロサイトに及ぼすG-2-MePEの効果をも評価した。18月齢の雄性Wistarラットを以下のように5つの治療群に割り当てた：ビヒクル、0.12mg/kg/日、0.12、1.2及び12mg/kg/日(それぞれn=6)。
GFAP陽性細胞をコンピュータープログラム(Discovery 1)を用いてカウントした。結果を図20C及び20Dに示す。G-2-MePEを腹腔内投与し、注射3日後にGFAP陽性細胞の数を評価した。視覚的採点システムを用いて(0=アストロサイトなし、1=少数のアストロサイト、2<50%、3>50%)、我々は5つの異なる皮質領域内でアストロサイトの数を評価した。
G-2-MePEによる治療、特に0.12及び12mg/kgの用量で治療した群は、ビヒクル治療群に比べて海馬のCA4領域で反応性アストロサイトの数を減少させた(図20C；*p<0.05)。大脳皮質内で同様の効果がG-2-MePEについて観察された(図20D)。
通常はラット脳の皮質の深層内にはGFAP陽性アストロサイトはほとんどなく、存在する当該アストロサイトは、一般的に白質管(white matter track)と密接に関連している。しかしながら、我々は、血管と密接に関連する皮質の中間層内にGFAP陽性細胞があることを見い出した。
ここで提示する研究結果は、加齢が脳内のいくつかの変化と関連することを示唆している。第1に、記憶及び認知機能の歳依存性損失がある。第2に、アストロサイト歳依存性増加がある。ラットにおけるこれらの知見は全て互いに一致し、かつ実験動物及びヒトで認知機能及び記憶を維持する際のコリン作動性神経の既知役割と一致する。
我々は予想外に、GPE類似体であるG-2-MePEが加齢動物の上記歳関連変化の全てを少なくとも部分的に逆転させることを見い出した。第1に、G-2-MePEは、神経毒オカダ酸又は3-NPにさらされた動物の脳細胞に存在するChATの量を増やす。このG-2-MePEの効果は、周知の神経保護薬、GPEの効果を模倣した。これらの効果は皮質細胞、小脳細胞及び線条体細胞内で見られた。これはこの効果が脳の様々な部分に及んでいたことを示唆している。第2に、G-2-MePEは線条体内のChATを増やした。これはコリン作動性ニューロンがG-2-MePEに感受性であることを示唆している。これらの観察された化学的及び組織学的変化は行動の変化に匹敵した。G-2-MePEで治療した加齢動物は、2つの周知試験システムでビヒクル治療コントロールに比べて記憶の改善を示した。次に、G-2-MePEは加齢脳内で神経芽細胞増殖を誘発した。最後に、G-2-MePEによる治療は加齢脳の海馬及び皮質内で観察されるアストロサイトの増加を逆転させた。G-2-MePEの効果は薬剤の急性効果に起因するものではなかった：本明細書で引用する多くの研究においては、薬物送達の休止から十分な時間が経過し、おそらく薬物はほとんど又は全く存在しなかったからである。
実施例7：GPEとG-2-MePEの薬物動態の比較
これらの研究の目的は、標準的な薬物動態学的方法を利用して動物のin vivoでのGPEとG-2-MePEの薬物動態プロファイルを比較することだった。
方法
体重が180〜240gの成年雄性Wistarラットを用いてGPEとG2MePEの薬物動態を決定した。静脈内ボーラス注入及び採血を容易にするため、実験3日前にハロタン麻酔下で留置用頚静脈カニューレを外科的に移植した。6匹のラットの群に、0.1Mコハク酸緩衝液(pH6.5)に溶かした30mg/kgのGPE又は10mg/kgのG2MePEのどちからの単一静脈内ボーラス注入を行なった。GPE又はG2MePEのどちらかの注入前10分及び0分、並びにGPE又はG2MePEのどちらかの注入後1、2、4、8、16、32、64及び128分に、哺乳動物用のSigmaプロテアーゼ阻害薬カクテルを含むヘパリン処置チューブに血液サンプル(それぞれ約220μl)を採取した。サンプルを4℃で15分間3000gで遠心分離させ、血漿を除去し、抽出及びラジオイムノアッセイ(「RIA」)又は逆相HPLCのどちらかによるアッセイまで-80℃で貯蔵した。利用したRIA及びHPLC方法は従来法であった。
単一静脈内ボーラス注入後の薬物排出は、方程式C=C0e-kt（式中、Cは、任意時点の薬物濃度を示し、C0は、時間(t)がゼロに等しいときの濃度であり、kは、1時間当たりの濃度の単位で表される一次速度定数である）に従う一次プロセスであることが分かった。血漿濃度対時間の片対数プロットの排出段階における線形回帰ラインの傾きから以下のようにk及び半減期(t1/2)を計算した：Log C=-kt/2.3+log C0。結果を平均±標準誤差として表した。
結果
図21は、静脈内(i.v.)注入後のGPE及びG-2-MePEのin vivo血漿濃度のグラフを示す。黒四角は各時点のGPEの濃度を示し、黒三角は各時点のG-2-MePEの濃度を示す。
GPE及びG-2-MePEの血漿濃度は、注入後の1分以内で顕著に増加した。30mg/kgのGPEの注入後には、40.0±10.8mg/mlのピーク濃度が観察された。そしてGPEの血漿濃度は、一次動態プロセスに従って急速に低下した。GPEの一次速度定数は0.15±0.014ng/ml/分であることが分かり、t1/2は4.95±0.43分であることが分かり、血漿からのGPEの推定クリアランスは137.5±12.3ml/時間であることが分かった。
10mg/kgのG-2-MePEの注入後、ピーク濃度は191±16.1mg/mlであることが分かった。そしてG-2-MePEの血漿濃度は一次動態プロセスに従って低下した。G-2-MePEの一次速度定数は0.033±0.001ng/ml/分であることが分かり、t1/2は20.7±0.35分であることが分かり、推定クリアランスは30.1±0.5ml/時間であることが分かった。
注入後、送達したG-2-MePEの用量(10mg/kg)に比べて送達したGPEの用量は多い(30mg/kg)にもかかわらず、G-2-MePEの最大血漿濃度は、GPEの最大血漿濃度の約4.8倍であった。
G-2-MePEの送達用量の方が低いにもかかわらず、125分未満の全ての時点でG-2-MePEの血漿濃度がGPEの血漿濃度より高いという知見は、GPEの既知血漿濃度に基づいて全く予想外であった。G-2-MePEのt1/2はGPEのt1/2より4倍以上長かった。
GPEの半減期に比べてG-2-MePEの半減期が増加したことは、GPEのt1/2に基づいて全く予想外であった。G-2-MePEのt1/2の増加は、循環からG-2-MePEがより緩徐に排除されることを意味する。この知見は、GPEのクリアランス速度に基づいて全く予想外であった。
我々は、これらの研究から、G-2-MePEはヒトを含めた動物の脳内で加齢の有害作用の多くを逆転できる強力な薬剤であると結論づけた。従って、G-2-MePEを含めたGPE類似体は、神経保護、記憶の改善、神経芽細胞増殖の増加及びアストロサイトの減少を含めた所望の治療効果をもたらすことができ、かつヒトの加齢の有害作用を逆転又は軽減するのに役立ち得る。
本発明を特定の好ましい実施形態について述べたが、当技術分野の知識及び本開示を考慮する当業者には、本発明の化合物の等価物を本出願に記載の状態のために調製かつ投与し得ることが明白であろう。また、このような等価物は、本出願の特許請求の範囲内に包含されることが意図される。
実施例8：レット症候群の治療I
レット症候群(RTT)モデルの寿命及び長期増強に及ぼすG-2-MePEの効果
G-2-MePE治療がレット症候群のマウスモデルにおけるレット症候群の発生及び進行に影響を与え得るかどうかを決定するため、我々は半接合性MeCP2(1lox)雄性マウスを使用した。MeCP2ノックアウト(MeCP2-KO)マウス系は、ヒト障害でるレット症候群の生理学的及び神経学的異常特性の範囲及び重症度を密接に模倣するとして当技術分野で広く認められている。
全ての実験は、テキサス南西大学医療センターで行なわれ、テキサス南西大学医療センター実験動物委員会によって認可された。G-2-MePEは、Albany Molecular Research Inc. (Albany, NY)により合成され、Neuren Pharmaceuticals Limitedによって供給された。
方法
治療
我々は半接合性MeCP2(1lox)雄性マウスを20mg/kg/日のG-2-MePE又は生理食塩水で治療した(0.01%BSA、生存実験では1群当たりn=15、LTP実験ではn=20)。出生後4週間から腹腔内投与で治療した。生存実験では、実験の全経過を通じて治療を維持した。LTP実験では、マウスをスライス標本に使用する9週まで治療した。
生存時間
MeCP2欠損ミュータントマウスは約4〜6週齢でRTT症状を発症し、10〜12週間で死亡する(Chen et al., 2001. Nat Genet 27: 327-331)。我々は、野生型コントロール並びにビヒクル治療群及びG-2-MePE治療群のMeCP2欠損動物の生存期間を比較した。治療開始(4週)から毎週生存期間を測定し、カプラン・マイヤー生存曲線(Kaplan-Meier survival curve)を作成して各週間隔(x軸)で生存しているマウスの比率(y軸)を示した(図22参照)。
長期増強(電気生理学)
MeCP2欠損マウスは、機能的及び超微細構造的シナプス機能障害、海馬依存性記憶及び海馬長期増強(LTP)の著しい障害を患うと以前に報告された(Moretti et al. The Journal of Neuroscience. 2006. 26(1):319-327)。RTTモデルのシナプス機能に及ぼすG-2-MePE治療の効果を試験するため、我々は9週齢でビヒクル及びG-2-MePE治療した両動物における海馬LTPを比較した。それを行なうため、我々は、生理食塩水又はG-2-MePEのどちらかで治療したMeCP2欠損マウス由来の海馬のスライス内のニューロンのベースラインポテンシャルの%としてfEPSPの傾きを測定した(図23)。
結果
図22は、G-2-MePE治療がMeCP2欠損マウスの生存期間を延ばしたことを示している。野生型マウス(最上部の線)はコントロール動物であるため、各時点での彼らの生存は100%であった。生理食塩水のみで治療したMeCP2欠損マウスは野生型マウスよりずっと急速に死亡したので(点線)、約11週には、MeCP欠損マウスの50%しか生存していなかった。しかし、著しく対照的に、我々は予想外に、G-2-MePEで治療したMeCP2欠損マウスが生理食塩水治療マウスよりかなり長く生存することを見い出した。約15週では、動物の50%が生存していた。最初に提示したデータは、未治療例では11週までに動物の50%が死亡するように、生存期間についてMeCP2マウスが影響されることを示した。G-2-MePE治療動物は、生存期間の改善を示し、16週で50%が死亡した。この研究では、長寿データは、マウスは自身の歯を一貫して切り取らせないように（実験開始時には認識されていなかったmecp2マウスの要件である）、相反する獣医学手順によって損ねれた。結果は、レット症候群に無関係の初期の動物の死の観察であった(特にコントロール群における)。データの再点検は、コントロール群を再実験すると、より小さい群の差異にもかかわらず、G-2-MePEの効果が持続することを示した(50%死亡までの時間がコントロールでは13.5週間、G-2-MePE治療動物では16週間)。mecp2マウスのG-2-MePE治療によって安全性への懸念は生じなかった。
これらの結果は、G-2-MePEがMeCP2欠損マウスの生存期間をかなり増やせることを実証した。MeCP2欠損マウスはレット症候群のヒトの病理学的及び治療的効力を予測するので、我々は、G-2-MePEがレット症候群のヒトの寿命を延ばすことができると結論づけた。
図23は、MeCP2欠損動物のfEPSP傾きによって測定した場合にG-2-MePE治療が生理食塩水治療ミュータントマウスに比べて海馬の長期増強(LTP)を高めるかどうかを決定するための我々の研究結果を示す。図23に示すように、我々は予想外に、G-2-MePEは、生理食塩水のみで治療した動物に比べてMeCP2欠損マウスのfEPSPの傾きを増やすことを見い出した。
これらの結果は、G-2-MePEがMeCP2欠損マウスのin vivo治療に有効であり得ることを実証した。MeCP2欠損マウスはレット症候群のヒトの病理学的及び治療的効力を予測するので、我々は、G-2-MePEがレット症候群のヒトに有効な療法となり得ると結論づけた。
実施例9：G-2-MePEは樹状突起の分枝を改善し、樹状突起スパインの長さを増加する。
我々は、樹状突起に及ぼすG-2-MePE治療の効果を評価する。トランスジェニックmecp2ノックアウトマウス(n=15〜20)に1日1回20mg/kgの用量でG-2-MePEを腹腔内投与した。下表1のように、9週間後に屠殺後、ゴルジ染色後に樹状突起スパイン密度、スパインの長さ及び分岐を調査した。
表1：全てのニューロンの形態及びスパインの分析

Figure 2018138606
生理食塩水(3匹の別々のマウス由来の3個のニューロンを分析、n=9)又はG-2-MePE(20mg/kg i.p. 1/日、4週から；3匹の別々のマウス由来の3個のニューロンを分析、n=9)のどちらかで治療した9週齢雄性mecp2ヌルミュータントマウス由来の代表的海馬CA1ニューロンの細胞体からの距離によって樹状突起の長さを評価した。
我々は、G-2-MePEが樹状突起の分岐を改善し、かつ樹状突起スパインの長さを増やすことを観察した。図24はこの研究結果を示す。μmの樹状突起長(縦軸)を細胞の細胞体からの距離(μmで；横軸)に対してプロットする。細胞体に近い樹状突起を有する細胞では、樹状突起は短かった。しかしながら、細胞体からの距離が増すにつれて、生理食塩水治療(白四角)は、細胞体から70μmの距離で最大になるまで樹状突起の長さを増やし、細胞体からさらに離れた距離で長さを減少させた。対照的に、G-2MePE(黒四角)による治療は、細胞体からの距離の範囲のほとんどにわたってより長い樹状突起をもたらした。
実施例10：マウスのレット症候群の治療II
マウスの交尾及び遺伝子型判定
MeCP2生殖系列ヌル対立遺伝子マウスを使用する(Chen et al., 2001)。Chenら(Chen et al., 2001)のとおりに遺伝子型判定を行なう。
G-2-MePE治療
生存期間測定、夜行性活動分析及び免疫ブロット分析のためには、G-2-MePE(Albany Molecular Research Inc. (Albany, NY)が合成し、Neuren Pharmaceuticals Limitedが供給した)を毎日腹腔内注射(20mg/kg、ビヒクル=生理食塩水、0.01%BSA)により投与する。P15で治療を開始し、実験の全経過を通じて維持する。細胞内生理学実験のためには、P15〜P28-P32（急性スライス標本のために使用するとき）まで2週間マウスに毎日G-2-MePE(20mg/kg(体重)、ビヒクル=生理食塩水、0.01%BSA)を注入する。光学イメージング実験のためには、眼瞼(lid)縫合の日からイメージングの日まで毎日マウスにG-2-MePE(20mg/kg(体重)、ビヒクル=生理食塩水、0.01%BSA)を注入する。
スライス生理学的標本
感覚運動皮質又はその近傍で冠状切片(300μm厚)を<4℃のACSF内でビブラトームを用いてカットする。スライシング後37℃で20分間スライスをインキュベートし、残りの実験用には室温でインキュベートする。スライスをWarnerチャンバーに移し、層5に位置する視覚的に確認した錐体ニューロンから記録を取る。126mM NaCl、25mM NaHCO3、1mM NaHPO4、3mM KCl、2mM MgSO4、2mM CaCl2、及び14mMブドウ糖を含む人工脳脊髄液(Artificial cerebral spinal fluid)(ACSF)を315〜320mOsm及び7.4のpHに調整し、95%O2/5%CO2で泡立てる。細胞内ピペット溶液は100mMグルコン酸カリウム、20mM KCl、10mM HEPES、4mM MgATP、0.3mM NaGTP、及び10mM Na-ホスホクレアチンを含有した。
細胞内ホールセル記録
ホウケイ酸塩ピペット(3〜5MΩ、WPI)をSutter P-80プラー(Sutter Instruments)で引く。赤外DIC光学器(Zeiss)を備えたAchroplan 40×水浸型レンズで細胞を可視化し、赤外カメラ(Hamamatsu)で検出してビデオモニターに映す。Matlab(Mathworks, Natick, Mass.)が書いたカスタム取得リアルタイム解析ソフトウェアでBNC-2110コネクターブロック及びMシリーズ二重チャネル取得カード(National Instruments)に接続したMulticlamp 700B増幅器(Axon Instruments)を用いて実験を進める。ギガシールと破裂を達成し、低レベルの漏出と直列抵抗についてホールセル記録を連続的に検証する。各記録のため、電圧固定で5mVの試験パルスを約10回与えて入力及び直列抵抗を測定する。次に電流固定で約10パルス(500ms、40〜140pA、10pA増分で)与えて誘発発火頻度と細胞興奮性を定量化する。アクセス抵抗、漏出及び細胞固有興奮性が群を越えて一致していることを検証する。最後に、-60mVで電圧固定下の自発的EPSCを10kHzでサンプリングし、1kHzで低域(low-pass)ろ過する。Matlabが書いたカスタムソフトウェアパッケージを用いて解析を行ない、全ての事象は自動閾値に従って検出され、各事象について個々に実験者が盲検的に検証する。
ゴルジ染色
P28マウス由来のサンプル(<1cm)を10%ホルマリン及び3%重クロム酸カリウム内で24時間固定する。次に組織を2%硝酸銀に移して暗所に室温で2日間置く。これらのサンプルから切片を50μm厚でカットして蒸留水に入れる。運動皮質に対応する切片をスライドガラス上に載せ、10分間空気乾燥させてから95%アルコール、100%アルコール、及びキシレンの連続リンスにより脱水してからカバーガラスで封鎖する。Zeiss Pascal 5 Exciter共焦点顕微鏡を用いて10×(ホールセル)及び100×(スパインイメージング)でイメージを取得する。
固有シグナルの光学イメージング
この実験では成年(>P60)野生型(SVEV又はBL6)及びMeCP2(+/-)ミュータント雌(BL6)を使用する。野生型コントロール群は、MeCP2+/-の野生型同腹仔の雌又は野生型同齢SVEV雌の両者を含む。単眼除去のため、動物をAvertin(0.016ml/g)で麻酔し、一方の眼の眼瞼を4日間縫合する。イメージング前に縫合糸を除去し、その剥脱眼を再び開かせる。剥脱縫合糸が無傷であり、かつ剥脱眼が健康に見える動物だけをイメージングセッションのために使用する。G-2-MePEシグナル伝達活性化のため、G-2-MePEを含む溶液を剥脱の全期間毎日腹腔内(IP)注射する。イメージングセッションではマウスをウレタンで麻酔し(1.5g/kg；全用量の20%をそれぞれ20〜30分、最終用量までIP投与し、最初の投与と共に0.02mlのクロルプロチキセン(cloroprothixene)1%をも注入する)。頭蓋骨を露出させ、特注プレートを頭部に接着して動きを最小限にする。頭蓋骨をV1上でドレメルドリル(dremel drill)で薄くし、生理食塩水中のアガロース溶液(1.5%)とカバーガラスで覆う。イメージングセッション中、動物に絶えず酸素を送り込み、加熱ブランケットで動物の温度を維持し、眼を定期的にシリコーンオイルで処置し；生理的状態を常にモニターする。単眼的にどちらかの眼に及ぼされる周期的刺激を表示するモニターの前に麻酔下のマウスを置き；刺激は、寸法9°×72°のドリフトする垂直又は水平白色バーから成り、均一な灰色背景にわたって9秒/周期でドリフトする。赤色光(630nm)で頭蓋骨表面を照射し、25分の各刺激セッション中CCDカメラ(Cascade 512B, Roper Scientific)で15フレーム/秒の速度にて輝度の変化を捕える。時間的高域フィルター(135フレーム)を利用してスローシグナルノイズを除去し、その後で該シグナルをコンピューター処理して、各ピクセルで、刺激周波数に対応する時間的高速フーリエ変換(FFT)成分を抽出する。FFT振幅を用いて、各眼への視覚的誘発反応の強度を測定する。各ピクセルでの各眼の反応(R)から、眼優位性指数(ocular dominance index)をODI=(Rcontra-Ripsi)/(Rcontra+Ripsi)として導く。両眼ゾーンは、イメージ化した半球と同側の眼の刺激により活性化した領域として定義される。
心拍数測定
リアルタイム心臓パルス速度(cardiac pulse rate)を尾部クリップセンサー(Mouse OX Oximeter--Oakmont, PA)を用い測定する。マウスを麻酔しないが、適合した開放プラスチックチューブ内で物理的に拘束する。記録セッションの前に、実験動物が順化できるように収容するケージ内にチューブを一晩置く。記録時間の間ずっと約27.8〜28.9℃(82〜84°F)に体温を維持する。我々は、各マウスについて15分間の3試験を記録する。マウスは8週齢であり、P15からビヒクル又はG-2-MePEで治療する。
夜間活動測定
赤外ビーム活性化運動モニタリングチャンバー(Opto-Varimax-MiniA; Columbus Instruments, Columbus, Ohio)を用いて自発運動活性を測定する。各実験では、記録開始前少なくとも3時間マウスをチャンバー内に置く。通常の12時間の暗周期(午後7時〜前7時)の間に運動をモニターする。動物毎時間点毎の1暗周期を収集する。
結果
G-2-MePE治療がRTT疾患の中核的特徴の発達に影響を与えるかどうかを試験するため、2週齢のミュータント動物にその寿命の過程にわたって毎日腹腔内注射する。次に、心拍数、自発運動活性レベル、及び寿命等の健康関連測定値と共に、後述するようにシナプスの生理機能、シナプスの分子組成、及び皮質の可塑性の測定値を取得する。
MeCP2ミュータントマウスのシナプス生理機能に及ぼすG-2-MePEの効果
最近の研究は、MeCP2-/yマウスの複数の脳領域にわたるニューロンが自発活動の著しい減少を示すこと(Chang et al., 2006; Chao et al., 2007; Dani et al., 2005; Nelson et al., 2006)、BDNFの過剰発現によって救出される表現型(Chang et al., 2006)を報告した。同様に、ラット海馬培養においてIGF1誘導体の急性適用が誘起興奮性シナプス後電流(evoked excitatory postsynaptic current)(EPSC)振幅を40%上昇させることが示された(Ramsey et al., 2005; Xing et al., 2007)。MeCP2-/y生理学的表現型の救出におけるG-2-MePEの効力を試験するため、我々は、急性脳スライス内の細胞内ホールセル記録を取得し、層5の皮質ニューロンの興奮性シナプス動因(自発性EPSC振幅及び周波数)を測定する。ここで、-/y動物から記録されたEPSCは、野生型動物で測定されたEPSCに比べて振幅がかなり減少する。この傾向は、G-2-MePEで治療したMeCP2-/y動物から記録されたEPSCでは部分的に逆転され、ビヒクルで治療したMeCP2-/yマウス由来のEPSCより振幅がかなり大きい。これらの差異は、細胞を越えて平均するときにも見られる。これらの測定を通じて、アクセス抵抗、漏出、及び細胞固有興奮性が群を越えて一致することも検証される。EPSC間隔の定量化も野生型動物とMeCP2-/y動物の間のEPSC事象(EPSC周波数の減少)間の間隔のわずかな増加を示す(P=0.04、Kolmogorov-Smirnov試験)。従って我々の知見は、MeCP2-/yマウスの皮質細胞における興奮性シナプス動因の減少、及びG-2-MePE治療後のその部分的救出は、この領域におけるシナプス媒介興奮性伝達の強度の変化の結果としてのEPSC振幅の変化に部分的に起因することを示唆している。
G-2-MePE治療は皮質スパイン成熟を刺激する
我々は、ゴルジ染色を利用してニューロンを低密度かつ明確に標識し、高解像度共焦点イメージングを適用して、臨界期マウス(P28)由来の運動皮質の切片内の層5錐体ニューロンへの解析に限定する、標識細胞の樹状突起のスパイン密度及び形態を測定する。
低倍率イメージングは錐体ニューロンの樹状突起の範囲を明確に描写するが、我々はさらに高倍率を利用してシナプス結合をカウントし、各スパインの形態学的分類を決める。我々は、大きくて球状(「キノコ」、M)、短くて太い(「スタビー」、S)、短くて薄い(「薄い」、T)又はフィロポディア(F)のどれかとしてスパインを分類する。単位分岐毎のスパインの密度の比較はノックアウトニューロンのスパイン密度の減少傾向を示し、この傾向は治療したノックアウトニューロンでは大いに回復する。
総じてこれらの結果は、G-2-MePEの投与後に治療可能な形での興奮性伝達の機能的欠陥を支持するため、ノックアウトにおける樹状突起結合の数及び成熟状態の欠陥の可能性を示唆している。
成年MeCP2+/-マウスの眼優位(Ocular Dominance)(OD)可塑性はG-2-MePEで減少する
OD可塑性の発達変化は部分的にIGF-1経路の活性化によって制御され、(1-3)IGF-1の投与は野生型幼若マウスのOD可塑性を減少させ得る(Tropea et al., 2006)。そこで我々は成年MeCP2ミュータントでG-2-MePE治療が遷延性OD可塑性を安定化できるかを試験する。歳がP60異常の雌性MeCP2+/-マウスを4日間単眼剥脱し、同時にG-2-MePEで治療する。G-2-MePE治療は成年Mecp2+/-マウスのOD可塑性を低減し、実際にG-2-MePEが迅速にシナプスの安定化又は成熟化を誘発できることを示唆している。
MeCP2-/yマウスの徐脈はG-2-MePEで治療される
神経生理学的症状の回復におけるG-2-MePEの効力の検討に加えて、我々は生物体の一般的健康に及ぼすその効果を特徴づけようとする。臨床的及び実験的証拠は、レット症候群患者の自律神経系機能障害、例えば不安定な呼吸リズム及びベースライン心臓迷走神経緊張の低下を示す(Julu et al., 2001)。交感神経系を通じて血圧恒常性を調節するフィードバック機構の不十分な制御、例えば心拍数の過換気誘発減少はレット症候群患者でよく見られ、重篤な不整脈を引き起こし得る(Acampa and Guideri, 2006; Julu et al., 2001)。
心臓性自律神経障害の病因は、よく理解されていないが、脳幹内の未熟なニューロン結合が原因であり得ると示唆されている。MeCP2-/yマウスの心拍異常及びG-2-MePE治療の効果を調査するため、我々は、ビヒクル又はG-2-MePEで治療した非麻酔野生型及びMeCP2-/y動物のリアルタイム心臓パルス速度をモニターする。野生型マウスは、1分当たり750拍近傍を中心とする規則的な心拍数測定値分布を示す。対照的に、MeCP2-/yマウスは、より低い平均速度の不規則な心拍数を示し、この出来事はG-2-MePE治療後に有意に減少する。
G-2-MePE投与は自発運動活性及び寿命を改善する
MeCP2-/yマウスは、進行的に嗜眠性になる4〜6週齢でレット症候群様症状を発症し、歩行失調を発症して10〜12週齢の間に死亡する(Chen et al., 2001)。ケージド領域内の夜行性赤外線ビーム交差事象をカウントすることによってベースライン自発運動活性も記録される。MeCP2ノックアウトマウス(KO)は、野生型(WT)に比べて自発運動活性レベルの顕著な減少を示すが、G-2-MePE(KO-T)による治療はこれらのレベルを上昇させる。
最後に、MeCP2 KO同腹仔に比し、G-2-MePEで治療したMeCP2-/yマウスは、平均余命約の50%の増加をも示す(0.5の確率の生存率の増加)。
我々は、海馬内のニューロン細胞体サイズに及ぼすG-2-MePE治療の効果をも測定する。上述したようにマウスを自発運動活性のためにG-2-MePEで治療する。海馬のCA3領域内のニューロンの細胞体サイズは野生型動物に比べてMeCP2 KO動物でかなり障害されている。G-2-MePE治療はKO動物の平均細胞体サイズを大きくするが、野生型動物の細胞体サイズにはほとんど又は全く効果を及ぼさない。
実施例11：マウスにおけるレット症候群の生存期間に及ぼす経口G-2-MePEの効果
レット症候群は、運動スキル喪失を含めた慢性の衰弱性障害であるため、容易に投与される製剤を用いてレット症候群を治療するのが望ましい。この目的を達成するために、我々は、G-2-MePEと関連化合物の予想外に有益な治療特性及び薬理特性を利用することができる(米国特許第7,041,314号、第7,605,177号、第7,714,070号、第7,863,309号及び米国特許出願第11/315,784号及び第12/903,844号)。
従って、我々は、US 2009/0074865に記載されているように、G-2-MePEをMeCP2欠損マウスに経口投与する。簡単には、医薬的に有効な量のG-2-MePE(動物当たり20又は80mg/kg)を含む水溶液、油中水エマルション(マイクロエマルション、粗エマルション又は液晶)、又はゲル組成物を毎日投与する。コントロールMeCP2欠損動物には、我々は生理食塩水のみを投与し、野生型動物を用いて、上記実施例8に記載の研究デザインと同様なベースラインデータを得る。
野生型動物では、各時点の生存期間を100%と定義する。MeCP2欠損動物では、生存期間はかなり減少する。しかし、MeCP2欠損マウスへのG-2-MePEの経口投与後、生存期間はかなり増加する。
実施例12：マウスのレット症候群の発作活動に及ぼすG-2MePEの効果
発作は、顕著で危険な、治療が困難なレット症候群の態様であるため、我々は、MeCP2欠損動物の発作活動に及ぼすG-2MePEの効果を決定する。G-2-MePEは、神経変性疾患の動物の発作活動の治療に有効であり得る(米国特許第7,714,020号)。そこで我々はG-2-MePEがMeCP2欠損マウスの発作活動をも治療できるかどうかを決定するための実験を行なう。
野生型マウス及び生理食塩水又はG-2-MePEで治療したMeCP2欠損マウスの脳波記録を米国特許第7,714,020号に記載の方法を利用して得る。
我々は、G-2MePEが運動発作及び非痙攣性発作を両方とも減らすのに有効であり得ることを見い出す。
結論
MeCP2欠損マウスの我々のin vivo及びin vitro研究に基づいて、我々はG-2-MePEはレット症候群のヒトを治療するための有効な療法であり得ると結論づけた。さらに、G-2-MePEは、天然に存在する化合物((1-3)IGF-1；グリシル-プロピル-グルタマート又はGPE)(図21)より予想外に長い半減期を有するので、我々は、G-2-MePEの使用は、GPEを含め、他の薬理作用のある物質を超える明確かつ相当な利益を有すると結論づけた。
例えば、G-2-MePEは経口投与後に胃腸細胞によって分解されず、胃腸細胞によって吸収され、かつ中枢神経系内で活性である(Wen et al., 米国特許出願第12/283,684号；米国特許出願第2009/0074865号、米国特許第7,887,839号、参照によってその全体をここに援用する)。従って、G-2MePEは、静脈内、皮下、脳室内、又は非経口送達する必要がない。実際に、神経機能を改善し、神経変性状態を治療できる錠剤、カプセル剤及びゲル等の製造において、マイクロエマルション、粗エマルション、液晶製剤、ナノカプセル及びヒドロゲルを含む経口製剤を使用することができる(米国特許第7,887,839号)。本発明の化合物は、患者の運動機能が錠剤又はカプセル剤を嚥下するのに必要な機能未満である状態でも使用可能である。化合物の経口投与用の可溶性ゲルのいくつかのタイプがあり、これらを用いて本発明の化合物又は組成物を患者に送達することができる。G-2-MePEは容易に経口投与可能であり、かつレット症候群を含めた神経変性障害の治療に経口的に有効であるため、我々は、G-2-MePEはレット症候群の患者の長期療法に便利かつ有益であり得ると結論づけた。
さらに、レット症候群は他の自閉症スペクトラム障害と重要な特徴を共有するので、本発明の化合物は他のASDを有する動物から治療利益を得るのに有用であり、かつ自閉症、アスペルガー症候群、小児期崩壊性障害、及び特定不能の広汎性発達障害(PDD-NOS)のヒトに役立ち得る。
実施例13：ASDの治療
シャンク3欠損マウスモデル
この研究では、ASDと関連する22q13欠失症候群のモデルとしてシャンク3欠損マウスを使用する。
22q13欠失症候群は、シャンク3遺伝子の欠失又は突然変異と関連づけられた(Bonaglia et al, 2006)。シャンク3遺伝子は、グルタミン酸作動性シナプス内でフレームワークを形成する主要な足場タンパク質をコードする(Boeckers et al, 2006)。シャンク3は、シナプス後肥厚部(PSD)のコアの重大な部分であり、多くの重要な機能要素をPSD及びシナプスに補充する。これらの機能要素としては、α-アミノ-3-ヒドロキシル-5-メチル-4-イソキサゾール-プロピオン酸(AMPA)、代謝型グルタミン酸(mGlu)、及びN-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)グルタミン酸受容体の成分、並びに細胞骨要素がある。22q13欠失／シャンク3突然変異の速度を探求する最近の研究は、シャンク3のハプロ不全が、ASD症例の0.5%〜1%の頻度のASDの一遺伝子型を引き起こし得ると示唆している(Durand et al, 2007; Moessner et al, 2007; Gauthier et al, 2008)。
全長シャンク3の発現が妨害されたマウスモデルの作製は、当技術分野で既に記載されている(Bozdagi et al., Molecular Autism 2010, 1:15, p4)。簡単に述べると、Bruce4 C57BL/6胚性幹細胞を用いて、エクソン4とエクソン9の前に挿入されたloxP部位を有するマウス系統を作製した。フロックス対立遺伝子を切除し、エクソン4〜9の欠失、すなわちシャンク3のアンキリンリピートドメインの完全欠失で系統を維持した。ヘテロ接合体-ヘテロ接合体交雑からメンデル頻度により野生型(+/+)、ヘテロ接合性(+/-)及びノックアウト(-/-)マウスを生じさせた。ヘテロ接合体(qPCR)で全長シャンク3のmRNAの50%減少並びにシャンク3タンパク質発現の減少を確証した(シャンク3抗体N69/46を用いた免疫ブロットによって)。
この実施例では野生型マウスとヘテロ接合体の交雑によって生じたヘテロ接合体マウスを、22q13欠失症候群の原因であるシャンク3のハプロ不全の最良モデルに用いる。
方法
薬物治療
1〜3月齢の野生型及びヘテロ接合性シャンク3欠失マウスを4つの治療群に分割する：プラセボ治療野生型、プラセボ治療シャンク3欠失群及び2つのシャンク3欠失G-2-MePE治療群。動物にプラセボ(水)又は経口投与される水に配合されたG-2-MePEを1日2回(b.i.d)14日間与える。2種の用量：15又は60mg/kgでG-2-MePEを投与する。
方法論
方法論の詳細な説明はBozdagiら(Molecular Autism 2010, 1:15)で見つけられる。
行動解析
いくつかの時点で行動評価を行ない、Bozdagiらによって記載された方法論に沿って、社会的相互作用及び超音波社会的コミュニケーションの解析を含める。簡単に述べると、各治療群の雄-雌の社会的相互作用を評価する。対象の雄を群化飼育し、きれいな寝わらを含むきれいなケージ内で個々に試験する。各試験セッションは5分間続く。各対象マウスを異なる不慣れな発情期のC57BL/6J雌とつがわせる。ケージから水平に30cmのところにデジタル閉回路テレビカメラ(Panasonic, Secaucus, NJ, USA)を配置する。超音波マイクロホン(Avisoft UltraSoundGateコンデンサーマイクロホンカプセルCM15；Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany)をケージの20cm上に取り付ける。マイクロホンのサンプリング周波数は250kHzであり、分解能は16ビットである。用いた設備は、雄対象及び雌相手が発した鳴き声間を区別できないが、マウスの雄-雌相互作用中は一般に雄が発する鳴き声が優勢である。単一の25ワットの赤色光で照射される音響減弱化環境チャンバーに装置全体を収容する(ENV-018V; Med Associates, St Albans, VT, USA)。対象の遺伝子型及び治療群について十分知らされていない調査者が、鼻を付き合わせて匂いを嗅ぐこと、鼻で肛門性器の匂いを嗅ぐこと及び体の他の部分の匂いを嗅ぐことの尺度について雄対象からのビデオをNoldus Observerソフトウェア(Noldus Information Technology, Leesburg, VA, USA)を用いて採点する。遺伝子型／治療群の情報を知らされていない2人の高度に訓練された調査者が手作業で超音波発声を同定し、Avisoftソフトウェアを利用して要約統計量を計算する。評価者間信頼性は95%である。対応のないスチューデントt検定を利用してデータを解析する。
各群の雄マウスと雌マウスで嗅覚馴化／脱馴化試験を行なう。方法論は以前に記載されている(Silverman et al 2010, Yang et al 2009 and Silverman et al 2010)。ホームケージに挿入した一連の綿スワブ上に非社会的及び社会的匂いをそれぞれ2分間下記順序で与える：水、水、水(蒸留水)；アーモンド、アーモンド、アーモンド(1:100希釈アーモンド抽出物)；バナナ、バナナ、バナナ(1:100希釈、人工バナナ香味料)；社会的1、社会的1、社会的1(不慣れな性一致B6マウスを収容しているケージの底から拭い取った)；及び社会的2、社会的2、社会的2(異なる群の不慣れな性一致129/SvImJ B6マウスを収容しているケージの底から拭い取った)。各治療群内で各セットの馴化事象及び各脱馴化事象について一元配置反復測定(One-way repeated measure)ANOVAを行なった後、チューキー事後検定(Tukey post hoc test)を行なう。
海馬スライスの電気生理
マウスから組織チョッパー用いて死後の急性海馬スライス(350μm)を調製する。スライスを維持し、32℃で実験を行なう。下記(mMで)：NaCl、125.0；KCl、2.5；MgSO4、1.3；NaH2PO4、1.0；NaHCO3、26.2；CaCl2、2.5；グルコース、11.0を含むリンゲル液でスライスを灌流させる。細胞外記録中、リンゲル液を32℃で95%O2/5%CO2を用いて泡立てる(電極液：3M NaCl)。スライスを1時間維持する。領域CA3内に置かれた双極性タングステン電極でシャッファー側枝-交連求心性神経の刺激(100μ秒パルス、全ての30秒)によって誘発された、領域CA1内で放線状層から記録された興奮性シナプス後場電位(fEPSP)のベースラインの確立前1時間スライスを維持する。試験刺激強度を調整して最大反応の1/2のfEPSP振幅を得る。4つの連続的反応の平均波形からEPSP初期傾き(mV/ms)を決定する。低Mg2+(0.1mM)溶液中の線維斉射振幅に対してfEPSP傾きをプロットして入出力(I/O)曲線を生成する。イオンチャネル型グルタミン酸受容体拮抗薬：2-アミノ-2-ホスホノペンタン酸APV(50μM)及び6-シアノ-7-ニトロキノキサリン-2,3-ジオンCNQX(100μM)の存在下でAMPA受容体媒介I/O関係及びNMDA受容体媒介I/O関係を測定する。10〜200ミリ秒の刺激間隔で対パルス反応を測定し、平均反応と第2刺激パルスと第1刺激パルスの比として表す。
コントロール及び遺伝子修飾マウスでは、高周波数刺激(4回の100Hzの訓練、5分離れて1秒の刺激)、又はθバースト刺激(theta-burst stimulation)(TBS)(200ms離れて100Hzで4パルスの10バースト)、又は単一の100Hz刺激のどれかでLTPを誘発する。長期抑圧(LTD)を誘発するため、シャッファー側枝を低周波数又は対パルス低周波数刺激(1Hzで15分間900パルス)で刺激してmGlu受容体依存性LTDを誘発する。データを平均±SDとして表し、分散分析(ANOVA)又はスチューデントt検定を利用し、0.05のαレベルで有意性設定して統計分析を行なう。
結果
行動
雄試験対象による社会的な匂いを嗅ぐ動作の累積総持続時間は、プラセボ治療野生型群よりプラセボ治療シャンク3欠損群で低い。さらに、雄-雌社会的相互作用中、プラセボ治療シャンク3欠損群ではプラセボ治療野生型コントロールより少ない超音波発声がが発せられる。
2つのシャンク3欠損群におけるG-2-MePE治療は、プラセボ治療シャンク3欠損群に比べて社会的な匂いを嗅ぐ動作の累積総持続時間の有意な増加をもたらす。さらに、G-2-MePE治療群は、プラセボ治療ミュータント群より超音波発声数の増加を呈する。
マウスが社会的フェロモンを検出できることを確認することを意図した嗅覚馴化／脱馴化研究では、4群全てが正常レベルの馴化(一連の3つの同じ匂いを嗅ぐのに費やす時間の減少によって示される)、及び予想される脱馴化(異なる匂いを嗅ぐのに費やす時間の増加によって示される)を呈する。
電気生理
興奮性シナプス後場電位(fEPSP)の傾きの刺激強度に対するプロットは、コントロール群に対するプラセボ治療シャンク3欠損群のI/O曲線の減少を実証する。ヘテロ接合性プラセボ治療群で、我々は、野生型コントロール群に比べてI/O機能の平均傾きの50%減少に反映されたAMPA受容体媒介電場電位の減少をも観察する。対照的に、競合的AMPA/カイニン酸受容体拮抗薬CNQXの存在下でI/O関係を分析してシナプスNMDA受容体機能を測定すると、野生型とプラセボ治療ヘテロ接合体群との間に差異はない。これらの結果は、シャンク3欠損ヘテロ接合体マウスにAMPA受容体媒介基礎伝達の特異的減少があることを示唆している。
両ヘテロ接合体群のG-2-MePE治療は、AMPA受容体媒介電場電位を正常化し、プラセボ治療シャンク3欠損群に比べてI/O機能の平均傾きの増加をもたらす。
プラセボ治療シャンク3欠損群のLTPの維持は、野生型コントロールに比べて明らかに損なわれている。TBS LTP試験(200ms離して100Hzで4パルスの10バースト)も、プラセボ治療シャンク3欠損群においてTBS後60分で増強の相当な減少を示す。LTPで観察されるシナプス可塑性変化とは対照的に、ミュータント群では長期抑圧(LTP)が有意には変化しなかった。G-2-MePE治療は、プラセボ治療シャンク3欠損群に比べて両シャンク3欠損群の海馬の長期増強(LTP)とその維持を高めた。
検討
不十分な社会適格性及び反復行動は、全ての形態のASDの共通の特徴であり、かつ重要な診断の尺度である。知的発達の遅れ及び言語スキルの未発達もアスペルガー症候群を除く全てのASDに存在する共通の特徴である。
上記動物モデルは、臨床ヒト状態に類似した症状を示すとして当技術分野で受け入れられている。上記全てのミュータントモデル(NLGN3、NLGN4、CADM1、NRXN1、FMR1、シャンク)は、社会的スキル障害又は社会的不安の増加を示す。NRXN1、シャンク3、MeCP2及びFMR1ミュータント動物モデルでは海馬への興奮性伝達の減少が同定された。現時点では、ASDのポリジーン又は多因子モデルは記載されていない。ヒト集団でASDをもたらすことが知られている遺伝的欠陥に基づいた上記動物モデルは、ASD療法の有効性を試験する最良の機会を与える。
従ってASD動物モデルにおけるG-2-MePEの有効性は、ASDを患うヒト対象におけるその有効性を合理的に予測する。
実施例14：G-2-MePE治療はレット症候群のヒトin vitroモデルのニューロンの形態を変える
ニューロンの形態に及ぼすG-2-MePEの効果を調べるため、我々は、Marchetto et al., A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells, Cell 143:527-539 (2010)(追加情報を含め)に記載されているRTTのin vitroモデルを用いた。このモデルは、様々なMeCP2突然変異を有するヒトRTT患者の線維芽細胞から作製した人工多能性幹細胞(iPSC)を使用する。
方法
細胞培養及びレトロウイルス感染
皮膚のバイオプシーの外植片からRTT線維芽細胞(4つの異なるMeCP2突然変異を有する)を作製する。標的MeCP2遺伝子に対するshRNAをLentiLox3.7レンチウイルスベクター中にクローン化する(Marchetto et al.に記載されているように)。線維芽細胞にレトロウイルス再プログラミングベクター(Sox2、Oct4、c-Myc及びKlf4)を感染させる。感染2日後、線維芽細胞を、hESC培地を伴う有糸分裂不活化マウス胚線維芽細胞上に蒔く。2週間後、線維芽細胞のバックグラウンドから現れるiPSCコロニーを手作業で採取し、胚幹細胞培養液mTeSRTM(Stem Cell Technologies)を用いてマトリゲル被覆皿(BD)上のフィーダーフリー条件に移して、手作業で継代培養する。生成されたクローンの遺伝子発現プロファイルをヒトゲノムAffymetrix Gene ChipTMアレイを用いて測定し、再プログラミングが成功していることを確認する。
神経分化：NPC及び成熟ニューロン
神経前駆細胞(NPC)を得るため、細胞クラスターの機械的解離及び低接着皿上でFGF2を含まないhESC培地に5〜7日間のプレーティングによって胚様体(EB)を形成する。その後、EBをポリ-オルニチン/ラミニン被覆皿上DMEM/F12+N2培地(有糸分裂後の細胞の成長及び発現のための血清フリー栄養補助剤)に蒔く。結果として生じるロゼットを7日後に収集し、アキュターゼ(accutase)で解離させてNPC培地を含む被覆皿に蒔く(DMEM/F12；0.5X N2；0.5X B27及びFGF2)。同一条件でアキュターゼを用いた1〜2回の継代培養後にNPCの均質集団が達成される。成熟ニューロンを得るため、浮遊するEBを1uMのレチノイン酸で3週間処理する(全部で4週間の分化時間を与える)。成熟EBをパパイン及びDNAアーゼで1時間37℃で解離させ、ポリ-オルニチン/ラミニン被覆皿内FGF2を含まないNPC培地に蒔く。
G-2-MePEによる処理
RTTニューロン培養をG-2-MePE(1nM〜10μM)で1週間処理する
ニューロン形態の免疫細胞化学及び定量化
細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、PBS中0.5%のTriton-X100で透過処理する。次に細胞を0.5%のTriton-X100及び5%のロバ血清を含むPBSで1時間室温で遮断する。Zeiss倒立顕微鏡を用いて蛍光シグナルを検出し、イメージをPhotoshop CS3で処理する。下記一次抗体を用いる：TRA-1-60、TRA-1-81(1:100)、NanogとLin28(1:500)、ヒトNestin(1:100)、Tuj-1(1:500)、Map2(1:100)；meCP2(1:1000)；VGLUT1(1:200)、Psd95(1:500)、GFP(1:200)、Sox1(1:250)、Mushasi1(1:200)及びme3H3K27(1:500)。Syn::EGFPTMを使用するニューロンの同定後に適切なソフトウェア(例えばImageJ)を用いて細胞体サイズを測定する。zスタック光学切片の個々の投影からニューロンの神経突起及びスパインの形態を研究し、z平面で評価される解像度と相関する0.5um増分でスキャンする。各光学切片は500lpsで3回スキャンした後、Kalmanフィルタリングした結果である。シナプス定量化のためには、Biorad Radiance 2100TM共焦点顕微鏡を用いて1umのzステップでイメージを撮る。遺伝子型を知らせずにシナプスの定量化を行なう。Map2陽性プロセスに沿うVGLUT1点のみをカウントする。2要因ANOVA検定及びボンフェローニ事後検定を利用して統計学的有意性を試験する。
カルシウムイメージング
ヒトiPSC由来ニューロンのネットワークにSyn:DsRedレポーター構築物を有するレンチウイルスを感染させる。細胞培養を無菌クレブスHEPES緩衝液(KHB)で2回洗浄し、KHB中2〜5μMのFluo-4AMTM(Molecular Probes/Invitrogen,Carlsbad,CA)と40分間室温でインキュベートする。KHBで2回洗浄して過剰色素を除去し、さらに20分間インキュベーションを行なって細胞内色素濃度を平衡にし、エステル分解させる。Olympus IX81倒立蛍光共焦点顕微鏡(Olympus Optical, Japan)上に488nmの(FITC)フィルターを備えたHamamatsu ORCA-ERTMデジタルカメラ(Hamamatsu Photonics K.K., Japan)を用いて28Hzにて336×256ピクセルの領域で5000フレームのコマ撮り(time-lapse)連続イメージ(倍率100×)を得る。イメージをMetaMorph 7.7TM(MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA)で取得する。引き続き、ImageJTM及びMatlab 7.2TMの特注ルーチン(Mathworks, Natick, MA)を用いてイメージを処理する。
電気生理
6週間の分化後にアストロサイトと共培養した細胞からホールセルパッチクランプ記録を行なう。新鮮なHEPES緩衝生理食塩水で絶えずバッチを灌流させる(処方の補足方法参照)。「補足材料」に記載の内部液で記録用マイクロピペット(先端抵抗3〜6MΩ)を満たす。Axopatch 200BTM増幅器(Axon Instruments)を用いて記録を行なう。シグナルを2kHzでふるい分け、5kHzでサンプリングする。ホールセル静電容量を完全に補償する。連続抵抗は補償しないが、実験中は10mVのパルスに応じた容量電流の振幅によってモニターする。全ての記録は室温で行ない、化学薬品はSigmaから購入する。自発的なシナプス後電流の周波数と振幅をMini Analysis ProgramTMソフトウェア(Synaptosoft, Leonia, NJ)で測定する。WT群とRTT群の統計的比較はノンパラメトリックなコルモゴロフ・スミルノフ両側検定(Kolmogorov-Smirnov two-tailed test)を利用し、p=0.05の有意水準で行なう。EPSCはCNQX又はDNQX(10〜20μM)で遮断し、IPSPはビククリン(bicuculine)(20μM)で抑制する。
結果
RTTのiPSC由来ニューロンは、グルタミン酸作動性シナプス数の減少、スパイン密度の減少及びより小さい細胞体サイズを特徴とする。RTTニューロンは、特定の電気生理学的欠陥、すなわちコントロールと比較したときに自発的なシナプス電流の周波数及び振幅のかなりの減少をも示す。RTTニューロンは、細胞内カルシウム移行頻度の減少を示す。
我々は、上記モデルにG-2-MePEを用いて、RTT表現型のいずれかの病因を減弱できるかどうかを試験する。
各薬物濃度による細胞培養の処理は、未処理RTTコントロールに比べて処理RTT細胞培養の形態学的及び生理学的パラメーターの全てを改善する。詳細には、我々は、G-2-MePE処理RTT細胞におけるグルタミン酸作動性シナプス数の相当な増加を観察する。全ての濃度のG-2-MePE処理がRTT由来ニューロンのVGLUT1点数を増やす。G-2-MePE処理は、自発的なシナプス後電流の周波数と振幅のみならず、G-2-MePE処理RTTニューロンのシナプス活動によってもたらされるカルシウム移行頻度をも正常化する。
ヒトRTTの現在のin vitroモデルでは、RTT患者由来のiPSC及びそれらから分化したニューロンは、MeCP2発現の異常によって特徴づけられる。上記本発明の詳細な説明で検討したように、RTT症例の大多数はMeCP2遺伝子の突然変異と関連する。従ってヒトRTTの現在のin vitroモデルにおけるG-2-MePEの有効性は、RTTを患うヒト対象におけるその有効性を合理的に予測する。
実施例15：レット症候群のヒトにおけるG-2-MePEの効果
方法
30名のレット症候群の被験者を採用する。被験者は16〜29歳の女性と男性である(平均=12.1、SD=4.4)。すべての被験者は、IQ<60及びMECP2遺伝子の突然変異を有する。被験者は、高速フーリエ変換(FFT)で検出されるように、EEGのスパイク活動又はEEGの低周波数帯の増加のどちらかをも示す。被験者には、研究前の少なくとも6週間併用薬が安定的であるべきことを指導する。注意障害の徴候を治療するための薬物を受けている被験者は午前中に検査し、午後薬物を服用するように指導する。QTc間隔>451ミリ秒の被験者は除外する。
研究は、プラセボ、5日間10mg/kgのT.I.D経口G-2-MePE、又は30mg/kgのT.I.D.経口G-2-MePEのどれかの3種の投与によるランダム化二重盲検プラセボ対照並行研究である。
下記手段を利用して被験者をベースラインで試験する：レット症候群自然経過／臨床的重症度スケール(The Rett Syndrome Natural History / Clinical Severity Scale)、異常行動チェックリストコミュニティー版(Aberrant Behavior Checklist Community Edition)(ABC)、ヴァインランド(Vinelands)、臨床全般重症度印象(Clinical Global Impression of Severity)(CGI-S)及びそれらの介護者が完成した介護者負担質問票(Caregiver Strain Questionnaire)(CSQ)。
被験者を入院患者として来院させて、睡眠ポリグラフ技術を利用して24時間常にEEG、ECG及び呼吸数の初期ベースライン記録を可能にする。Q-SensorTMを用いて手の動きをも記録する。誘導EEG尺度には以下のものが含まれる：EEGの単位時間当たりのスパイク、EEGの周波数帯域の総パワー、QTc及び心拍変動(HRV)、並びに呼吸不整。
標準的安全尺度及び有害事象のSMURF誘発を利用して有害事象をも記録する。
ベースラインスコアからの変化に及ぼす治療の効果について反復共分散分析(ANCOVA)を行なうことによって、統計的に、G-2-MePEによる治療の効果を分析する。
結果
G-2-MePEによる治療は、プラセボによる治療中に存在する有害事象と同程度の有害事象をもたらし、全ての有害事象は短い持続時間かつ軽度の重症度のものである。重大な有害事象は報告されない。QTCの増加の例も報告されない。
呼吸数又は心拍変動に対する影響も見られない。
G-2-MePEによる治療は、EEGの単位時間当たりのスパイクのかなりの全体的減少をもたらす。30mg/kgのT.I.D.経口G-2-MePEによる治療は、プラセボに比べてスパイク活動を低減する。この用量のG-2-MePEは、プラセボに比べてEEGのデルタ帯域のパワーをも低減する。
G-2-MePEによる治療は、Q-SensorTM装置を用いてカウントしたところ、24時間当たりの全体的な手の動きをも減らす。この効果は、プラセボに比べて30mg/kgのT.I.D.用量で有意である。
G-2-MePEによる治療は、レット症候群の自然経過／臨床的重症度スコア(Rett Syndrome Natural History / Clinical Severity Score)に対して全体的な有意な効果はもたらさない。しかし、30mg/kgのT.I.D.経口G-2-MePEは、プラセボに比し、下記サブスコアに有意な効果をもたらす：「この来診での検査による非言語性コミュニケーション(Nonverbal Communication at this visit by exam)」；「この来診での癲癇／発作(Epilepsy/Seizures at this visit)」；及び「手の使用(Hand use)」。
結論
G-2-MePEによる治療は、本研究において中枢神経系機能のかなりの改善をもたらす。相対的に短期の治療にもかかわらず、脳の電気的活動の異常が低減し、有効性の明白な徴候である。この効果は用量依存性であり、30mg/kgのT.I.D.経口G-2-MePE治療後に見られる。これらの効果は、G-2-MePEの投与後にレット症候群のmecp2ノックアウトトランスジェニックマウスモデルで見られるCNS機能の改善と酷似している。
用量依存性効果は、客観的計数装置及び主観的評定により評価したところ、手の使用に関しても見られる。これは、目的もなく手を握り締めることはレット症候群の臨床表現型に特徴的でもあり、この障害に独特でもあることから興味深い。
治療によってレット症候群の自然経過／臨床的重症度スコアの非言語性コミュニケーション評点が改善される。この尺度は主にアイコンタクトを評価する。このことはG-2-MePEでのより長期治療がこの集団の社会的関連性を改善し得るという見込みを高める。
G-2-MePEはこの集団で良い耐容性を示す。QTc間隔の延長又は無呼吸等のこの患者集団に特異的な懸念の標準的尺度又は範囲のどちらにも影響は見られない。
実施例16：自閉症スペクトラム障害のヒトに及ぼすG-2MePEの効果
方法
G-2-MePEがASDの症状を治療できるかどうかを決定するため、我々は、ASDのヒトで研究を行なう。20名の自閉症スペクトラム障害の被験者を採用する。被験者は16〜65歳の男性と女性である(平均=18.1、SD=3.4)。全ての被験者はIQ>60及び自閉症性障害又はアスペルガー症候群の厳密なDSM-IV-TR診断を有する。被験者は、ADI-R及びADOS-G手段に従う自閉症スペクトラム障害の判断基準にも合致し、かつ提案されたDSM-V判断基準を満たす。被験者には、研究前の少なくとも6週間併用薬が安定的であるべきことを指導する。注意障害の徴候を治療するための薬物を受けている被験者は午前中に検査し、午後薬物を服用するように指導する。自閉症のために指示された非定型の抗精神病薬でよく治療された被験者は除外する。脆弱X症候群又は結節性硬化症を含め、既知の一般的障害について被験者を選別し、脆弱X症候群又は結節性硬化症の患者は除外する。制御されない癲癇の被験者も除外する。
研究は、3相の二重盲検プラセボ対照クロスオーバー研究である。被験者は、ランダム化順序でクロスオーバーの各相に入る。試験相では、被験者はプラセボ、5日間10mg/kgのT.I.D経口G-2-MePE、又は30mg/kgのT.I.D.経口G-2-MePEのどれかを受ける。クロスオーバーの各相は14日の洗い流し期間で分離される。
下記手段を利用して被験者をベースラインで試験する：ウェクスラー(Wechsler)IQ、異常行動チェックリストコミュニティー版(Aberrant Behavior Checklist Community Edition)(ABC)、ヴァインランド(Vinelands)、エール・ブラウン強迫観念・強迫行為評価スケール(Yale-Brown Obsessive Compulsive Scale)(YBOCS)強迫行為サブスケール、対人応答性スケール(Social Responsiveness Scale)(SRS)、臨床全般重症度印象(Clinical Global Impression of Severity)(CGI-S)及びそれらの介護者が完成した介護者負担質問票(Caregiver Strain Questionnaire)(CSQ)。
被験者を2タスク−改訂された「眼で心を読み取る検査(Reading the Mind in the Eyes Test)(RMET)」及び「視標追跡(Eye Tracking)(ET)」タスク、並びに「臨床全般印象改善(Clinical Global Impression of Improvement)(CGI-I)」で管理する。プラセボ又は各用量のG-2-MePEの投与後2時間でタスクが開始する。RMETは、眼からわずかな感情的な顔の表情の情動を読み取る能力を評価するコンピューターに基づいたタスクであり、自閉症患者の情動認知の広く使用されている検査である(2001)。重要なことに、RMETは薬理作用のある物質の単一投与でさえ改善を検出することができる(Guastella et al., 2010)。視標追跡の問題は、ヒトの顔写真の眼を見るのにあまり時間をかけない自閉症患者の特徴である。この場合もやはり、薬理的処置の単一投与が自閉症の視標追跡欠陥を回復させることができる(Andari et al, 2010)。
標準的安全尺度を用いて有害事象をも記録する。
ベースラインスコアからの変化に及ぼす治療の効果について反復共分散分析(ANCOVA)を行なうことによって、統計的に、G-2-MePEによる治療の効果を分析する。
結果
G-2-MePEによる治療は、プラセボによる治療中に存在する有害事象と同程度の有害事象をもたらし、全ての有害事象は短い持続時間かつ軽度の重症度のものである。重大な有害事象は報告されない。
G-2-MePEによる治療は、RMET検査のパフォーマンスの有意な全体的改善をもたらす。30mg/kgのT.I.D.経口G-2-MePEによる治療は、RMETについて正しい応答率を高める。
G-2-MePEによる治療は、ET検査で眼領域を見るのにかける時間の有意な全体的改善をもたらす。治療期間の最後におけるCGI-Iスコアは有意な差異を示す。プラスの治療効果はベースラインCSQスコアと関連がある。
結論
G-2-MePEによる治療は、改訂された「眼で心を読み取る検査」におけるパフォーマンス、及び「指標追跡」タスクのパフォーマンスの有意な改善をもたらす。この効果は用量依存性であり、30mg/kgのT.I.D.経口G-2-MePEによる治療後に見られる。
これらの尺度の改善は、社会情報処理の改善を反映する。社会的相互作用の欠陥は自閉症スペクトラム障害の診断にとって中心的な症状であるため、このことは重要な知見である。
G-2-MePEは、「臨床全般印象改善(Clinical Global Impression of Improvement)」でで指標づけられるように機能の全体的改善をももたらす。この研究からの症例報告書のフリーテキスト注釈は、この効果が社会的関連性に関係することを示唆している。これは、RMET及びETタスクで見られる変化は日常生活における社会的活動に対する関連性があり得ることを意味する。G-2-MePEは、この集団で良い耐容性を示す。
実施例17：自閉症スペクトラム障害に及ぼすG-2-MePEの効果を決定するための動物モデル G-2-MePEの効果をASDの下記遺伝的モデルでさらに試験する：Tbx1ヘテロ接合性マウス、Cntnap2ノックアウトマウス及びSlc9a6ノックアウトマウス。G-2-MePEを脆弱X症候群のfmr1ノックアウトマウスモデルでも試験する。
Tbx1. TBX1の突然変異は自閉症スペクトラム障害と関連する(Paylor et al., 2006)。トランスジェニックTbx1マウスは、社会的相互作用、超音波発声、反復行動及び作業記憶について選択的に障害されている(Hiramoto et al., 2011)。
Cntnap2. コンタクチン関連タンパク質様2(CNTNAP2)遺伝子の突然変異のある患者の2/3は自閉症スペクトラム障害と診断される(Alarcon et al., 2008; Arking et al., 2008; Bakkaloglu et al., 2008; Strauss et al., 2006; Vernes et al., 2008)。Cntnap2ノックアウト(KO)マウスは、社会的行動、超音波発声及び反復行動においてASD関連表現型を示す(Penagarikano et al., 2011)。
Slc9a6. この遺伝子は、症候性ASDと結びつけられており、ナトリウム水素交換輸送体(sodim-hydrigen exchanger)6(NHE6)をコードする。SLC9A6の突然変異は知的障害(Gilfillan et al., 2008)及び自閉症性行動(Garbern et al., 2010)と関連する。Slc9a6 KOマウスについては多動及び小脳機能不全(Stromme et al., 2011)を示す。
Fmr1. FMR1遺伝子のサイレンシングは、その表現型に自閉症が含まれる脆弱X症候群をもたらし；脆弱X症候群患者の2/3は自閉症スペクトラム障害の選別基準を満たす(Harris et al., 2008)。脆弱X症候群の小児患者発作閾値の低下をも示す。fmr1ノックアウトマウスは、若年性発作感受性を含めた脆弱X症候群の表現型の多くを複製する(Yan et al., 2004)。
方法
上記各動物を引用文献に記載の方法論に従って作製する。各遺伝的モデルについて野生型等価物をも得る。各モデルの動物を3群に分割する(n=10〜n=20)：プラセボ治療野生型マウス、ミュータントG-2-MePE治療群及びプラセボ治療コントロール群。
治療は腹腔内投与である：プラセボ(生理食塩水)又は20mg/kg/日のG-2-MePE。
各モデルで提示されるASDの重要な特徴の尺度を引用文献に従って測る。
結果
G-2-MePE治療は、ASD表現型と関連する全ての尺度を有意に改善する。
参考文献
下記参考文献及び本明細書で引用した全ての特許、特許出願その他の出版物は、参照によってその全体が援用される。
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Claims (18)

  1. 自閉症スペクトラム障害(ASD)の症状を患っている動物の治療方法であって、有効量のグリシル-2-メチル-L-プロピル-L-グルタマート(G-2-MePE)を前記動物に投与する工程を含み、前記治療が、レット症候群自然経過／臨床的重症度スケール、異常行動チェックリストコミュニティー版(ABC)、ヴァインランド、臨床全般重症度印象(CGI-S)及びそれらの介護者が完成した介護者負担質問票(CSQ)から成る群より選択される1以上の行動試験、又は前記症状を患っていないコントロール動物と比べた脳波(EEG)スパイク周波数、EEGの周波数帯域の総パワー、手の動き、QTc及び心拍変動(HRV)、並びに呼吸不整から成る群より選択される1以上の生理学的試験で評価した場合に前記症状の改善をもたらす、方法。
  2. 前記ASDが、自閉症、脆弱X症候群、レット症候群(RTT)、自閉症性障害、アスペルガー症候群、小児期崩壊性障害及び特定不能の広汎性発達障害(PDD-NOS)、及び病理学的要求回避(PDA)から成る群より選択される、請求項1の方法。
  3. 前記G-2-MePEの有効量が約0.001mg/kg〜約100mg/kgの範囲である、請求項1又は2のいずれかの方法。
  4. 脳に直接投与するときの前記G-2-MePEの有効量が、約0.001mg/kg〜約0.1mg/kgの範囲である、請求項1〜3のいずれかの方法。
  5. 全身投与のときの前記G-2-MePEの有効量が、約1mg/kg〜約100mg/kgの範囲である、請求項1〜2のいずれかの方法。
  6. 前記G-2-MePEを全身、非経口又は直接脳内に投与する、請求項1〜2のいずれかの方法。
  7. 前記G-2-MePEを直接脳室内に投与する、請求項1〜2のいずれかの方法。
  8. 前記G-2-MePEを静脈内、皮下又は経口投与する、請求項1〜2のいずれかの方法。
  9. 前記G-2-MePEを約10mg/kg〜約60mg/kgの用量で経口投与する、請求項1〜8のいずれかの方法。
  10. 前記G-2-MePEが、生理学的に適合性の水溶液、油中水マイクロエマルション、油中水粗エマルション、油中水液晶、ナノカプセル、又は錠剤中にある、請求項1〜9のいずれかの方法。
  11. 前記G-2-MePEを、水溶液に溶けるゲルに組み入れる、請求項1〜10のいずれかの方法。
  12. 前記G-2-MePEを前記動物の粘膜に投与する、請求項1〜11のいずれかの方法。
  13. 前記動物の口内に前記ゲルを置き、前記G-2-MePEを前記ゲルから放出させる、請求項11の方法。
  14. 自閉症スペクトラム障害(ASD)の症状を有する動物の治療方法であって、下記式1又は式2：
    Figure 2018138606
     （式中、
    mは0又は1であり；
    nは0又は1であり；
    XはH又は-NR6R7であり；
    YはH、アルキル、-CO2R5、又は-CONR6R7であり；
    ZはH、アルキル、-CO2R5又は-CONR6R7であり；
    R1はH、アルキル、又はアラルキルであり；
    R2、R3、及びR4は独立にH又はアルキルであり；
    各R5は独立にH、アルキル、又は脂肪アルコール残基であり；
    各R6及びR7は独立にH、アルキル、又はアラルキルであり、或いは-NR6R7はピロリジノ、ピペリジノ、又はモルホリノである）
    の化合物；
    或いはYが-CO2(アルキル)であり、かつZが-CO2Hであるか又はYが-CO2Hであり、かつZがCO2(アルキル)である化合物がラクトン化されると形成されるラクトン；
    及びその医薬的に許容できる塩
    （但し、前記化合物はGPE、N-Me-GPE、GPEアミド、APE、GPQ又はその塩でない）
    を前記動物に投与する工程を含む方法。
    いくつかの態様では、本発明は下記を包含する：
    (a)前記化合物は式1の化合物であり；
    (b)mは0であり；
    (c)nは1であり；
    (d)X、Y、R1、R2、R3、R4、及びR5の少なくとも1つは水素でなく；
    (e)Xは-NR6R7であり；かつ
    (f)Yは-CO2R5又は-CO2NR6R7であり；かつ
    (g)Zは-CO2R5又は-CO2NR6R7である。
  15. 前記化合物が有効量のG-2-MePEである、請求項14の方法。
  16. 下記：インスリン様成長因子I(IGF-I)、インスリン様成長因子II(IGF-II)、グリシル-プロリル-グルタマート(GPE)、トランスフォーミング成長因子β1、アクチビン、成長ホルモン、神経成長因子、脳由来神経栄養因子(BDNF)、成長ホルモン結合タンパク質、IGF結合タンパク質(特にIGFBP-3)、塩基性線維芽細胞成長因子、酸性線維芽細胞成長因子、hst/Kfgk遺伝子産物、FGF-3、FGF-4、FGF-6、ケラチノサイト成長因子、アンドロゲン誘発性成長因子、int-2、線維芽細胞成長因子相同因子1(FHF-1)、FHF-2、FHF-3及びFHF-4、ケラチノサイト成長因子2、グリア細胞活性化因子、FGF-10及びFGF-16、毛様体神経栄養因子、脳由来成長因子、ニューロトロフィン3、ニューロトロフィン4、骨形成タンパク質2(BMP-2)、グリア細胞系由来神経栄養因子、活性依存性神経栄養因子、サイトカイン白血病抑制因子、オンコスタチンM、インターロイキン、α-、β-、γ-、又はコンセンサスインターフェロン、TNFα、クロメチアゾール；キヌレン酸、Semax、タクロリムス、L-スレオ-1-フェニル-2-デカノイルアミノ-3-モルホリノ-1-プロパノール、アンドレノコルチコトロピン-(4-9)類似体[ORG 2766]及びジゾシルピン(MK-801)、セレギリン；グルタミン酸拮抗薬、例えばメマンチン(Namenda) NPS1506、GV1505260、MK-801、GV150526；AMPA拮抗薬、例えば2,3-ジヒドロキシ-6-ニトロ-7-スルファモイルベンゾ(f)キノキサリン(NBQX)、LY303070及びLY300164；アドレシンMAdCAM-1及び／又はそのインテグリンα4受容体(α4β1及びα4β7)に対する抗炎症薬、例えば抗MAdCAM-1mAb MECA-367(ATCC受け入れ番号HB-9478)、フェノバム、選択的セロトニン再取り込み阻害薬、例えばフルオキセチン、又は非定型抗精神病薬、例えばリスペリドンから成る群より選択される第2の治療薬を前記動物に投与する工程をさらに含む、請求項1〜15のいずれかの方法。
  17. 前記化合物の前記用量が、10mg/kgを1日3回又は30mg/kgを1日3回の量である、請求項1〜15のいずれかの方法。
  18. 前記動物がヒトである、請求項1〜17のいずれかの方法。
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