ES2641880T3 - Tratamiento de trastornos del espectro autista usando ácido glicil-L-2-metilprolil-L-glutámico - Google Patents

Tratamiento de trastornos del espectro autista usando ácido glicil-L-2-metilprolil-L-glutámico Download PDF

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Abstract

Glicil-2-metil-L-prolil-L-glutamato (G-2-MePE) para su uso en el tratamiento de un síntoma seleccionado del grupo que consiste en el funcionamiento social alterado y el comportamiento repetitivo de un trastorno del espectro autista (ASD) en un animal mediante la administración oral de una cantidad eficaz de G-2-MePE.

Description

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DESCRIPCION
Tratamiento de trastornos del espectro autista usando acido glicil-L-2-metilprolil-L-glutamico Campo de la invencion
La presente invencion se refiere, en general, a la terapia de trastornos del espectro autista (ASD), incluyendo autismo, sfndrome de X fragil, sfndrome de Rett (RTT), trastorno autista, sfndrome de Asperger, trastorno disociativo de la infancia y trastorno generalizado del desarrollo no especificado (PDD-NOS), asf como evitacion de la demanda patologica (PDA). En particular, la presente invencion se refiere al tratamiento del funcionamiento social alterado y al comportamiento repetitivo de un aSd usando glicil-2-metil-prolil-glutamato (G-2-MePE).
Antecedentes
Descripcion de la tecnica relacionada
Los trastornos del espectro autista se estan diagnosticando cada vez mas. Los trastornos del espectro autista (ASD) son un grupo de trastornos del desarrollo vinculados, caracterizados por anomalfas en la interaccion social y en la comunicacion, intereses restringidos y comportamientos repetitivos. La clasificacion actual de los ASD reconoce cinco formas distintas: el autismo clasico o el trastorno autista, el sfndrome de Asperger, el sfndrome de Rett, el trastorno disociativo de la infancia y el trastorno generalizado del desarrollo no especificado (PDD-NOS). Un sexto sfndrome, la evitacion de la demanda patologica (PDA), es un trastorno del desarrollo generalizado mas especffico.
El documento EP 0 366 638 desvela GPE (un tripeptido que consiste en los aminoacidos Gly-Pro-Glu) y sus derivados dipeptfdicos Gly-Pro y Pro-Glu. El documento EP 0 366 638 desvela que el GPE es eficaz como neuromodulador y es capaz de afectar a las propiedades electricas de las neuronas.
El documento W095/172904 desvela que el GPE tiene propiedades neuroprotectoras y que la administracion de GPE puede reducir el dano en el sistema nervioso central (CNS) mediante la prevencion o inhibicion de la muerte celular neuronal y glial.
El documento WO 98/14202 desvela que la administracion de GPE puede aumentar la cantidad eficaz de colina acetiltransferasa (ChAT), acido glutamico descarboxilasa (GAD) y oxido nftrico sintasa (NOS) en el sistema nervioso central (SNC).
El documento WO9965509 desvela que el aumento de la cantidad eficaz de GPE en el SNC, tal como mediante la administracion de GPE, puede aumentar la cantidad eficaz de tirosina hidroxilasa (TH) en el SNC para aumentar la produccion de dopamina mediada por TH en el tratamiento de enfermedades tales como la enfermedad de Parkinson.
El documento WO02/16408 desvela ciertos analogos de GPE que tienen sustituciones de aminoacidos y otra cierta modificacion que son capaces de inducir un efecto fisiologico equivalente al GPE dentro de un paciente. Las aplicaciones de los analogos de GPE incluyen el tratamiento de la lesion cerebral aguda y enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la lesion o enfermedad en el SNC.
El documento WO 2008/153929 analiza metodos de tratamiento del sfndrome de Rett y de otros trastornos de la funcion y maduracion sinaptica usando analogo/s de IGF1, (1-3)IGF-1, (1-3)IGF-1 y/o moleculas terapeuticas relacionadas.
La patente de EE.UU. n.° 7.041.314 desvela composiciones de materia y metodos de uso de G-2-MePE.
Sumario
En la actualidad, no existe un tratamiento eficaz del ASD, y el cuidado del paciente se limita al tratamiento de los sfntomas.
La presente invencion proporciona glicil-2-metil-L-prolil-L-glutamato (G-2-MePE) para su uso en el tratamiento de un sfntoma seleccionado del grupo que consiste en el funcionamiento social alterado y el comportamiento repetitivo de un trastorno del espectro autista (ASD) en un animal mediante la administracion oral de una cantidad eficaz de G-2- MePE.
Breve descripcion de los dibujos
La presente invencion se describe haciendo referencia a realizaciones especfficas de la misma. Otros aspectos y caracterfsticas de la presente invencion se pueden entender con referencia a las figuras, en las que:
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La FIG. 1 es un esquema general para la preparacion de analogos sinteticos de GPE.
Las FIG. 2 y 3 representan esquemas para modificar los restos de glicina en GPE.
Las FIG. 4 a 9 representan esquemas para modificar los restos de acido glutamico en GPE.
Las FIG. 10 y 11 representan esquemas para modificar enlaces peptfdicos de GPE.
Las FIG. 12-15 representan graficas que resumen los resultados del ensayo de neuronas in vitro con GPE o G-2- MePE y acido okadaico.
La FIG. 12 representa un grafico que muestra los efectos de GPE en neuronas corticales lesionadas con acido okadaico.
La FIG. 13 representa un grafico que muestra los efectos de G-2-MePE en neuronas corticales lesionadas con acido okadaico.
La FIG. 14 representa un grafico que muestra los efectos de G-2-MePE, GPE en microexplantes cerebelosos danados con acido okadaico.
La FIG. 15 representa un grafico que muestra los efectos de G-2-MePE o GPE en celulas estriadas danadas con acido okadaico.
La FIG. 16 muestra los efectos de la inyeccion subcutanea de G-2-MePE (a dosis de 0,012, 0,12, 1,2 y 12 mg/kg) sobre el numero de neuronas positivas para ChAT en el cuerpo estriado de ratas de 18 meses de vida.
La FIG. 17 muestra los efectos del tratamiento con G-2-MePE sobre la retencion de la memoria espacial en ratas adultas de mediana edad de 12 meses.
Las FIG. 18A y 18B muestran los efectos de G-2-MePE en la memoria de trabajo espacial de ratas envejecidas (17 meses) en un laberinto radial de 8 brazos despues de 3 semanas de tratamiento y un lavado de nueve dfas. La FIG. 18A muestra los perfiles de adquisicion del laberinto a lo largo de los dfas para los diferentes grupos. La FIG. 18B muestra la proporcion de elecciones correctas de laberintos promediadas a lo largo de los dfas para los grupos.
La FIG. 19A muestra los efectos de una sola administracion intraperitoneal de 4 dosis de G-2-MePE sobre la proliferacion de neuroblastos, evaluada por el numero de celulas positivas en PCNA en la zona subventricular (SVZ) de ratas envejecidas.
La FIG. 19B muestra los efectos de una sola administracion intraperitoneal de 4 dosis de G-2-MePE en la colocalizacion de PCNA y tincion con doblecortina en una rata tratada con la dosis mas alta de G-2-MePE (panel derecho) en comparacion con la rata tratada con vehfculo (panel izquierdo).
La FIG. 19C muestra los efectos de G-2-MePE en la proliferacion de neuroblastos evaluada mediante tincion inmunohistoqufmica de PCNA en ratas de mediana edad.
La FIG. 20A muestra un aumento significativo en el numero de astrocitos reactivos evaluado mediante tincion con GFAP en el hipocampo en ratas envejecidas en comparacion con ratas jovenes (*p < 0,01) y ratas de mediana edad (*p <0,01).
La FIG. 20B muestra una fotograffa de una seccion de corteza cerebral de una rata envejecida, que muestra astrocitos evaluados con tincion con GFAP, algunos de los cuales estan asociados con la formacion de capilares (flechas).
La FIG. 20C muestra los efectos dependientes de la dosis del tratamiento con G-2-MePE (a dosis de 0,12, 0,12,
1.2 y 12 mg/kg/dfa) sobre la reduccion del numero de astrocitos ensayados usando tincion con GFAP en la subregion CA4 del hipocampo en ratas envejecidas.
La FIG. 20D muestra los efectos dependientes de la dosis del tratamiento con G-2-MePE (a dosis de 0,12, 0,12,
1.2 y 12 mg/kg/dfa) sobre la reduccion del numero de astrocitos ensayados usando tincion con GFAP en la corteza cerebelosa.
La Fig. 21 muestra las propiedades farmacocineticas de GPE y G-2-MePE en la circulacion de ratas despues de la inyeccion intravenosa.
La FIG. 22 muestra los efectos de G-2-MePE sobre el aumento de la duracion de la supervivencia en ratones deficientes en MeCP2 en comparacion con ratones deficientes en MeCP2 tratados con solucion salina.
La FIG. 23 muestra los efectos de G-2-MePE sobre la potenciacion a largo plazo del hipocampo medida por la pendiente de fEPSP en ratones deficientes en MeCP2, en comparacion con los ratones deficientes en MeCP2 tratados con solucion salina.
La FIG. 24 representa un grafico que muestra los efectos de G-2-MePE sobre la longitud de la dendrita en funcion de la distancia desde el soma celular.
Descripcion detallada
Definiciones
El termino "aproximadamente" con referencia a una dosis o al tiempo se refiere a una variable en particular y a un intervalo alrededor de esa variable que esta dentro del error de medicion normal o esta en un 20 % del valor de la variable. El termino “aproximadamente” con referencia a un resultado observado significa que la variacion es un 20 % del valor de la variable observada.
El termino "animal" incluye a seres humanos y animales no humanos tales como los animales domesticos (gatos, perros y similares) y animales de granja (vacas, caballos, ovejas, cabras, cerdos y similares).
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El termino "enfermedad" incluye cualquier afeccion no saludable de un animal, incluyendo, en particular, la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, esclerosis multiple, diabetes, trastornos motores, convulsiones, disfunciones cognitivas debidas al envejecimiento y trastornos del espectro autista incluyendo autismo, sfndrome de X fragil, sfndrome de Rett (RTT), sfndrome autfstico, sfndrome de Asperger, trastorno disociativo de la infancia y trastorno generalizado del desarrollo no especificado (PDD-NOS) y evitacion de la demanda patologica (PDA).
La expresion “factor de crecimiento” significa una molecula de senalizacion polipeptfdica extracelular que simula una celula que crece o prolifera.
El termino "lesion" incluye cualquier dano agudo de un animal, incluyendo apoplejfa no hemorragica, lesion cerebral traumatica, asfixia perinatal asociada con sufrimiento fetal, tal como despues del desprendimiento, oclusion del cordon o asociado con el retraso del crecimiento intrauterino, asfixia perinatal asociada con la insuficiencia de una adecuada reanimacion o respiracion, lesiones graves del SNC asociadas con un percance proximo al ahogamiento, percance proximo a la muerte subita, inhalacion de monoxido de carbono, intoxicacion por amonfaco u otros gases, paro cardiaco, coma, meningitis, hipoglucemia y estado epileptico, episodios de asfixia cerebral asociados con la cirugfa de bypass coronario, episodios de hipotension y crisis hipertensivas, traumatismo cerebral y lesion toxica.
"Trastornos de la memoria" o "trastornos cognitivos" son trastornos que se caracterizan por el deterioro o la perdida de la capacidad de aprender, memorizar o recordar informacion, permanente o temporal. El trastorno de la memoria puede deberse al envejecimiento normal, lesion en el cerebro, tumores, enfermedades neurodegenerativas, afecciones vasculares, afecciones geneticas (enfermedad de Huntington), hidrocefalia, otras enfermedades (enfermedad de Pick, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, SIDA, meningitis), sustancias toxicas, deficiencia nutricional, trastornos bioqufmicos, disfunciones psicologicas o psiquiatricas. La presencia de trastorno de la memoria en un ser humano se puede establecer a traves de un examen del historial del paciente, un examen ffsico, pruebas de laboratorio, pruebas de imagen y pruebas neuropsicologicas. Las pruebas neuropsicologicas convencionales incluyen, pero sin limitacion, breve prueba de memoria visual revisada (BVMT-R), baterfa automatizada de el ensayo neuropsicologica de Cambridge (CANTAB), escala de memoria infantil (CMS), prueba de memoria contextual, prueba de memoria de reconocimiento continuo (CMRT) prueba de la asociacion de palabras oral controlada y cuestionario de funcionamiento de la memoria, escala de memoria neuropsicologica de Denman, subprueba de escala de dfgitos y secuencia de numero y letras de la escala de inteligencia de adultos de Wechsler III, evaluacion de la memoria de objetos de Fuld (FOME), prueba de memoria para disenos de Graham-Kendall, prueba de memoria de Guild, prueba de aprendizaje cerebral de Hopkins, baterfa de aprendizaje y memoria (LAMB), escala de autovaloracion clfnica de evaluacion de la memoria (MAC-S), escalas de evaluacion de la memoria (MAS), prueba de memoria de Randt, prueba de memoria de reconocimiento (RMT), prueba de aprendizaje auditivo y verbal de Rey (RAVLT), prueba de memoria de comportamiento de Rivermead, version de la escala de memoria de Wechsler de Russell (RWMS), memoria de trabajo espacial, prueba de memoria y aprendizaje (TOMAL), escala de memoria de Vermont (VMS), escala de memoria de Wechsler, evaluacion de memoria y aprendizaje a gran alcance (WRAML).
La expresion "excipiente farmaceuticamente aceptable" significa un excipiente que es util en la preparacion de una composicion farmaceutica que, en general, es segura, no toxica y deseable, e incluye excipientes que son aceptables para el uso veterinario, asf como para el uso farmaceutico humano. Dichos excipientes pueden ser solidos, lfquidos, semisolidos o, en el caso de una composicion en aerosol, gaseosos.
La expresion "sal farmaceuticamente aceptable" significa una sal que es farmaceuticamente aceptable y que tiene las propiedades farmacologicas deseadas. Dichas sales incluyen sales que pueden formarse cuando los protones acidos presentes en los compuestos reaccionan con bases inorganicas u organicas. Las sales inorganicas adecuadas incluyen las formadas con los metales alcalinos, por ejemplo, sodio y potasio, magnesio, calcio, y aluminio. Las sales organicas adecuadas incluyen las formadas con bases organicas, tales como aminas, por ejemplo, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, W-metilglucamina y similares. Las sales tambien incluyen sales de adicion de acido formadas por la reaccion de un grupo amina o grupos presentes en el compuesto con un acido. Los acidos adecuados incluyen acidos inorganicos (por ejemplo, acidos clorhfdrico y bromhfdrico) y acidos organicos (por ejemplo, acido acetico, acido cftrico, acido maleico, y acidos alcanosulfonico y arenosulfonico, tales como acido metanosulfonico y acido bencenosulfonico). Cuando hay dos grupos acidos presentes en un compuesto, una sal farmaceuticamente aceptable puede ser una monosal monoacido o una disal; y del mismo modo, cuando hay mas de dos grupos acidos presentes, todos o algunos de dichos grupos se pueden salificar. El mismo razonamiento se puede aplicar cuando dos o mas grupos amina estan presentes en un compuesto.
La expresion “grupo protector” es un grupo que bloquea selectivamente uno o mas sitios reactivos en un compuesto multifuncional de manera que puede llevarse a cabo una reaccion qufmica selectivamente en otro sitio reactivo no protegido y que el grupo se puede retirar facilmente una vez completada la reaccion selectiva.
La expresion "cantidad terapeuticamente eficaz" significa la cantidad de un agente que, cuando se administra a un animal para tratar una enfermedad, es suficiente para efectuar el tratamiento de esa enfermedad medida usando un sistema de ensayo reconocido en la tecnica.
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El termino "tratar" o "tratamiento" de una enfermedad puede incluir la prevencion de la aparicion de la enfermedad en un animal que puede estar predispuesto a la enfermedad, pero que todavfa no la padece ni muestra sfntomas de la enfermedad (tratamiento profilactico), la inhibicion de la enfermedad (ralentizar o detener su desarrollo), el alivio de los sfntomas o los efectos secundarios de la enfermedad (incluyendo el tratamiento paliativo), y el alivio de la enfermedad (que causa la regresion de la enfermedad).
La expresion "deficiencia funcional" significa una deficiencia de comportamiento asociado con el dano neurologico. Dichas deficiencias incluyen deficiencias en el andar, observados en pacientes con enfermedad de Parkinson, alteraciones motoras, observadas en pacientes con la enfermedad de Huntington. El deficit funcional tambien incluye la colocacion anormal del pie y trastornos de la memoria descritos en el presente documento.
El termino "G-2MePE" o "NNZ-2566" significa L-glicil-2-metil-L-prolil-L-glutamato.
El termino "convulsiones" significa un patron anomalo de la actividad neuronal en el cerebro que da lugar a un deficit motor o a la falta de control motor que da lugar a un movimiento anomalo, incluyendo un movimiento espasmodico. "Convulsiones" incluye anomalfas electroencefalograficas, acompanadas o no por una actividad motora anomala.
Los atomos de hidrogeno implfcitos (tales como atomos de hidrogeno de un anillo de pirrolidina, etc.) se omiten de las formulas para mayor claridad, pero se debe entender que estan presentes.
Trastornos del espectro autista
Los trastornos del espectro autista (ASD) son un grupo de trastornos del desarrollo vinculados, caracterizados por anomalfas en la interaccion social y en la comunicacion, intereses restringidos y comportamientos repetitivos. La clasificacion actual de los ASD reconoce cinco formas distintas: el autismo clasico o el trastorno autista, el sfndrome de Asperger, el sfndrome de Rett, el trastorno disociativo de la infancia y el trastorno generalizado del desarrollo no especificado (PDD-NOS). Un sexto sfndrome, la evitacion de la demanda patologica (PDA), es un trastorno del desarrollo generalizado mas especffico. Sin embargo, aunque el PDA es cada vez mas reconocido como un ASD, aun no forma parte del Manual Diagnostico y Estadfstico de Trastornos Mentales (DSM-IV), publicado por la Asociacion Americana de Psiquiatrfa, ni forma parte de la revision propuesta, el DSM-V.
Autismo
El autismo clasico es un trastorno del desarrollo neurologico altamente variable. Se diagnostica normalmente durante la infancia o la primera infancia, con sfntomas manifiestos a menudo aparentes a partir de los 6 meses de edad, y se establece hacia los 2-3 anos. De acuerdo con los criterios establecidos en el dSM-IV, el diagnostico del autismo requiere que este presente una trfada de sfntomas, incluyendo (a) deficiencias en la interaccion social, (b) deficiencias en la comunicacion y (c) intereses y comportamientos restringidos y repetitivos. Otras disfunciones, tales como la alimentacion atfpica, tambien son comunes, pero no son esenciales para el diagnostico. De estas deficiencias, las deficiencias de interaccion social son particularmente importantes para el diagnostico, debiendo estar presentes dos de las siguientes deficiencias para un diagnostico del autismo:
(i) deficiencias en el uso de comportamientos no verbales multiples (por ejemplo, contacto visual) para regular la interaccion social;
(ii) deficiencias en el desarrollo de relaciones entre companeros adecuadas al nivel de desarrollo;
(iii) falta de busqueda espontanea de compartir el goce, los intereses o los logros;
(iv) falta de reciprocidad social o emocional.
Las deficiencias de comunicacion en el autismo pueden manifestarse de una o mas de las siguientes maneras: retraso en (o falta total) del desarrollo del lenguaje hablado; deterioro marcado de la capacidad de iniciar o mantener una conversacion; uso estereotipado y repetitivo del lenguaje; y/o falta de juego espontaneo. Tambien se requieren patrones de comportamiento restringidos, repetitivos y estereotipados para el diagnostico, tales como la preocupacion por uno o mas intereses considerados anormales en intensidad, la adhesion inflexible a rutinas o rituales, los manierismos repetitivos motores y/o el enfoque persistente en partes de objetos.
Por ultimo, para un diagnostico del autismo, es necesario que el deterioro en el funcionamiento de al menos un area (es decir, interaccion social, lenguaje o juego imaginativo) se inicie a menos de 3 anos de edad.
El autismo se asocia comunmente con la epilepsia o la actividad epileptiforme en el electroencefalograma (EEG). Hasta el 60 por ciento de los pacientes con autismo tiene actividad epileptiforme en sus EEG (Spence y Schneider, 2009 Ped Res 65: 599-606).
El autismo tambien esta asociado con alteraciones en la funcion del IGF-1, que se agota en el sistema nervioso central (SNC) en pacientes con autismo (Riikonen et al., 2006 Devel Med Child Neurol 48: 751-755). Los niveles de IGF-1 en el aumento del SNC en pacientes con autismo despues del tratamiento con agentes que reducen los sfntomas como la fluoxetina (Makkonen et al., 2011 Neuropediatrics 42:207-209).
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Es importante destacar que el autismo comparte las caracterfsticas del sindrome de Rett y el sindrome de X fragil en relacion con la conectividad neuronal. Los tres trastornos se caracterizan por defectos en la funcion sinaptica y la conectividad neuronal. Esto se refleja en los estudios de cerebro humano post mortem en estos grupos de pacientes, que muestran todos la incapacidad de formar conexiones sinapticas normales. Esto se refleja en la alteracion de las caracterfsticas morfologicas, ya sea una reduccion en la densidad de la espina dendrftica neuronal o una mayor densidad de la espina dendrftica, pero asociada con las sinapsis inmaduras. Esto se refleja en modelos animales de autismo, sindrome de Rett y sindrome de X fragil, que se basan en cambios geneticos conocidos por ser patologicos en estos trastornos. En estos modelos animales, se revelan morfologicamente defectos de conectividad neuronal, y tambien como un fracaso de la potenciacion a largo plazo (LTP). Esto es importante, ya que IGF-1, IGF-1 [1-3] y G-2-MePE aumentan la formacion de sinapsis.
Sindrome de Asperger
El sindrome de Asperger o trastorno de Asperger es similar al autismo, y comparte ciertas caracterfsticas. Al igual que el autismo, el sindrome de Asperger tambien se caracteriza por el deterioro de la interaccion social y este se ve acompanado de intereses y comportamientos restringidos y repetitivos. Asf pues, el diagnostico del sindrome de Asperger se caracteriza por la misma trfada de deficiencias que el autismo. Sin embargo, difiere de los otros ASD en que tiene retraso general en el desarrollo lingufstico o cognitivo y en que no hay deficit de interes en el entorno del sujeto. Ademas, el sindrome de Asperger normalmente es menos grave en la sintomatologfa que el autismo clasico, y los pacientes de Asperger pueden funcionar con autosuficiencia y llevar una vida relativamente normal.
Trastorno disociativo de la infancia
El trastorno disociativo de la infancia (CDD), tambien conocido como sindrome de Heller, es una afeccion en la que los ninos se desarrollan normalmente hasta los 2-4 anos (es decir, mas tarde que en el autismo y el sindrome de Rett), pero luego demuestran una perdida grave de comunicacion social y otras habilidades. El trastorno disociativo de la infancia es muy parecido al autismo y ambos implican un desarrollo normal seguido de una perdida significativa de lenguaje, juego social y habilidades motoras. Sin embargo, el trastorno disociativo de la infancia normalmente se produce mas tarde que el autismo, implica una perdida mas drastica de las habilidades y es mucho menos comun.
El diagnostico del CDD depende de la perdida drastica de habilidades previamente adquiridas en dos o mas de las siguientes areas: lenguaje, habilidades sociales, juego, habilidades motoras (como una disminucion drastica de la capacidad de caminar, trepar, agarrar, etc.) o el control vesical e intestinal (a pesar de tener previamente control de esffnteres). La perdida de habilidades de desarrollo puede ser abrupta y tener lugar en el transcurso de dfas a semanas o puede ser mas gradual.
Trastorno generalizado del desarrollo - no especificado (PDD-NOS)
El trastorno generalizado del desarrollo - no especificado (PDD-NOS) es un ASD que describe a pacientes que presentan alguno, pero no todos, de los sfntomas asociados con otros ASD bien definidos. Los criterios clave para el diagnostico de un ASD incluyen la dificultad para socializarse con otros individuos, los comportamientos repetitivos y la sensibilidad aumentada a ciertos estfmulos. Todos ellos se encuentran en los ASD descritos anteriormente. Sin embargo, el autismo, el sindrome de Asperger, el sindrome de Rett y el trastorno disociativo de la infancia tienen otras caracterfsticas que permiten su diagnostico especffico. Cuando no se puede realizar el diagnostico especffico de uno de estos cuatro trastornos, pero el ASD es evidente, se realiza un diagnostico de PDD-NOS. Dicho diagnostico puede resultar de los sfntomas que comienzan en una edad mas avanzada de la aplicable para otras afecciones del espectro.
Sindrome de Rett
El sindrome de Rett (RTT) es un trastorno del desarrollo neurologico que afecta casi exclusivamente a las mujeres (1 de cada 10.000 nacidos vivos). El RTT se clasifica como un trastorno del espectro autista (Manual Diagnostico y Estadfstico de Trastornos Mentales, Cuarta Edicion - Revisado (DSM-IV-R). Aproximadamente 16.000 pacientes estan afectados por el mismo en EE.UU. (Datos de una investigacion fiable sobre el sindrome de Rett). Para un diagnostico del sindrome de Rett, son caracterfsticos los siguientes sfntomas: desarrollo alterado desde la 6-18 meses de edad; ralentizacion de la tasa de crecimiento de la cabeza a partir de entre los 3 meses y los 4 anos; lenguaje gravemente danado; movimientos repetitivos y estereotfpicos de las manos; y anomalfas de la marcha, por ejemplo, andar de puntillas o caminar inestable con las piernas rfgidas. Hay, ademas, una serie de criterios de apoyo que pueden ayudar a diagnosticar el sindrome de Rett, pero que no son esenciales para un diagnostico. Estos incluyen dificultades respiratorias, anomalfas del EEG, convulsiones, rigidez muscular y espasticidad, escoliosis (curvado de la columna vertebral), rechinar de dientes, manos y pies pequenos en relacion con la altura, retraso del crecimiento, disminucion de la grasa corporal y la masa muscular, patrones anomalos del sueno, irritabilidad o agitacion, dificultades para masticar y/o tragar, mala circulacion y estrenimiento.
El inicio del RTT generalmente comienza entre los 6-18 meses de edad, con una desaceleracion de las tasas de desarrollo y crecimiento. A esto le sigue una fase de regresion (normalmente, en ninos de entre 1 y 4 anos de edad),
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una fase pseudoestacionaria (2-10 anos de edad) y un posterior estado de deterioro motor progresivo tardfo. Los sfntomas del RTT incluyen la desaceleracion subita del crecimiento y la regresion en el lenguaje y las habilidades motoras, incluyendo movimientos intencionados de la mano que son reemplazados por movimientos estereotfpicos, rasgos autistas, ataques de panico, trastornos del ciclo del sueno, temblores, convulsiones, disfunciones respiratorias (apnea episodica, hiperpnea), apraxia, distonfa, discinesia, hipotonfa, cifosis progresiva o escoliosis y deterioro cognitivo grave. La mayorfa de los pacientes de RTT sobreviven a la edad adulta con discapacidades graves, y requieren atencion las 24 horas del dfa.
Se ha informado que entre el 85 % y el 95 % de los casos de RTT estan causados por una mutacion del gen Mecp2 (Amir et al. 1999. Nat Genet 23:185-188; datos de investigacion fiable sobre el sfndrome de Rett) - un gen que codifica la protefna 2 de union a metil-CpG (MeCP2). Mecp2 se transmite al cromosoma X (localizacion Xq28) y, por esta razon, las mutaciones del gen en los varones suelen ser letales. Aunque el RTT es un trastorno genetico, menos del 1 % de los casos registrados son hereditarios; casi todas las mutaciones de Mecp2 ocurren de novo, estando dos tercios causados por mutaciones en 8 dinucleotidos CpG (R106, R133, T158, R168, R255, R270, R294 y R306) ubicados en el tercer y cuarto exones.
MeCP2 es una protefna que se une a los dinucleotidos CpG metilados para ejercer el silenciamiento de la transcripcion del ADN en el SNC. El efecto clave de una reduccion o ausencia de MeCP2 parece ser un deterioro del desarrollo de la espina dendrftica y la formacion de sinapsis. La expresion de MeCP2 parece correlacionarse temporalmente con la maduracion del cerebro, lo que explica por que los sfntomas suelen aparecer alrededor de 18 meses de edad.
Presentacion de caracterfsticas comunes a los ASD
Tomando los ASD conjuntamente, es evidente que hay puntos en comun en la presentacion de los sfntomas entre las 5 formas. Estas caracterfsticas comunes son deficiencias en las competencias sociales normales y comportamientos repetitivos. En todos menos en el sfndrome de Asperger tambien hay una presentacion uniforme de retraso en el desarrollo intelectual que se manifiesta mas comunmente se como un deficit en las habilidades del lenguaje. La perdida cognitiva relativa a los parametros normales para la edad suele ser bastante marcada en el autismo, el sfndrome de Rett, el CDD y el PDD-NOS. La presencia de epilepsia o actividad anomala en el EEG tambien es comun en el autismo, el sfndrome de X fragil y el sfndrome de Rett. La epilepsia surge en situaciones de conectividad neuronal anomala. La alteracion de la conectividad neuronal y la funcion sinaptica alterada es una caracterfstica comun del autismo, del sfndrome de X fragil y del sfndrome de Rett, y de modelos animales de estas afecciones.
Modelos geneticos del ASD
Para ofrecer validez, los modelos animales de los ASD deben demostrar sfntomas similares a las afecciones clfnicas y tener un grado razonable de validez aparente con respecto a la etiologfa de esos sfntomas. Se sabe que el autismo clasico puede estar causado por muchas alteraciones geneticas diferentes, y no se cree que haya un solo defecto genetico que represente mas de un pequeno porcentaje de casos de autismo. De hecho, estudios recientes han revelado numerosas variaciones estructurales de novo de las ubicaciones cromosomicas que se cree que subyacen al ASD, ademas de los raros defectos geneticos heredados (Marshall et al., 2008; Sebat et al., 2007). Por lo tanto, la variacion del numero de copias (CNV), la translocacion y la inversion de secuencias de genes en 20 sitios clave o mas, incluyendo 1p, 5q, 7q, 15q, 16p, 17p y Xq, se han asignado como locus de los ASD.
Sin embargo, a pesar del fondo poligenico subyacente al ASD, y la complejidad de la etiologfa, se sabe que ciertos defectos geneticos pueden producir ASD. Algunos de los defectos mejor caracterizados surgen de aberraciones cromosomicas de los genes que codifican un grupo de protefnas de densidad postsinaptica, incluyendo la neuroligina-3 (NLGN3), neuroligina-4 (NLGN4), neurexina-1a (NRXN1) y shank3 (Sebat et al , 2007). Es importante destacar que estos defectos apuntan a la funcion sinaptica alterada y, por tanto, a la conectividad neuronal perturbada como una via final comun en el autismo y en los trastornos relacionados (Minshew y Williams 2007 Arch Neurol. 64:945-950; Gilman et al., 2011 Neuron. 70:898-907). Dichas deficiencias de conectividad se reflejan en hallazgos morfologicos en el examen post mortem, que revelan una mayor densidad de la espina dendrftica en el autismo (Hutsler y Zhang 2010 Brain Res. 1309:83-94).
NLGN3 y NLGN4 son moleculas postsinapticas de adhesion celular presentes en las sinapsis glutamatergicas. Desempenan un papel en la coordinacion del contacto presinaptico con el sitio postsinaptico y tambien interactuan con la protefna armazon postsinaptica shank3. Las mutaciones a NLGN3 y NLGN4 se han observado en la poblacion de ASD y representan quizas el 1 % de todos los casos de ASD (Lintas y Persico, 2008). Jamain y colaboradores informaron por primera vez de un sentido erroneo en NLGN3 y un cambio de marco en NLGN4 en dos sujetos no relacionados, resultando en el sfndrome de Asperger y el autismo clasico respectivamente (Jamain et al., 2003). Si bien la incidencia de las mutaciones NLGN3 o NLGN4 en la poblacion de ASD es baja (de hecho, no se observaron muchas mutaciones en un estudio de 96 pacientes con ASD en un estudio canadiense, Gauthier et al., 2005), se ha confirmado en estudios preclfnicos que las mutaciones de la neuroligina pueden, de hecho, producirse de modelo de sfntomas autistas. Por lo tanto, la introduccion en ratones de la misma R451C de sentido erroneo a
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NLGN3 ha informado clfnicamente de resultados en una cepa de raton mutante mostrando una reduccion de la interaccion social y el aumento de la transmision sinaptica inhibidora (Tabuchi et al., 2007).
Por lo tanto, el raton mutante R451C representa un modelo para el ASD basado en la mutacion NLGN3. En este caso, la mutacion en la posicion R451 de NLGN3 da lugar a una mutacion de "ganancia de funcion".
Por el contrario, la modelizacion de la mutacion clfnica de NLGN4 en ratones se logra mediante una mutacion de “perdida de funcion” de NLGN4 (un modelo de desactivacion clasico). En este modelo, los ratones mutantes muestran un deficit de interaccion social y la reduccion de la vocalizacion ultrasonica (Jamain et al., 2008). Los deficit de comunicacion son centrales en los ASD clfnicos y, en los ratones con desactivacion de NLGN4, una reduccion de las vocalizaciones ultrasonicas de ratones macho expuestos a homologos femeninos de tipo silvestre apoya la validez aparente de la cepa como modelo del ASD.
Las protefnas neurexinas presinapticas inducen la diferenciacion postsinaptica en dendritas opuestas a traves de interacciones con homologos de neuroligina postsinapticos. Se han descrito mutaciones del gen de la neurexina-1a (NRXN1) en numerosos estudios (Sebat et al., 2007, Marshall et al., 2008, Kim et al., 2008, Yan et al., 2008) y se han observado en la forma de variantes del numero de copia. Al igual que con las mutaciones de NLGN, cuando se introduce una mutacion del gen NRXN1 en ratones (en forma de desactivacion genica), se produce una cepa mutante con ciertas caracterfsticas similares al ASD (Etherton et al., 2009). Estos ratones con desactivacion de NRXN1 muestran una disminucion de la frecuencia de la corriente postsinaptica excitadora en miniatura del hipocampo (mEPSC) y una reduccion de la relacion de entrada-salida de las corrientes evocadas. Estos efectos electrofisiologicos se relacionan con la disminucion de la transmision excitatoria en el hipocampo. Ademas de la disminucion de la neurotransmision excitatoria, los ratones con desactivacion de NRXN1 muestran una disminucion en la inhibicion pre-pulso, aunque el comportamiento social parece no verse afectado (Etherton et al., 2009).
Compartiendo ciertas caracterfsticas con la construccion trans-sinaptica de neurexina-NLGN, la molecula de adhesion celular 1 (CADM1) es una protefna de la familia de las inmunoglobulinas presente tanto pre- y post- sinapticamente que tambien esta implicada en la actividad de adhesion transcelular sinaptica (Biederer et al., 2002). Se han detectado mutaciones en el gen CADM1 en pacientes con ASD y parecen representar una posible causa adicional de estas afecciones (Zhiling et al., 2008).
El analisis de los ratones con desactivacion de CADM1 revela que estos animales muestran un mayor comportamiento relacionado con la ansiedad, el deterioro de la interaccion social y el deterioro de la memoria y del reconocimiento social. Ademas, los ratones con desactivacion de CADM1 demuestran peores habilidades motoras mas (Takayanagi et al., 2010). Estas disfunciones estan de nuevo en consonancia con la sintomatologfa del ASD.
El sfndrome de eliminacion de 22q13 (tambien conocido como sfndrome de Phelan-McDermid) es un trastorno genetico raro causado por una microeliminacion en el extremo terminal q13.3 del cromosoma 22. Esta microeliminacion rara vez se descubre mediante la exploracion genetica tfpica, y se recomienda una prueba de hibridacion in situ fluorescente para confirmar el diagnostico. Trabajos recientes indican que el sfndrome esta causado por errores en el gen shank3, una protefna de densidad postsinaptica fundamental para el funcionamiento neuronal normal. Curiosamente, los errores en este gen tambien se han asociado con el ASD, y el sfndrome de eliminacion de 22q1 puede conducir comunmente a un diagnostico del ASD (Durand et al., 2007; Moessner et al., 2007; Sykes et al., 2009). Dada la estrecha asociacion del sfndrome de eliminacion de 22q13 y el diagnostico consecuente del ASD, se ha desarrollado un modelo mutante de raton de esta mutacion.
El raton con desactivacion de shank3 presenta varias deficiencias que reflejan los sfntomas del ASD, incluyendo la reduccion de las vocalizaciones ultrasonicas (es decir, la disminucion de la comunicacion social), asf como el deterioro del tiempo de interaccion social entre ratones. Ademas, estos ratones tienen alteracion de la transmision excitatoria de CA1 en el hipocampo, medida por la relacion entrada-salida de las corrientes evocadas y la alteracion de la potenciacion a largo plazo (LTP). Se cree que la LTP es un proceso fisiologico que subyace a la formacion y consolidacion de la memoria. Por lo tanto, el modelo presenta un fenotipo similar a la desactivacion de NLGN4, en consonancia con el ASD.
Como se ha observado, el sfndrome de eliminacion de 22q13 en sf mismo es muy raro. Sin embargo, proporciona informacion importante sobre la participacion que genes especfficos pueden tener en la etiologfa de los ASD. Ademas de shank3, este trastorno revela un posible defecto genetico adicional en el ASD. De los aproximadamente 50 casos de sfndrome de eliminacion de 22q13 descritos, todos menos uno tienen una eliminacion genetica que se extiende mas alla de shank3 para incluir un gen adicional, conocido como el gen Islet Brain-2 (IB2) (Sebat et al., 2007). La protefna IB2 interacciona con otras muchas protefnas incluyendo las MAP quinasas y la protefna precursora amiloide, parece influir en el trafico de protefnas en las neuritas y se encuentra enriquecida a densidades postsinapticas (Giza et al., 2010). Los ratones que carecen de la protefna (ratones con desactivacion IB2-/-) muestran una alteracion de la interaccion social (reduccion del olfateo social y el tiempo de interaccion), reduccion de la exploracion, y deficiencias cognitivos y motores (Giza et al., 2010). Este fenotipo de comportamiento se asocio con la reduccion de la transmision excitatoria en las celulas cerebelosas. Al igual que con la desactivacion de knock3, el fenotipo de la mutacion de IB2 es, por lo tanto, tambien compatible con el ASD.
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Ademas de los modelos animales de los defectos de protefnas de densidad postsinaptica descritos anteriormente, otros sfndromes monogeneticos que comparten diversas caracterfsticas con los ASD pueden conducir al autismo y ofrecen otra via para el control de los farmacos dirigidos al ASD. Un excelente ejemplo de esto es el sfndrome de X fragil.
El Sfndrome de X fragil (FXS) esta causado por la expansion de una unica secuencia de genes trinucleotfdicos (CGG) en el cromosoma X que produce la falta de expresion de la protefna codificada por el gen fmrl. FMR1 (Retraso mental X fragil 1) es una protefna necesaria para el desarrollo neuronal normal. FXS puede causar que un nino tenga autismo (Hagerman et al., 2010); en el 2-6 % de todos los ninos diagnosticados con autismo, la causa es la mutacion del gen FXS. Por otra parte, aproximadamente el 30 % de los ninos con FXS tienen cierto grado de autismo y otro 30 % son diagnosticados con PDD-NOS (Hagerman et al., 2010). De hecho, el sfndrome de X fragil es la causa de autismo mas comun conocida como de un solo gen. Los ratones con desactivacion de FMR1 se han desarrollado como un modelo de FXS y, por lo tanto, como un modelo adicional de ASD. Se ha demostrado que la mutacion de desactivacion del gen FMR1 produce deficiencias de conectividad neuronal tales como el desarrollo y el recorte anomalos de la espina dendrftica (Comery et al., 1997), junto con una desregulacion asociada de las protefnas del armazon dendrftico (incluyendo shank1) y las subunidades del receptor de glutamato en densidades postsinapticas (Schiitt et al., 2009). Estos efectos sobre la morfologfa dendrftica producen deficiencias en las medidas funcionales de la conectividad, tales como la alteracion de la LTP en la corteza y la amfgdala (Zhao et al., 2005) y en el hipocampo (Lauterborn et al., 2007), asf como el deterioro cognitivo (Kreuger et al.) y una mejora en la ansiedad social (Spencer et al., 2005). Estas deficiencias de conectividad se reflejan en pacientes con FXS, que muestran una mejor densidad de la espina dendrftica en los analisis post mortem (Irwin et al., 2000 Cereb Cortex 10:1034-1048). Esta densidad de espina dendrftica mejorada esta acompanada por sinapsis inmaduras (Klemmer et al., 2011 J Biol Chem. 286:25495-25504), es decir, puede representar un estado funcionalmente inmaduro.
En contraste con los ASD de autismo, Asperger, CDD y PDD-NOS, el sfndrome de Rett parece tener una base casi monogenetica y puede ser modelado en ratones con buena validez aparente. Se cree que el sfndrome de Rett esta causado, en hasta un 96 % de los casos, por un defecto en el gen Mecp2 (Zoghbi, 2005). Como resultado de ello, los ratones mutantes con desactivacion de MeCP2 proporcionan un modelo animal con todos los signos distintivos del sfndrome de Rett clfnico, mostrando un fenotipo algunos solapamientos con los modelos de ASD de desactivacion de NLGN4, shank3 e IB2. Por lo tanto, los ratones con desactivacion de MeCP2 muestran un claro deterioro de la LTP en el hipocampo, junto con una disminucion correspondiente en la memoria social y espacial (Moretti et al., 2006) y deterioro del reconocimiento de objetos (Schaevitz et al., 2010). Este deterioro en la LTP se ve acompanado de una disminucion en la densidad de la espina dendrftica. Los pacientes con el sfndrome de Rett muestran una menor densidad de espina dendrftica (Belichenko et al., 1994 Neuroreport 5:1509-1513).
Por lo tanto, los ASD en seres humanos comparten muchas caracterfsticas de trastornos cognitivos o del desarrollo en animales, incluyendo roedores. Por lo tanto, los estudios de terapias de los ASD en roedores tales como ratones y ratas son razonablemente predictivos de los resultados obtenidos en seres humanos. Una caracterfstica comun que se observa en el autismo, en el sfndrome de X fragil y en el sfndrome de Rett es la presencia de una deficiencia en la conectividad neuronal, que se refleja en la disminucion de la densidad de la espina dendrftica o en un aumento de la densidad de la espina dendrftica con sinapsis inmaduras. Las consecuencias funcionales de estos cambios morfologicos son similares en modelos animales de estos trastornos, reflejados como deficiencias en la LTP, por ejemplo.
Tratamiento del ASD clfnico y modelos animales del ASD con G-2-MePE
Segun lo descrito anteriormente, se observa una patologfa conservada en los ASD que comprende un deterioro del desarrollo de las neuritas, un deterioro de la conectividad sinaptica y una correspondiente alteracion del funcionamiento social y cognitivo como resultado. Dichas disfunciones sinapticas se deben a funciones geneticamente alteradas de protefnas de densidad postsinaptica. El crecimiento normal de las neuritas y el desarrollo postsinaptico pueden ser regulados y aumentados por factores de crecimiento tales como el factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF, Chapleau et al., 2009) y el factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-1, Riikonen et al., 2006, Tropea et al. al, 2009). De hecho, el lGF-1 es esencial para el crecimiento normal de la espina dendrftica y la formacion de sinapsis (Cheng et al., 2003 J Neurosci Res. 73:1-9). Por lo tanto, los farmacos que potencian la funcion del factor de crecimiento son utiles en el tratamiento de trastornos progresivos del desarrollo tales como los ASD. G-2 MePE es un analogo metilado de molecula pequena del tripeptido terminal de IGF-1, IGF 1 (1-3). Como analogo mimetico de IGF-1, G-2-MePE ejerce efectos troficos y neuroprotectores en diversos modelos animales. Por lo tanto, G-2-MePE es eficaz en el tratamiento de sfntomas del ASD tales como los relacionados con las disfunciones sinapticas resultantes de las mutaciones genicas descritas anteriormente.
En terminos clfnicos, los pacientes con ASD, que presentan autismo, sfndrome de Asperger, sfndrome de Rett, trastorno disociativo de la infancia y PDD-NOS, asf como los pacientes con sfndrome de eliminacion de 22q13, sfndrome de X fragil y evitacion de la demanda patologica se tratan con G-2-MePE. Los pacientes presentan deficiencias sociales y de comunicacion, asf como deficiencia cognitiva. El tratamiento con G-2-MePE, por ejemplo, diariamente y, en otro ejemplo, por via oral, se observa que induce una mejora en los movimientos repetitivos estereotfpicos, un mejor funcionamiento social y un mejor rendimiento cognitivo despues del tratamiento con
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farmaco.
En modelos animales de los ASD, el tratamiento diario con G-2-MePE por sonda oral o inyeccion intraperitoneal para ratones con desactivacion mejorara los smtomas similares al ASD. El G-2-MePE es eficaz en los siguientes modelos de raton mutante con ASD: NLGN3 mutante (R451C), desactivacion de NLGN4, desactivacion de NRXN1, desactivacion de CADM1, desactivacion de shank3, desactivacion de IB2, desactivacion de FMR1 y desactivacion de MeCP2. Cuando se administra subcronicamente (1-10 semanas) diariamente, G-2-MePE es eficaz para mejorar la LTP en el hipocampo despues de la estimulacion por estallido o estimulacion de alta frecuencia. De forma similar, G-2-MePE aumenta la neurotransmision excitatoria medida por las grabaciones electrofisiologicas potenciales postsinapticas extracelulares de campo en la corteza, el hipocampo y el cerebelo. Como resultado de la mejora de la neurotransmision excitatoria (inversion de la deficiencia observada de neurotransmision de tipo ASD), se observa que el G-2-MePE mejora las pruebas cognitivas y motoras del rendimiento cognitivo. Por lo tanto, G-2-MePE mejora el rendimiento en el laberinto de agua de Morris y en las pruebas del laberinto de brazo radial. En modelos de interaccion social, el G-2-MePE, administrado a ratones mutantes con ASD, aumenta el tiempo que pasan los machos con desactivacion en la interaccion social con hembras de tipo silvestre. Ademas, las vocalizaciones ultrasonicas a ratones hembra de tipo silvestre aumentan. En modelos en los que se observa que la longevidad se reduce en ratones mutantes en comparacion con los controles de tipo silvestre (tales como el modelo de ratones de desactivacion de MeCP2 del smdrome de Rett), el tratamiento con G-2-MePE aumenta la vida util de los animales.
Se ha encontrado que G-2-MePE inhibe los ataques no convulsivos (NCS) en animales con lesiones hipoxico- isquemicas causadas por la oclusion de la arteria cerebral media (MCaO, patente de EE.UU. n.° 7.714.020, Lu et al., NNZ-2566, un analogo de glipromato, atenua los ataques no convulsivos inducidos por la isquemia cerebral en ratas, (J. Cerebral Blood Flow metabolism (2009) 1-9) e inhibe la neuroinflamacion en animales con lesion balfstica penetrante (pTBI; Wei et al., “NNZ-2566 treatment inhibits neuroinflammation and pro-inflammatory cytokine expression induced by experimental penetrating ballistic-like brain injury in rats”, J. Neuroinflammation (2009) 6:19, 1-10).
Los hallazgos de los presentes inventores de que los G-2-MePE tambien son eficaces en el tratamiento del smdrome de Rett y los ASD, son completamente inesperados basandose en la tecnica anterior. Esto se debe a que el NCS en el modelo de MCaO esta causado por hipoxia-isquemia, y la expresion de citoquinas inflamatorias en el modelo de pTBI esta causada por traumatismo penetrante, siendo ambas lesiones agudas muy diferentes de los efectos cronicos de MECP2 u otras mutaciones producidas en la maduracion sinaptica.
Debido a que G-2-MePE se dirige a mecanismos neurologicos subyacentes (por ejemplo, disminuyen la inflamacion neuronal mediante la inhibicion de la liberacion de citoquinas inflamatorias), puede proporcionar mas que un tratamiento a corto plazo de los smtomas. Mas bien, G-2-MePE puede mejorar la funcion neuronal, potenciar la migracion de celulas neuronales, potenciar la neurogenesis, potenciar la diferenciacion de celulas madre neuronales, potenciar la excrecencia axonal y dendntica, y potenciar la transmision sinaptica, aliviando de este modo los smtomas adversos de los ASD.
Farmacologfa y utilidad
G-2-MePE puede tener efectos antiinflamatorios, antiapoptoticos, antinecroticos y neuroprotectores. Su actividad in vivo puede medirse por recuento celular, tincion espedfica de los marcadores deseados, o mediante metodos tales como los analizados en Klempt N. D. et al: “Hypoxia-ischemia induces transforming growth factor pi mRNA in the infant rat brain. Molecular Brain Research”: 13: 93-101. Su actividad tambien se puede medir in vitro usando metodos conocidos en la tecnica o descritos en el presente documento.
Las afecciones que afectan a la funcion cerebral se vuelven frecuentes en las poblaciones envejecidas. La perdida de memoria y el deterioro de la memoria son angustiantes para los pacientes afectados y para sus familias. La perdida o el deterioro de la memoria puede deberse al envejecimiento normal, lesiones en el cerebro, enfermedades neurodegenerativas y disfunciones psicologicas o psiquiatricas. Por lo tanto, es muy beneficioso para los pacientes, para sus familias y para la sociedad que se identifiquen y caractericen nuevos compuestos que mejoren la memoria y/o la funcion cognitiva, y traten o prevengan la perdida o el deterioro de la memoria.
Es deseable estudiar los efectos de agentes terapeuticos potenciales en sistemas animales. Uno de estos sistemas utiles es la rata. Se sabe que con el envejecimiento, las ratas y otros animales (incluyendo los seres humanos) pueden presentar smtomas de perdida de memoria, deterioro de la memoria y otras disfunciones cognitivas. Ademas, se sabe que los estudios en ratas de agentes terapeuticos son predictivos de los efectos terapeuticos en seres humanos. Por lo tanto, los estudios de los efectos de GPE y G-2-MePE y la funcion cognitiva en ratas envejecidas son razonablemente predictivos de los efectos terapeuticos de los agentes en seres humanos envejecidos que tienen o son propensos a adquirir deficiencias de memoria u otra disfuncion cognitiva. G-2-MePE tambien puede mejorar la funcion cognitiva y/o tratar trastornos de la memoria. La actividad estimulante cognitiva y la actividad terapeutica in vivo se pueden medir mediante ensayos neuropsicologicos o de comportamiento convencionales conocidos por los expertos en la materia. Dichos ensayos se pueden escoger entre una amplia seleccion de ensayos disponibles descritas anteriormente, y variaran dependiendo de la funcion cognitiva que se
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vaya a ensayar y del estado del animal.
Los ensayos de comportamiento convencionales utiles para ensayar la funcion cognitiva en animales de experimentacion incluyen, pero sin limitacion, el ensayo del laberinto acuatico de Morris, el ensayo de respuesta evasiva pasiva, el ensayo de reconocimiento de objetos nuevos, el ensayo de discriminacion olfativa, el ensayo de laberinto radial de 8 brazos y el ensayo de laberinto T. Estos ensayos se pueden aplicar directamente a los estudios de los efectos de GPE y G-2-MePE sobre la funcion cognitiva en ratas envejecidas.
La actividad de G-2-MePE se puede medir mediante los metodos conocidos en la tecnica y que se analizan en los documentos citados en el presente documento, y mediante metodos usados para medir la actividad de GPE.
La relacion terapeutica de un compuesto se puede determinar, por ejemplo, comparando la dosis que proporciona una actividad antiinflamatoria, antiapoptotica y antinecrotica eficaz en un modelo in vivo adecuado, tal como una lesion hipoxico-isquemica (Sirimanne E. S., Guan J., Williams C. E. y Gluckman P. D: “Two models for determining the mechanisms of damage and repair after hypoxic-ischemic injury in the developing rat brain” (Journal of Neuroscience Methods: 55: 7-14, 1994) en una especie animal adecuada tal como la rata, dando la dosis efectos secundarios observables significativos en la especie animal de ensayo.
La relacion terapeutica de un compuesto tambien se puede determinar, por ejemplo, comparando la dosis que proporciona un aumento eficaz de la funcion cognitiva o trata un trastorno de la memoria en un modelo in vivo adecuado (Ejemplos 4, 5 y 6 que se presentan a continuacion) en una especie animal adecuada tal como la rata, dando la dosis una perdida de peso significativa (u otros efectos secundarios observables) en la especie animal de ensayo.
Ademas, segun lo descrito de manera mas completa mas adelante en el presente documento, G-2-MePE para su uso de acuerdo con la presente invencion puede ser util en el tratamiento del sfndrome de Rett, incluyendo la prolongacion de la vida, el aumento de la actividad neuronal y el tratamiento de las convulsiones asociadas con el sfndrome de Rett.
En un estudio del sfndrome de Rett en ratones (usando el modelo de desactivacion de MeCP2), se encontro que GPE tenia efectos de prolongacion de la vida y de aumento de la funcion neuronal (publicacion de EE.UU. n.° 2009/0099077). Sin embargo, como se desvela mas adelante, GPE, que es un peptido natural, se degrada rapidamente in vivo e in vitro, y su utilidad en el tratamiento cronico de pacientes con el sfndrome de Rett es, por lo tanto, poco clara.
Composiciones farmaceuticas y administracion
En general, G-2-MePE para su uso de acuerdo con la presente invencion puede administrarse en cantidades terapeuticamente eficaces por cualquiera de los modos habituales conocidos en la tecnica, bien individualmente o en combinacion con al menos otro agente terapeutico convencional para la enfermedad que se este tratando. Una cantidad terapeuticamente eficaz puede variar ampliamente dependiendo de la enfermedad o de la lesion, de la gravedad de la enfermedad, de la edad y de la salud relativa del animal que se esta tratando, la potencia del/de los compuesto/s, y otros factores. Por ejemplo, las dosis tales como aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg/kg, por ejemplo, 10 mg/kg, son apropiadas para la administracion mediante metodos tales como la administracion oral. El experto en la materia podra, sin experimentacion excesiva, teniendo en cuenta esa destreza y la presente divulgacion, determinar una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de la presente invencion para una enfermedad o lesion dada.
En general, G-2-MePE para su uso de acuerdo con la presente invencion se puede administrar como composiciones farmaceuticas. Las composiciones pueden adoptar la forma de comprimidos, pastillas, capsulas, semisolidos, polvos, formulacion de liberacion sostenida, soluciones, suspensiones, elixires, aerosoles, geles solubles o cualquier otra composicion apropiada; y comprenden G-2-MePE en combinacion con al menos un excipiente farmaceutica o fisiologicamente aceptable. Los excipientes adecuados son bien conocidos por los expertos en la materia, y los mismos, y los metodos de formulacion de las composiciones, pueden encontrarse en referencias convencionales como Gennaro A. R: “Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, 20a ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2000. Los vehfculos lfquidos adecuados incluyen agua, solucion salina acuosa, solucion acuosa de dextrosa, glicoles y similares.
G-2-MePE para su uso de acuerdo con presente invencion se administra por via oral, por ejemplo, en comprimidos o capsulas. En algunas realizaciones, G-2-MePE se puede preparar en emulsiones de agua en aceite en forma de microemulsiones, emulsiones de grano grueso, cristales lfquidos o nanocapsulas (solicitud de EE.UU. n.° 12/283.684, ahora patente n.° 7.887.839). Debido a que G-2-MePE puede tener una biodisponibilidad oral sustancial, puede usarse ventajosamente para una administracion conveniente y cronica. Ademas, las composiciones disponibles por via oral incluyen hidrogeles solubles que contienen compuestos activos, permitiendo asf la administracion oral de compuestos neuroprotectores sin la necesidad de que un paciente trague un comprimido o una capsula. Dichos materiales y geles de liberacion lenta son conocidos en la tecnica.
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G-2-MePE tambien se puede administrar adecuadamente mediante un sistema de liberacion sostenida o un material de gel con G-2-MePE incorporado en el mismo. Los ejemplos adecuados de composiciones de liberacion sostenida incluyen matrices polimericas semipermeables en forma de artfculos conformados, por ejemplo, pelfculas o microcapsulas. Las matrices de liberacion sostenida incluyen polilactidos (patente de eE.U. n.° 3.773.919; documento EP 58.481), copolfmeros de acido L-glutamico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman et al., 1983), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer et al., 1981), acetato de etilen-vinilo (Langer et al., supra) o acido poli-D-(-) -3-hidroxibutfrico (documento EP 133.988). Ademas, pueden usarse composiciones de gel basadas en polisacaridos (por ejemplo, carboximetilcelulosa, carboxietilcelulosa, quitosano u otros derivados de celulosa) y derivados de oxido de polietileno (por ejemplo, polietilenglicoles). Estas composiciones de gel son solubles en soluciones acuosas, son biocompatibles, no toxicas y, por lo tanto, pueden usarse para la administracion a cualquier superficie de la mucosa, incluyendo la cavidad oral.
Las composiciones de liberacion sostenida tambien incluyen un compuesto atrapado liposomalmente. Los liposomas que contienen el compuesto se preparan mediante metodos conocidos en si: documento DE 3.218.121; Epstein et al., 1985; Hwang et al., 1980; documento EP 52322; documento EP 36.676; documento EP 88.046; documento EP 143.949; documento EP 142.641; solicitud de patente 83-118008; patentes de EE.UU. n.° 4.485.045 y 4.544.545; y documento EP 102.324. Habitualmente, los liposomas son del tipo unilamelar pequeno (desde o aproximadamente 200 a 800 Angstroms), en el que el contenido de lfpidos es superior al aproximadamente 30 por ciento en moles de colesterol, ajustandose la proporcion seleccionada para la terapia mas eficaz.
G-2-MePE tambien se puede unir a polietilenglicol ("PEGilado") para aumentar su vida util in vivo, basandose, por ejemplo, en la tecnologfa conjugada descrita en el documento WO 95/32003.
Deseablemente, si es posible, cuando se administran como un agente antiinflamatorio, un agente antiapoptotico, un agente antinecrotico o un agente antineurodegenerativo, los compuestos pueden administrarse por via oral. La cantidad de un compuesto en dicha composicion puede variar ampliamente dependiendo del tipo de composicion, del tamano de una dosis unitaria, del tipo de excipientes y de otros factores bien conocidos por los expertos en la materia. En general, la composicion final puede comprender del aproximadamente 0,0001 por ciento en peso (% en peso) al aproximadamente 10 % en peso del compuesto, preferentemente del aproximadamente 0,001 % en peso al aproximadamente 1 % en peso, siendo el resto un excipiente o excipientes.
Una composicion puede contener opcionalmente, ademas del compuesto de la presente invencion, al menos un agente seleccionado de, por ejemplo, factores de crecimiento y derivados asociados (factor de crecimiento similar a insulina-1 (IGF-I), factor de crecimiento similar a la insulina II (IGF-II), factor de crecimiento transformante p-1, activina, hormona del crecimiento, factor de crecimiento nervioso, factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF), protefna de union a la hormona del crecimiento, protefnas de union a IGF (en especial, IGFBP-3), factor de crecimiento basico de fibroblastos, factor de crecimiento acido de fibroblastos, producto genico hst/Kfgk, FGF-3, FGF-4, FGF-6, factor de crecimiento de queratinocitos, factor de crecimiento inducido por androgenos. Otros miembros adicionales de la familia de FGF incluyen, por ejemplo, int-2, factor 1 homologo al factor de crecimiento de fibroblastos (FHF-1), FHF-2, FHF-3 y FHF-4, factor 2 de crecimiento de queratinocitos, factor de activacion glial, FGF-10 y FGF-16, factor neurotrofico ciliar, factor de crecimiento derivado del cerebro, neurotrofina 3, neurotrofina 4, protefna morfogenetica osea 2 (BMP-2), factor neurotrofico derivado de la estirpe celular glial, factor neurotrofico dependiente de la actividad, factor inhibidor de la leucemia de citoquinas, oncostatina M, interleucina), interferon a, p, y o consenso, y TNF-a. Otras formas de agentes terapeuticos neuroprotectores incluyen, por ejemplo, clometiazol; acido kinurenico, Semax, tacrolimus, L-treo-1-fenil-2-decanoilamino-3-morfolin-1-propanol, analogo de andrenocorticotropina-(4-9) [ORG 2766] y dizolcipina (MK-801), selegilina; antagonistas de glutamato tales como mematina (Namenda) NPS1506, GV1505260, MK-801, GV150526; antagonistas de AMPA tales como 2,3-dihidroxi- 6-nitro-7-sulfamoilbenzo(f)quinoxalina (NBQX), LY303070 y LY300164; agentes antiinflamatorios dirigidos contra la adresina MAdCAM-1 y/o sus receptores de integrina a4 (a4p1 y a4p7), tales como mAb MECA-367 anti-MAdCAM-1 (ATCC n.° de acceso HB-9478). Tambien puede ser util la terapia de combinacion con antagonistas metabotropicos del receptor de glutamato tales como fenobam. Tambien, ademas de un compuesto de la presente invencion, una composicion puede incluir un inhibidor selectivo de la recaptacion de la serotonina tal como la fluoxetina, un inhibidor selectivo de la recaptacion de la norepinefina tal como la viloxazina, o un agente antipsicotico atfpico tal como la risperidona. La mayorfa de estos agentes, en especial, los peptidos tales como los factores de crecimiento, etc., no son activos por via oral, y requeriran la administracion por inyeccion o infusion.
Preparacion de composiciones
Los materiales de partida y los reactivos usados en la preparacion de G-2-MePE estan disponibles a partir de proveedores comerciales tales como Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wis.), Bachem (Torrance, Calif.), Sigma (St. Louis, Mo.) o se preparan mediante metodos bien conocidos por el experto habitual en la materia siguiendo procedimientos descritos en referencias tales como “Fieser y Fieser's Reagents for Organic Synthesis”, vol 1-17, John Wiley and Sons, Nueva York, N.Y., 1991; “Rodd's Chemistry of Carbon Compounds”, vol. 1-5 y suplementos, Elsevier Science Publishers, 1989; “Organic Reactions”, vol. 1-40, John Wiley and Sons, Nueva York, N.Y., 1991; March J; Advanced Organic Chemistry, 4a ed. John Wiley and Sons, Nueva York, N.Y., 1992; y Larock: “Comprehensive Organic Transformations”, VCH Publishers, 1989. En la mayorfa de los casos, los aminoacidos y
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sus esteres o amidas, y aminoacidos protegidos, estan ampliamente disponibles en el mercado; y la preparacion de aminoacidos modificados y sus amidas o esteres se describen extensamente en la bibliograffa qmmica y bioqmmica y, por lo tanto, son bien conocidos por los expertos habituales en la materia. Por ejemplo, el acido N-pirrolidinacetico se describe en Dega-Szafran Z y Pryzbylak R. “Synthesis, IR, and NMR studies of zwitterionic a-(1- pyrrolidine)alkanocarboxylic acids and their N-methyl derivatives”. J. Mol. Struct: 436-7, 107-121, 1997; y el acido N- piperidinacetico se describe en Matsuda O., Ito S. y Sekiya M. “Reaction of N-(alkoxymethyl)dialkylamines and N,N'- methylenebisdialkylamines with isocyanides”. Chem. Pharm. Bull: 23(1), 219-221, 1975.
Los materiales de partida, productos intermedios y G-2-MePE se pueden aislar y purificar usando tecnicas convencionales, incluyendo filtracion, destilacion, cristalizacion, cromatograffa y similares. Pueden caracterizarse usando metodos convencionales, incluyendo constantes ffsicas y datos espectrales.
G-2-MePE se puede preparar mediante los metodos descritos a continuacion y como se dan en los Ejemplos.
En general, G-2-MePE se puede preparar mediante metodos tales como los que ya son bien conocidos por los
expertos en la materia de smtesis de peptidos y de peptidos modificados, siguiendo los esquemas de reaccion
expuestos en las FIG. 1-11 que acompanan a la presente memoria descriptiva, o siguiendo otros metodos bien conocidos por los expertos en la materia de la smtesis de peptidos y analogos.
Convenientemente, la produccion sintetica de G-2-MePE puede ser de acuerdo con el metodo sintetico en fase solida descrito por Merrifield et al., “Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide”: J. Amer. Chem. Soc: 85, 2149-2156, 1963. Esta tecnica es muy conocida y es un metodo comun para la preparacion de
peptidos. El concepto general de este metodo depende de la union del primer aminoacido de la cadena a un
poifmero solido por un enlace covalente. Se agregan aminoacidos protegidos sucesivos, uno cada vez (estrategia escalonada) o en bloques (estrategia de segmentos), hasta que se ensambla la secuencia deseada. Finalmente, se retira el peptido protegido del soporte de resina solida y se escinden los grupos protectores. Mediante este procedimiento, los reactivos y subproductos se eliminan por filtracion, eliminando asf la necesidad de purificar los productos intermediarios.
Los aminoacidos pueden unirse a cualquier polfmero adecuado como una resina. La resina debe contener un grupo funcional al que puede unirse el primer aminoacido protegido firmemente por un enlace covalente. Para este fin, son adecuados diversos polfmeros, tales como celulosa, alcohol polivimlico, polimetilmetacrilato y poliestireno. Las resinas adecuadas estan disponibles en el mercado y son muy conocidas por los expertos en la materia. Los grupos protectores apropiados que se pueden usar en dicha smtesis incluyen terc-butiloxicarbonilo (BOC), bencilo (Bzl), t- amiloxicarbonilo (Aoc), tosilo (Tos), o-bromo-fenilmetoxicarbonilo (BrZ), 2,6-diclorobencilo (BzlCh) y fenilmetoxicarbonilo (Z o CBZ). Otros grupos protectores adicionales se identifican en Merrifield, citado anteriormente, asf como en McOmie J. F. W.:” Protective Groups in Organic Chemistry”, Plenum Press, Nueva York, 1973, ambas referencias se incorporan expresamente en el presente documento.
Los procedimientos generales de preparacion de peptidos implican inicialmente la union de un aminoacido protegido con terminacion carboxilo a la resina. Tras la union, la resina se filtra y se lava, y se retira el grupo protector (deseablemente BOC) del grupo I-amino del aminoacido con terminacion carboxilo. La retirada de este grupo protector debe tener lugar, por supuesto, sin romper el enlace entre ese aminoacido y la resina. A continuacion, se acopla el siguiente aminoacido, y si es necesario, el aminoacido protegido con cadena lateral, al grupo I-amino libre del aminoacido sobre la resina. Este acoplamiento tiene lugar mediante la formacion de un enlace de amida entre el grupo carboxilo libre del segundo aminoacido y el grupo amino del primer aminoacido unido a la resina. Esta secuencia de eventos se repite con sucesivos aminoacidos hasta que todos los aminoacidos se unen a la resina. Finalmente, el peptido protegido se escinde de la resina, y se retiran los grupos protectores para revelar el peptido deseado. Las tecnicas de escision usadas para separar el peptido de la resina y para retirar los grupos protectores dependen de la seleccion de resina y de los grupos protectores, y son conocidas por los expertos habituales en la materia de la smtesis de peptidos.
Otras tecnicas alternativas para la smtesis de peptidos se describen en Bodanszky et al., “Peptide Synthesis”, 2a ed, John Wiley and Sons, Nueva York, 1976. Por ejemplo, G-2-MePE tambien pueden sintetizarse usando metodologfas de smtesis de peptidos en solucion convencionales, que implican el acoplamiento por etapas o en bloques de aminoacidos o fragmentos peptfdicos usando metodos qmmicos o enzimaticos de formacion de enlaces de amida. (Vease, por ejemplo, H. D. Jakubke en “The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology”, Academic Press, Nueva York, 1987, pag. 103-165; J. D. Glass, ibid., pag. 167-184; y patente europea n.° 0324659 A2, que describe metodos de smtesis de peptidos enzimaticas). Estos metodos de smtesis en solucion son muy conocidos en la tecnica.
Los sintetizadores de peptidos comerciales, tales como el Modelo 430A de Applied Biosystems, estan disponibles para la practica de estos metodos.
Un experto habitual en la materia no tendra que realizar una experimentacion excesiva, teniendo en cuenta esa destreza tecnica y el conocimiento disponible, y de la presente divulgacion, en el desarrollo de uno o mas metodos sinteticos adecuados para G-2-MePE.
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Ejemplos
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar realizaciones de la presente invencion. Ejemplo 1: Smtesis de glicil-L-2-metil-L-prolil-L-glutamato (G-2-MePE)
Acido glicil-L-2-Metilprolil-L-glutamico (G-2MePE)
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La L-2-metilprolina y el p-toluenosulfonato de ester dibendlico de acido glutamico se adquirieron en Bachem, la N- benciloxicarbonil-glicina, en Acros Organics, y el cloruro bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfmico (BoPCl, 97 %), en Aldrich Chem. Co.
Clorhidrato de L-2-metilprolinato de metilo 2
Se anadio cuidadosamente cloruro de tionilo (5,84 cm3, 80,1 mmol) gota a gota a una solucion agitada de (L)-2- metilprolina 1 (0,43 g, 3,33 mmol) en metanol anhidro (30 cm3) a -5 °C bajo una atmosfera de nitrogeno. Se calento la mezcla de reaccion a reflujo durante 24 h, y se concentro la solucion resultante de color amarillo palido a sequedad al vado. Se disolvio el residuo en una mezcla 1: 1 de metanol y tolueno (30 cm3), luego se concentro a sequedad para eliminar el cloruro de tionilo residual. Se repitio este procedimiento dos veces mas, proporcionando clorhidrato 2 (0,62 g, 104 %) en forma de un solido blanquecino higroscopico, espectroscopicamente puro, p.f. = 127-131 °C. [a]d -59,8 (c 0,24 in Ch^Ch); vmax (pelfculaycm'1 3.579, 3.398 ancho, 2.885, 2.717, 2.681, 2.623, 2.507, 1.743, 1.584, 1.447, 1.432, 1.374, 1.317, 1.294, 1.237, 1.212, 1.172, 1.123, 981, 894, 861 y 764; 6h (300 MHz; CDCla; Me4 Si) 1,88 (3H, s, Proa-CHs), 1,70-2,30 (3H, m ancho, PtoP-HaHb y ProY-H2), 2,30-2,60 (1H, m ancho, PtoP-HaHb), 3,40-3,84 (2H, m ancho, Pro6-H2), 3,87 (3H, s, CO2CH3), 9,43 (1H, s ancho, NH) y 10,49 (1H, s ancho, HCl); Sc (75 MHz; CDCha) 21,1 (CH3, Proa-C^), 22,4 (CH2, ProY-C), 35,6 (CH2, Prop-C), 45,2 (CH2, Pro6-C), 53,7 (CH3, CO2CH3), 68,4 (c., Proa-C) y 170,7 (c., CO); m/z (FAB+) 323,1745 ^2^35^^: (CyH13NO2)2^H35Cl^H requiere 323,1738] y 325,1718 [M2^H37ChH+: (CyH13NO2)2^H37Cl^H requiere 325,1708].
N-Benciloxicarbonil-glicil-L-2-metilprolina 5
Se anadio gota a gota trietilamina anhidra (0,45 cm3, 3,23 mmol) a una mezcla de clorhidrato de metil-L-2- metilprolinato 2 (0,42 g, 2,34 mmol) y N-benciloxicarbonilglicina (98,5 %) 3 (0,52 g, 2,45 mmol) en cloruro de metileno (16 cm3) a 0 °C, bajo una atmosfera de nitrogeno. Se agito la solucion resultante durante 20 minutos y se
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anadio gota a gota una solucion de 1,3-diciclohexilcarbodiimida (0,56 g, 2,71 mmol) en cloruro de metileno (8 cm3) a 0 °C, y se calento la mezcla de reaccion a temperatura ambiente y se agito durante otras 20 h. Se filtro la mezcla blanca resultante a traves de un lecho corto de CeliteTM para retirar parcialmente la 1,3-diciclohexilurea, y se lavo el lecho corto con cloruro de metileno (50 cm3). Se lavo el filtrado sucesivamente con acido clorhfdrico acuoso al 10 % (50 cm3) y bicarbonato sodico acuoso saturado (50 cm3), se seco (MgSO4), se filtro y se concentro a sequedad al vacfo. La purificacion adicional del residuo mediante cromatograffa en columna ultrarrapida (35 g de SiO2, 30-70 % de acetato de etilo - hexano, elucion en gradiente) proporciono provisionalmente N-benciloxicarbonil-glicil-L-2- metilprolinato de metilo 4 (0,56 g), que contenfa 1,3-diciclohexilurea, en forma de un semisolido blanco: Rf 0,65 (EtOAc); m/z (EI+) 334,1534 (M+. C17H22N2O5 requiere 334,1529) y 224 (1,3-diciclohexilurea).
A una solucion de prolinato impuro 4 (0,56 g, aprox. 1 0,67 mmol) en 1,4-dioxano (33 cm3), se anadio gota a gota hidroxido de sodio acuoso 1 M (10 cm3, 10 mmol), y se agito la mezcla durante 19 h a temperatura ambiente. A continuacion, se anadio cloruro de metileno (100 cm3), y se extrajo la capa organica con bicarbonato de sodio acuoso saturado (2 x 100 cm3). Se acidificaron las capas acuosas combinadas cuidadosamente con acido clorhfdrico (32 %), se extrajeron con cloruro de metileno (2 x 100 cm3), y se secaron las capas organicas combinadas (MgSO4), se filtraron y se concentraron a sequedad al vacfo. La purificacion del residuo resultante (0,47 g) por cromatograffa en columna ultrarrapida (17 g de SiO2, acetato de etilo al 50 % - hexano hasta metanol al 30 % - diclorometano, elucion en gradiente) dio el dipeptido N-protegido 5 (0,45 g, 60 %) en forma de una espuma blanca en dos etapas del clorhidrato 2. Se demostro que el dipeptido 5 era exclusivamente el conformero con orientacion trans mediante analisis de RMN: Rf 0,50 (MeOH al 20 %-CH2Cl2); [a]d -62,3 (c 0,20 en CHCh); vmax (pelfcula)/cm'1 3.583, 3.324 ancho, 2.980, 2.942, 1.722, 1.649, 1.529, 1.454, 1.432, 1.373, 1.337, 1.251, 1.219, 1.179, 1.053, 1.027, 965, 912, 735 y 698; Sh (300 MHz; CDCla; Me4 Si) 1,59 (3H, s, Proa-CH), 1,89 (1H, 6 lfneas, J 18,8, 6,2 y 6,2, PtoP-HaHb),
2.01 (2H, dtt, J 18,7, 6,2 y 6,2, ProY-H2), 2,25-2,40 (1H, m, PtoP-HaHb), 3,54 (2H, t, J 6,6, ProS-H), 3,89 (1H, dd, J
17.1 y 3,9, Glya-HAHB), 4,04 (1H, dd, J 17,2 y 5,3, Glya-HH), 5,11 (2H, s, OCHPh), 5,84 (1H, t ancho, J 4,2, N- H), 7,22-7,43 (5H, m, Ph) y 7,89 (1H, s ancho, -COOH); 6 c (75 MHz; CDCha) 21,3 (CH, Proa-CH), 23,8 (CH2, Proy-C), 38,2 (CH2, Prop-C), 43,6 (CH2, Glya-C), 47,2 (CH2, Pro6-C), 66,7 (c., Proa-C), 66,8 (CH2, OCHPh), 127,9 (CH, Ph), 127,9 (CH, Ph), 128,4, (CH, Ph), 136,4 (c., Ph), 156,4 (c., NCO2), 167,5 (c., Gly-CON) y 176,7 (c., CO); m/z (EI+) 320,1368 (M+. C16H20N2O5 requiere 320,1372).
N-benciloxicarbonil-glicil-L-2-metilprolil-L-glutamato de dibencilo 7
Se anadio gota a gota trietilamina (0,50 cm3, 3,59 mmol) a una solucion del dipeptido 5 (0,36 g, 1,12 mmol) y p- toluenosulfonato de ester dibencflico de acido L-glutamico 6 (0,73 g, 1,46 mmol) en metileno (60 cm3) bajo nitrogeno a temperatura ambiente, y se agito la mezcla de reaccion durante 10 min. Se anadio cloruro de bis(2-oxo-3- oxazolidinil)fosffnico (BoPCl, 97 %) (0,37 g, 1,41 mmol) y se agito la solucion incolora durante 17 h. Se lavo la solucion de cloruro de metileno sucesivamente con acido clorhfdrico acuoso al 10 % (50 cm3) y bicarbonato sodico acuoso saturado (50 cm3), se seco (MgSO4), se filtro y se evaporo hasta sequedad al vacfo. La purificacion del residuo resultante mediante cromatograffa en columna rapida repetida (x2) (24 g de SiO2, acetato de etilo - hexano al 30-70 %, elucion en gradiente) produjo el tripeptido 7 totalmente protegido (0,63 g, 89 %) en forma de un aceite incoloro. El tripeptido 7 mostro ser exclusivamente el conformador con orientacion trans mediante analisis de RMN. Rf 0,55 (EtOAc); [a]d -41,9 (c 0,29 en CH2Cl2); Vmax (pelfcula)/cm'1 3.583, 3.353 ancho, 2.950, 1.734, 1.660, 1.521, 1.499, 1.454, 1.429, 1.257, 1.214, 1.188, 1.166, 1.051, 911, 737 y 697; Sh (400 MHz; CDCha; Me4Si) 1,64 (3H, s, Proa-CH), 1,72 (1H, dt, J 12,8, 7,6 and 7,6, PtoP-HaHb), 1,92 (2H, 5 lfneas, J 6,7, ProY-H2), 2,04 (1H, 6 lfneas, J 7,3 GIuP-HaHb), 2,17-2,27 (1H, m, GIuP-HaHb), 2,35-2,51 (3H, m, PtoP-HaHb y GIUY-H2), 3,37-3,57 (2H, m, Pro6- H2), 3,90 (1H, dd, J 17,0 y 3,6, Glya-HH), 4,00 (1H, dd, J 17,1 y 5,1, Glya-HH), 4,56 (1H, td, J 7,7 y 4,9, Glua- H), 5,05-5,20 (6H, m, 3 x OCHPh), 5,66-5,72 (1H, m ancho, Gly-NH), 7,26-7,37 (15H, m, 3 x Ph) y 7,44 (1H, d, J 7,2, Glu-NH); Sc (100 MHz; CDCha) 21,9 (CH, Proa-CH), 23,4 (CH2, ProY-C), 26,6 (CH2, Glup-C), 30,1 (CH2, GIuy-C), 38,3 (CH2, Prop-C), 43,9 (CH2, Glya-C), 47,6 (CH2, Pro6-C), 52,2 (CH, Glua-C), 66,4 (CH2, OCHPh), 66,8 (CH2, OCH2Ph), 67,1 (CH2, OCH2 Ph), 68,2 (c., Proa-C), 127,9 (CH, Ph), 128,0 (CH, Ph), 128,1, (CH, Ph), 128,2, (CH, Ph), 128,2, (CH, Ph), 128,3, (CH, Ph), 128,4, (CH, Ph), 128,5, (CH, Ph), 128,5, (CH, Ph), 135,2 (c., Ph), 135,7 (c., Ph), 136,4 (c., Ph), 156,1 (c., NCO2), 167,3 (c., Gly-CO), 171,4 (c., CO), 172,9 (c., CO) y 173,4 (x., CO); m/z (FAB+) 630,2809 (MH+. Ca5H4oNaO8 requiere 630,2815).
Acido glicil-L-2-metilprolil-L-glutamico (G-2-MePE)
Se agito una mezcla del tripeptido protegido 7 (0,63 g, 1,00 mmol) y 10 % en peso de paladio sobre carbon activado (0,32 g, 0,30 mmol) en metanol-agua 91: 9 (22 cm3) bajo una atmosfera de hidrogeno a temperatura ambiente, protegida de la luz, durante 23 h. Se filtro la mezcla de reaccion a traves de un lecho corto de Celite® y se lavo el lecho corto con metanol-agua 75:25 (200 cm3). Se concentro la fraccion filtrada a sequedad a presion reducida y se trituro el residuo con eter dietflico anhidro, proporcionando una mezcla 38:1 de G-2-MePE y provisionalmente metilamina 8 (0,27 g, 86 %) en forma de un solido blanco extremadamente higroscopico. Los estudios analfticos de HPLC en fase inversa sobre la mezcla [columna de Si C18 Altech Econosphere, 150 x 4,6 mm, 5 pm; lavado abundante durante 5 min con H2O (TFA al 0,05 %) y despues gradiente constante durante 25 min a MeCN como eluyente a un caudal de 1 ml/min; deteccion usando matriz de diodos] indicaron que era una mezcla 38:1 de dos picos de elucion con tiempos de retencion de 13,64 y 14,44 min a 207 y 197 nm, respectivamente. Se demostro que el G-2-MePE era una mezcla de conformeros trans.cis de 73:27 mediante analisis de RMN de 1H (la relacion se
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estimo a partir de las intensidades relativas del doblete doble y el triplete a 6 4,18 y 3,71, asignados a los protones Glua-H de los conformeros mayor y menor, respectivamente): p.f.= 144 °C$; [a]o -52,4 (c 0,19 en H2 O); 6h (300 MHz; D2O; MeOH interno) 1,52 (3H, s, Proa-CH3), 1,81-2,21 (6H, m, Prop-H, ProY-H2 y Glup-H2), 2,34 (1,46H, t, J 7,2, GIuy-H2), 2,42* (0,54H, t, J 7,3, GIuy-H2), 3,50-3,66 (2H, m, Pro6-H2), 3,71* (0,27H, t, J 6,2, Glua-H), 3,85 (1H, d, J 16,6, GlyaHAHB), 3,92 (1H, d, J 16,6, Glya-H\HB) y 4,18 (0,73H, dd, J 8,4 y 4,7, Glua-H); Sc (75 MHz; D2O; MeOH interno) 21,8 (CH3, Proa-CHs), 25,0 (CH2, Proy-C), 27,8* (CH2, Glup-C), 28,8 (CH2, Glup-C), 32,9 (CH2, GIuy-C), 40,8 (CH2, Prop-C), 42,7 (CH2, Glya-C), 49,5 (CH2, Pro6-C), 56,0* (CH, Glua-C), 56,4 (CH, Glua-C), 69,8 (c, Proa-C), 166,5 (c., Gly-CO), 177,3 (c., Pro-CON), 179,2 (c., Glua-CO), 180,2* (c., GIuy-CO) y 180,6 (c., GIuy-CO); m/z (FAB+) 316,1508 (MH+. C13H22N3O6 requiere 316,1509).
Ejemplo 2: Neuroproteccion in vitro
Se examinaron los efectos terapeuticos de los analogos de GPE en una serie de experimentos in vitro para determinar sus efectos sobre la neurodegeneracion de celulas neuronales de diferente origen. Los sistemas in vitro descritos en el presente documento estan bien establecidos en la tecnica y se sabe que son predictivos de los efectos neuroprotectores observados in vivo, incluyendo los efectos en seres humanos que padecen trastornos neurodegenerativos.
Material y metodos
El siguiente protocolo experimental siguio las pautas aprobadas por el Comite de Etica Animal de la Universidad de Auckland.
Preparacion de cultivos de astrocitos corticales para la cosecha de sobrenadante de cultivo celular metabolizado
Se uso un hemisferio cortical de una rata postnatal de dfa 1 y se recogio en 4 ml de DMEM. La trituracion se realizo usando una pipeta de vidrio de 5 ml y una aguja de calibre 18. Se tamizo la suspension de celulas a traves de un filtro de celulas de 100 pm, y se lavo en 50 ml de DMEM (centrifugacion durante 5 min a 250 g). Se volvio a suspender el sedimento en 20 ml de DMEM + suero fetal de ternera al 10 %. Se anadio la suspension a dos matraces de 25 cm3 (10 ml por matraz) y se cultivo a 37 °C en presencia de CO2 al 10 %, seguido de un cambio del medio dos veces por semana. Cuando las celulas alcanzaron la confluencia, se lavaron tres veces con PBS, se ajustaron a Neurobasal/B27 y se incubaron durante otros 3 dfas. Este sobrenadante se congelo para un almacenamiento transitorio a -80 °C.
Preparacion de tejido cortical y estriado procedente de embriones de rata E18/E19
Se sacrifico una presa mediante tratamiento con CO2 y luego se preparo para la cesarea. Despues de la cirugfa, se extrajeron los embriones de sus sacos amnioticos y se decapitaron. Se colocaron las cabezas sobre hielo en medio DMEM/F12 para el cuerpo estriado y en PBS + D-(+)-glucosa al 0,65 % para la corteza.
Procedimiento de extraccion de tejido estriado y preparacion de celulas
Se extrajo un cerebro entero del craneo con el lado ventral hacia arriba en Medio DMEM/F12. Se disecciono el cuerpo estriado de ambos hemisferios bajo un estereomicroscopio y se coloco el tejido estriado en un tubo de Falcon sobre hielo. Luego se trituro el tejido estriado con una pipeta P1000 en 1 ml de volumen. Se trituro el tejido pipeteando suavemente la solucion hacia arriba y hacia abajo en la punta de la pipeta aproximadamente 15 veces, usando la fuerza de cizalla en flujos de salida alternos. Los trozos de tejido se asentaron en el fondo del tubo Falcon en 30 segundos. A continuacion, se transfirio el sobrenadante que contenfa una suspension de celulas individuales disociadas a un nuevo tubo Falcon esteril sobre hielo. Se volvieron a triturar los fragmentos de tejido para evitar el dano excesivo en las celulas ya disociadas, por triturarlas mas. Se anadio 1 mililitro de medio de DMEM/F12 enfriado con hielo a los fragmentos de tejido del primer tubo y se trituraron como antes. Se dejaron sedimentar los fragmentos de tejido y se retiro el sobrenadante a un nuevo tubo Falcon esteril sobre hielo. Se centrifugaron las celulas a 250 g durante 5 minutos a 4 °C.
Siembra en placas y cultivo de celulas estriadas
Se sembraron celulas estriadas en placas de 96 pocillos recubiertas con poli-L-lisina (0,1 mg/ml) (solo 60 pocillos internos) a una densidad de 200.000 celulas/cm2 en medio Neurobasal/B27 (Invitrogen). Se cultivaron las celulas en presencia de CO2 al 5 % a 37 °C bajo una humedad del 100 %. Se cambio el medio en los dfas 1, 3 y 6.
Procedimiento de extraccion de tejido cortical y preparacion de celulas
Se extirparon cuidadosamente los dos hemisferios corticales mediante la espatula de todo el cerebro con el lado ventral hacia arriba en una placa de Petri que contenfa PBS + D-(+)-glucosa al 0,65 %. Se colocaron forceps en la parte del rostro (cerca de B. olfactorius) de la corteza con el fin de fijar el tejido y se realizaron dos cortes orientados
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lateral-sagitalmente para retirar la corteza paraformal y entorinal. Se realizo un corte con orientacion frontal en el extremo posterior para retirar la formacion del hipocampo. Se realizo un ultimo corte frontal a pocos milfmetros del ultimo corte para obtener la zona 17/18 de la corteza visual.
Se colocaron las cortezas sobre hielo en PBS + (+)-glucosa al 0,65 % y se centrifugaron a 350 g durante 5 minutos. Se retiro el sobrenadante y se anadio tripsina/EDTA (0,05 %/0,53 mM) durante 8 min a 37 °C. Se detuvo la reaccion anadiendo una cantidad igual de DMEM y suero fetal de ternera al 10 %. Se retiro el sobrenadante por centrifugacion seguido de dos lavados posteriores en medio Neurobasal/B27.
Se trituraron las celulas una vez con una pipeta de vidrio Pasteur en 1 ml de medio Neurobasal/B27 y posteriormente dos veces usando una jeringa de insulina de 1 ml con una aguja de calibre 22. Se hizo pasar la suspension celular a traves de un filtro de celulas de 100 pm y se enjuago con 1 ml de medio Neurobasal/B27. Se contaron las celulas y se ajustaron a 50.000 celulas por 60 pl.
Siembra en placas y cultivo de celulas corticales
Se recubrieron placas de 96 pocillos con 0,2 mg/ml de poli-L-lisina y posteriormente se recubrieron con 2 pg/ml de laminina en PBS, despues de lo que se anadieron 60 pl de medio condicionado de astrocitos corticales a cada pocillo. Posteriormente, se anadieron 60 pl de suspension de celulas corticales. Las celulas se cultivaron en presencia de CO2 al 10 % a 37 °C bajo una humedad del 100 %. El dfa 1, hubo un cambio completo del medio (1:1 - Neurobasal/B27 y medio condicionado de astrocitos) con la adicion de 1 pM de citosina-p-D-arabino-furanosida (inhibidor de la mitosis). Los dfas 2 y 5, se modificaron 2/3 del medio.
Microexplantes cerebelosos de animales P8: Preparacion, cultivo y fijacion
Se explantaron cortezas cerebelosas laminadas de los dos hemisferios de una rata P8, se cortaron en trozos pequenos en solucion de PBS + D-(+)glucosa al 0,65 % y se trituraron con una aguja de calibre 23 y, posteriormente, se presionaron a traves de un tamiz de tamano de poro de 125 pm. Se centrifugaron los microexplantes obtenidos (60 g) dos veces (cambio de medio) en medio sTaRTV suplementado con BSA exento de suero (Biochrom). Para el cultivo, se adhirieron 40 pl de suspension celular durante 3 horas sobre un cubreobjetos recubierto con poli-L-lisina a 0,1 mg/ml dispuesto en placas de 6 pocillos de 35 mm de tamano en presencia de CO2 al 5 % bajo humedad del 100 % a 34 °C. Posteriormente, se anadio 1 ml de medio STARTV junto con las toxinas y farmacos. Se controlaron los cultivos (evaluaron) despues de 2-3 dfas de cultivo en presencia de CO2 al 5 % bajo una humedad del 100 %. Para el analisis de recuento de celulas, se fijaron los cultivos a concentraciones crecientes de paraformaldehfdo (0,4 %, 1,2 %, 3 % y 4 % durante 3 min cada vez) seguido de un lavado en PBS.
Administracion de toxinas y farmacos a celulas neuronales in vitro y analisis de datos
Para estudiar los efectos neuroprotectores de los analogos de GPE, se llevaron a cabo una serie de experimentos in vitro usando acido okadaico para causar lesiones toxicas a las celulas neuronales. El acido okadaico es una toxina reconocida en la tecnica que se sabe que causa dano a las neuronas. Ademas, la recuperacion de las celulas neuronales o la funcion de las celulas neuronales despues de la lesion por el acido okadaico se reconoce que es predictiva de las recuperaciones de las lesiones causadas por otras toxinas.
Para causar lesiones toxicas a las neuronas, se expusieron las neuronas a 1:100 partes de acido okadaico a concentraciones de 30 nM o 100 nM y acido 3-nitropropionico 0,5 mM (solo para microexplantes cerebelosos). Se uso GPE (1 nM-1 mM) o G-2-MePE (l nM-l mM) a los 8 dfas in vitro (DIV) para cultivos corticales y 9DIV para cultivos estriados. El tiempo de incubacion fue de 24 horas. Se determino la tasa de supervivencia mediante un ensayo de MTT de punto final colorimetrico a 595 nm en un lector de placas de pocillos multiples. Para los microexplantes cerebelosos, se seleccionaron cuatro ventanas (campo de 0,65 mm2) con la mayor densidad celular y se contaron las celulas que presentaban excrecencia de neuritas.
Resultados
El analogo de GPE G-2-MePE presento efectos neuroprotectores comparables dentro de los tres sistemas in vitro ensayados (FIG. 12-15).
Los cultivos corticales respondieron a concentraciones de 10 pM de GPE (FIG. 12) o G-2-MePE (10 pM, FIG. 13) con 64 % y 59 % de neuroproteccion, respectivamente.
Los otros 2 tipos de cultivos mostraron neuroproteccion a dosis mas bajas de G-2-MePE (microexplantes cerebelosos: FIG. 14 y celulas estriadas: FIG. 15). Las celulas estriadas demostraron neuroproteccion dentro del intervalo de 1 nM a 1 mM de G-2-MePE (FIG. 15), mientras que los microexplantes cerebelosos posnatales demostraron neuroproteccion con G-2-MePE en el intervalo de dosis de entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 100 nM (FIG. 14). Por lo tanto, los presentes inventores concluyen que G-2-MePE es un agente neuroprotector y puede tener efectos terapeuticos en los seres humanos que padecen de trastornos
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Ejemplo de referencia 3: Efectos de G-2-MePE sobre las neuronas colinergicas estriadas en ratas envejecidas
Para determinar si G-2-MePE puede afectar a las neuronas colinergicas, se estudiaron ratas envejecidas. La colina acetiltransferasa (ChAT) es una enzima que participa en la biosintesis del neurotransmisor para los nervios colinergicos, la acetilcolina. Es bien sabido que la inmunodeteccion de ChAT puede usarse para determinar el numero de nervios colinergicos presentes en un tejido. Tambien se sabe que el numero de nervios colinergicos presentes esta asociado con la funcion fisiologica de las vfas neuronales colinergicas en el cerebro.
En este experimento, se ensayaron los efectos de G-2-MePE sobre el numero de neuronas positivas en ChAT en cerebros de ratas de 18 meses de vida.
Metodos
Las ratas macho de 18 meses de vida recibieron uno de los cinco tratamientos. Se trato un grupo de control con vehfculo (solucion salina sola (n = 4) y cuatro grupos se trataron con una sola dosis de G-2-MePE. Se administraron dosis de 0,012 (n = 4), 0,12 (n = 5), 1,2 (n = 5) y 12 mg/kg (n = 3), respectivamente, por via subcutanea. Las ratas se sacrificaron con una sobredosis de pentobarbital 3 dfas despues del tratamiento con farmaco. Se perfundieron los cerebros con solucion salina normal y paraformaldehfdo al 4 % y se fijaron en un fijador de perfusion durante la noche. Los cerebros se almacenaron en sacarosa al 25 % en PBS 0,1 M (pH 7,4) hasta que el tejido se hundio. Se realizaron cortes coronales congelados de estriado con un microtomo y se almacenaron en azida de sodio al 0,1 % en PBS 0,1 M a 4 °C. Se establecio la inmunorreactividad para la colina acetiltransferasa (ChAT) mediante tincion usando un metodo de seccion flotante libre. En resumen, se diluyeron los anticuerpos en suero de cabra al 1 %. Se incubaron los cortes en triton al 0,2 % en PBS/Triton™ 0,1 M a 4 °C. durante la noche antes de tincion inmunohistoqufmica. Se trataron previamente los cortes con H2O2 al 1 % en metanol al 50 % durante 20 min. A continuacion, se incubaron los cortes con anticuerpos anti-ChAT (1:5000) de conejo (Rb) (los anticuerpos primarios) en 4D en un agitador durante dos dfas. Se lavaron los cortes usando PBS/TritonTM (15 minutos x 3 d) y luego se incubaron con anticuerpos secundarios biotinilados de cabra anti-conejo (1:1000) a temperatura ambiente durante la noche. Se lavaron los cortes y se incubaron en ExtrAvidin™ (Sigma) (1:1000) durante 3 horas y seguido de H2O2 (0,01 %) en tetracloruro de 3,3-diaminobencina (DAB, 0,05 %) para producir un producto de reaccion coloreado. Se montaron estas secciones en diapositivas recubiertas de alumbre de cromo, se secaron, se deshidrataron y se cubrieron.
Se contaron las neuronas estriadas de ambos hemisferios que presentaron inmunorreactividades especfficas correspondientes a ChAT usando un microscopio optico y una reticula de 1 mm2 x 1000. El tamano de la region estriada usada para el recuento se midio usando un analizador de imagenes. Se compararon los recuentos totales de neuronas/mm2 entre los grupos.
Los datos se analizaron usando una prueba t pareada y se presentaron como la media ± ETM. Los resultados se presentan en la FIG. 16.
Resultados
La FIG. 16A muestra que el numero de neuronas inmunopositivas en ChAT aumento en los cerebros de animales tratados con G-2-MePE. Esto indica claramente que la administracion de G-2-MePE es eficaz para aumentar el nivel de ChAT en los cerebros de ratas envejecidas. Debido a que ChAT es una enzima implicada en la sfntesis del neurotransmisor colinergico acetilcolina, los presentes inventores concluyen que G-2-MePE puede aumentar la cantidad de transmisor colinergico en los cerebros de ratas de mediana edad.
Ejemplo de referencia 4: Efectos de G-2-MePE en la memoria de referencia espacial en ratas
Despues de haberse demostrado que G-2-MePE puede aumentar la ChAT y, por lo tanto, que tiene el potencial de mejorar la funcion neuronal colinergica, a continuacion, se examino si G-2-MePE puede ser util en el tratamiento de los cambios relacionados con la edad en la cognicion y/o la memoria. Por lo tanto, se llevo a cabo una serie de estudios en ratas usando ensayos bien establecidos para la memoria.
Experimento 1: Ensayo del laberinto acuatico de Morris
El ensayo del laberinto acuatico de Morris es un ensayo ampliamente reconocido para evaluar la memoria de referencia espacial en ratas.
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Sujetos
Se usaron ratas macho Wistar de 12, 8 o 4 meses de vida.
Metodos
Entorno y aparato de ensayo
El ensayo del laberinto acuatico de Morris se realizo usando una piscina de plastico negra llenada hasta una profundidad de 25 cm con agua coloreada de negro con un tinte no toxico. La piscina tenia una insercion negra circular para que las paredes tambien parecieran de un negro uniforme. La piscina estaba dividida en cuatro cuadrantes (norte, sur, este y oeste) por dos lineas perpendiculares imaginarias cruzando por el centro de la piscina. Se coloco una plataforma metalica en el centro geografico del cuadrante SE a 50 cm del borde de la piscina, de modo que quedaba 2 cm por debajo de la superficie del agua e invisible. La plataforma permanecio en esa posicion a lo largo del entrenamiento.
El experimento uso pistas fuera del laberinto (es decir, objetos en la sala que rodeaba a la piscina) que las ratas podrian usar para navegar a la plataforma. Se colgaron carteles o cuadros distintivos en las paredes. Los muebles de la sala no se movieron durante el periodo de ensayo. La colocacion de la piscina permitio al experimentador un facil acceso a la misma desde todos los lados. La piscina se vacio y relleno diariamente durante el ensayo, con agua a 25 °C ± 2 °C.
El punto mas lejano del estanque (relativo a la posicion del experimentador) fue designado como "norte", y los otros puntos de la brujula "este", "sur" y "oeste" eran los puntos mas a la derecha, al fondo y a la izquierda de la piscina, respectivamente. Se marcaron estos puntos con cinta en el exterior de la piscina.
Fase de adquisicion
Las ratas de cada grupo fueron entrenadas para nadar hasta la plataforma sumergida. Las ratas recibieron seis ensayos de 60 segundos al dia durante cuatro dias consecutivos. Un ensayo comenzo colocando a la rata en el agua frente a la pared de la piscina, en uno de los cuatro lugares de inicio (norte, sur, este, oeste). La secuencia de ubicaciones iniciales se selecciono pseudoaleatoriamente, de modo que la ubicacion inicial de cualquier ensayo dado fue diferente de la del ensayo anterior, y no se uso ninguna ubicacion inicial mas de dos veces durante el entrenamiento diario. Se uso la misma secuencia de ubicaciones para todas las ratas en un dia dado, pero vario entre los dias. El ensayo termino cuando la rata hubo encontrado la plataforma, o a los 60 segundos, lo que ocurriera primero. Los ensayos fueron cronometrados con un cronometro. Si la rata encontraba la plataforma, se le dejaba permanecer allf durante 15 segundos antes de ser retirada a un recipiente de contencion. Si no encontraba la plataforma, la rata era guiada manualmente y colocada en la plataforma durante 15 segundos. El intervalo entre ensayos era de 60 segundos. El recipiente de contencion estaba cubierto para reducir al mfnimo cualquier interferencia entre ensayos. Al completar el ensayo diario para una rata, el animal era secado con una toalla y colocado bajo la lampara de calor en el recipiente de mantenimiento hasta que se secara. Se obtuvo el tiempo necesario para localizar la plataforma (latencia, segundos) para cada rata en cada ensayo de entrenamiento. Si la rata no encontraba la plataforma en un ensayo dado, su puntuacion de latencia era la duracion maxima de ese ensayo (60 segundos).
Tratamiento farmacologico
Tres dias despues de la finalizacion de la fase de adquisicion, se implantaron bombas mini-osmoticas (Alzet) por via subcutanea bajo anestesia con halotano) para dispensar el farmaco o el vehfculo de manera continua durante 1 o 3 semanas. Al completarse la infusion, se retiraron las bombas y se volvieron a suturar las heridas.
Los 5 grupos de tratamiento eran:
1. solucion salina, 1 semana (n era originalmente 7, pero se excluyo una rata que perdio peso rapidamente y mas tarde se encontro que tenia un tumor pituitario);
2. solucion salina, 3 semanas (n = 8);
3. baja dosis de G-2-MePE (0,96 mg/dfa), 1 semana (n = 8);
4. baja dosis de G-2-MePE (0,96 mg/dfa), 3 semana (n = 8);
5. alta dosis de G-2-MePE (4,8 mg/dfa), 3 semana (n = 7).
Las ratas de control de cuatro (n = 3) y ocho (n = 9) meses no recibieron tratamiento con farmaco. Las ratas de 12 meses de vida se asignaron a uno de los cinco grupos basandose en sus tiempos de natacion durante la adquisicion, de manera que los grupos eran aproximadamente equivalentes en su rendimiento medio antes de recibir cualquier farmaco.
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Fase de retencion (memoria de referencia)
Se ensayo la capacidad de las ratas para recordar o volver a aprender la ubicacion original de la plataforma cuatro semanas despues del entrenamiento original. Esto significa que el farmaco residual se habrfa retirado por lavado durante un mfnimo de 7 dfas en el caso de las bombas de 3 semanas y de 21 dfas en el caso de las bombas de 1 semana. El procedimiento de ensayo de retencion fue identico al de adquisicion. Los estudios farmacocineticos indican que la concentracion en plasma de G-2-MePE administrado por via subcutanea aumento hasta un pico y luego disminuyo con un patron cinetico aproximadamente de primer orden, con una semivida en plasma (t1/2) de entre aproximadamente 30 y 60 minutos. Por lo tanto, cuando se realizo el estudio de retencion, al menos 7 dfas despues de la retirada de las minibombas que contenfan G-2-MePE, casi todo el G-2-MePE se habfa eliminado de la circulacion de los animales.
Analisis de datos
Se registro la latencia de nado para cada rata para cada ensayo para cada dfa de las fases de adquisicion y retencion, y se examinaron los cambios entre las fases usando un analisis de varianza.
Se compararon el vehfculo de 3 semanas y la dosis alta de G-2-MePE de 3 semanas en la adquisicion y retencion. La dosis alta de G-2-MePE, administrada durante 3 semanas, mejoro la retencion de la tarea del laberinto acuatico original despues de un retraso de 4 semanas.
Resultados
La FIG. 17 muestra la comparacion entre las ratas envejecidas tratadas con una dosis alta (4,8 mg/dfa) de G-2- MePE y tratadas con dosis baja (0,96 mg/dfa) y las ratas envejecidas tratadas con solucion salina, con los controles de ratas jovenes (4 meses) usados como controles. Antes del tratamiento con G-2-MePE, no habfa diferencias entre los grupos de edad (12 meses). Por el contrario, los animales de 4 meses requerfan menos tiempo para llegar a la plataforma que los animales mas mayores. Despues de un perfodo de 3 semanas de ausencia de ensayo, durante el que se administro solucion salina o G-2-MePE, los animales que recibieron solucion salina solamente no mostraron una mejor capacidad para alcanzar la plataforma, como se indica en los tiempos similares requeridos el dfa 4 del ensayo de la fase de adquisicion y el dfa 1 del ensayo de la fase de retencion. Por el contrario, los animales que recibieron tratamiento con G-2-MePE a dosis alta o baja, habfan mejorado la memoria como se refleja en una disminucion en el tiempo necesario para llegar a la plataforma en comparacion con los controles tratados con solucion salina. Ademas, los animales tratados con G-2-MePE tuvieron un rendimiento similar al de los animales jovenes de 4 meses de vida (FIG. 17) y los animales de 8 meses de vida (datos no mostrados). Por lo tanto, los presentes inventores concluyen que G-2-MePE puede mejorar la memoria en las ratas de mediana edad que hayan demostrado anteriormente deficiencias de memoria en relacion con las ratas jovenes. Ademas, debido a que en el momento de volver a realizar el ensayo, el G-2-MePE se habfa lavado de la circulacion, se concluye que los efectos potenciadores de la memoria de G-2-MePE probablemente se debieron a la mejora en la funcion de las neuronas colinergicas.
Experimento 2: Ensayo del laberinto radial de 8 brazos
Cinco meses despues del experimento original, se volvieron a ensayar las ratas, que en ese momento tenfan 17 meses, para determinar la memoria de trabajo espacial en un laberinto de brazo radial.
Metodos
Aparatos
El aparato consiste en una plataforma central que se comunica con 8 brazos identicos, cada uno con una taza de comida al final del brazo.
Procedimiento de ensayo
Las ratas fueron parcialmente privadas de comida durante al menos 10 dfas antes y durante todo el procedimiento de laberinto radial.
Se monto el laberinto y se coloco de manera que el experimentador pudiera observar claramente el comportamiento de las ratas desde un lugar predeterminado. El experimentador numero los brazos del laberinto de acuerdo con su orientacion de uno a ocho en el sentido de las agujas del reloj.
Entrenamiento previo (previo al farmaco)
El primer dfa, se introdujeron las puertas en los brazos y se confino cada rata en la plataforma central con 20 microgranulos de alimento durante 5 minutos. Esto continuo una vez al dfa durante cuatro dfas, y se observo que
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todas las ratas consumfan algunos de los microgranulos. Al dfa siguiente, se permitio a las ratas que exploraran durante cinco minutos por todo el laberinto. Todos los brazos fueron cebados con dos microgranulos de comida en la copa de comida ubicada al final de cada brazo, y un microgranulo en la entrada y en la mitad de cada brazo. Esto se repitio durante al menos cinco, pero hasta ocho dfas para que las ratas que exploraran menos de los ocho brazos en dos sesiones consecutivas. Todas las ratas tuvieron una sesion final el noveno dfa de entrenamiento previo. En este momento, se decidio que una de las ratas viejas que solo habfa entrado en un brazo de los ocho los nueve dfas se debfa excluir de los futuros ensayos en este procedimiento. El resto de las ratas se incluyo independientemente de la cantidad de exploracion que realizaron en el entrenamiento previo. No hubo diferencias estadfsticamente significativas entre los grupos de ratas viejas en el numero de brazos en el que entraron en la sesion final de entrenamiento previo (Farmaco: F (2,31) = 0,44, p = 0,65).
Tratamiento farmacologico
30 dfas antes del ensayo (cinco dfas despues del entrenamiento previo), se implantaron en las 17 ratas macho Wistar de un mes de vida (bajo anestesia con halotano) bombas miniosmoticas subcutaneas (Alzet) para dispensar el farmaco de manera continua durante 3 semanas. Al completarse la infusion, se retiraron las bombas y se suturaron las heridas (se permitio el lavado de 9 dfas).
Los grupos de tratamiento fueron:
1. controles jovenes (4 meses), n = 6;
2. solucion salina, n = 10;
3. baja dosis de G-2-MePE (2,4mg/kg/dfa), n = 13;
4. alta dosis de G-2-MePE (12,4mg/kg/dfa), n=5.
Los grupos de solucion salina y de dosis baja se componen de todas las ratas que recibieron los tratamientos en la fase 1 de este experimento (cuando las ratas tenfan 12 meses) independientemente de si tenfan el tratamiento de una o de tres semanas. Se retiro una rata de cada uno de los grupos de solucion salina y dosis altas debido a tumores de piel. Una de las ratas de dosis baja no participo en este experimento debido al hecho de que no pudo ser entrenada previamente (vease mas adelante).
Ensayo (posterior al farmaco)
El ensayo de memoria de trabajo comenzo el noveno dfa de lavado. Las ratas recibieron 10 sesiones diarias de
entrenamiento durante 12 dfas. El procedimiento fue el mismo que para el entrenamiento previo, pero solo se
cebaron las tazas de comida. Las ratas tenfan 6 minutos para hacer hasta 16 elecciones de visita de cualquiera de los ocho brazos. Se consideraba eleccion el tener las cuatro patas dentro de un brazo. El experimentador registro la secuencia de las entradas en los brazos con papel y lapiz. Las sesiones se terminaron despues de que hubieran entrado en los ocho brazos, se hubieran realizado 16 elecciones o hubieran transcurrido 6 minutos. Se registro el tiempo necesario para entrar en los ocho brazos, cuando esto ocurrio.
Analisis de datos
Una eleccion de brazo se considero correcta cuando la rata entro en un brazo no visitado previamente. El rendimiento se clasifico diariamente de acuerdo con los siguientes parametros:
1) Eleccion Correcta (EC): 8-12 es el numero de elecciones correctas hechas dividido entre el numero total de
elecciones hechas. Para los animales que no visitaron los 8 brazos en un ensayo, se considera que el
denominador de esta proporcion es 12;
2) Eleccion Correcta de Trabajo (ECT): 8-12 es la medida a partir de la que se derivan los datos de la memoria de trabajo. Los datos se recogieron como se describe para la EC 8-12 anterior, pero para este parametro, solo se incluyeron las ratas que entraron en los 8 brazos en una sesion.
Las ratas que hicieron menos de 8 entradas de brazo no se usaron para determinar la memoria de trabajo, porque no podfan recordar que brazos habfan visitado anteriormente y, por lo tanto, tenfan la memoria tan danada que no podfan completar el ensayo, en oposicion con los animales que, por cualquier razon, no exploraron el laberinto.
Resultados
EC8-12: hubo una mejora general de todos los grupos a lo largo de los 10 dfas (F (9,324) = 4,01, p < 0,0001), pero no hubo efecto significativo de grupo (F (3,36) = 1,19, ns) ni interaccion entre Grupo y Dfas (F (27,324) = 1,05, ns) (datos no mostrados).
ECT8-12: La FIG. 18A muestra el perfil de adquisicion de acuerdo con la calificacion ECT8-12 a lo largo de los 10 dfas de ensayo. Hubo un efecto significativo de Grupo (F(3,12) = 4,27; p = 0,029) and Dfas (F(9,108) = 2,09, p = 0,036) , pero la interaccion entre estos factores no fue significativa (F (27,108 ) = 1,06, ns). El grupo de dosis alta de
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G-2Me-PE mostro la mayor mejora a lo largo de los dfas, seguido por los controles jovenes. Hubo muy poca diferencia entre la dosis baja de G-2Me-PE y la solucion salina.
La FIG. 18B muestra los resultados que indican que las ratas expuestas a la dosis mas alta de G-2-MePE (n = 5) habfan hecho entradas mas correctas para obtener los microgranulos de comida en comparacion con las ratas tratadas con vehfculo (* p < 0,05, n = 10). Los presentes inventores concluyen a partir de este estudio que G-2- MePE mejora la memoria espacial en ratas envejecidas.
Ejemplo de referencia 5: G-2-MePE aumenta la proliferacion de neuroblastos y reduce los astrocitosis en los cerebros de ratas envejecidas
Debido a que la degeneracion neuronal puede dar lugar a una reduccion del numero de neuronas, un objetivo terapeutico deseable es aumentar el numero de neuronas en el cerebro. Las neuronas se derivan de los neuroblastos, una celula menos diferenciada que una neurona, pero dentro del linaje neuronal. Por lo general, un neuroblasto se expone a condiciones que lo hacen madurar en un fenotipo maduro, teniendo un soma definido, procesos neuronales (axones y dendritas) y, en ultima instancia, haciendo conexiones con otras neuronas (por ejemplo, sinapsis). Por lo tanto, la medicion de la proliferacion neuroblastica se ha convertido en un marcador temprano bien conocido para la proliferacion de las celulas nerviosas. Asf pues, la deteccion de un aumento en la proliferacion neuroblastica inducida por un agente farmaceutico es un metodo aceptado para predecir el crecimiento de las celulas neuronales en animales. Debido a que las ratas y los seres humanos comparten mecanismos similares en la proliferacion de las celulas neuronales, la deteccion de cambios en la proliferacion neuroblastica en ratas in vivo es predictiva de efectos similares en seres humanos.
Tambien se sabe que un correlato histologico de la funcion cognitiva deteriorada es un aumento en el numero de celulas astrocfticas en el cerebro de los animales afectados. Por lo tanto, para determinar si G-2-MePE podrfa ser util en la estimulacion de la proliferacion neuroblastica y en el tratamiento de la astrocitosis, se llevo a cabo una serie de estudios en ratas envejecidas.
Metodos y materiales
Inmunohistoqufmica
Para llevar a cabo estos estudios, se fijaron e introdujeron los tejidos en parafina, y se obtuvieron cortes usando metodos convencionales. Se realizaron cortes coronales (6 pm) que contenfan el nivel del hipocampo y se montaron sobre portaobjetos recubiertos con alumbre de cromo para la tincion. Se desparafinaron los cortes en xileno, se deshidrataron en una serie de etanol y se incubaron en solucion salina tamponada con fosfato 0,1 M (PBS).
Se usaron anticuerpos primarios contra la protefna acida fibrilar glial (GFAP) y el antfgeno nuclear de celulas proliferantes (PCNA) para marcar las celulas gliales reactivas y las celulas sometidas a apoptosis y proliferacion, respectivamente. Para el desenmascaramiento del antfgeno (tincion con caspasa-3 y PCNA), se calentaron los cortes en tampon de citrato de sodio 10 mM (pH 6,0) durante 1 min a potencia elevada. Todos los cortes se pretrataron con H2O2 al 1 % en metanol al 50 % durante 30 min para detener la actividad de la peroxidasa endogena. Despues se aplico suero de caballo normal al 1,5 % o suero de oveja normal al 2,5 % en PBS durante 1 h a temperatura ambiente para bloquear la tincion inespecffica de fondo. A continuacion, se incubaron los cortes con los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpo anti-GFAP de raton monoclonal (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU. diluido 1:500); anticuerpo anti-PCNA de raton (DAKA, A/S, Dinamarca, diluido 1:100). Tras la incubacion con anticuerpos primarios a 4 °C durante 2 d (excepto para la tincion con PCNA, que se incubaron durante toda la noche), se incubaron los cortes con anticuerpo secundario de caballo anti-raton o anticuerpo secundario de cabra anti-conejo biotinilados (1:200, Sigma) a 4 °C durante la noche. Se aplico el ExtrAvidin™ (Sigma, 1:200), que se habfa preparado 1 h antes de su uso, durante 3 h a temperatura ambiente y despues se hizo reaccionar en 3,3- diaminobencidina (DAB) al 0,05 % y PBS para producir un producto de reaccion de color marron. Se deshidrataron los cortes en una serie de alcoholes hasta xileno y se cubrieron con un medio de montaje.
Se realizo tincion inmunohistoqufmica en muestras cerebrales tomadas de grupos de control y tratados con G-2- MePE de ratas jovenes (4 meses de vida), de mediana edad (9 meses) y envejecidas (18 meses).
Los cortes de control se procesaron de la misma manera a excepcion de la omision del anticuerpo primario de la solucion de incubacion. Se conto el numero de celulas positivas en PCNA en la zona subventricular y se puntuaron las celulas positivas en GFAP en la corteza cerebral.
Experimento 1: el G-2-MePE estimula la proliferacion neuroblastica en cerebros de ratas envejecidas
La zona subventricular (SVZ) y el giro dentado (DG) son dos regiones cerebrales que albergan la neurogenesis adulta. Se ha informado que la reduccion de la neurogenesis tanto en la SVZ como en la DG esta relacionada con la disminucion de la memoria con el envejecimiento, y los efectos del factor de crecimiento nervioso y el factor de crecimiento epidermico en la mejora de la memoria se deben al aumento de la proliferacion de progenitores de la
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SVZ. Usando PCNA como un marcador de la proliferacion celular, se examino la proliferacion celular en la SVZ mediante el recuento del numero de celulas que son positivas en PCNA. En los animales seleccionados, al menos algunas de las celulas proliferantes se identificaron como neuroblastos, pues se tineron con el agente especffico de las celulas neuronales, la doblecortina.
Se trataron ratas macho de 18 meses de vida por via intraperitoneal con una sola dosis de G2-MePE (dosis de 0, 0,012, 0,12, 1,2, 12 mg kg). Los cerebros se recogieron 3 dfas despues de los tratamientos y se realizo la tincion inmunohistoqufmica de PCNA y GFAP. Se conto el numero de celulas positivas en PCNA en la SVZ y despues se calculo la media del numero de celulas como celulas/mm dependiendo de la longitud de la pared del ventrfculo usada para el recuento (FIG. 19A). El grupo tratado con la dosis mas alta (12 mg/kg, n = 5) mostro un aumento significativo en el numero de celulas positivas en PCNA en comparacion con el grupo tratado con vehfculo (*p < 0,05, n = 7). Los datos indicaron un efecto dependiente de la dosis de G-2PE en la mejora de la neurogenesis.
El marcaje doble de fluorescencia indico la ubicacion conjunta de PCNA y la doblecortina, un marcador de neuroblastos. La FIG. 19B es una fotograffa de una parte del cerebro de una rata que muestra un aumento en PCNA (verde, x 20) y doblecortina (rojo, x 20) en la rata tratada con la dosis mas alta de G-2-MePE (panel derecho) en comparacion con rata tratada con vehfculo (panel izquierdo). Los dos marcadores se situaron conjuntamente de manera clara (FIG. 19B, foto, x 100). Los presentes inventores concluyen que G-2-MePE puede estimular la proliferacion de las celulas cerebrales, incluyendo los neuroblastos. Debido a que los neuroblastos son celulas precursoras de neuronas, se concluye ademas que G-2-MePE puede aumentar la poblacion de neuronas en los cerebros de los animales tratados con el compuesto de la presente invencion.
Experimento 2: el G-2-MePE estimula la proliferacion neuroblastica en la SVZ de cerebros de ratas de mediana edad
Se estudiaron los efectos de G-2-MePE (1,2 mg/kg) en un grupo de ratas de mediana edad de 9 meses de vida. Se administro G-2-ePE (1,2 mg/kg) o vehfculo por via intraperitoneal (i.p.). Se examino la proliferacion de celulas en la SVZ 3 dfas despues del tratamiento usando tincion inmunohistoqufmica con PCNA. La FIG. 19C muestra un aumento significativo del numero de celulas positivas en PCNA despues del tratamiento de G-2-MePE (**p < 0,005, n = 4). Debido a que algunas de las celulas proliferantes tenidas con PCNA se identificaron como neuroblastos (vease el Experimento 1 anterior), los presentes inventores concluyen que G-2-MePE puede estimular la proliferacion neuroblastica en cerebros de rata de mediana edad.
Experimento 3: Astrocitosis en el envejecimiento de los cerebros
La creciente evidencia sugiere que la disfuncion de los astrocitos en edad avanzada puede desencadenar la inflamacion, lo que conduce a una mayor degeneracion neuronal. Se ha informado mucho de la regulacion positiva de los astrocitos activados, y esta estrechamente asociada con la disminucion de la memoria con el envejecimiento, tal vez a traves de la depresion de la neurogenesis endogena.
Usando GFAP como marcador de astrocitos reactivos, se conto el numero de celulas positivas en GFAP en la subregion CA4 del hipocampo de ratas envejecidas tratadas con G-2MeP o vehfculo. Se encontro un aumento significativo en los astrocitos reactivos en el hipocampo de animales de envejecidos (Figura 20A), y en la corteza cerebral. Algunos de los astrocitos se asociaron con capilares (Figura 20B foto, flechas) en ratas envejecidas en comparacion con ratas jovenes (*p < 0,01) y de mediana edad (*# p < 0,01).
Como parte del componente vascular, los astrocitos positivos en GFAP tambien desempenan un papel en la angiogenesis (FIG. 20B, flechas), que tambien contribuyen a la respuesta inflamatoria en los cerebros. Por lo tanto, los astrocitos GFAP elevados observados en cerebros envejecidos pueden indicar una etapa cronica de degeneracion cerebral.
Experimento 4: G-2-MePE reduce la astrocitosis en los cerebros envejecidos
Tambien se evaluaron los efectos de G-2-MePE en la astrocitosis en la subregion CA4 del hipocampo en ratas envejecidas. Se asignaron ratas Wistar macho de 18 meses de vida a los 5 grupos de tratamiento siguientes: vehfculo, 0,12 mg/kg/dfa, 0,12, 1,2 y 12 mg/kg/dfa (cada uno n = 6).
Se contaron las celulas positivas en GFAP usando un programa computarizado (Discovery 1). Los resultados se muestran en las FIG. 20C y 20D. Se administro G-2-MePE por via intraperitoneal y se evaluo el numero de celulas positivas en GFAP 3 dfas despues de la inyeccion. Usando un sistema de puntuacion visual (0 = sin astrocitos, 1 = pocos astrocitos, 2 < 50 %, 3 > 50 %), se estimo el numero de astrocitos en 5 regiones corticales diferentes.
El tratamiento con G-2-MePE redujo el numero de astrocitos reactivos en la region CA4 del hipocampo en comparacion con el grupo tratado con vehfculo (FIG. 20C; *p < 0,05), en particular, los grupos tratados con dosis de 0,12 y 12 mg/kg. Se observo un efecto similar para G-2-MePE en la corteza cerebral (FIG. 20D).
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Normalmente, hay pocos astrocitos positivos en GFAP situados en la capa profunda de la corteza de los cerebros de rata, y los que hay, por lo general, estan en estrecha asociacion con las pistas de materia blanca. Sin embargo, los presentes inventores han encontrado que habfa celulas positivas en GFAP en la capa media de la corteza, estrechamente asociada con los vasos sangufneos.
Los resultados de los estudios presentados en el presente documento indican que el envejecimiento se asocia con varios cambios en el cerebro. En primer lugar, hay una perdida dependiente de la edad de la memoria y de la funcion cognitiva. En segundo lugar, hay un aumento dependiente de la edad de los astrocitos. Todos estos hallazgos en la rata son consecuentes entre si y con las funciones conocidas de los nervios colinergicos en el mantenimiento de la funcion cognitiva y la memoria en animales de experimentacion y en seres humanos.
Inesperadamente, los presentes inventores encontraron que un analogo de GPE, el G-2-MePE, administrado a animales envejecidos revierte al menos parcialmente todos los cambios anteriores asociados con la edad. En primer lugar, G-2-MePE aumenta la cantidad de ChAT presente en las celulas cerebrales de los animales expuestos a las neurotoxinas acido okadaico o 3-NP. Este efecto de G-2-MePE imito el de un agente neuroprotector bien conocido, el GPE. Estos efectos se observaron en celulas corticales, celulas cerebelosas y en celulas estriadas, lo que indica que los efectos se generalizaron en diferentes partes del cerebro. En segundo lugar, G-2-MePE aumento ChAT en el estriado, lo que indica que las neuronas colinergicas son sensibles a G-2-MePE. Estos cambios qufmicos e histologicos observados fueron paralelos a cambios en el comportamiento. Los animales envejecidos tratados con G-2-MePE presentaron una mejora en la memoria en dos sistemas de ensayo bien conocidos en comparacion con los controles tratados con vehfculo. A continuacion, G-2-MePE indujo la proliferacion neuroblastica en cerebros envejecidos. Por ultimo, el tratamiento con G-2-MePE invirtio el aumento de los astrocitosis observado en el hipocampo y en la corteza de los cerebros envejecidos. Los efectos de G-2-MePE no se debieron a los efectos agudos del agente; porque en muchos de los estudios citados en el presente documento, habfa transcurrido suficiente tiempo desde el cese de la administracion del farmaco hasta el ensayo, siendo probable que hubiera poco o ningun farmaco presente.
Ejemplo de referencia 6: Comparacion de la farmacocinetica de GPE y G-2-MePE
El fin de estos estudios era comparar los perfiles farmacocineticos de GPE y G-2-MePE en animales in vivo usando metodos farmacocineticos convencionales.
Metodos
Para determinar la farmacocinetica de GPE y G2MePE, se usaron ratas Wistar macho adultas que pesaban entre 180 y 240 g. Para facilitar las inyecciones intravenosas en bolo y el muestreo de sangre, se implantaron en todas las ratas quirurgicamente una canula venosa yugular permanente bajo anestesia con halotano tres dfas antes del experimento. A los grupos de seis ratas, se les administro una sola inyeccion intravenosa en bolo de 30 mg/kg de GPE o 10 mg/kg de G2MePE disueltos en tampon succinato 0,1 M (pH 6,5). Se recogieron muestras de sangre (aproximadamente 220 pl de cada una) en tubos heparinizados que conteman coctel de inhibidor de proteasa Sigma para tejidos de mamffero a los 10 y 0 minutos antes de la inyeccion de GPE o G2MePE, y 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 y 128 min despues de la inyeccion de GPE o G2MePE. Las muestras se centrifugaron a 3.000 g durante 1 5 min a 4 °C y se retiro el plasma y se almaceno a -80 °C hasta su extraccion y ensayo mediante radioinmunoensayo (RIA) o HPLC de fase inversa. Los metodos de RIA y HPLC usados fueron convencionales.
La eliminacion de farmacos despues de una sola inyeccion en bolo intravenoso resulto ser un proceso de primer orden siguiendo la ecuacion C = Cce'kt, donde C representa la concentracion de farmaco en cualquier punto de tiempo, C0 es la concentracion cuando el tiempo (t) es igual a cero y k es la constante de velocidad de primer orden expresada en unidades de concentracion por hora. Se calcularon la k y la semivida (t1/2) a partir de la pendiente de la lfnea de regresion lineal en la fase de eliminacion del diagrama semilogarftmico de la concentracion en plasma frente al tiempo como: Log C = -kt/2,3 + log C0. Los resultados se expresaron como la media ± error tfpico.
Resultados
La FIG. 21 muestra un grafico de las concentraciones en plasma in vivo de GPE y G-2-MePE despues de la inyeccion intravenosa (i.v.). Los cuadrados rellenos representan concentraciones de gPe en cada punto de tiempo, y los triangulos rellenos representan concentraciones de G-2-MePE en cada punto de tiempo.
Las concentraciones en plasma de GPE y G-2-MePE se aumentaron notablemente en 1 minuto despues de la inyeccion. Despues de la inyeccion de 30 mg kg de GPE, se observo una concentracion maxima de 40,0 ± 10,8 mg/ml. Las concentraciones en plasma de GPE disminuyeron luego rapidamente de acuerdo con un proceso cinetico de primer orden. Se encontro que la constante de velocidad de primer orden para GPE era de 0,15 ± 0,014 ng/ml/min, se encontro que t1/2 era 4,95 ± 0,43 min y se encontro que la eliminacion estimada de GPE del plasma era de 137,5 ± 12,3 ml/hora.
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Tras la inyeccion de 10 mg/kg de G-2-MePE, se encontro que la concentracion maxima era de 191 ± 16,1 mg/ml. Las concentraciones en plasma de G-2-MePE se redujeron luego de acuerdo con un proceso cinetico de primer orden. Se encontro que la constante de velocidad de primer orden para G-2-MePE era de 0,033 ± 0,001 ng/ml/min, se encontro que t1/2 era de 20,7 ± 0,35 min y la eliminacion estimada era de 30,1 ± 0,5 ml/h.
Tras la inyeccion, la concentracion en plasma maxima de G-2-MePE era aproximadamente 4,8 veces mayor que la concentracion en plasma maxima de GPE, a pesar de la mayor dosis de GPE suministrada (30 mg/kg) en comparacion con la dosis de G-2-MePE administrada (10 mg/kg).
El hallazgo de mayores concentraciones en plasma de G-2-MePE que de GPE en todos los puntos temporales inferiores a 125 minutos, a pesar de una menor dosis administrada de G-2-MePE, fue totalmente inesperado basandose en las concentraciones en plasma conocidas de GPE. t1/2 para G-2-MePE fue mas de 4 veces superior que 11/2 para GPE.
El hallazgo de un aumento de la semivida de G-2-MePE en comparacion con el de GPE fue completamente inesperado basandose en la t1/2 de GPE. El aumento de t1/2 de G-2-MePE significa que el G-2-MePE se elimina mas lentamente de la circulacion. Este hallazgo es totalmente inesperado basandose en la tasa de eliminacion de GPE..
Los presentes inventores concluyen de estos estudios que G-2-MePE es un potente agente capaz de revertir muchos de los efectos adversos del envejecimiento en el cerebro de los animales, incluyendo los seres humanos. Por lo tanto, los analogos de GPE, incluyendo el G-2-MePE, pueden producir efectos terapeuticos deseables, incluyendo neuroproteccion, mejora de la memoria, aumento de la proliferacion neuroblastica y reduccion de la astrocitosis, y pueden ser valiosos para revertir o mitigar los efectos adversos del envejecimiento en seres humanos.
Aunque la presente invencion se ha descrito en terminos de ciertas realizaciones preferidas, sera evidente para el experto habitual en la materia teniendo en cuenta ese conocimiento y la presente divulgacion que se pueden preparar y administrar equivalentes del compuesto de la presente invencion para las condiciones descritas en la presente solicitud, y que todos estos equivalentes pretenden estar incluidos dentro de las reivindicaciones de la presente solicitud.
Ejemplo de referencia 7: Tratamiento del sfndrome de Rett I
Modelo de los efectos de G-2-MePE sobre el tiempo de vida y la potenciacion a largo plazo en el sfndrome de Rett (RTT)
Para determinar si el tratamiento con G-2-MePE puede afectar el desarrollo y a la progresion del Sfndrome de Rett en un modelo murino del trastorno, se usaron ratones hemicigoticos MeCP2(1lox) macho. El sistema de raton con desactivacion de MeCP2 (MeCP2-KO) es ampliamente aceptado en la tecnica, pues imita estrechamente el intervalo y la gravedad de las anomalfas fisiologicas y neurologicas caracterfsticas del trastorno humano, el sfndrome de Rett.
Todos los experimentos se realizaron en el Centro Medico Southwestern de la Universidad de Texas, y fueron aprobados por el Comite de Cuidado y Uso de Animales del Centro Medico Southwestern de la Universidad de Texas. G-2-MePE fue sintetizado por Albany Molecular Research Inc. (Albany, NY) y suministrado por Neuren Pharmaceuticals Limited.
Metodos
Tratamiento
Se trataron ratones machos hemicigoticos MeCP2 (1lox) con 20 mg/kg/dfa de G-2-MePE o solucion salina, (BSA al 0,01 %, n = 15 por grupo en el experimento de supervivencia y n = 20 en el experimento de LTP). Los tratamientos se administraron por via intraperitoneal a partir de las 4 semanas despues del nacimiento. Para los experimentos de supervivencia, el tratamiento se mantuvo a lo largo del experimento. Para el experimento de LTP, los ratones se trataron hasta la semana 9, cuando se usaron para la preparacion de los cortes.
Supervivencia
Los ratones mutantes deficiente en MeCP2 desarrollan sfntomas de RTT a las 4-6 semanas de vida y mueren entre 10-12 semanas (Chen et al., 2001. Nat Genet 27: 327-331). Se comparo la supervivencia de los controles de tipo silvestre y los animales deficientes en MeCP2 en los grupos tratados con vehfculo y con G-2-MePE. La supervivencia se midio semanalmente desde el inicio del tratamiento (4 semanas), y se uso para producir curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para mostrar la proporcion de ratones que sobrevivieron (eje y) en cada intervalo semanal (eje x) (vease la FIG. 22).
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Potenciacion a largo plazo (electrofisiologfa)
Se ha informado anteriormente que los ratones deficientes en MeCP2 padecen disfuncion sinaptica funcional y ultraestructural, deterioro significativo de la memoria dependiente del hipocampo y potenciacion a largo plazo del hipocampo (LTP) (Ivloretti et al., The Journal of Neuroscience. 2006, 26(1):319-327). Para ensayar los efectos del tratamiento con G-2-MePE sobre la funcion sinaptica en el modelo de RTT, se comparo el LTP del hipocampo en animales tratados con vehfculo y con G-2-MeP a las 9 semanas de vida. Para ello, se midio la pendiente de fEPSP como un % del potencial inicial en las neuronas en cortes de hipocampo de ratones deficientes en MeCP2 tratados con solucion salina o G-2-MePE (FIG. 23).
Resultados
La FIG. 22 muestra que el tratamiento con G-2-MePE aumento la supervivencia de los ratones deficientes en MeCP2. Los ratones de tipo silvestre (lfnea superior) son animales de control y, por tanto, su supervivencia fue del 100 % en cada punto de tiempo. Los ratones deficientes en MeCP2 tratados con solucion salina solo murieron mucho mas rapidamente (lfnea punteada) que los ratones de tipo silvestre, de manera que, en aproximadamente 11 semanas, solo sobrevivio el 50 % de los ratones deficientes en MeCP. Sin embargo, en sorprendente contraste, los presentes inventores encontraron inesperadamente que los ratones deficientes en MeCP2 tratados con G-2-MePE sobrevivieron sustancialmente mas tiempo que los ratones tratados con solucion salina. A las aproximadamente 15 semanas, el 50 % de los animales sobrevivio. Los datos presentados inicialmente mostraron que los ratones con MeCP2 se vieron afectados en terminos de supervivencia de manera que el 50 por ciento de los animales murio en 11 semanas en el caso de los no tratados. Los animales tratados con G-2-MePE mostraron una mejor supervivencia, y el 50 % murio a las 16 semanas. En este estudio, los datos de longevidad se vieron comprometidos por procedimientos veterinarios incoherentes, tales como el no limar los dientes de los ratones de forma sistematica - un requisito en los ratones mecp2 sin reconocer al inicio del experimento. Una consecuencia fue la observacion de muertes tempranas de los animales no relacionadas con el sfndrome de Rett (particularmente en el grupo de control). El nuevo examen de los datos demostro que el efecto del G-2-MePE persistio cuando se volvio a reanudar el grupo de control, aunque la diferencia en los grupos fue menor (tiempo hasta el 50 por ciento de mortalidad 13,5 semanas en los controles, 16 semanas en el animales tratados con G-2-MePE). No se plantearon problemas de seguridad con el tratamiento con G-2-MePE de los ratones mecp2.
Estos resultados demostraron que G-2-MePE puede aumentar sustancialmente la supervivencia de los ratones deficientes en MeCP2. Debido a que los ratones deficientes en MeCP2 son predictivos de la patologfa y la eficacia terapeutica en seres humanos con sfndrome de Rett, los presentes inventores concluyen que G-2-MePE puede aumentar la vida de los seres humanos con sfndrome de Rett.
La FIG. 23 muestra los resultados de nuestros estudios para determinar si el tratamiento con G-2-MePE aumento la potenciacion a largo plazo del hipocampo (LTP) medida por la pendiente de fEPSP en animales deficientes en MeCP2 en comparacion con los ratones mutantes tratados con solucion salina. Como se muestra en la FIG. 23, los presentes inventores encontraron inesperadamente que G-2-MePE aumento la pendiente de fESPS en los ratones deficientes en MeCP2 en comparacion con los animales tratados solo con solucion salina.
Estos resultados demostraron que G-2-MePE puede ser eficaz en el tratamiento de los ratones deficientes en MeCP2 in vivo. Debido a que los ratones deficientes en MeCP2 son predictivos de la patologfa y la eficacia terapeutica en seres humanos con el sfndrome de Rett, los presentes inventores concluyen que G-2-MePE puede ser un tratamiento eficaz para las personas con sfndrome de Rett.
Ejemplo de referencia 8: G-2-MePE mejora la arborizacion dendrftica y aumenta la longitud de la espina dendrftica
Se evaluaron los efectos del tratamiento con G-2-MePE en las dendritas. Se administro a ratones transgenicos con desactivacion de mecp2 (n = 15 a 20) se G-2-MePE por via intraperitoneal a una dosis de 20 mg/kg una vez al dfa. Tras el sacrificio, se examinaron la densidad de la espina dendrftica, la longitud de la espina y la arborizacion despues de la tincion de Golgi tras nueve semanas, segun la siguiente Tabla 1:
Tabla 1: Tamano de la muestra para todos los analisis morfologicos de las neuronas y de la espina
MACHO
Analisis EDAD Tamano de muestra (n.° de Tamano de muestra (numero medio de
(Semanas) ratones) neuronas o dendritas por animal)
KO-vehfculo KO-NNZ-G- KO-vehfculo KO-NNZ-
2MePE G- 2MePE
Morfologfa de las neuronas
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Analisis de espina
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Se evaluo la longitud dendrftica por la distancia del soma de las neuronas CA1 del hipocampo representativas de ratones mutantes nulos para mecp2 macho de 9 semanas tratados con solucion salina (3 neuronas analizadas de 3 ratones separados, n = 9) o G-2-MePE (20 mg/kg i.p. 1/dfa, a partir de la semana 4, 3 neuronas analizadas de 3 ratones separados, n = 9).
Se observo que G-2-MePE mejoro la arborizacion dendrftica y aumento la longitud de la espina dendrftica. La FIG. 24 muestra los resultados de este estudio. La longitud dendrftica en pm (eje vertical) se representa en funcion de la distancia (en pm, eje horizontal) del soma de las celulas. Para las celulas con dendritas cerca de los somas, las dendritas eran cortas. Sin embargo, a medida que la distancia de los somas aumento, el tratamiento salino (cuadrados vados) produjo longitudes dendnticas que aumentaron hasta un maximo a una distancia de 70 pm del soma y disminuyeron a distancias mas alejadas de los somas. Por el contrario, el tratamiento con G-2MePE (cuadrados rellenos) produjo dendritas mas largas en gran parte del intervalo de distancias de los somas.
Ejemplo de referencia 9: Tratamiento del sfndrome de Rett en ratones II
Acoplamiento de los ratones y genotipificacion
Se usan los ratones de alelo nulo de la lfnea germinal MeCP2 (Chen et al., 2001). La genotipificacion se realiza como en Chen et al. (Chen et al., 2001).
Tratamiento con G-2-MePE
Para las mediciones de la supervivencia, el analisis de actividad nocturna y el analisis de inmunotransferencia, se administro G-2-MePE (sintetizado por Albany Molecular Research Inc. (Albany, NY) y suministrado por Neuren Pharmaceuticals Limited) diariamente a traves de inyecciones intraperitoneales (20 mg/kg, vehfculo = solucion salina, BSA al 0,01 %). El tratamiento comienza en P15 y se mantiene a lo largo de los experimentos. Para los experimentos de fisiologfa intracelular, se inyectan diariamente a los ratones G-2-MePE (20 mg/kg de peso corporal, vehfculo = solucion salina, BSA al 0,01 %) durante 2 semanas, de P15 a P28-P32 cuando se usan para preparacion aguda de cortes. Para los experimentos de formacion de imagenes opticas, se inyectan a los ratones G-2-MePE (20 mg/kg de peso corporal, vehfculo = solucion salina, BSA al 0,01 %) diariamente desde el dfa de la sutura del parpado hasta el dfa de la formacion de imagenes.
Preparacion de fisiologfa de los cortes
Se realizan cortes coronales (300 pm de grosor) en o cerca de la corteza sensoriomotora en ACSF a < 4 °C usando un Vibratome. Se incuban los cortes a 37 °C durante 20 minutos despues de cortarlos y a temperatura ambiente durante el resto del experimento. Se transfieren los cortes a una camara de Warner y se toman grabaciones de neuronas piramidales identificadas visualmente situadas en la capa 5. Se ajusta lfquido cefalorraqufdeo cerebral artificial (ACSF) que contiene NaCl 126 mM, NaHCO3 25 mM, NaHPO4 1 mM, KCL 3 mM, MgSO4 2 mM, CaCl2 2 mM y dextrosa 14 mM, a 315-320 mOsm, y pH 7,4 y se burbujea con O2 al 95 %/CO2 al 5 %. La solucion de pipeta intracelular contenfa gluconato de potasio 100 mM, KCl 20 mM, HEPES 10 mM, MgATP 4 mM, NaGTP 0,3 mM y Na-fosfocreatina 10 mM.
Grabaciones intracelulares de celulas enteras
Se extraen pipetas de borosilicato (3-5 MQ, WPI) con un extractor Sutter P-80 (Sutter Instruments). Las celulas se visualizan con una lente de inmersion en agua Achroplan x40 con optica DIC de infrarrojos (Zeiss) y se detectan con una camara de infrarrojos (Hamamatsu) que se proyecta hacia un monitor de video. Los experimentos se realizan mediante un software de adquisicion personalizada y de analisis en tiempo real creado en Matlab (Mathworks, Natick, Mass.) usando un amplificador Multiclamp 700B (Axon Instruments) conectado a un bloque conector BNC- 2110 y a una tarjeta de adquisicion de canal dual de serie M (National Instruments). Se realiza el gigasello y la ruptura, y las grabaciones de celulas enteras se verifican de manera continua para los bajos niveles de fugas y la resistencia en serie. Para cada grabacion, se aplica un impulso de ensayo de 5 mV en la pinza de tension ~10 veces para medir la entrada y la resistencia en serie. A continuacion, se aplican en la pinza de corriente ~10 impulsos (500 ms, 40-140 pA a 10 pA) para cuantificar las tasas de disparo suscitadas y la excitabilidad celular. Se verifica que la resistencia de acceso, la fuga y la excitabilidad intrfnseca celular son uniformes entre los grupos. Por ultimo, se muestrean las EPSC espontaneas bajo la pinza de tension a -60 mV a 10 kHz y se filtra a paso bajo a 1 kHz. El analisis se realiza usando un paquete de software personalizado creado en Matlab, con todos los eventos detectados de acuerdo a umbrales automatizados y verificados de forma oculta para cada evento individualmente por el experimentador.
Tincion de Golgi
Se fijan muestras (<1 cm) de ratones P28 en formalina al 10 % y bicromato de potasio al 3 % durante 24 horas. A continuacion, se transfiere el tejido a nitrato de plata al 2 % durante 2 dfas a oscuras a temperatura ambiente. Se realizan cortes de estas muestras de 50 pm de espesor en agua destilada. Se montan cortes correspondientes a la
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corteza motora sobre portaobjetos, se secan al aire durante 10 minutos y luego se deshidratan mediante lavados secuenciales de alcohol al 95 %, alcohol al 100 % y xileno, y luego se sellan con un cubreobjetos. Se adquirieron imagenes a 10 aumentos (celula entera) y 100 aumentos (imagen de la espina) usando un microscopio confocal Zeiss Pascal 5 Exciter.
Formacion de imagenes opticas de senales intrfnsecas
Para este experimento, se usan hembras adultas (>P60) de tipo silvestre (SVEV o BL6) y mutantes MeCP2 (+/-) (BL6). El grupo de control de tipo silvestre se compone de dos hembras de la misma de camada de tipo silvestre MeCP2 +/- o hembras SVEV de la misma edad de tipo silvestre. Para la privacion monocular, los animales se anestesian con Avertin (0,016 ml/g) y se suturan los parpados de un ojo durante 4 dfas. Antes de la formacion de imagenes, se retira la sutura y se vuelve a abrir el ojo privado. Solo se usan los animales en los que las suturas de privacion estan intactas y el estado del ojo privado parece sano para la sesion de formacion de imagenes. Para la activacion de la senalizacion de G-2-MePE, se inyecta por via intraperitoneal (IP) una solucion que contiene G-2- MePE durante todo el perfodo de privacion. Para las sesiones de formacion de imagenes, se anestesian los ratones con uretano (0,5 g/kg; el 20 % de la dosis completa se administra IP cada 20-30 minutos hasta la dosis final; tambien se inyectan 0,02 ml de cloroproxixeno al 1 % junto con la primera administracion). Se deja el craneo al descubierto y se pega una placa hecha a medida en la cabeza para minimizar el movimiento. Se adelgaza el craneo sobre VI con un taladro de dremel y se cubre con una solucion de agarosa en solucion salina (1,5 %) y un cubreobjetos de vidrio. Durante la sesion de formacion de imagenes, el animal esta constantemente oxigenado, su temperatura se mantiene con una manta calefactora y los ojos se tratan periodicamente con aceite de silicona; las condiciones fisiologicas se controlan de manera constante. Se coloca el raton anestesiado delante de un monitor que muestra un estfmulo periodico presentado a cualquier ojo, monocularmente; el estfmulo consistfa en una barra blanca vertical u horizontal de deriva de dimensiones 9° x 72°, que se desvfa a 9 s/ciclo, sobre un fondo uniformemente gris. Se ilumina la superficie del craneo con una luz roja (630 nm), y se captura el cambio de luminancia con una camara CCD (Cascade 512B, Roper Scientific) a una velocidad de 15 fotogramas/s durante cada sesion de estfmulo de 25 minutos. Se emplea un filtro de paso alto temporal (135 fotogramas) para eliminar el ruido de la senal lenta, despues de lo que la senal es procesada por ordenador para extraer, en cada pixel, la componente de Transformada Rapida de Fourier (FFT) temporal correspondiente a la frecuencia del estfmulo. Se usa la amplitud de FFT para medir la fuerza de la respuesta visual suscitada en cada ojo. El fndice de dominancia ocular se deriva de la respuesta de cada ojo (R) en cada pixel como ODI = (Rcontra - Ripsi)/(Rcontra + Ripsi). La zona binocular se define como la region activada por la estimulacion del ojo ipsilateral al hemisferio fotografiado.
Mediciones del ritmo cardiaco
Se mide la frecuencia cardiaca en tiempo real usando un sensor de pinza de cola (Mouse OX Oximeter - Oakmont, PA). Los ratones no se anestesian, sino que se limitan ffsicamente en un tubo de plastico abierto ajustado. Antes de la sesion de grabacion, se coloca el tubo durante la noche en las jaulas en las que se alojan los animales de experimentacion para permitir la habituacion. La temperatura corporal se mantiene a ~28-29 °C (~82-84 °F) durante todo el tiempo de grabacion. Se registraron 3 ensayos de 15 minutos para cada raton, los ratones tienen 8 semanas de vida y se trataron con vehfculo o G-2-MePE de P15.
Mediciones de la actividad nocturna
Se mide la actividad motora espontanea usando una camara de monitorizacion del movimiento activada por haz de infrarrojo (Opto-Varimax-MiniA, Columbus Instruments, Columbus, Ohio). Para cada experimento, se coloca un raton en la camara al menos 3 h antes de iniciarse las grabaciones. El movimiento se controla durante el ciclo normal de oscuridad de 12 h (7 p.m. a 7 a.m.). Se recoge un ciclo de oscuridad por animal y por punto de tiempo.
Resultados
Para ensayar si el tratamiento con G-2-MePE afectara al desarrollo de las caracterfsticas cardinales de la enfermedad de RTT, se administraron los animales mutantes de 2 semanas inyecciones intraperitoneales diarias en el transcurso de su vida. Las mediciones de la fisiologfa sinaptica, la composicion molecular sinaptica y la plasticidad cortical se adquieren como se detalla a continuacion, junto con mediciones relacionadas con la salud tales como la frecuencia cardiaca, los niveles de actividad locomotora y la esperanza de vida.
Efectos de G-2-MePE sobre la fisiologfa sinaptica de los ratones mutantes MeCP2
Estudios recientes han informado de que las neuronas a traves de multiples regiones cerebrales de ratones MeCP2- /y muestran una profunda reduccion en la actividad espontanea (Chang et al., 2006; Chao et al., 2007; Dani et al., 2005; Nelson et al., 2006), un fenotipo que es rescatado por la sobrexpresion de BDNF (Chang et al., 2006). De forma similar, se ha demostrado que la aplicacion aguda de un derivado de IGF1 eleva las amplitudes de la corriente postsinaptica excitadora suscitada (EPSC) en un 40 % en cultivos de hipocampo de rata (Ramsey et al., 2005; Xing et al., 2007). Para probar la eficacia de G-2-MePE en el rescate del fenotipo fisiologico MeCP2-/y, se adquirieron grabaciones de celulas enteras intracelulares en cortes cerebrales agudos, midiendo el impulso sinaptico excitatorio
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(amplitud y frecuencia EPSC espontanea) en las neuronas corticales de la capa 5. En este caso, las EPSC registradas de animales -/y son significativamente reducidas en amplitud en comparacion con las EPSC medidas en animales de tipo silvestre. La tendencia se invierte parcialmente en las EPSC registradas de animales MeCP2-/y tratados con G-2-MePE, que son significativamente mayores en amplitud que las EPSC de ratones MeCP2-/y tratados con vehfculo. Estas diferencias tambien se observan al calcular la media entre celulas. A lo largo de estas mediciones, tambien se verifica que la resistencia de acceso, la fuga y la excitabilidad intrfnseca celular son uniformes entre los grupos. La cuantificacion de los intervalos de EPSC tambien muestra un ligero aumento en el intervalo entre los eventos de EPSC (reduccion de la frecuencia de EPSC) entre animales de tipo silvestre y MeCP2- /y (P = 0,04, prueba de Kolmogorov-Smirnov). Los presentes hallazgos indican que la reduccion del impulso sinaptico excitatorio en celulas corticales de ratones MeCP2-/y su rescate parcial despues del tratamiento con G-2- MePE se deben, en parte, a un cambio en la amplitud de EPSC como consecuencia de un cambio en la fuerza de las sinapsis que median en la transmision excitatoria en esta region.
El tratamiento con G-2-MePE estimula la maduracion de la espina cortical
Se uso la tincion de Golgi para marcar las neuronas escasamente y de forma distinta, y se aplicaron imagenes confocales de alta resolucion para medir la densidad y la morfologfa de la espina dendrftica en las celulas marcadas, restringiendo el analisis a las neuronas piramidales de la capa 5 en cortes de corteza motora de ratones del perfodo crftico (P28).
Aunque la imagen de baja amplificacion delimita claramente la extension de las dendritas de las celulas piramidales, Se usaron mayores aumentos para el recuento de los contactos sinapticos y determinar la clase morfologica de cada espina. Las espinas se clasificaron como grandes y bulbosas ("champinon", M), cortas y gruesas ("regordeta", S), cortas y finas ("delgada", T) o filopodias (F). La comparacion de la densidad de espinas por rama unitaria muestra una tendencia a disminuir la densidad de la espina en las neuronas con desactivacion que se ha mejorado en gran medida en la desactivacion con tratamiento.
En conjunto, estos resultados indican el potencial de deficiencias en el numero y en el estado de maduracion de los contactos dendrfticos en la desactivacion para sostener defectos funcionales en la transmision excitatoria, de una manera que se puede tratar despues de la administracion de G-2-MePE.
La plasticidad de dominancia ocular (OD) en ratones adultos MeCP2+/- se reduce mediante G-2-MePE
Los cambios en el desarrollo de la plasticidad OD se controlan, en parte, por la activacion de la via de IGF-1, y la administracion de (1-3)IGF-1 puede reducir la plasticidad OD en ratones jovenes de tipo silvestre (Tropea et al., 2006). Por lo tanto, se ensayo si el tratamiento con G-2-MePE podrfa estabilizar la plasticidad OD prolongada observada en adultos mutantes MeCP2. Se privan monocularmente ratones MeCP2+/- hembras, de edad P60 o mayores, durante 4 dfas y se tratan simultaneamente con G-2-MePE. El tratamiento con G-2-MePE reduce la plasticidad OD en los ratones adultos Mecp2 +/-, lo que indica que G-2-MePE puede inducir rapidamente la estabilizacion o maduracion de la sinapsis.
La bradicardia en ratones MeCP2-/y se trata por G-2-MePE.
Ademas de examinar la eficacia de G-2-MePE en la mejorfa de los sfntomas neurofisiologicos, se busco caracterizar sus efectos sobre la salud general del organismo. La evidencia clfnica y experimental muestra disfunciones del sistema autonomico tales como los ritmos respiratorios labiles y la reduccion del tono vagal cardiaco basal en pacientes con sfndrome de Rett (Julu et al., 2001). Un control deficiente de los mecanismos de retroalimentacion que regulan la homeostasis de la presion sangufnea a traves del sistema simpatico, por ejemplo, la disminucion de la frecuencia cardiaca inducida por hiperventilacion, es comun en pacientes con sfndrome de Rett y puede causar arritmias cardiacas potencialmente mortales (Acampa and Guideri, 2006; Julu et al., 2001).
La patogenesis de la disautonomfa cardiaca, aunque no se conoce bien, sugiere que las conexiones neuronales inmaduras en el tronco encefalico podrfan ser la causa. Para examinar las anomalfas de la frecuencia cardiaca en ratones MeCP2-/y el efecto del tratamiento con G-2-MePE, se controlo el pulso cardiaco en tiempo real en animales silvestres no anestesiados y animales MeCP2-/y tratados con vehfculo o G-2-MePE. Los ratones de tipo silvestre presentan una distribucion regular de las mediciones de frecuencia cardiaca centradas cerca de 750 latidos por minuto. Por el contrario, los ratones MeCP2-/y presentan una frecuencia cardiaca mas irregular con una frecuencia media mas baja, cuya aparicion se reduce significativamente despues del tratamiento con G-2-MePE.
La administracion de G-2-MePE mejora la actividad locomotora y la esperanza de vida
Los ratones MeCP2-/y desarrollan sfntomas de tipo Rett comenzando a las 4-6 semanas de vida cuando se vuelven letargicos progresivamente, desarrollan ataxia de la marcha y mueren entre las 10 y 12 semanas de vida (Chen et al., 2001). Tambien se registra la actividad locomotora basal en ratones despues de 6 semanas contando los episodios nocturnos de cruce de haz infrarrojo dentro de una zona de la jaula. Los ratones con desactivacion MeCP2 (KO) presentan niveles de actividad locomotora marcadamente reducidos en comparacion con los ratones de tipo
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silvestre (WT), pero el tratamiento con G-2-MePE (KO-T) eleva estos niveles.
Por ultimo, en comparacion con los companeros de camada MeCP2 KO, los ratones MeCP2-/y tratados con G-2- MePE tambien muestran un aumento de la esperanza de vida de ~50 % (un aumento en la tasa de supervivencia de probabilidad 0,5).
Tambien se mide el efecto del tratamiento con G-2-MePE en el tamano del soma neuronal en el hipocampo. Los ratones se tratan con G-2-MePE como se ha descrito anteriormente para la actividad locomotora. El tamano del soma en las neuronas de la region CA3 del hipocampo esta significativamente deteriorado en los animales MeCP2 KO en relacion con animales de tipo silvestre. El tratamiento con G-2-MePE aumenta el tamano medio del soma en animales KO, pero tiene poco o ningun efecto sobre el tamano del soma en animales de tipo silvestre.
Ejemplo 10: Efecto de G-2-MePE oral sobre la supervivencia en el sfndrome de Rett en ratones
Debido a que el sfndrome de Rett es un trastorno cronico debilitante que implica la perdida de habilidades motoras, es deseable tratar el sfndrome de Rett usando preparados que se administren facilmente. Con este fin, se pueden aprovechar las propiedades terapeuticas y farmacocineticas inesperadamente beneficiosas de G-2MePE y compuestos relacionados (patentes de EE.UU. n.° 7.041.314, 7.605.177, 7.714.070, 7.863.309 y las solicitudes de EE.UU. n.° 11/315.784 y 12/903.844).
Por lo tanto, se administro G-2-MePE por via oral a ratones deficientes en MeCP2 como se describe en el documento US [2009/0074865. En resumen, se administra diariamente una solucion acuosa, una emulsion de agua en aceite (microemulsion, emulsion de grano grueso o cristal lfquido) o una composicion de gel que contiene una cantidad farmaceuticamente eficaz de G-2-MePE (20 o 80 mg/kg por animal). En animales de control deficientes en MeCP2, se administra solo solucion salina, y se usan animales de tipo silvestre para obtener datos basales similares al diseno de los estudios descritos en el Ejemplo 7 anterior.
En los animales de tipo silvestre, la supervivencia se define como el 100 % en cada punto de tiempo. En los animales deficientes en MeCP2, la supervivencia disminuye sustancialmente. Sin embargo, despues de la administracion oral de G-2-MePE a ratones deficientes en MeCP2, la supervivencia aumenta sustancialmente.
Ejemplo 11: Efecto de G-2MePE sobre la actividad convulsiva en el sfndrome de Rett en ratones
Dado que las convulsiones son un aspecto prominente, peligroso y diffcil de tratar del sfndrome de Rett, se determinaron los efectos de G-2MePE sobre la actividad convulsiva en animales deficientes en MeCP2. G-2-MePE puede ser eficaz en el tratamiento de la actividad convulsiva en animales con enfermedad neurodegenerativa (patente de EE.UU. n.° 7.714.020). Por lo tanto, se llevaron a cabo experimentos para determinar si G-2-MePE tambien puede tratar la actividad convulsiva en ratones deficientes en MeCP2.
Se obtienen grabaciones electroencefalograficas de ratones de tipo silvestre y ratones deficientes en MeCP2 tratados con solucion salina o con G-2-MePE usando los metodos descritos en la patente de EE.UU. n.° 7.714.020.
Se encontro que el G-2MePE puede ser eficaz para disminuir tanto las convulsiones motoras como los ataques no convulsivos.
Conclusiones
Basandose en los presentes estudios in vivo e in vitro en animales deficientes en MeCP2, los presentes inventores concluyen que G-2-MePE puede ser una terapia eficaz para el tratamiento de seres humanos con sfndrome de Rett. Por otra parte, debido a que G-2-MePE tiene inesperadamente una semivida mas larga que un compuesto natural ((1-3)IGF-1, Glicil-Prolil-Glutamato o GPE) (FIG. 21), se concluye que el uso de G-2-MePE tiene ventajas distintas y sustanciales frente a otros agentes farmacologicos, incluyendo el GPE.
Por ejemplo, el G-2-MePE no es degradado por las celulas gastrointestinales, es absorbido por las celulas gastrointestinales y es activo en el sistema nervioso central despues de la administracion oral Wen et al., solicitud de EE.UU. n.° 12/283.684; U.S. 2009/0074865, patente de EE.UU. n.° 7.887.839). Por consiguiente, G-2MePE no necesita ser administrado por via intravenosa, subcutanea, intraventricular ni parenteral. De hecho, se pueden usar formulaciones orales que comprenden microemulsiones, emulsiones de grano grueso, preparados de cristal lfquido, nanocapsulas e hidrogeles en la fabricacion de los preparados administrados por via oral tales como comprimidos, capsulas y geles que pueden mejorar la funcion neurologica y tratar enfermedades neurodegenerativas (patente de EE.UU. n.° 7.887.839). G-2-MePE se puede usar en situaciones en las que el funcionamiento motor de un paciente es inferior al necesario para tragar un comprimido o una capsula. Existen varios tipos de geles solubles para la administracion oral de compuestos, y estos pueden usarse para suministrar G-2-MePE a un paciente. Debido a que G-2-MePE puede administrarse facilmente por via oral y es eficaz por via oral en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos, incluyendo el sfndrome de Rett, los presentes inventores concluyen que G-2-MePE puede ser conveniente y beneficioso para el tratamiento a largo plazo de pacientes con sfndrome de Rett.
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Ademas, dado que el Sindrome de Rett comparte caracterfsticas clave con otros trastornos del espectro autista, G- 2-MePE puede ser util para proporcionar beneficios terapeuticos de animales que tienen otros ASD y en seres humanos con autismo, sindrome de Asperger, trastorno disociativo infantil y trastorno generalizado de desarrollo - no especificado (PDD-NOS).
Ejemplo 12: Tratamiento de los ASD
Modelo de raton deficiente en Shank3
En el estudio, se usaron ratones deficientes en Shank3 como un modelo de sindrome de eliminacion de 22q13 asociado con los ASD.
El sindrome de eliminacion de 22q13 se ha relacionado con eliminaciones o mutaciones en el gen Shank3 (Bonaglia et al., 2006). El gen Shank3 codifica una protefna madre de armazon que forma el armazon en las sinapsis glutamatergicas (Boeckers et al., 2006). Shank3 es una parte crucial del nucleo de la densidad postsinaptica (PSD) y recluta muchos elementos funcionales clave en el PSD y en la sinapsis, incluyendo los componentes del acido a- amino-3-hidroxil-5-metil-4-isoxazol-propionico (AMPA), glutamato metabotropico (mGlu) y receptores de glutamato de acido N-metil-D-aspartico (NMDA), asf como elementos citoesqueleticos. Estudios recientes que exploran la tasa de eliminaciones de 22q13/mutaciones de Shank3 sugieren que la haploinsuficiencia de Shank3 puede causar una forma monogenica de ASD con una frecuencia del 0,5 % al 1 % de los casos de ASD (Durand et al., 2007; Moessner et al., 2007; Gauthier et al., 2008).
La generacion del modelo de raton con la expresion alterada de Shank3 de longitud completa se ha descrito previamente en la tecnica (Bozdagi et al., Molecular Autism 2010, 1:15, pag. 4). En resumen, se usaron celulas madre embrionarias Bruce4 C57BL/6 para generar una estirpe de raton que tenia sitios loxP insertados antes del exon 4 y del exon 9. Se extirpo el alelo floxeado y se mantuvo una estirpe con una eliminacion de los exones 4 a 9, es decir, una eliminacion completa de los dominios de repeticion de ankirina de Shank3. Se produjeron ratones de tipo silvestre (+/+), heterocitoticos (+/-) y ratones con desactivacion (-/-), con frecuencias mendelianas a partir de cruces heterocigoto-heterocigoto. Se confirmo una reduccion del 50 % del ARNm de Shank3 de longitud completa en heterocigotos (qPCR), asf como una expresion reducida de la protefna Shank3 (por inmunotransferencia con el anticuerpo Shank3 N69/46).
Los ratones heterocigoticos generados al cruzar ratones de tipo silvestre con heterocigotos se usan en el presente ejemplo para modelizar mejor la haploinsuficiencia de Shank3, responsable del sindrome de eliminacion de 22q13.
Metodos
Tratamiento farmacologico
Se dividen ratones deficientes en Shank3 heterocitoticos de tipo silvestre de 1 a 3 meses de vida en 4 grupos de tratamiento: grupo de tipo silvestre tratado con placebo, grupo deficiente en Shank3 tratado con placebo y dos grupos tratados con G-2-MePE deficientes en Shank3. Se administra a los animales placebo (agua) o G-2-MePE formulado en agua administrada por via oral, dos veces al dfa durante 14 dfas. Se administra G-2-MePE a dos dosis: 15 o 60 mg/kg.
Metodologia
Se puede encontrar una descripcion detallada de la metodologia en Bozdagi et al. (Molecular Autism 2010, 1:15). Analisis del comportamiento
Las evaluaciones del comportamiento se realizan en varios momentos, e incluyen analisis de interacciones sociales y comunicacion social ultrasonica, de acuerdo con la metodologia descrita por Bozdagi et al. En resumen, se evaluan las interacciones sociales macho-hembra en cada grupo de tratamiento. Los sujetos macho se alojan en grupos y se ensayan individualmente en jaulas limpias con camas limpias. Cada sesion de ensayo dura 5 min. Cada uno de los ratones esta emparejado con una hembra C57BL/6J distinta de celo no familiar. Se coloca una camara digital de circuito cerrado de television (Panasonic, Secaucus, NJ, EE.UU.) horizontalmente a 30 cm de la jaula. Se monta un microfono ultrasonico (capsula de microfono de condensador de Avisoft UltraSoundGate CM15, Avisoft Bioacoustics, Berlin, Alemania) 20 cm por encima de la jaula. La frecuencia de muestreo para el microfono es de 250 kHz, y la resolucion es de 16 bits. Mientras que el equipo usado no puede distinguir entre las llamadas emitidas por el sujeto macho y la pareja hembra, la preponderancia de llamadas durante las interacciones macho-hembra en ratones, en general, es emitida por el macho. Todo el aparato esta contenido en una camara ambiental atenuadora del sonido (ENV-018V, Med Associates, St Albans, VT, EE.UU.) iluminada por una sola luz roja de 25 vatios. Posteriormente, los videos de los sujetos macho son puntuados por un investigador con ocultacion de la informacion del genotipo del sujeto y del grupo de tratamiento en medidas de olfateo de nariz a nariz, olfateo de nariz a zona anogenital y olfateo de otras partes del cuerpo, usando el software Noldus Observer (Noldus Information
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Technology, Leesburg, VA, EE.UU.). Las vocalizaciones ultrasonicas son identificadas manualmente por dos investigadores muy capacitados con ocultacion de la informacion del genotipo/del grupo de tratamiento, y las estadfsticas de resumen se calculan usando el paquete de Avisoft. La fiabilidad entre evaluadores es del 95 %. Los datos se analizan usando ensayo t de Student para muestras no relacionadas.
Se realizan ensayos de habituacion/deshabituacion olfativas en ratones macho y hembra para cada grupo. La metodologfa es la descrita anteriormente (Silverman et al., 2010, Yang et al., 2009 and Silverman et al., 2010). Se presentan olores no sociales y sociales en una serie de hisopos de algodon introducidos en la jaula secuencialmente, cada uno durante 2 min, en el siguiente orden: agua, agua, agua (agua destilada); almendra, almendra, almendra (extracto de almendra en dilucion de 1:100); platano, platano, platano (aroma artificial de platano en dilucion de 1:100); social 1, social 1, social 1 (golpeado desde la parte inferior de una jaula que aloja a ratones B6 del mismo sexo desconocidos); y social 2, social 2, social 2 (golpeado desde el fondo de una segunda jaula que aloja a un grupo diferente de ratones 129/SvImJ del mismo sexo desconocidos). Se realizan ANOVA de medidas repetidas de una via dentro de cada grupo de tratamiento para cada conjunto de eventos de habituacion y cada evento de dishabituacion, seguido de un ensayo post hoc de Tukey.
Electrofisiologfa de cortes del hipocampo
Se preparan cortes de hipocampo agudo post mortem (350 pm) de ratones usando un cortador de tejidos. Se mantienen los cortes y se realizan los experimentos a 32 °C. Se perfunden los cortes con solucion de Ringer que contiene (en mM): NaCl, 125,0; KCl, 2,5; MgSO4, 1,3; NaH2PO4, 1,0; NaHCO3, 26,2; CaCl2, 2,5; glucosa, 11,0. Se burbujea solucion de Ringer con O2 al 95 %/CO2 al 5 %, a 32 °C, durante grabaciones extracelulares (solucion de electrodo: NaCl 3 M). Los cortes se mantienen durante 1 hora antes del establecimiento de una lfnea basal de potenciales postsinapticos excitatorios de campo (fEPSP) registrados en el stratum radiatum en la zona CA1, suscitados por estimulacion de los aferentes colaterales-comisurales de Schaffer (impulsos de 100 ps cada 30 s) con electrodos de tungsteno bipolares colocados en la zona CA3. La intensidad del estfmulo del ensayo se ajusta para obtener fEPSP con amplitudes que son la mitad de la respuesta maxima. Se determina la pendiente inicial de EPSP (mV/ms) a partir de la forma de onda media de cuatro respuestas consecutivas. Se generan curvas de entrada- salida (I/O) trazando la pendiente de fEPSP frente a la amplitud de la volea de fibra en solucion de bajo contenido de Mg2+ (0,1 mM). Las relaciones de IO mediadas por receptores de AMPA y mediadas por receptores de NMDA se miden en presencia de antagonistas de receptores de glutamato ionotropicos: de acido 2-amino-2-fosfonopentanoico APV (50 pm) y 6-ciano-7-nitroquinoxalin-2,3-diona CNQX (100 pM). Las respuestas de impulsos pareados se miden con intervalos entre estfmulos de 10 a 200 ms, y se expresan como la proporcion de las respuestas medias al segundo impulso de estimulacion con respecto al primer impulso de estimulacion.
Se induce la LTP bien por un estfmulo de alta frecuencia (cuatro trenes de 100 Hz, 1 s de estimulacion separado por 5 min) o por la estimulacion de rafaga theta (TBS) (10 rafagas de cuatro impulsos a 100 Hz separado a por 200 ms) o mediante una sola estimulacion de 100 Hz, para ratones de control y ratones geneticamente modificados. Para inducir la depresion a largo plazo (LTD), se estimulan colaterales de Schaffer por un estfmulo de baja frecuencia o impulsos emparejados de baja frecuencia (900 impulsos a 1 Hz durante 15 min) para inducir la LTD dependiente del receptor mGlu. Los datos se expresan como las medias ± DT, y los analisis estadfsticos se realizan mediante el analisis de varianza (ANOVA) o el ensayo t del Student, con una significacion establecida en un nivel a de 0,05.
Resultados
Comportamiento
La duracion acumulada del olfateo social total por los sujetos macho del ensayo es menor en el grupo deficiente en Shank3 tratado con placebo que en el grupo de tipo silvestre tratado con placebo. Ademas, el grupo deficiente en Shank3 tratado con placebo emite menos vocalizaciones ultrasonicas que los controles de tipo silvestre durante las interacciones sociales entre machos y hembras.
El tratamiento con G-2-MePE en los dos grupos deficientes en Shank3 produce un aumento significativo en la duracion acumulada del olfateo social total en comparacion con el grupo deficiente en Shank3 tratado con placebo. Ademas, los grupos tratados con G-2-MePE muestran un aumento del numero de vocalizaciones ultrasonicas en comparacion con el grupo mutante tratado con placebo.
En el estudio olfativo de habituacion/deshabituacion, destinado a confirmar que los ratones son capaces de detectar feromonas sociales, los 4 grupos presentan niveles normales de habituacion (indicados por un menor tiempo en oler la secuencia de tres olores iguales) y de deshabituacion esperada (indicada por el aumento empleado en oler el olor diferente).
Electrofisiologfa
La representacion de la pendiente del potencial excitatorio postsinaptico de campo (fEPSP) frente a la intensidad del estfmulo demuestra una reduccion en las curvas de I/O en el grupo deficiente en Shank3 tratado con placebo frente
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al grupo de control. En el grupo heterocigotico tratado con placebo tambien se observa una disminucion de los potenciales de campo mediados por el receptor de AMPA, que se refleja en una disminucion del 50 % en la pendiente media de la funcion de I/O en comparacion con el grupo de control de tipo silvestre. Por el contrario, cuando se analiza la relacion de I/O en presencia del antagonista competitivo del receptor de AMPA/kainato CNQX para medir la funcion sinaptica del receptor de NMDA, no hay diferencia entre los grupos heterocigoticos tratados con placebo y de tipo silvestre. Estos resultados indican que existe una reduccion especffica en la transmision basal mediada por el receptor de AMPA en los ratones heterocigoticos para Shank3.
El tratamiento con G-2-MePE en ambos grupos heterocigoticos normaliza los potenciales de campo mediados por el receptor de AMPA y provoca un aumento en la pendiente media de la funcion de I/O en comparacion con el grupo deficiente en Shank-3 tratado con placebo.
El mantenimiento de la LTP en el grupo deficiente en Shank-3 tratado con placebo esta claramente alterado en comparacion con el control de tipo silvestre. Los ensayos de la LTP de TBS (10 rafagas de cuatro impulsos a 100 Hz separados por 200 ms) tambien muestran una disminucion significativa en la potenciacion a los 60 min despues de TBS en el grupo deficiente en Shank-3 tratado con placebo. En contraste con la plasticidad sinaptica alterada observada con la LTP, la depresion a largo plazo (LTD) no cambio significativamente en el grupo mutante. El tratamiento con G-2-MePE aumento la potenciacion a largo plazo del hipocampo (LTP) y su mantenimiento en el grupo deficiente en Shank-3 en comparacion con el grupo deficiente en Shank-3 tratado con placebo.
Analisis
Las deficientes competencias sociales y los comportamientos repetitivos son las caracterfsticas comunes y las medidas de diagnostico clave de todas las formas de ASD. El retraso en el desarrollo intelectual y el subdesarrollo de las destrezas lingufsticas son tambien una caracterfstica comun presente en todos los ASD, excluyendo el sfndrome de Asperger.
Los modelos animales descritos anteriormente han sido aceptados en la tecnica como la demostracion de sfntomas similares a las condiciones clfnicas humanas. Todos los modelos de mutantes descritos anteriormente (NLGN3, NLGN4, CADM1, NRXN1, FMR1, shank3) muestran un deterioro de las habilidades sociales o un aumento de la ansiedad social. Se ha identificado una disminucion de la transmision excitatoria en el hipocampo en los modelos animales mutantes NRXN1, shank3, MeCP2 y FMR1. En la actualidad, no se han descrito modelos poligenicos o multifactoriales de ASD. Los modelos animales descritos anteriormente, basados en defectos geneticos que se sabe que producen ASD en la poblacion humana, proporcionan la mejor oportunidad para ensayar la eficacia de las terapias de ASD.
Por lo tanto, la eficacia de G-2-MePE en modelos animales de ASD es razonablemente predictiva de su eficacia en un sujeto humano que padece ASD.
Ejemplo 13: El tratamiento con G-2-MePE cambia la morfologfa de las neuronas en un modelo humano in vitro del sfndrome de Rett
Para ensayar los efectos de G-2-MePE en la morfologfa neuronal, se uso un modelo in vitro de RTT descrito en Marchetto et al., “A model for neuronal development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells”, Cell 143:527-539 (2010) (incluyendo informacion suplementaria). El modelo usa celulas madre pluripotentes inducidas (iPSC) generadas a partir de fibroblastos de pacientes de RTT humanos portadores de diferentes mutaciones de MeCP2.
Metodos
Cultivo celular e infeccion por retrovirus
Se generan fibroblastos de RTT (portadores de 4 mutaciones distintas de MeCP2) y fibroblastos de control a partir de explantes de biopsias dermicas. Se clona ARNhc frente al gen MeCP2 diana en el vector lentivirus LentiLox3.7 (como se describe en Marchetto et al.). Se infectan fibroblastos con vectores de reprogramacion retrovfricos (Sox2, Oct4, c-Myc y Klf4). Dos dfas despues de la infeccion, se siembran los fibroblastos en placas sobre fibroblastos embrionarios de raton inactivados mitologicamente con medio hESC. Despues de 2 semanas, se recogen manualmente las colonias de iPSC que emergen del fondo de los fibroblastos y se transfieren a condiciones libres de alimentacion en placas recubiertas con matrigel (BD) usando medio de cultivo de celulas madre embrionarias mTeSR™ (Stem Cell Technologies) y se pasan manualmente. Se miden perfiles de expresion genica de los clones generados usando matrices del genoma humano Affymetrix Gene Chip™ para confirmar que la reprogramacion era satisfactoria.
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Diferenciacion neuronal: NPC y neuronas maduras
Para obtener celulas progenitoras neuronales (NPC), se forman cuerpos embrioides (EB) por disociacion mecanica de grupos de celulas y se siembran en placas de baja adherencia en medio hESC sin FGF2 durante 5-7 dfas. Tras ello, se siembran los EB en placas recubiertas de poli-ornitina/laminina en medio DMEM/F12 mas N2 (suplemento exento de suero para el crecimiento y la expresion de celulas postmitoticas). Se recogen las rosetas resultantes despues de 7 dfas y se disocian con acutasa, y se siembran sobre placas recubiertas con medios NPC (DMEM/F12; 0,5 x N2; 0,5 x B27 y FGF2). Las poblaciones homogeneas de NPC se consiguen despues de 1-2 pasos con la acutasa en las mismas condiciones. Para obtener neuronas maduras, se tratan EB flotantes con 1 uM o acido retinoico durante 3 semanas (dando el tiempo total de diferenciacion de 4 semanas). Los EB maduros se disocian con papama y ADNasa durante 1 h a 37 °C y se siembran en placas recubiertas con poli-ornitina/laminina en medios NPC sin FGF2.
Tratamiento con G-2-MePE
Se tratan cultivos neuronales de RTT con G-2-MePE (1 nM-10 MM) durante 1 semana.
Inmunocitoqufmica y cuantificacion de la morfologfa neuronal
Se fijan celulas en paraformaldetndo al 4 % y se permeabilizan con Triton-X 100 al 0,5 % en PBS. Las celulas se bloquean despues en PBS que contiene Triton-X100 al 0,5 % y suero de burro al 5 % durante 1 h a temperatura ambiente. Las senales fluorescentes se detectan usando un microscopio invertido Zeiss y las imagenes se procesan con Photoshop CS3. Se usaron los siguientes anticuerpos primarios: TRA-1-60, TRA-1-81 (1:100), Nanog y Lin28 (1:500), Nestina humana (1:100), Tuj-1 (1:500), Map2 (1:100); meCP2 (1:1000; VGLUT1 (1:200), Psd95 (1:500), GFP (1:200), Sox1 (1:250), Mushasi1 (1:200) y me3H3K27 (1:500). Se mide tamano del soma celular usando un software adecuado (p. ImageJ) despues de la identificacion de las neuronas usando el Syn::EGFP™. Se estudian las morfologfas de las dendritas y espinas neuronales de una proyeccion individual de las secciones opticas de las pilas z y se exploran en incrementos de 0,5 um que se correlacionan con la resolucion valorada en el plano z. Cada seccion optica es el resultado de 3 exploraciones a 500 lps seguidas de filtrado de Kalman. Para la cuantificacion de la sinapsis, las imagenes se toman con un paso z de 1 um usando el microscopio confocal Biorad radiance 2100™. La cuantificacion de sinapsis se hace con ocultacion del genotipo. Solo se cuentan los puncta VGLUT1 junto con los procesos positivos en Map2. La significacion estadfstica se ensaya usando el ensayo ANOVA de dos vfas y el ensayo posterior de Bonferroni.
Formacion de imagenes de calcio
Se infectan redes neuronales derivadas de iPSC humanas con el vector lentivmco portador de la construccion de informador Syn:DsRed. Se lavan dos veces cultivos celulares con tampon HEPES de Krebs (KHB) esterilizado y se incuban con Fluo-4AM™ 2-5 pM ((Molecular Probes/Invitrogen, Carlsbad, CA) en KHB durante 40 minutos a temperatura ambiente. Se elimina el exceso de colorante lavando dos veces con KHB, y se realiza una incubacion adicional de 20 minutos para equilibrar la concentracion de colorante intracelular y permitir la desesterificacion. Se adquieren secuencias de imagenes en lapso de tiempo (ampliacion x100) de 5.000 fotogramas a 28 Hz con una region de 336 x 256 pfxeles, usando una camara digital ORCA-ER™ de Hamamatsu (Hamamatsu Photonics K.K., Japon) con un filtro de 488 nm (FITC) en un microscopio confocal de fluorescencia invertida Olympus 1X81 (Olympus Optical, Japon). Las imagenes se adquieren con MetaMorph 7,7™ (MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA). Las imagenes se procesan posteriormente usando ImageJ™ y rutinas escritas de manera personalizada en Matlab 7.2™ (Mathworks, Natick, MA).
Electrofisiologfa
Se realizan grabaciones de pinza de parche de celulas enteras a partir de celulas cultivadas junto con astrocitos despues de 6 semanas de diferenciacion. Se perfunde el bano de manera constante con solucion salina recien preparada tamponada con HEPES (veanse los metodos suplementarios para la receta). Se llenan micropipetas de registro (resistencia de la punta de 3 a 6 MQ) con la solucion interna descrita en los materiales suplementarios. Las grabaciones se realizan con el amplificador Axopatch 200B™ (Axon Instruments). Las senales se filtran a 2 kHz y se muestrean a 5 kHz. La capacitancia de la celula completa esta totalmente compensada. La resistencia en serie no esta compensada, pero se monitoriza durante el experimento por la amplitud de la corriente capacitiva en respuesta a un impulso de 10 mV. Todas las grabaciones se realizan a temperatura ambiente y los productos qmmicos se adquieren en Sigma. Se miden la frecuencia y la amplitud de las corrientes postsinapticas espontaneas con el software Mini Analysis Program™ (Synaptosoft, Leonia, NJ).
Resultados
Las neuronas derivadas de iPSC RTT se caracterizan por un menor numero de sinapsis glutamatergicas, una menor densidad de la espina y un tamano de soma mas pequeno. Las neuronas RTT tambien muestran ciertos defectos electrofisiologicos, es decir, una disminucion significativa de la frecuencia y la amplitud de las corrientes sinapticas
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espontaneas en comparacion con los controles. Las neuronas RTT muestran una disminucion de la frecuencia de los transitorios intracelulares de calcio.
Se ensaya G-2-MePE en el modelo anterior para ensayar si se podia atenuar alguna de las patologfas del fenotipo RTT.
El tratamiento de los cultivos celulares con cada concentracion de farmaco mejora todos los parametros morfologicos y fisiologicos de los cultivos de celulas RTT tratados en comparacion con los controles RTT no tratados. En concreto, se observa un aumento significativo del numero de sinapsis glutamatergicas en las celulas RTT tratadas con G-2-MePE. Todas las concentraciones de tratamiento de G-2-MePE aumentan el numero de puncta VGLUT1 en las neuronas derivadas de RTT. El tratamiento con G-2-MePE normaliza la frecuencia y la amplitud de las corrientes postsinapticas espontaneas, asf como la frecuencia de los transitorios de calcio generados por la actividad sinaptica de las neuronas RTT tratadas con G-2-MePE.
En el presente modelo in vitro de RTT humano, las iPSC derivadas de pacientes con RTT y neuronas diferenciadas de las mismas se caracterizan por anomalfas en la expresion de MeCP2. Como se describe en la anterior descripcion detallada de la invencion, la gran mayorfa de los casos de RTT estan asociados con mutaciones del gen MeCP2. Por lo tanto, la eficacia de G-2-MePE en el presente modelo in vitro de RTT humano es razonablemente predictiva de su eficacia en un sujeto humano que padece RTT.
Ejemplo 14: Efectos de G-2-MePE en seres humanos con sfndrome de Rett
Metodos
Se reclutan treinta sujetos con sfndrome de Rett. Los sujetos son mujeres y de edades comprendidas entre 16 y 29 anos (Media = 12,1; DT = 4,4). Todos los sujetos tienen un IQ < 60 y mutaciones del gen MECP2. Los sujetos tambien muestran la actividad del pico de eter en el EEG o un aumento en las bandas de frecuencia mas bajas del EEG como se detecta por Transformada de Fourier Rapida (FFT). Se indica a los sujetos que los medicamentos concomitantes deben ser estables durante al menos seis semanas antes del estudio. Los sujetos que reciben medicamentos para tratar signos de falta de atencion son ensayados por la manana y se les instruye para que tomen su medicacion por la tarde. Se excluye a los sujetos con intervalo QTc > 451 ms.
El estudio es un estudio aleatorizado con ocultacion doble controlado con placebo paralelo con tres dosis de bien placebo, 10 mg/kg tres veces al dfa de G-2-MePE oral durante cinco dfas o 30 mg/kg tres veces al dfa de G-2-MePE oral.
Los sujetos se analizaron al inicio usando los siguientes instrumentos: la historia natural/escala de gravedad clinica del sfndrome de Rett, la edicion de la comunidad de la lista de control del comportamiento aberrante (ABC), escala de Vineland, la impresion clinica global de la gravedad (CGI-S), y sus cuidadores completaron el cuestionario del cuidador (CSQ).
Los sujetos se llevan a la clinica como pacientes hospitalizados para permitir los registros iniciales iniciales de EEG, ECG y frecuencia respiratoria de manera continua durante 24 horas usando tecnologfa de polisomnograffa. Tambien se registran los movimientos de las manos usando el Q-Sensor™. Las medidas derivadas del EEG incluyen: picos por unidad de tiempo en el EEG, potencia total de las bandas de frecuencia del EEG, QTc y variabilidad de la frecuencia cardiaca (HRV) e irregularidades respiratorias.
Tambien se registran los eventos adversos usando las medidas de seguridad convencionales y la elicitacion de eventos adversos SMURF.
A nivel estadfstico, se analiza el efecto del tratamiento con G-2-MePE mediante la realizacion de un analisis repetido de la covarianza (ANCOVA) sobre el efecto del tratamiento sobre el cambio de las puntuaciones de referencia.
Resultados
El tratamiento con G-2-MePE no produce mas eventos adversos que los presentes durante el tratamiento con placebo, siendo todos los eventos adversos de corta duracion y gravedad leve. No se informa de eventos adversos graves. No se informa de casos de aumentos en QTC.
No se observan efectos sobre la frecuencia respiratoria ni la variabilidad de la frecuencia cardiaca.
El tratamiento con G-2-MePE produce una reduccion global significativa de los picos por unidad de tiempo en el EEG. El tratamiento con 30 mg/kg de G-2-MePE oral tres veces al dfa disminuye la actividad del pico en comparacion con el placebo. Esta dosis de G-2-MePE tambien disminuye la potencia de la banda delta del EEG en comparacion con el placebo.
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El tratamiento con G-2 ePE tambien reduce los movimientos totales de la mano por perfodo de veinticuatro horas contados usando el dispositivo Q-Sensor™. Este efecto es significativo para la dosis de 30 mg/kg tres veces al dfa en comparacion con el placebo.
El tratamiento con G-2-MePE no tiene un efecto significativo global sobre la historia natural/escala de gravedad clfnica del sfndrome de Rett. Sin embargo, 30 mg kg de G-2-MePE oral tres veces al dfa, en comparacion con el placebo, produce efectos significativos en las siguientes subescalas: "comunicacion no verbal en esta visita por examen"; "epilepsia/convulsiones en esta visita: y "uso de la mano".
Conclusiones
El tratamiento con G-2-MePE produce mejoras significativas en la funcion del sistema nervioso central en el presente estudio. A pesar del tratamiento a corto plazo, se reducen las anomalfas en la actividad electrica del cerebro, una clara senal de eficacia. Este efecto es dependiente de la dosis, observado despues del tratamiento con 30 mg kg de G-2-MePE oral tres veces al dfa. Estos efectos reflejan las mejoras en la funcion del SNC observadas en el modelo de raton transgenico con desactivacion de mecp2 del sfndrome de Rett despues de la administracion de G-2-MePE.
Tambien se observan efectos dependientes de la dosis en el uso de las manos, evaluado por un dispositivo de conteo objetivo y de clasificacion subjetiva. Esto es de interes debido a que los apretones de manos sin sentido son caracterfsticos del fenotipo clfnico del sfndrome de Rett y exclusivos de este trastorno.
La clasificacion de la comunicacion no verbal de la historia natural/escala de gravedad clfnica del sfndrome de Rett se mejora mediante el tratamiento. Esta medida evalua principalmente el contacto visual. Esto plantea la perspectiva de que el tratamiento a largo plazo con G-2-MePE puede mejorar la relacion social en la poblacion.
G-2-MePE es bien tolerado en esta poblacion. No se observan efectos en las medidas convencionales ni en las areas de preocupacion especfficas de la poblacion de pacientes, tales como la prolongacion del intervalo QTc o la apnea.
Ejemplo 15: Efectos de G-2MePE-MePE en seres humanos con trastornos del espectro autista Metodos
Para determinar si G-2-MePE puede tratar los sfntomas de ASD, se llevo a cabo un estudio en seres humanos con ASD. Se reclutan 20 sujetos con un trastorno del espectro autista. Los sujetos son varones y tienen entre 16 y 65 anos (Media = 18,1; DT = 3,4). Todos los sujetos tienen un IQ > 60 y diagnostico estricto del DSM-IV-TR de trastorno autista o trastorno de Asperger. Los sujetos tambien cumplen los criterios de un trastorno del espectro autista segun los instrumentos ADI-R y ADOS-G, y cumplen con los criterios de DSM-V propuestos para el trastorno del espectro autista. Se indica a los sujetos que los medicamentos concomitantes deben ser estables durante al menos seis semanas antes del estudio. Los sujetos que reciben medicacion para tratar signos de falta de atencion son examinados por la manana y se les indica que tomen su medicacion por la tarde. Se excluyen los sujetos mejor tratados con medicamentos antipsicoticos atfpicos indicados para el autismo. Los sujetos se evaluan para detectar trastornos geneticos conocidos, y se excluyen aquellos con sfndrome de X fragil o esclerosis tuberosa. Se excluyen los sujetos con epilepsia no controlada.
El estudio es un estudio cruzado con ocultacion doble controlado con placebo de tres fases. Los sujetos entran en cada fase del cruce en un orden aleatorio. En las fases del ensayo, los sujetos reciben placebo, 10 mg/kg de G-2- MePE oral tres veces al dfa durante cinco dfas o 30 mg/kg de G-2-MePE oral tres veces al dfa. Cada fase del cruce esta separada por un perfodo de lavado de catorce dfas.
Los sujetos se evaluan al inicio usando los siguientes instrumentos: Wechsler IQ, edicion de la comunidad de la lista de control de comportamiento aberrante (ABC), Escala de Vineland, subescala de compulsion de la escala del comportamiento obsesivo-compulsivo de Yale-Brown (YBOCS), escala de receptividad social (SRS), la impresion clfnica global de la gravedad (CGI-S), y sus cuidadores completan el cuestionario del cuidador (CSQ).
Se administra a los sujetos dos tareas: la lectura de la mente en el ensayo ocular - revisada (RMET) y una tarea de seguimiento de los ojos (ET), asf como la impresion clfnica global de la mejorfa (CGI-I). Las tareas comienzan dos horas despues de la administracion del placebo o de cualquiera de las dosis de G-2-MePE. La RMET es una tarea informatica que evalua la capacidad de un individuo de leer las emociones de los ojos de expresiones faciales afectivas sutiles, y es un ensayo ampliamente usado de reconocimiento de las emociones en pacientes con autismo (2001). Es importante destacar que la RMET es capaz de detectar mejoras incluso con una sola dosis de un agente farmacologico (Guastella et al., 2010). Los problemas del seguimiento ocular son caracterfsticos de los pacientes con autismo, que pasan menos tiempo mirando a los ojos de las fotograffas de caras humanas. Una vez mas, una sola administracion de una intervencion farmacologica puede mejorar un seguimiento ocular deficiente en el autismo (Andari et al., 2010).
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Tambien se registran los eventos adversos usando las medidas de seguridad convencionales.
A nivel estadfstico, se analiza el efecto del tratamiento con G-2-MePE mediante la realizacion de un analisis repetido de la covarianza (ANCOVA) sobre el efecto del tratamiento en el cambio de las puntuaciones de referencia.
Resultados
El tratamiento con G-2-MePE no produce mas eventos adversos que los presentes durante el tratamiento con placebo, siendo todos los eventos adversos de corta duracion y gravedad leve. No se informa de eventos adversos graves.
El tratamiento con G-2-MePE produce una mejora global significativa en el rendimiento del ensayo de RMET. El tratamiento con 30 mg/kg de G-2-MePE oral tres veces al dfa aumenta el porcentaje de respuestas correctas en la RMET.
El tratamiento con G-2-MePE produce una mejora significativa en el tiempo dedicado a observar la region ocular en el ensayo de ET. Las puntuaciones de CGI-I al final de los perfodos de tratamiento muestran una diferencia significativa. Los efectos positivos del tratamiento se correlacionan con las puntuaciones de referencia de CSQ.
Conclusiones
El tratamiento con G-2-MePE produce mejoras significativas en el rendimiento de la lectura de la mente en el ensayo ocular - Revisada, y en el rendimiento de una tarea de seguimiento de los ojos. Este efecto depende de la dosis, observado despues del tratamiento de 30 mg/kg de G-2-MePE oral tres veces al dfa.
La mejora de estas medidas refleja una mejora en el procesamiento de la informacion social. Las deficiencias de interaccion social son un diagnostico de sfntoma basico para los trastornos del espectro autista, y se trata, por tanto, un hallazgo clave.
G-2-MePE tambien produce una mejorfa general en la funcion segun lo indexado por la impresion clfnica global de la mejorfa. La anotacion de texto libre de los formularios del informe de casos del estudio indica este efecto relacionado con una mejora en la relacion social. Esto implica que los cambios observados en la tarea de RMET y ET pueden tener relevancia para la actividad social en la vida diaria.
G-2-MePE es bien tolerado en esta poblacion.
Ejemplo 16: Modelos animales de determinacion de los efectos de G-2-MePE en los trastornos del espectro autista
Los efectos de G-2-MePE se ensayan ademas en los siguientes modelos geneticos de ASD: el raton heterocigotico para Tbx1, el raton con desactivacion de Cntnap2 y el raton con desactivacion de Slc9a6. G-2-MePE tambien se ensaya en el modelo de ratones con desactivacion de fmrl del sfndrome de X fragil.
Tbx1. Las mutaciones del gen TBX1 estan asociadas con trastornos del espectro autista (Paylor et al., 2006). Los ratones Tbx1 transgenicos son tienen afectada selectivamente la interaccion social, la vocalizacion ultrasonica, los comportamientos repetitivos y la memoria de trabajo (Hiramoto et al., 2011).
Cntnap2. Dos tercios de los pacientes con mutaciones del gen 2 de tipo protefna asociado a la contactina (CNTNAP2) son diagnosticados con un trastorno del espectro autista (Alarcon et al., 2008; Arking et al., 2008; Bakkaloglu et al., 2008; Strauss et al., 2006; Vernes et al., 2008). Los ratones con desactivacion (KO) de Cntnap2 presentan fenotipos relacionados con el ASD en el comportamiento social, la vocalizacion ultrasonica y los comportamientos repetitivos (Penagarikano et al., 2011).
Slc9a6. Este gen se ha implicado en el ASD sindromico y codifica el intercambiador de sodio-hidrogeno 6 (NHE6). Las mutaciones en SLC9A6 estan asociadas con la discapacidad intelectual (Gilfillan et al., 2008) y el comportamiento autista (Garbern et al., 2010). Los ratones Slc9a6 KO presentan hiperactividad motora y disfuncion cerebelosa (Stromme et al., 2011).
Fmr1. El silenciamiento del gen FMR1 produce el sfndrome de X fragil, cuyo fenotipo incluye el autismo; dos tercios de los pacientes con sfndrome de X fragil cumplen los criterios de seleccion para un trastorno del espectro autista (Harris et al., 2008). Los pacientes pediatricos con sfndrome de X fragil tambien muestran un umbral de convulsiones mas bajo. El raton con desactivacion de fmr1 replica gran parte del fenotipo del sfndrome del Fragil X, incluyendo la susceptibilidad a las convulsiones juveniles (Yan et al., 2004).
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Metodos
Los animales de cada uno de los modelos anteriores se generan de acuerdo con la metodologfa descrita en la bibliograffa citada. Tambien se obtienen equivalentes de tipo silvestre para cada modelo genetico. Los animales de cada modelo se dividen en tres grupos (n = 10 a n = 20): ratones de tipo silvestre tratados con placebo, grupo tratado con G-2-MePE mutante y grupo de control mutante tratado con placebo. Los tratamientos se administran por via intraperitoneal: placebo (solucion salina) o 20 mg/kg/dfa de G-2-MePE. Se toman medidas de las caracterfsticas clave del ASD que se muestran en cada modelo de acuerdo con la literatura citada.
Resultados
El tratamiento con G-2-MePE mejora significativamente todas las medidas asociadas con el fenotipo de ASD. Referencias
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Claims (7)

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    REIVINDICACIONES
    1. Glicil-2-metil-L-prolil-L-glutamato (G-2-MePE) para su uso en el tratamiento de un sfntoma seleccionado del grupo que consiste en el funcionamiento social alterado y el comportamiento repetitivo de un trastorno del espectro autista (ASD) en un animal mediante la administracion oral de una cantidad eficaz de G-2-MePE.
  2. 2. El G-2-MePE para el uso de la reivindicacion 1, en el que dicho tratamiento produce una mejorfa de dicho sfntoma evaluado por uno o mas ensayos del comportamiento seleccionados del grupo que consiste en la historia natural/escala de gravedad clfnica del sfndrome de Rett, la edicion de la comunidad de la lista de control del comportamiento aberrante (ABC), escala de Vineland, la impresion clfnica global de la gravedad (CGI-S), y el cuestionario del cuidador (CSQ), o uno o mas ensayos fisiologicos seleccionados del grupo que consiste en la frecuencia de picos del electroencefalograma (EEG), la potencia global de las bandas de frecuencia de un EEG, el movimiento de las manos, QTc y variabilidad de la frecuencia cardiaca (HRV) e irregularidades respiratorias en comparacion con los animales de control que no padecen dicho sfntoma.
  3. 3. El G-2-MePE para el uso de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que dicho ASD se selecciona del grupo que consiste en autismo, sfndrome de X fragil, sfndrome de Rett (RTT), trastorno autista, sfndrome de Asperger, trastorno disociativo de la infancia y trastorno generalizado del desarrollo no especificado (PDD-NOS), y evitacion de la demanda patologica (PDA).
  4. 4. El G-2-MePE para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, estando dicha cantidad eficaz de G-2-MePE en el intervalo de 1 mg/kg a 100 mg/kg.
  5. 5. El G-2-MePE para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el segundo agente terapeutico se selecciona de un grupo que consiste en: factor de crecimiento similar a la insulina-I (IGF-I), factor de crecimiento similar a la insulina II (IGF-II), glicil-prolil-glutamato (GPE), factor de crecimiento transformante p-1, activina, hormona del crecimiento, factor de crecimiento nervioso, factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF), protefna de union a la hormona del crecimiento, protefnas de union a IGF (en especial, IGFBP-3), factor de crecimiento basico de fibroblastos, factor de crecimiento acido de fibroblastos, producto genico hst/Kfgk, FGF-3, FGF-4, FGF-6, factor de crecimiento de queratinocitos, factor de crecimiento inducido por androgenos, int-2, factor 1 homologo al factor de crecimiento de fibroblastos (FHF-1), FHF-2, FHF-3 y FHF-4, factor 2 de crecimiento de queratinocitos, factor de activacion glial, FGF-10 y FGF-16, factor neurotrofico ciliar, factor de crecimiento derivado del cerebro, neurotrofina 3, neurotrofina 4, protefna morfogenetica osea 2 (BMP-2), factor neurotrofico derivado de la estirpe celular glial, factor neurotrofico dependiente de la actividad, factor inhibidor de la leucemia de citoquinas, oncostatina M, interleucina, interferon a, p, y o consenso, TNF-a, clometiazol; acido kinurenico, Semax, tacrolimus, L-treo-1 -fenil- 2-decanoilamino-3-morfolin-1-propanol, analogo de andrenocorticotropina-(4-9) [ORG 2766] y dizolcipina (MK-801), selegilina; antagonistas de glutamato tales como mematina (Namenda) NPS1506, GV1505260, MK-801, GV150526; antagonistas de AMPA tales como 2,3-dihidroxi-6-nitro-7-sulfamoilbenzo(f)quinoxalina (NBQX), LY303070 y LY300164; agentes antiinflamatorios dirigidos contra la adresina MAdCAM-1 y/o sus receptores de integrina a4 (a4p1 y a4p7), tales como mAb MECA-367 anti-MAdCAM-1 (ATCC n.° de acceso HB-9478), fenobam, un inhibidor selectivo de la recaptacion de la serotonina tal como la fluoxetina o un agente antipsicotico atfpico tal como la risperidona, se administra al animal.
  6. 6. El G-2-MePE para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la dosis de dicho compuesto es de 10 mg/kg tres veces al dfa o de 30 mg/kg tres veces al dfa.
  7. 7. El G-2-MePE para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho animal es un ser humano.
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