JPH10500693A

JPH10500693A - 改変型インスリン様増殖因子

Info

Publication number: JPH10500693A
Application number: JP7530514A
Authority: JP
Inventors: コツクス，ジヨージ・エヌ; マクダモツト，マーテイン・ジエイ; コー，クリステイーン
Original assignee: アムジエン・ブルダー・インコーポレーテツド
Priority date: 1994-05-24
Filing date: 1995-05-24
Publication date: 1998-01-20
Also published as: CA2190752A1; AU2601895A; EP0756494A1; WO1995032003A1

Abstract

(57)【要約】向上した薬理学的特性と生物特性とを有する改変型インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）を提供する。この改変型は、天然型ＩＧＦのアミノ酸配列におけるシステインの置換又は付加によって産生されるＩＧＦムテインと、遊離システイン部位においてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合させたＩＧＦムテインとを含む。この発明は更に、このような改変型を製造する方法も提供する。ＩＧＦ−ＰＥＧ結合体を、医薬組成物に配合し、ＩＧＦ関連疾患の治療のために使用することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】改変型インスリン様増殖因子発明の分野本発明は、ポリペプチドの改変に係わり、更に特にインスリン様増殖因子の改変と、このような改変型ポリペプチドの製造方法及びその使用方法に係わる。発明の背景インスリン、レラキシン、インスリン様増殖因子１及び２、並びに、場合によっては７Ｓ神経増殖因子のβサブユニットから構成されるインスリン遺伝子ファミリーは、Ｄｕｌｌ他，Ｎａｔｕｒｅ３１０：７７７−７８１（１９８４）に報告されている通りにその生物機能が様々に異なっている、互いに構造的に類似したポリペプチドの一群である。インスリン様増殖因子１及び２（ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２）は、相互に構造的に類似し且つインスリンに構造的に類似した約７−８キロダルトンのタンパク質である。ＩＧＦ−１とＩＧＦ−２は、互いに約７０％のアミノ酸同一性を有し、インスリンに対しては約３０％のアミノ酸同一性を有する。１９９０年１月２５日付けで公開されたＰＣＴ出願公開第ＷＯ９０／００５６９号に報告されているように、ＩＧＦ−１とＩＧＦ−２は、互いに類似した三次構造を有すると考えられている。ＩＧＦ−１とＩＧＦ−２との間の構造的類似性は、この両者がＩＧＦ受容体に結合することを可能にする。２つのＩＧＦ受容体が存在することが知られている。ＩＧＦ−１とＩＧＦ−２はＩＧＦＩ型受容体に結合し、一方、インスリンは、この受容体に対して結合するが、親和性はかなり低い。ＩＧＦＩ型受容体はＩＧＦ−１に優先的に結合し、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の有糸分裂促進作用(mitogenic effect)を変換すると考えられている。ＩＧＦ−２はＩＧＦ−１に比べて１０分の１の親和性をもってＩ型受容体と結合する。第２のＩＧＦ受容体、即ち、ＩＩ型ＩＧＦ受容体は、優先的にＩＧＦ−２と結合する。受容体結合は、ＩＧＦ−１とＩＧＦ−２の生物活性のために必要であると考えられている。ＩＧＦ−１とＩＧＦ−２は、線維芽細胞、角化細胞、内皮細胞、骨芽細胞（造骨細胞）を含む様々な細胞型に対して有糸分裂促進作用を及ぼす。更に、ＩＧＦ −１とＩＧＦ−２は、様々な細胞型の分化、例えば、骨芽細胞によるコラーゲンの合成と分泌を刺激する。ＩＧＦ−１とＩＧＦ−２は、特異的ＩＧＦ細胞表面受容体に結合することによってその有糸分裂促進作用と細胞分化作用を及ぼす。更に、ＩＧＦ−１が、インビボでのタンパク質異化作用を阻害し、細胞によるグルコース取り込みを刺激し、培養中の単離ニューロンの生存を促進することが明らかになっている。こうした特性のために、Ｆｒｏｅｓｃｈ他，ＴｒｅｎｄｓｉｎＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙａｎｄＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ，２５４−２６０（Ｍａｙ／Ｊｕｎｅ１９９０）及びＣｏｔｔｅｒｉｌｌ，ＣｌｉｎｉｃａｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，３７：１１−１６（１９９２）に報告されている通り、様々な病状に対する治療剤としてＩＧＦ−１が試験されるようになっている。特異的細胞表面受容体に加えて、体全体を循環する少なくとも６つの異なったＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ−１からＩＧＦＢＰ−６）がある。これらのタンパク質は高い親和性をもってＩＧＦ−１とＩＧＦ−２に結合する。ＩＧＦ−１とＩＧＦ−２が結合タンパク質に結合することによって、これらのＩＧＦが細胞表面ＩＧＦ受容体と相互作用することが妨げられ、その結果、これらのＩＧＦが細胞に対して及ぼす作用が低下する。ＩＧＦ結合タンパク質、特にＩＧＦＢＰ−３は、血流中でのＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の循環半減期を延長させる働きもする。ＩＧＦ結合タンパク質が存在しない場合には、血液中でのＩＧＦ−１の半減期は１０分未満である。これとは対照的に、ＩＧＦ−１がＩＧＦＢＰ−３と結合している場合には、その血液中での半減期は約８時間に延長される。Ｄａｖｉｓ他，Ｊ．ｏｆＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２３：４６９−４７５（１９８９）；Ｇｕｌｅｒ他，ＡｃｔａＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａ，１２１：７５３−７５８（１９８９）；Ｈｏｄｇｋｉｎｓｏｎ他，Ｊ．ｏｆＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２３：４６１−４６８（１９８９）に報告されているように、その他のより小さな結合タンパク質に結合したＩＧＦ−１の循環半減期は約３０分である。ＩＧＦが結合タンパク質に結合している場合には、ＩＧＦはＩＧＦ受容体に結合することが不可能であり、従って、体内で不活性である。結合タンパク質に対する親和性が低ければ低いほど、体内で活性であるＩＧＦの量が増える。結合タンパク質に対する親和性が低いことが有益であり得る状況は、例えば、悪液質(cachexia)、骨粗鬆症、及び、末梢神経疾患を含む。更に、ＩＧＦの治療上の有益性を、ＩＧＦの有益な効果を強化又は抑制する可能性がある上記ＩＧＦ結合タンパク質の有無によって変化させることが可能である。特定のＩＧＦ結合タンパク質のレベルは、疾病の状態に応じて大きく変化する可能性がある。例えば、Ｂｒｉｓｍａｒ他，Ｊ．ｏｆＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１１：５９９−６０２（１９８８）、Ｓｕｉｋｋａｒｉ他，Ｊ．ｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙａｎｄＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ，６６：２６６−２７３（１９８８）、及び、Ｕｎｔｅｒｍａｎ他，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１６３：８８２−８８７（１９８９）に報告されているように、ＩＧＦＢＰ−１のレベルは糖尿病患者では非常に高く、一方、糖尿病以外の患者では殆ど検出不可能である。Ｄａｖｉｅｓ他，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３０：４６９−４７３（１９９１）、及び、Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ他，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔａｂ．，７５：５９０−５９５（１９９２）に報告されているように、大手術を受けたばかりの患者のような病状の重い患者では、ＩＧＦＢＰ−３のレベルが低下している。ＩＧＦＢＰ−３のレベルが低いこと、従ってＩＧＦ−１の循環半減期がより短いことが、こうした患者に認められる悪液質（体重減）の原因である可能性がある。ソマトメジンＣとしても知られているインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）は、様々な組織の成長において果たすその役割に関して、長期に亙って研究されている。幾つかの種類の疾病に対する治療剤としてＩＧＦ−１が役立つことが示唆されている。Ｍｏｌｌｅｒ他，Ｂｕｒｎｓ，１７（４）：２７９−２８１（１９９１）の報告によれば、様々な範囲と重傷度の火傷をおった２３人の患者において、ＩＧＦ−１のレベルが著しく低いことが発見された。Ｌａｒｏｎ他，ＣｌｉｎｉｃａｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，３５：１４５−１５０（１９９１）の報告によれば、小人症の患者又は成長ホルモンに非反応性の患者に対して組換え法で生産したＩＣＦ−１を投与して１週間後に、血清において、骨形成のマーカーであるＩＩＩ型プロコラーゲンの著しい増加が生じた。Ｌａｒｏｎ小人症の小児におけるＩＧＦ−１注入の効果については、Ｗａｌｋｅｒ他，ＴｈｅＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，３２４（２１）：１４８３−１４８８（１９９１）で説明されている。ＩＧＦ−１、又は、ＩＧＦ−１中に通常存在する最初の３つのアミノ酸が欠失したＩＧＦ−１（「（ｄｅｓ１−３）ＩＧＦ−１」と呼ばれる）によって糖尿病ラットを治療した後に、体重増加と窒素保持と筋肉タンパク質合成とが増大したことが、Ｔｏｍａｓ他，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２７６：５４７−５５４（１９９１）で示されている。組換え法で生産したヒトＩＧＦ−１の投与によるインスリン欠乏糖尿病ラットの成長回復は、Ｓｃｈｅｉｗｉｌｌｅｒ他，Ｎａｔｕｒｅ，３２３：１６９（１９８６）で報告されている。Ｌｅｍｍｅｙ他，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６０（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２３）Ｅ２１３−Ｅ２１９（１９９１）に述べられているように、ＩＧＦ−１と（ｄｅｓ１−３）ＩＧＦ−１は、腸切除後のラットの成長を促進する。Ｌｙｎｃｈ他，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ，１６：５４５ −５４８（１９８９）の報告によれば、血小板由来増殖因子とインスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１を含む）の組み合わせは、ビーグル犬における歯周再生を促進した。創傷治癒における血小板由来増殖因子とＩＧＦ−１との相乗作用は、Ｌｙｎｃｈ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４：７６９６−７７００（１９８７）に報告されている。インビトロにおける長軸方向の骨成長に対するＩＧＦ−１と成長ホルモンとの作用が、Ｓｃｈｅｖｅｎ及びＨａｍｉｌｔｏｎ，ＡｃｔａＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）１２４：６０２−６０７（１９９１）で説明されている。ラットにおける骨の形成と再吸収とに対するＩＧＦ−１のインビボ作用が、Ｓｐｅｎｃｅｒ他，Ｂｏｎｅ，１２：２１−２６（１９９１）に示されている。哺乳動物における非有糸分裂コリン作動性神経細胞の生存を促進するためのＩＧＦ−１とＩＧＦ−２の使用が、米国特許第５，０９３，３１７号（Ｌｅｗｉｓ他）に記載されている。これに加えて、１９９２年７月２３日付けで公開されたＰＣＴ出願公開第ＷＯ９２／１１８６５号は、心臓疾患の治療のためのＩＧＦ−１の使用を記載している。天然型又は野生型ＩＧＦ−１に対する様々な改変がこれまでに報告されている。例えば、Ｓｅｒａ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８３：４９０４−４９０７（１９８６）とＦｒａｎｃｉｓ他，ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ，２５１：９５−１０３（１９８８）の報告によれば、最初の３つのＮ末端アミノ酸が欠落したＩＧＦ−１の天然変異体（ｄｅｓ１−３）ＩＧＦ−１が脳脊髄液と初乳との中に発見された。ＩＧＦ細胞表面受容体に対する結合と細胞の有糸分裂の促進において、この変異体がＩＧＦ−１と同等の能力を有することが、インビトロでの研究によって示されている。従って、ＩＧＦ−１の最初の３つのアミノ酸は、特異的細胞表面受容体に対するＩＧＦ−１の結合にとって必ずしも不可欠なものではないと考えられる。Ｆｏｒｂｅｓ他，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１５７：１９６−２０２（１９８８）、及び、Ｃａｒｌｓｓｏｎ−Ｓｋｗｉｒｕｔ他，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１０１：１９２−１９７（１９８９）に報告されているように、特定のＩＧＦ結合タンパク質（特に、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２）に対する（ｄｅｓ１−３）ＩＧＦ−１の親和性が極めて低い（１００分の１）ことが発見されている。（ｄｅｓ１−３）ＩＧＦ−１に対するＩＧＦＢＰ−３の結合も影響を受け、２分の１から３分の１に低減される。Ｃａｓｃｉｅｒｉ他，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２３：３７３−３８１（１９８８）及びＧｉｌｌｅｓｐｉｅ他，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２７：４０１−４０５（１９９０）に報告されているように、連続皮下注入によって（ｄｅｓ１−３）ＩＧＦ−１を投与する場合に、成長のような幾つかの同化作用の刺激に関してＩＧＦ−１よりも強力な作用を（ｄｅｓ１ −３）ＩＧＦ−１が示すことが、動物実験によって明らかになった。Ｃａｒｌｓｓｏｎ−Ｓｋｗｉｒｕｔ他，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１０１：１９２−１９７（１９８９）の報告によれば、（ｄｅｓ１−３）ＩＧＦ− １の優れた特性は、ＩＧＦ結合タンパク質に対する親和性の低さに起因すると考えられる。Ｃａｓｃｉｅｒｉ他，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２３：３７３−３８１（１９８８）に報告されているように、（ｄｅｓ１−３）ＩＧＦ− １は、ＩＧＦ結合タンパク質に対する親和性が低いので、野生型ＩＧＦ−１の循環半減期よりも短い循環半減期を有することになる。従って、（ｄｅｓ１−３）ＩＧＦ−１の高い効力を生かすためには、連続注入によって、又は、１日数回の注射によって、（ｄｅｓ１−３）ＩＧＦ−１を投与しなければならない。１９８９年６月２９日付けで公開されたＰＣＴ出願公開第ＷＯ８９／０５８２２号は、ＩＧＦ−１の別の改変を開示している。この出願は、天然型ＩＧＦ−１のＮ末端から３番目のアミノ酸をグリシン、グルタミン、ロイシン、アルギニン、又は、リシンで置換し、ＩＧＦ−１ムテインを形成したことを記載している。しかし、この公開公報は、上記第３のアミノ酸をシステインで置換することは教示していない。ＩＧＦ−１と（ｄｅｓ１−３）ＩＧＦ−１の治療上の潜在的有用性が発揮されるのは、そのタンパク質の循環半減期が短いので、最大の治療上の潜在能力を引き出すように連続注入又は１日数回の注射によってそのタンパク質を投与することが可能である場合に限られる。例えば、Ｗｏｏｄａｌｌ他，Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．，２３：５８１−５８４（１９９１）は、同一の合計用量のＩＧＦ−１を皮下注入によって１日４回投与する場合の方が、同一の合計用量のＩＧＦ−１を１日１回投与する場合よりも、突然変異種ｌｉｔ／ｌｉｔマウス（成長ホルモン欠乏マウス）の成長を促進する上で効果が著しく高いということを報告している。１日１回又は数日おきに１回の割合で注射する形でＩＧＦ−１を投与することが好ましい場合が多い。注射用薬剤の場合には、１日数回に分けて投与する薬剤よりも、１日１回投与するだけでよい薬剤の方が、患者にとって受け入れ易いと考えられる。ＩＧＦ−１を１日１回又は数日おきに１回投与する場合であってもＩＧＦ−１が治療上有効であることを可能にするために、ＩＧＦ−１の循環半減期を延長するための方法を開発しなければならない。タンパク質に不活性ポリマー鎖（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を共有結合させることによってそのタンパク質の分子量を増加させ、体内でのタンパク質の循環半減期を延長させることが知られている。例えば、Ｄａｖｉｓ他，ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｏｌｙｍｅｒｓ：ＰｏｌｙｍｅｒｉｃＭａｔｅｒｉａｌｓａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓｆｏｒＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＵｓｅ，ｐ．４４１−４５１（１９８０）を参照されたい。しかし、複数のＰＥＧ分子が各々のタンパク質分子に結合する可能性があり、且つ、公知の方法を使用する場合には、複数のＰＥＧ分子に結合するのに適した多数の部位が各タンパク質上に存在することが一般的であるという理由から、均一な反応生成物を得るようにＰＥＧ分子をタンパク質に結合させることは、これまで殆ど不可能だった。Ｇｏｏｄｓｏｎ他，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：３４３（１９９０）と、米国特許第４，９０４，５８４号を参照されたい。部位的特異結合性の不足は、上記タンパク質の活性の損失を含む様々な問題を生じさせる可能性がある。従って、ＩＧＦの治療剤としての有効性を低下させることなく、その循環半減期を延長させる必要がある。本発明は、ＩＧＦの分子量を増大させることによって、この要件を満たす。ＩＧＦに対するＰＥＧのチオール特異的結合に適したＩＧＦのムテイン(mutein)と、こうしたムテインから形成されるＰＥＧ結合体とを提供することによって、ＩＧＦの治療剤としての有効性を低下させることなくその循環半減期を延長させることを実現する。発明の要約本発明は、ＩＧＦの様々な改変型に係わる。野生型分子の特定のアミノ酸をシステイン残基で置き換えることによって、又は、野生型分子のアミノ酸に隣接してシステイン残基を挿入することによって、もしくは、そのアミノ酸間にシステイン残基を挿入することによって、ムテインと呼ばれる１つのタイプの改変型ＩＧＦを調製することが可能である。分子内ジスルフィド結合に関与しないシステイン残基は「遊離している」とみなされる。システィン残基を、ＩＧＦ分子の表面上に露出している領域内に置換又は挿入することが可能である。例えば、元々ない（すなわち非天然の）システインを、野生型ＩＧＦ−１の最初又は最後の２０個のアミノ酸の中に挿入又は置換することが可能である。この非天然のシステインは、遊離しており、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がＩＧＦに結合するための結合部位として作用し、ＰＥＧ化した分子を生じさせると考えられる。しかし、場合によっては、ＰＥＧとの反応の前のムテインの再折り畳み(refolding)又はムテインの還元の最中に、非天然システインが、ジスルフィド結合に関与させられ、それによってＰＥＧ化用の天然システインを遊離させることが可能である。ＰＥＧ分子をムテインに結合させることによって、更に別のＩＧＦの改変型、即ち、ＰＥＧが遊離システイン残基においてＩＧＦに結合している上記構造のＩＧＦ−ＰＥＧ結合体を生じさせる。従って、本発明は、ＩＧＦ（特にＩＧＦ−１）のムテインに対してＰＥＧが非天然システインにおいて結合している、ＰＥＧとＩＧＦムテインとを含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合体に係わる。ＰＥＧは、例えばマレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフラート、トレシラート、アジリジン、エキシラン、及び、５−ピリジルを含むチオール特異的活性基を介して、遊離システインに結合することが可能である。適切なＰＥＧは、５ｋＤａ、８．５ｋＤａ、１０ｋＤａ、又は、２０ｋＤａの分子量を有することが可能である。本発明のＰＥＧ結合体は、第２のタンパク質を含み、ダンベル（ｄｕｍｂｂｅｌｌ）を形成することも可能である。本発明は、ＰＥＧ結合体を作製するための方法も提供する。更に、ＰＥＧは、体内のタンパク質の循環半減期を延長させることが知られている。従って、従来におけるＩＧＦの有効性に比べて等しいか又は優れたＩＧＦの有効性を維持しながら、ＩＧＦの投与の頻度を従来よりも少なくすることが可能である。本発明は、更に、ＩＧＦのムテイン、特に、そのムテインのＮ末端又はＣ末端領域内に非天然システインを有するＩＧＦのムテインに係わる。このムテインを組換え法によって生産することが可能である。本発明では、ＩＧＦ−ＰＥＧ結合体を含む医薬組成物および、ＩＧＦ関連疾患を有するか又は潜在的に有する患者を治療するためにＩＧＦ−ＰＥＧ結合体を使用する方法を提供する。発明の詳細な説明本発明は、野生型ＩＧＦでは得られない有益な特性をもたらすインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）の改変型に係わる。ＩＧＦの改変型は、少なくとも１つの遊離システインを含有するＩＧＦのムテインを包含する。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合したＩＧＦムテインを含む結合体も、ＩＧＦの改変型とみなす。本明細書と請求の範囲で使用する用語を次のように定義する。用語「ＩＧＦ」は、ＩＧＦＩ型受容体に結合するあらゆるポリペプチド（例えば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、（ｄｅｓ１−３）ＩＧＦ−１、非天然アルギニンを残基番号３に有するムテインである（Ｒ３）ＩＧＦ−１、及び、インスリンを含む）を意味する。このホルモン群は、Ｂｌｕｎｄｅｌｌ及びＨｕｍｂｅｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２８７：７８１−７８７（１９８０）に説明されている。この共通の受容体結合のために、ＩＧＦ−１に関して説明する本発明の開示内容は、ＩＧＦ−２、（ｄｅｓ１−３）ＩＧＦ−１、（Ｒ３）ＩＧＦ−１、及び、インスリンも包含することを意図している。用語「野生型ＩＧＦ」は、非改変型すなわち天然型ＩＧＦを意味する。この用語を、「ＩＧＦ」、「天然型ＩＧＦ」、及び、「ネイティブ(native)ＩＧＦ」と共に互換的に使用する。用語「野生型ＩＧＦ」は、メチオニン残基がそのＮ末端に付加されているネイティブＩＧＦも意味する。用語「野生型ＩＧＦ−１」は、ＩＧＦ−１の非改変又は天然の７０アミノ酸形態を意味する。この用語を、「ＩＧＦ−１」、「天然型ＩＧＦ−１」、及び、「ネイティブＩＧＦ−１」と共に互換的に使用する。用語「野生型ＩＧＦ−１」は、メチオニン残基がそのＮ末端に付加されているネイティブＩＧＦ−１も意味する。用語「非天然（の）」は、本来の分子に存在しないことを意味する。用語「ＩＧＦ−ＰＥＧ結合体」は、ポリエチレングリコール分子に結合したＩＧＦ分子を意味する。この用語は「ＰＥＧ結合体」とも称される。用語「Ｎ末端領域」は、ＩＧＦ又はＩＧＦムテインのＮ末端から最初の２０アミノ酸と、ＩＧＦのＮ末端の最初のアミノ酸の前に位置する１２個までのアミノ酸を概ね意味する。用語「Ｎ末端」は、野生型ＩＧＦの配列内のＮ末端領域の最初のアミノ酸（例えば、ＩＧＦ−１ではグリシン）を意味する。用語「Ｃ末端領域」は、ＩＧＦ又はＩＧＦムテインのＣ末端からの最後の２０アミノ酸と、ＩＧＦのＣ末端の最後のアミノ酸より後に位置する１２個までのアミノ酸を概ね意味する。用語「Ｃ末端」は、野生型ＩＧＦの配列内のＣ末端領域の最後のアミノ酸（例えば、ＩＧＦ−１でのアラニン）を意味する。用語「ムテイン(mutein)」は、非天然システインを含むように改変された改変型ＩＧＦを意味する。用語「生物活性を保持する」は、本明細書で説明するアッセイを使用して、ＩＧＦ結合タンパク質−１の不在下で、ＵＭＲ１０６ラット骨肉腫細胞中に取り込まれた³Ｈ−チミジンの相対量によって測定した場合に、野生型組換えＩＧＦの有糸分裂促進活性(mitogenic aciivity)の少なくとも１０％を有することを意味する。本発明のムテインと結合体は生物活性を保持する。用語「活性基」は、ムテインに結合するＰＥＧ分子上の部位を意味する。用語「医薬上許容可能な担体」は、生理学的に適合性のある水性又は非水性の溶媒を意味する。用語「遊離システイン」は、細胞内ジスルフィド結合に関与しない任意のシステイン残基を意味する。用語「ＩＧＦ関連疾患」は、ＩＧＦ、ＩＧＦ結合タンパク質、又はＩＧＦ受容体の過剰産生又は過少産生、及び、結合タンパク質又は受容体に対するＩＧＦの不適切な又は不十分な結合に起因する、現存の又は潜在的な病的生理学的状態と、ＩＧＦ投与によってその疾病症状が軽減されるあらゆる疾病とを意味する。ＩＧＦ関連疾患は、通常の患者に対するＩＧＦの投与が所期の効果をもたらす疾患も意味する。用語「患者」は、ＩＧＦ関連疾患の治療が必要なあらゆるヒト又は哺乳動物を意味する。野生型ＩＧＦを改変することによって、特にそのタンパク質のＮ末端領域又はＣ末端領域において改変することによって、本発明のＩＧＦムテインを生産する。こうした改変は、少なくとも１つのシステイン残基の置換又は付加でありうる。システインで特定のアミノ酸を置き換えることによって、例えば、ＩＧＦ−１の最初又は最後の４つのアミノ酸の中の１つのアミノ酸をシステイン残基で置換することによって、ＩＧＦムテインを生産することが可能である。Ｎ末端から始まる野生型ＩＧＦ−１のアミノ酸配列は、である。他の改変は、例えば、ＩＧＦの最初のアミノ酸の前に又は最後のアミノ酸の後に少なくとも１つのシステイン残基を付加することを含む。例えば、ＩＧＦの最初のアミノ酸の前に隣接させてシステイン残基を挿入することが可能である。Ｅ．ｃｏｌｉによって生産されるムテインの場合には、非天然システインをＭｅｔとＩＧＦの最初のアミノ酸との間に出現させることも可能である。遊離システイン残基を、ＩＧＦの最初のアミノ酸の前に又は最後のアミノ酸の後に挿入された約１２個以下のアミノ酸群の中に出現させて、より長いＩＧＦムテインを形成することも可能である。特に有用な実施様態では、非天然システインは、ＩＧＦ−１タンパク質表面に露出した該分子の領域の中に位置する。例えば、Ｎ末端領域は結合タンパク質に対するＩＧＦの結合に関与するが、細胞表面ＩＧＦ受容体に対するＩＧＦの結合には関与しない。本発明のＩＧＦ−１ムテインを、「ＩＧＦ−１のシステインムテイン」とも呼ぶ。非天然システイン残基は、ポリエチレングリコール上の活性基の共有結合のための結合部位として働くことが可能である。或いは、非天然システインがジスルフィド結合に関与し、それによってＰＥＧに対するチオール特異的結合のための天然システイン残基を遊離させることが可能である。ＰＥＧが結合したＩＧＦのシステインムテインを含む新規に作製された分子を、「ＩＧＦのＰＥＧ結合体」と呼ぶ。本発明のＩＧＦムテインを、当業者に公知の方法で製造することが可能である。こうした方法は、例えば、本明細書に参考として組み入れる米国特許第４，５１８，５８４号に説明されているような、アミノ酸残基の置換又は挿入のための突然変異誘発法を含む。突然変異誘発法によって生産した突ムテインを、その後に当業者に公知の手順によって組換え生産物として発現させることが可能である。或いは、このムテインを当業界で公知の従来の方法で合成することも可能である。更に、ＩＧＦムテインを、下記の実施例で説明する方法と技術によって製造することも可能である。更に、本発明は、ＩＧＦ−ＰＥＧ結合体を提供し、更に、体内でのＩＧＦムテイン分子の循環半減期を増大させ且つＩＧＦ結合タンパク質に対する親和性を低下させるために、ＩＧＦムテインをポリエチレングリコールに結合させることによって、このＩＧＦ−ＰＥＧ結合体を製造する方法を提供する。本発明では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の長鎖ポリマーユニットが、ＩＧＦムテイン上の遊離システイン残基のスルフヒドリル基との共有結合を介して該ムテインに結合される。異なった分子量、５．０ｋＤａ（ＰＥＧ₅₀₀₀）、８．５ｋＤａ（ＰＥＧ₈₅₀₀）、１０ｋＤａ（ＰＥＧ₁₀₀₀₀）、及び、２０ｋＤａ（ＰＥＧ₂₀₀₀₀）を有する様々なＰＥＧポリマーを、ＩＧＦ−ＰＥＧ結合体の製造に使用することが可能である。反応の選択性と均一な反応混合物を得るために、スルフヒドリル基又はチオール基と特異的に反応する官能化したポリマーを使用することが有益である。長鎖ポリエチレングリコールに結合させる官能基又は反応性基は、ＩＧＦムテインがその遊離システイン部位において結合する活性基である。使用可能な活性基は、例えば、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフラート、トレシラート、アジリジン、エキシラン、及び、５−ピリジルを含む。別の実施様態では、ＰＥＧ分子の各末端において１つのＰＥＧ分子に結合させた２つのＩＧＦムテインを含む「ダンベル」型分子を作製するために、２個の活性基を含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーを使用することが可能である。例えば、ＰＥＧビス−マレイミド（ＰＥＧ分子の各末端にマレイミド活性基を含むポリエチレングリコールポリマー）を、「ダンベル」型分子の作製に使用することが可能である。こうしたダンベル型分子には、異なった構造を持つ第２のタンパク質又はペプチドにＰＥＧを介して共有結合した単一のＩＧＦムテインも包含しうる。この第２のタンパク質又はペプチドは例えば、血小板由来増殖因子のような増殖因子、又は、線維芽細胞増殖因子であることが可能である。当業者は、有効収量のモノＰＥＧ化ＩＧＦ−１（ＩＧＦ−ＰＥＧ）又はダンベル型ＩＧＦ−１（ＩＧＦ−ＰＥＧ−ＩＧＦ、ＩＧＦ−ＰＥＧ−ＰＤＧＦ、もしくは、ＩＧＦ−ＰＥＧ−ＦＧＦ）のどちらかを調製するのに必要な、適切なｐＨとタンパク質濃度と「タンパク質：ＰＥＧ」比率とを、こうした決定を行うための当業界で公知の従来の方法を使用して容易に決定することが可能である。本発明の方法は医薬上許容可能な組成物を更に含む。ＩＧＦムテイン又はＰＥＧ結合体を医薬上許容可能な担体と混合し、本発明の医薬上許容可能な組成物を製造することが可能である。本明細書で使用する用語「医薬上許容可能な担体」は、組成物の活性成分に対して悪影響を与えず且つその組成物が投与される患者に対して悪影響を与えない、活性成分用の無毒で一般的に不活性の賦形剤を意味する。適切な賦形剤又は担体は、標準的な薬剤学の教科書に記載されており、例えば、本明細書に参考として組み入れるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１６版，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８０）中に見出すことが可能である。こうした担体は、例えば、炭酸水素塩緩衝液、リン酸緩衝液、リンガー液、及び、生理的食塩水のような水溶液を含む。これに加えて、この担体は、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、無菌性、安定性、溶解速度、又は、臭いを改変又は維持するための他の医薬上許容可能な賦形剤を含むことが可能である。この医薬上許容可能な組成物は、例えば試薬の単純混合を含む当業界で公知の方法によって調製可能である。当業者は、医薬用担体の選択と上記組成物の適切な調製とが、意図された投与方法と投与形態とに応じて行われることを理解するだろう。実施様態の１つでは、担体とＩＧＦムテイン又は結合体とが生理学的に適合性のある徐放性製剤を構成することを意図している。こうした担体中の主溶媒は水性溶媒又は非水性溶媒のどちらであってもよい。これに加えて、担体は、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、無菌性、安定性、溶解速度、又は、臭いを改変又は維持するための他の医薬上許容可能な賦形剤を含むことが可能である。同様に、この担体は、ＩＧＦムテイン又は結合体の安定性と溶解速度と放出と吸収を改変又は維持するための更に別の医薬上許容可能な賦形剤を含むことが可能である。こうした賦形剤は、単回用量形態又は多回用量形態（ｍｕｌｔｉ−ｄｏｓｅｆｏｒｍ）の形の非経口的投与用の薬用量を調合するために一般的に且つ慣習的に使用される物質である。医薬組成物の配合が終わると直ちに、この組成物は、溶液、懸濁液、ゲル、乳剤、固体、脱水粉末、又は、凍結乾燥粉末として無菌容器中に貯蔵することが可能である。こうした製剤は、そのまま直ちに使用可能な形態で貯蔵することも、投与直前に再構成が必要な形で貯蔵することも可能である。こうした製剤の貯蔵は、約４℃以下の温度、好ましくは−７０℃の温度で行うことが好ましい。ＩＧＦムテイン又は結合体を含むこうした製剤を、生理的ｐＨ又はその付近のｐＨで貯蔵及び投与することも好ましい。現時点では、高ｐＨ（即ち、８より高いｐＨ）又は低ｐＨ（即ち、５より低いｐＨ）の製剤としての投与は望ましくないと考えられている。全身的送達のためのＩＧＦムテイン又は結合体を含む組成物の投与方法は、皮下、筋肉内、静脈内、経口、鼻腔内、膣坐薬、又は、直腸座薬によるものであることが可能である。局所的送達のためのＩＧＦムテイン又は結合体を含む組成物の投与方法は、関節内、気管内、又は、呼吸路への滴注もしくは吸入によるものであることが好ましい。これに加えて、適切な組成物の形で又は適切な装置を使用して経口投与することによって消化管の特定の部分にＩＧＦムテイン又は結合体を投与することが望ましいだろう。経口投与の場合には、ＩＧＦムテイン又は結合体をカプセル封入する。カプセル封入ＩＧＦムテイン又は結合体を、固体投薬形態の組成物で慣習的に使用される医薬上許容可能な担体と共に、又は、こうした担体なしに、配合することが可能である。生物利用率が最大化され、且つ全身に送達される前に生じる分解が最少化される胃腸管内の特定の場所で、組成物の活性部分が放出されるように、上記カプセルを設計することが好ましい。ＩＧＦムテイン又は結合体の吸収を容易にするために、更に別の賦形剤を加えることが可能である。希釈剤、香味料、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、及び、結合剤を使用することも可能である。投与形態のいかんに係わらず、患者のおおよその体重に従って個々に用量を計算する。適切な用量を決定する際の他のファクターは、治療又は予防すべき疾病又は疾患、投与経路、患者の年齢、性別、病状を含むことが可能である。特定の実施様態では、患者の血流中のＩＧＦムテイン又は結合体の濃度が予め選択した濃度範囲になるように、用量と投与方法を計画する。血漿１ｍＬあたり０．０１μｇ未満のＩＧＦムテイン又は結合体の循環濃度を維持することによっては組成物の有効な効果が得られず、一方、血漿１ｍＬあたり１００μｇの過剰のＩＧＦムテイン又は結合体の循環濃度を維持することは、好ましくない副作用をもたらす可能性があると考えられる。上記組成物の各々を使用する治療のための適切な用量を決定するのに必要な計算を更に改善する努力は、当業者によって日常的に行われており、特に本明細書で開示している用量情報とアッセイの観点から、当業者によって不要な実験なしに日常的に行われている作業の範囲内に含まれる。こうした用量を、適切な用量−応答データに関連して使用する確立した用量決定アッセイを用いることによって確定することが可能である。本明細書に記載するＩＧＦムテイン又は結合体の医薬組成物をヒトに対して使用するばかりでなく獣医学的用途にも使用することが可能であること、また用語「患者」を限定的な形で解釈すべきではないこととに留意されたい。獣医学的用途の場合は、その用量範囲は上記用量範囲と同じであるべきである。ＩＧＦ関連疾患を有する又は潜在的に有する患者を治療するために、本発明の医薬組成物を使用することが可能である。こうした疾患の幾つかは、例えば、小人症、糖尿病、歯周病、骨粗鬆症を含む。普通の患者に対するＩＧＦの投与が所期の効果をもたらす疾患を治療するために本発明の医薬組成物を使用することが可能であり、例えば普通の身長の患者の成長を促進するためにＩＧＦ−１を使用することが可能である。下記の実施例は、本発明を限定することなしに、本発明を説明することを意図している。実施例１Ａ．ＩＧＦ−１遺伝子の構築ＩＧＦ−１遺伝子を２つの段階によって構築した。最初に、ＩＧＦ−１をコードするＤＮＡ配列を、Ｅ．ｃｏｌｉＯＭＰＡタンパク質（ｏｍｐＡＬ）の分泌リーダー配列をコードするＤＮＡ配列に結合させた。ＩＧＦ−１がＥ．ｃｏｌｉから効率よく分泌されることが可能かどうかを決定するために、上記遺伝子融合体を構築した。ＯｍｐＡリーダー配列をコードするＤＮＡ配列を欠失し、このＯｍｐＡリーダー配列をコードするＤＮＡ配列を、ＩＧＦ−１の細胞内発現を可能にするＤＮＡ配列で置き換えることによって、ＩＧＦ−１がＥ．ｃｏｌｉ内の細胞内タンパク質として発現させられる第２の構築物を作製した。Ｂ．ＯｍｐＡＬ−ＩＧＦ−１遺伝子融合体の構築４つの合成オリゴヌクレオチド標識ＯｍｐＡ１Ｕ：５′ＧＡＴＣＣＧＡＴＣＧＴＧＧＡＧＧＡＴＧＡＴＴＡＡＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＣＧＣＡ３′（配列番号：２）、ＯｍｐＡ２Ｕ：５′ＧＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＧＴＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＧＣＴＣＣＧＴＧＧＣＡＧＴＧＣ３′（配列番号：３）、ＯｍｐＡ１Ｌ：５′ＣＡＧＴＧＣＣＡＣＴＧＣＧＡＴＣＧＣＧＡＴＡＧＣＴＧＴＣＴＴＴＴＴＣＡＴＴＴＡＡＴＣＡＴＣＣＴＣＣＡＣＧＡＴＣＧ３′（配列番号：４）、及び、ＯｍｐＡ２Ｌ：５′ＧＣＡＣＴＧＣＣＡＣＧＧＡＧＣＧＧＣＣＴＧＣＧＣＴＡＣＧＧＴＡＧＣＧＡＡＡＣＣＡＧＣ３′（配列番号：５）は、対（１Ｕ＋１Ｌ、及び、２Ｕ＋２Ｌ）をなしてアニーリングし、これらの対は互いに結合した。これら４つのオリゴヌクレオチドを、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入したＤＮＡ合成装置（Ｍｏｄｅｌ３９１及び３８０Ａ）を使用して合成した。その後で、連結反応混合物を制限酵素ＨａｅＩＩＩで消化した。その結果、翻訳開始シグナルとｏｍｐＡシグナル配列の最初の２１アミノ酸とをコードするＢａｍＨＩ／ＨａｅＩＩＩ制限フラグメントを得、このフラグメントを精製した。このＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩ＋ＰｓｔＩ消化ＰＵＣ１８ＤＮＡ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮから入手可能）と混合し、２つの合成オリゴヌクレオチド［ＩＧＦ−１（１−１４）Ｕ＋Ｌ］５′ＣＣＧＧＴＣＣＧＧＡＧＡＣＴＣＴＧＴＧＣＧＧＣＧＣＡＧＡＡＣＴＧＧＴＴＧＡＣＧＣＴＣＴＧＣＡ３′（配列番号：６）と５′ＧＡＧＣＧＴＣＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＧＣＧＣＣＧＣＡＣＡＧＡＧＴＣＴＣＣＧＧＡＣＣＧＧ３′（配列番号：７）を互いに連結反応させた。連結反応混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＪＭ１０９（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡから入手可能）を形質転換するために使用し、個々のコロニーを単離した。これらのプラスミド（ＯｍｐＡＬＩＧＦ−１ｐＵＣ１８）は、翻訳開始シグナルと、このシグナルの後に続く、ＯｍｐＡシグナル配列とＩＧＦ−１の最初の１４アミノ酸とをコードするＤＮＡ配列とを有する。ＩＧＦ−１のアミノ酸１５−７０をコードするＤＮＡ配列を含むＭ１３ファージを、２つのオリゴヌクレオチド相補対（ＩＧＦ１Ｕ＋１Ｌ、及び、１ＧＦ２Ｕ＋２Ｌ）５′ＧＴＴＣＧＴＡＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣＧＴＧＧＣＴＴＣＴＡＣＴＴＣＡＡＣＡＡＡＣＣＧＡＣＴＧＧＣＴＡＣＧＧＴＴＣＣＡＧＣＴＣＴＣＧＴＣＧＴＧＣＡＣＣＧＣＡＧＡＣＴＧＧＴＡＴＣ３′（配列番号：８）、及び、５′ＴＴＣＧＴＣＡＡＣＧＡＴＡＣＣＡＧＴＣＴＧＣＧＧＴＧＣＡＣＧＡＣＧＡＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＣＧＴＡＧＣＣＡＧＴＣＧＧＴＴＴＧＴＴＧＡＡＧＴＡＧＡＡＧＣＣＡＣＧＧＴＣＧＣＣＧＣＡＴＡＣＧＡＡＣＴＧＣＡ３′（配列番号：９）を互いに連結反応させることと、そのＤＮＡ配列をＰｓｔＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ消化Ｍ１３ｍｐ１９ＤＮＡ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡから市販入手可能）の中にクローニングすることによって作製した。二本鎖ＤＮＡをファージクローンから精製し、ＩＧＦ−１タンパク質のアミノ酸１５−７０をコードするＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを単離した。このＤＮＡフラグメントをＰｓｔＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ消化プラスミドＯｍｐＡＬＩＧＦ−ＩｐＵＣ１８ＤＮＡと連結反応させ、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＪＭ１０７（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから市販入手可能）を形質転換するために使用した。ＯｍｐＡＬ配列に融合したＩＧＦ−１遺伝子を含むＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを単離し、プラスミドｐＴ３ＸＩ−２のＢａｍＨＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ生成部位中にクローニングした（１９９１年６月１３日付けで公開されたＰＣＴ出願公開第ＷＯ９１／０８２８５号に説明されている）。ｏｍｐＡＬ−ＩＧＦ −１遺伝子融合体を含む完成プラスミドを、ｐＴ３ＸＩ−２ φ１０Ｃ（ＴＣ３）ｏｍｐＡＬＩＧＦ−１と呼ぶ。Ｃ．メチオニル−ＩＧＦ−１遺伝子の構築上記のＯｍｐＡＬ−ＩＧＦ−１遺伝子融合体を含むＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、プラスミドｐＴ３ＸＩ−２ φ１０Ｃ（ＴＣ３）ｏｍｐＡＬＩＧＦ−１から精製し、ＨｉｎｆＩで消化した。約２００ｂｐのＨｉｎｆＩ／ＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡフラグメントを、アニーリングした相補的合成オリゴヌクレオチド（ＭｅｔＩＧＦＩＵ＋１Ｌ）５′ＧＡＴＣＣＧＡＴＣＧＴＧＧＡＧＧＡＴＧＡＴＴＡＡＡＴＧＧＣＣＧＧＴＣＣＧＧＡＧ３′（配列番号：１０）と５′ＡＧＴＣＴＣＣＧＧＡＣＣＧＧＣＣＡＴＴＴＡＡＴＣＡＴＣＣＴＣＣＡＣＧＡＴＣＧ３′（配列番号：１１）と混合し、ＢａｍＨＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ消化プラスミドｐＴ３ＸＩ２ＤＮＡと連結反応させ、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０７を形質転換するために使用した。完成したプラスミド構築物をφ１０Ｃ（ＴＣ３）ＩＧＦ−１ｐＴ３ＸＩ−２と呼び、このプラスミドは、イニシエーターメチオニンとＩＧＦ−１配列の開始点との間に余分のアラニン残基を含む。変異体ＩＧＦ −１遺伝子を含むＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを単離し、プラスミドｐＴ５ＴのＢａｍＨＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ生成部位の中に結合させた（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４３，Ｎｏ．６２５６，ｐｐ．３４１−３４６，１９９０に記載）。Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１／ＤＥ３（米国特許第４，９５２，４９６号に記載）を形質転換するために連結反応混合物を使用し、その結果得た個々のコロニーを単離した。この構築物をφ１０Ｃ（ＴＣ３）ＩＧＦ−１ｐＴ５Ｔと名付けた。上記余分のアラニンコドンをインビトロ突然変異誘発によって取り除いた。インビトロ突然変異誘発を、Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から購入したＭｕｔａ−ＧｅｎｅＫｉｔを使用して行った。行った突然変異誘発手順は、そのキットに添付された説明書に記載された手順と概ね同じだった。プラスミドφ１０Ｃ（ＴＣ３）ＩＧＦ−１ｐＴ３ＸＩ−２をＢａｍＨＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、変異体ＩＧＦ−１遺伝子を含む２００ｂｐＤＮＡフラグメントを精製し、プラスミドＭ１３ｍｐ１９のＢａｍＨＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の中にクローニングした。ウラシルを含む一本鎖鋳型ＤＮＡを調製した後に、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＣＪ２３６（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡから購入したＭｕｔａ−ＧｅｎｅＫｉｔと共に入手）中でのファージの増殖を行った。突然変異誘発に使用したオリゴヌクレオチドは、配列：５′ＧＡＴＧＡＴＴＡＡＡＴＧＧＧＴＣＣＧＧＡＧＡＣＴ３′（配列番号：１２）を有した。突然変異誘発反応生成物を、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＪＭ１０９の形質転換に使用し、個々のプラークを採取した。個々のファージからの二本鎖複製形態ＤＮＡを単離し、ＢａｍＨＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＩＧＦ−１遺伝子を含む２００ｂｐフラグメントを精製した。精製したＤＮＡを、プラスミドｐＴ５ＴのＢａｍＨＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ生成部位の中にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１／ＤＥ３の形質転換に使用した。適正なプラスミドを有する１つのバクテリアコロニーをφ１０Ｃ（ＴＣ３）ｍｕｔＩＧＦ−１ｐＴ５Ｔと名付けた。幾つかの単離物を配列決定したが、全てが適正だった。実施例２ＩＧＦ−１ムテインの構築幾つかのＩＧＦ−１ムテインを構築した。これらの中の３つのムテインでは、ＩＧＦ−１の最初の３つのアミノ酸の各々がシステイン残基で置き換えられた。この３つのムテインを、各々Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３と呼ぶ。第４のムテインは、Ｎ末端メチオニン残基とＩＧＦ−１の最初のアミノ酸との間にシステイン残基を導入した。このムテインを−１Ｃと呼ぶ。ＩＧＦ−１の−１Ｃ、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３ムテインを、下記で説明する通りのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用して作製した。突然変異誘発実験に使用した開始プラスミドは、実施例１で説明したφ１０（ＴＣ３）ｍｕｔＩＧＦ−１ｐＴ５Ｔだった。このプラスミドは、イニシエーターメチオニンとその後に続く天然ヒトＩＧＦ−１タンパク質配列とをコードするＤＮＡ配列を含む。所期の突然変異を含む５′突然変異誘発オリゴヌクレオチドと適正な配列の３′オリゴヌクレオチドとを使用して、変異体ＩＧＦ−１ＤＮＡ配列を上記遺伝子から増幅した。ＮｄｅＩ制限酵素切断部位（ＣＡＴＡＴＧ）の一部分として上記遺伝子の最初のメチオニンを５′突然変異誘発オリゴヌクレオチドが取り込むように、その５′突然変異誘発オリゴヌクレオチドを設計した。各々の突然変異誘発オリゴヌクレオチドは、所期の変異と、その後に続く、プラスミドφ１０（ＴＣ３）ｍｕｔＩＧＦ−１ｐＴ５Ｔ中のＩＧＦ−１遺伝子配列に完全に一致した１５−２１ヌクレオチドとを含んでいた。３′オリゴヌクレオチドは、長さが２５ヌクレオチドであり、ＩＧＦ−１の最後の６つのコドンをコードし且つ停止コドンの後に続くＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むように設計された。これに加えて、野生型クローンを、最初のメチオニンとしてｐＴ５Ｔ（上記）のＮｄｅｌ部位を使用して上記と同様に作製した。この野生型クローンを８５ｐ −１１と呼ぶ。−１Ｃ、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３ムテイン及び８５ｐ−１１野生型クローンを構築するために使用したオリゴヌクレオチドを次の表１に示す。各々のオリゴ２０ｐｍｏｌと、鋳型ＤＮＡとしてのプラスミドφ１０（ＴＣ３）ｍｕｔＩＧＦ−１ｐＴ５Ｔ約１ｎｇとを使用して、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．８）、１０ｍＭＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む１００μＬ反応物中で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。６５℃に維持したチューブを使用した第１の変性段階の後で、０．５μｌ（１．２５単位）のＰｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を加えた。その時に２滴の鉱油を反応物に重層した。ＥｒｉｃｏｍｐＴｗｉｎｂｌｏｃｋ^TMサーマルサイクラー（Ｅｒｉｃｏｍｐ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）中で、９５℃で１分間、６５℃で１分間、７２℃で１分間に亙って、反応を３０サイクル実施した。最後の反応サイクルの後で、反応生成物を１０分間７２℃に維持した。ＰＣＲの後で、反応生成物８０μＬを１回フェノール抽出し、その後でエタノールで沈殿させた。沈殿したＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ）中に再懸濁させ、２０μＬをＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩとで消化し、１．５％アガロースゲル上で電気泳動した。約２１０ｂｐに移動した増幅ＤＮＡバンドを、製造者の指示に従ってＮＡ４５ペーパー（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄＳｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）を使用して溶離させた。溶離ＤＮＡをＴＥ緩衝液２０μＬ中に再懸濁させ、２μＬを、体積２０μＬの、ゲル精製したＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化プラスミドｐＴ５Ｔに連結反応させた。プラスミドｐＴ５Ｔは実施例１で説明している。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１／ＤＥ３を形質転換するために連結反応を使用し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上でコロニーを選択した。ミニプラスミドＤＮＡプレップを形質転換プレートからの幾つかのコロニーから作製した。ＤＮＡをＥｃｏＲＶとＨｉｎｄＩＩＩとで消化し、どの形質転換細胞がＩＧＦ −１ＤＮＡインサートを含むかを調べた。ＩＧＦ−１ＤＮＡインサートを含むプラスミドを配列決定し、そのインサートが適正に突然変異したことを確認した（各々のムテイン毎にＩＧＦ遺伝子全体を配列決定した）。各々のムテイン質に関する代表的な形質転換細胞を［ＬｕｒｉａＢｒｏｔｈ＋１２μｇ／ｍＬテトラサイクリン中で約１．０の概算ＯＤ₆₀₀まで増殖させることによって、予備的な増殖試験を行った。Ｔ７ポリメラーゼの発現と、それに続くＩＧＦムテインの転写と翻訳とを誘発するために、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭに加えた。２分間沸騰させることによって約０．１ＯＤ単位の細胞をＳＤＳ試料緩衝液中で溶解し、１６％ポリアクリルアミドＳＤＳゲル上で電気泳動した。そのゲルをクーマシーブルーで染色した。予測したサイズ（約７−８ｋＤａ）のＩＧＦ−１タンパク質バンドを、各々のムテインと野生型対照とに関して、誘発細胞を載せたレーンにおいて観察した。野生型ＩＧＦ−１の残基１１、１２、１５、１６、５５、６４、６５、６７、６９においてアミノ酸をシステインで置換したムテインも、ＰＣＲを使用して調製した。ＰＣＲ用の鋳型は、クローン８５ｐ−１１からの全長プラスミド、又は、野生型ＩＧＦ−１遺伝子を含むクローン８５ｐ−１１からのＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントのどちらかだった。ムテインＣ１１、Ｃ１２、Ｃ１５、Ｃ１６の場合には、ＮｄｅＩ部位（ＣＡＴＡＴＧ）の一部分として最初のメチオニンを取り込んだ５′オリゴヌクレオチドを合成し、これらのオリゴヌクレオチドの各々は、クローン８５ｐ−１１に完全に一致した２１−２４ヌクレオチドがその後に続く所期の突然変異を含んでいた。これらのオリゴヌクレオチドを表２に示す。この遺伝子の３′末端では、停止コドンの後に続く［ＩＧＦ−１の最後の６つのコドン＋ＨｉｎｄＩＩＩ部位］に一致する２５−ｍｅｒオリゴヌクレオチド（ＩＧＦ（２６２ｐ）２５）を使用した。ＩＧＦ（２６２ｐ）２５を表１に示す。ムテインＣ５５、Ｃ６４、Ｃ６５、Ｃ６７、Ｃ６９に関しては、ＨｉｎｄＩＩＩ部位（ＡＡＧＣＴＴ）と停止コドン（ＴＡＡ）とを含み、且つ、クローン８５ｐ−１１に完全に一致した２１−２７ヌクレオチドがその後に続く所期の突然変異を含む３′オリゴヌクレオチドを合成した。上記遺伝子の５′末端に関しては、「ＩＧＦ−１の最初の７つのコドン＋ＮｄｅＩ部位に取り込まれたメチオニンの開始コドン」に一致した２８−ｍｅｒオリゴヌクレオチド（ＩＧＦ（８５ｐ）２８）を使用した。これらのオリゴヌクレオチドを表３に示す。各々のオリゴ２０ｐｍｏｌ、鋳型ＤＮＡ約１ｎｇ、ｄＡＴＰ２００μＭ、ｄＣＴＰ２００μＭ、ｄＧＴＰ２００μＭ、ｄＴＴＰ２００μＭ、各オリゴプライマー２０ｐｍｏｌ、及び、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）１μＬ（２．５Ｕ）とを使用して、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．８）、１０ｍＭＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む１００μＬ反応中で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９６００（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）中で、９５℃で１分間、６５℃で１分間、７２℃で１分間に亙って、反応を３０回サイクル実施した。最後の反応サイクルの後で、反応生成物を１０分間７２℃に維持した。ＰＣＲを行った後に、ＣｈｒｏｍａＳｐｉｎ１００カラム（ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂ．Ｉｎｃ．，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）を通過させることによって反応混合物を精製した。精製ＰＣＲフラグメントをＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩとで消化し、製造者の指示に従ってＮＡ４５ペーパー（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄＳｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）を使用して〜２１０ｂｐバンドを１．５％アガロースゲルから溶出させた。二重切断のゲル精製ＤＮＡフラグメントを、同様に切断しゲル精製したｐＴ５Ｔプラスミドに１８時間１５℃で連結反応させた。その結果得た連結反応混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５ａを形質転換するために使用し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で平板培養した。Ｑｉａｇｅｎプラスミドキットを使用して複数のコロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、ＴａｑＤｙｅＤｅｏｘｙＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＩＧＦ−１遺伝子全体を配列決定した。各ムテイン（クローンＣ１１−１、Ｃ１２−３、Ｃ１５−１、Ｃ１６−４、Ｃ５５− １、Ｃ６４−１、Ｃ６５−１、Ｃ６７−２、Ｃ６９−１）毎に適正な構築物を選択し、発現のためにＥ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１／ＤＥ３に形質転換した。各々のムテインの２つの代表的な形質転換細胞を［ＬＢ＋１２μｇ／ｍＬテトラサイクリン］中で約０．６−０．８の概算ＯＤ₆₀₀まで増殖させることによって、予備的な発現試験を行った。ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように加え、更に２時間、細胞を増殖させた。ＩＰＴＧは、Ｔ７ポリメラーゼの発現とそれに続くＩＧＦムテインの転写と翻訳を誘発した。約０．１ＯＤ単位の細胞（非誘発細胞とＩＰＴＧ誘発細胞の両方）を、β−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ試料緩衝液中で溶解し、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動した。そのゲルをクーマシーブルーで染色し、予測したサイズのＩＰＴＧ誘発ＩＧＦ−１ムテインバンドを、各々のムテイン毎に誘発細胞を載せたレーンにおいて観察した。実施例３ムテインの発現、再折り畳み、及び精製下記ではＣ３ムテインについて説明するが、同じ手順を、本発明の範囲に含まれることが意図されている他のムテインに適用する。唯一の相違点は、使用する出発細胞である。ＩＧＦ−１Ｃ３ムテインを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、緩衝液Ａ（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、２０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ））中に「緩衝液Ａ４０ｍＬ：細胞ペースト１０ｇ」の濃度に懸濁させ、ＦｒｅｎｃｈＰｒｅｓｓｕｒｅＣｅｌｌ（ＳＬＭＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，ＵｒｂａｎａＩＬ）を使用して１８００ｐｓｉで破壊した。その懸濁液を３０分間２０，０００ｘｇで遠心し、ペレットと上清液のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＩＧＦ−１Ｃ３ムテインに対応する主バンドがペレットに存在したが、上清液には存在しなかつた。ペレットを「緩衝液Ａ４０ｍＬ：細胞ペースト１０ｇ」の濃度に緩衝液Ａ中に懸濁させ、その懸濁液を再び３０分間２０，０００ｘｇで遠心した。この洗浄作業を２回繰り返した。ＩＧＦ−１Ｃ３ムテインを含む最終ペレットを、すり合せガラスホモジナイザーを使用して「緩衝液２５ｍＬ：細胞ペースト１０ｇ」の濃度に、緩衝液（６Ｍグアニジン、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、６ｍＭＤＴＴ）中に懸濁させた。その懸濁液を室温で１５分間インキュベートした。３０分間２０，０００ｘｇで遠心し、不溶性タンパク質を取り除いた。Ｃ３ムテインの最終濃度は１．０ｍｇ／ｍＬだった。実施例２の手順に従って行ったペレットと上清液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析からは、ＩＧＦ−１Ｃ３ムテインが上清液中にだけ存在することを明らかになった。変性させ且つ還元したこのＩＧＦ−１ムテインに対して、次の３段階の折り畳み(refolding)手順を行った。（１）酸化型グルタチオンである混合ジスルフィド生成試薬（ＧＳＳＧ）を上記上清液に最終濃度２５ｍＭにまで加え、室温で１５分インキュベートした。（２）その後で、溶液を５０ｍＭトリス（ｐＨ９．７）で徐々に１０倍に希釈し、フェニルメチルスルホニルフルオリドを最終濃度１ｍＭにまで加え、更に、システインを最終濃度５ｍＭにまで加えた。タンパク質の最終濃度は１００μｇ／ｍＬだった。（３）折り畳み混合物を４℃で一晩インキュベートし、その後で１５分間２０，０００ｘｇで遠心した。ペレットと上清液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、上清液が比較的均一なＩＧＦ−１ムテインからなることが明らかになった。上清液のアリコート（５０μＬ）を緩衝液Ｂ（０．０５％ＴＦＡ）で２００μ Ｌに希釈し、逆相カラム（ＲＰ−４、１ｘ２５０ｍｍ、Ｓｙｎｃｈｒｏｍ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＩＮ）上に注入し、０．２５ｍＬ／分の流速で直線勾配（２％緩衝液Ｃ／分の増加）を使用して緩衝液Ｃ（８０％アセトニトリル、０．０４２％ＴＦＡ）によって溶出させた。折り畳みＩＧＦ−１Ｃ３ムテインを表す単一の主ピークが２６．５分に溶出した。折り畳みＩＧＦ−１Ｃ２ムテインが２６．０分に溶出した。完全に還元し、５Ｍグアニジン、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭＤＴＴ中で変性させた後では、折り畳みＩＧＦ−１Ｃ３ムテインの保持時間は３２．２分にシフトし、折り畳みＩＧＦ−１Ｃ２ムテインの保持時間は３１．７分にシフトした。この結果は、上記条件下でＣ３とＣ２ムテインの両方が単一の主要種に折り畳まれたことを示している。２６．６分に溶出したＩＧＦ− １Ｃ３ムテインのＮ末端配列分析によって、配列ＭＧＰＣＴＬＣ（配列番号：２９）が得られ、天然ヒトＩＧＦ−１のＮ末端配列の３位においてグルタミン酸がシステイン残基で置き換えられていることを確認した。Ｅ．ｃｏｌｉによって発現された組換えタンパク質のＮ末端に余分のメチオニン残基が存在する。２６．０分に溶出したＩＧＦ−１Ｃ２ムテインのＮ末端配列分析によって、配列ＧＣＥＴＬＣ（配列番号：３０）が得られ、天然ヒトＩＧＦ−１のＮ末端配列の２位においてプロリンがシステイン残基で置き換えられていることを確認した。Ｃ５５、Ｃ６４、Ｃ６５、Ｃ６７、又はＣ６９ムテインを含む折り畳み(refol d)上清液を、上清液のアリコート（５０μＬ）を緩衝液Ｂ（０．０５％ＴＦＡ）で２００μＬに希釈し、その希釈上清液を逆相カラム（ＲＰ−４、１ｘ２５０ｍｍ、Ｓｙｎｃｈｒｏｍ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＩＮ）上に注入し、０．２５ｍＬ／分の流速で直線勾配（２％緩衝液Ｄ／分の増加）を使用して緩衝液Ｄ（１００％アセトニトリル、０．０４２％ＴＦＡ）で溶出させることによって分析した。２つの別々の主対称ピーク（各々１：１の比）であるＰｋＩ及びＰｋＩＩがそれぞれ２０．５分、２１．５分に溶出した。このパターンは、野生型（「ＷＴ」）ＩＧＦ−Ｉに関して観察されたパターン（本明細書に参考として組み入れるＭｅｎｇ他，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｖｏｌ．４４３，ｐｐ．１８３− １９２（１９８８）を参照されたい）に酷似している。ＷＴ折り畳みにおいて観察された、より早い時点の溶出ピークが、Ｓ−Ｓ帰属Ｃ６−Ｃ４７、Ｃ４８−Ｃ５２、及び、Ｃ１８−Ｃ６１を有するＩＧＦ−１のアイソマー形であることが判明しており、一方、より遅い時点の溶出ピークが、Ｓ−Ｓ帰属Ｃ６−Ｃ４８、Ｃ４７−Ｃ５２、及びＣ１８−Ｃ６１を伴って適正に折り畳まれる（本明細書に参考として組み入れるＲａｓｃｈｄｏｒｆ他，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ＆ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｖｏｌ．１６，ｐｐ．３−８（１９８８）を参照されたい）。２１．５−２３．０分に溶出するサイズの異なる非対称ピークも、折り畳み上清液中に存在する。この材料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、この材料がＩＧＦ−１の誤まって折り畳まれた単量体及び多量体形を含むことを示す。Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１５、又はＣ１６ムテインを含む折り畳み上清液のＲＰ４分析は、２０．５ −２１．５分に溶出する複数のピークの存在と、２１．５−２３．０分に溶出する多量（全体の５０−７５％）の見掛け上は誤まって折り畳まれた材料の存在とを示した。折り畳まれたムテインを５Ｍグアニジン、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭＤＴＴ中で完全に還元し変性させた後では、折り畳まれたそのムテインの保持時間は２７分にシフトした。このことは、ジスルフィドの還元後にその折り畳まれた形態が単一のポリペプチドに「折り畳まれる（ｃｏｌｌａｐｓｅ）」ことを示している。従って、ＲＰ４ピークは、異なったジスルフィド結合を有するＩＧＦムテインの別個の形態を表す。実施例４折り畳まれたＩＧＦ−１ムテインの単離実施例３の折り畳まれたＣ２又はＣ３ムテインのどちらかを含むＥ．ｃｏｌｉペースト２０ｇから調製した折り畳み混合物を、１００ｍＬに濃縮し、５ＭＨＣｌでｐＨ５．５に酸性化し、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）に対して透析し、上記酢酸ナトリウム緩衝液で予め平衡化したＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫＢ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）カラム（１．６ｘ１５ｃｍ）上に添加した。結合したタンパク質を０Ｍから０．５ＭのＮａＣｌの直線勾配３００ｍＬで溶出させた。３ｍＬのフラクションを集めた。単一の主タンパク質ピークが０．２−０．３ＭＮａＣｌで溶出した。各ピークのアリコート（１００μＬ及び２５μＬ）を逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−４，１ｘ２５０ｍｍ）及びゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５，３．２ｘ３００ｍｍ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫＢ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で別々に分析した。ゲル濾過は、折り畳み上清液中に存在したＩＧＦの二量体および多量体形から単量体を効果的に分離する。大部分が単量体であるＣ３ムテイン（ゲル濾過とＲＰ−４分析から決定される）を含むフラクションをプールし、２．０ｍｇタンパク質／ｍＬに濃縮し、アリコート２．０−５．０ｍＬを、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５），２５０ｍＭＮａＣｌで予め平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−１００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫＢ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）ゲル濾過カラム（２．６ｘ１００ｃｍ）に載せた。タンパク質は２．０ｍＬ／分で溶出し、各フラクションのアリコート（１０μＬ）を、実施例２の手順によってＲＰ−４逆相クロマトグラフィーとＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。純度９５％以上のＩＧＦ−１Ｃ３又はＩＧＦ−１Ｃ２ムテイン単量体の折り畳まれた単一種を含むフラクションをプールし、２５０μｇ／ｍＬに濃縮した。この材料を生物活性に関してアッセイし、下記の通りに８．５ｋＤａポリエチレングリコールと反応させた。Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ５５、Ｃ６４、Ｃ６５、Ｃ６７、及びＣ６９ムテインに関し、折り畳み上清液を２０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）に対して透析し，１０−１５倍に濃縮し、同じ緩衝液で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ゲル濾過カラム上に載せた。その後で単量体をプールし、ＲＰ− ４カラム（ＲＰ−４，２．１ｘ２５０ｍｍ、Ｓｙｎｃｈｒｏｍ）上に載せ、流速１．０ｍＬ／分で直線勾配（２％緩衝液Ｂ／分の増加）を使用して緩衝液Ｂ（１００％アセトニトリル、０．０４２％ＴＦＡ）で溶出させた。Ｃ１２、Ｃ５５、Ｃ６４、Ｃ６５、Ｃ６７、及びＣ６９ムテインは、ＷＴＩＧＦ−Ｉに関して観察されたパターン（Ｍｅｎｇ他，上記）に酷似している２つの異なるＲＰ−４単量体ピーク（各々１：１の比、ＰｋＩ及びＰｋＩＩ）に折り畳まれた。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５からのＣ１２及びＣ１５単量体フラクションも、ＰＩＩ後（２１．５分−２３．０分）に溶出した多量の見掛け上は誤まって折り畳まれた材料を含んでいた。Ｃ１１、Ｃ１５、及びＣ１６単量体は、ＲＰ−４で分析した時に、多重（３−６個）のピークを含んでいた。単量体ピークを別々に集めて、生物活性アッセイを行い、更に質量分析を行った（下記参照のこと）。単量体ピークの質量分析を、Ｓｃｉｅｘ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａから入手したＡＰＩＩＩＩを使用して行った。折り畳まれた（ジスルフィド結合が損なわれていない）単量体と還元・変性された単量体の両方に対して質量分析を行った。次の質量を得た。還元されたムテインの質量は、実験誤差の範囲内で、上記システイン突然変異をもつポリペプチドの予想質量に一致する。折り畳まれた単量体の質量は、３つの分子内ジスルフィド結合と、システイン−グルタチオン（Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−グルタチオン）又はシステイン−システイン（Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ）のどちらかの単一の混合ジスルフィドとを有するポリペプチドの予想質量に一致する。混合ジスルフィドは折り畳みの間に形成され、無傷のまま維持されるが、これは分子内ジスルフィドの形成に使用可能な他のシステイン残基がその分子の中に存在しないからである。Ｃ６９ムテインの大規模な精製も行った。洗浄した封入体（ＷＩＢＳ）８ｇｍからの折り畳まれた混合物を４００ｍＬまで〜１０倍に濃縮し、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）に対し透析した。アリコート２００μＬを、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５），２５０ｍＭＮａＣｌとで予め平衡化したｓｅｐｈａｃｒｙｌＳ−１００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫＢ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）ゲル濾過カラム（１０ｘ８０ｃｍ）上に載せた。フラクションを毎分２５ｍＬで溶出させ、各フラクションのアリコート（５０μＬ）をＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析した。単量体を含むフラクションをプールした。Ｃ６９の２つのアイソマー形態を分離するために、Ｓ−１００単量体プール２００ｍＬを、１．１Ｍ硫酸アンモニウム−２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５（緩衝液Ａ）で希釈し、緩衝液Ａで予め平衡化したＯｃｔｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫＢ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）カラム（２．５ｘ２０ｃｍ）上に載せた。結合したタンパク質を、緩衝液Ａから５０％緩衝液（５０％エタノール−２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５）の直線勾配７５０ｍＬで溶出させた。フラクション１２ｍＬを集めた。２つの主タンパク質ピークが２５％緩衝液Ｂと３２％緩衝液Ｂとにおいて溶出した。各ピークのアリコート（５０μＬ）を逆相（ＲＰ−４、１ｘ２５０ｍｍ）で分析した。〜３２−３８％緩衝液Ｂで溶出した、大部分が適正に折り畳まれた（ＲＰ−４分析によって決定）Ｃ６９を含むフラクションをプールした。逆相分析は、適正に折り畳まれたＣ６９のプールが９５％以上均一であることを示した。この材料の生物活性をアッセイした（下記参照のこと）。実施例５ムテインのＰＥＧ化Ｃ３、Ｃ２、及び、Ｃ６９ムテインを、２段階のプロセスによって、マレイミド活性基を有する８．５ｋＤａポリエチレングリコール（８．５ｋＤａＰＥＧ）又は２０ｋＤａポリエチレングリコール（２０ｋＤａＰＥＧ）と共有結合させた。（１）１４ｍＭ酢酸ナトリウム、３３ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中にＩＧＦ−１ムテイン２．３ｍｇ（２９６ｎｍｏｌ）とＤＴＴ１７０μｇ（１１１０ｎｍｏｌ）とを含む反応混合物１５ｍＬ中ＤＴＴによって、精製ＩＧＦ− １ムテインを部分還元した。タンパク質の最終濃度は１０μｇ／ｍＬであり、ＤＴＴ：タンパク質のモル比は３．７５：１だった。Ｃ６９ムテインとの反応のために、ＤＴＴ９１μｇ（５９２ｎｍｏｌ）を使用し、ＤＴＴ：タンパク質のモル比は２：１だった。反応混合物を室温で３時間インキュベートし（Ｃ６９ムテインとの反応のために５時間）、１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）１．０ｍＬを加えて反応を停止させた。反応混合物を、４℃で一晩、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）に対し透析した。（２）タンパク質２．３ｍｇ（２９６ｎｍｏｌ）、１５ｍＭ酢酸ナトリウム中の８．５ｋＤａＰＥＧ９．９８５ｍｇ（１１７４ｎｍｏｌ）、２６ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を含む反応混合物２０ｍＬ中で、８．５ｋＤａＰＥＧ又は２０ｋＤａＰＥＧのどちらかと、部分還元ＩＧＦ−１ムテインとを反応させた。タンパク質の最終濃度は１１２ｍｇ／Ｌだった。８．５ｋＤａＰＥＧ：タンパク質のモル比は４：１だった。Ｃ６９ムテインとの反応の場合には、２０ｋＤａＰＥＧ：タンパク質のモル比は４：１だった。反応混合物を室温で３時間インキュベートし、４℃にすること又は−２０℃に凍結することによって反応を停止させた。実施例２の手順によって反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析し、部分還元ＰＥＧ化Ｃ２及びＣ３ムテインの約５０％がモノＰＥＧ化種に変換されたことが明らかになった。Ｃ３及びＣ２２０ｋＤａ−ＰＥＧ結合体はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上において約６０ｋＤａの相対分子量に移動した。Ｃ３及びＣ２８．５ｋＤａ−ＰＥＧ結合体はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上において約２３ｋＤａの相対分子量に移動した。約２０％の部分還元ＰＥＧ化Ｃ６９ムテインは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上において６７ｋＤａの相対分子量に移動するモノＰＥＧ化種に変換された。同一の部分還元条件とＰＥＧ化手順とで処理した野生型ＩＧＦ−１は、ＰＥＧ化しなかった。実施例６ＰＥＧ化ムテインの精製ＥＧ化Ｃ２又はＣ３ムテイン反応混合物（タンパク質約１００−２００ｍｇを含む）を、５ｍＭクエン酸（ｐＨ２．６）に対し４℃で十分に透析した。５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ２．６）で予め平衡化したＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫＢ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）カチオン交換カラム（２．５ｘ２５ｃｍ）を使用して、ＰＥＧ化ムテインを非ＰＥＧ化ムテインから分離した。結合したタンパク質を、０Ｍから１ＭのＮａＣｌの直線勾配２０００ｍＬを使用して溶出させた。フラクション２５ｍＬを収集した。ＰＥＧ化Ｃ２又はＣ３ムテインが０．２５−０．４ＭＮａＣｌで溶出し、非ＰＥＧ化ムテインが０．８−０．９ＭＮａＣｌで溶出した。ＰＥＧ化Ｃ２又はＣ３ムテインを含むフラクションをプールし、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００ゲル濾過クロマトグラフィーによって更に精製した。全タンパク質約２０ｍｇを含む濃縮フラクション１５ｍＬを、２５０ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）で予め平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫＢ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）カラム（２．６ｘ１００ｃｍ）上に載せた。タンパク質を毎分２．０ｍＬで溶出した。この材料のバルクは２００ｋＤａの見掛け分子量で溶出した。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアニオン交換クロマトグラフィーによって、Ｃ６９− ＰＥＧを非ＰＥＧ化Ｃ６９ムテインから分離した。全タンパク質１１ｍｇを含む反応混合物１００ｍＬを、２０ｍＭトリス（ｐＨ９．０）（緩衝液Ａ）で予め平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアニオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫＢ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）（２．６ｘ１００ｃｍ）上に載せた。結合したタンパク質を、流速５．０ｍＬ／分で２０ｍＭトリス（ｐＨ９．０）、１ＭＮａＣｌ（緩衝液Ｂ）の直線勾配によって溶出させた。フラクション１０ｍＬを収集した。Ｃ６９−ＰＥＧは５０ｍＭＮａＣｌで溶出し、１００ｍＭＮａＣｌで溶出した未反応単量体から適切に分離された。Ｃ６９−ＰＥＧをプールし、１３ｍＬに濃縮し、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、２５０ｍＭＮａＣｌで予め平衡化したＳ−２００ゲル濾過カラム（２．６ｘ１００ｃｍ）上に載せた。実施例７ＰＥＧ化ムテインの生物検定組換えヒトｍｅｔＩＧＦ−１（ｒＩＧＦ−１）（ＢａｃｈｅｍＣａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）と、様々な非ＰＥＧ化ムテイン及びＰＥＧ化ムテインとを、その相対的有糸分裂促進活性と、１９８９年１０月１９日付けで公開されたＰＣＴ出願公開第ＷＯ８９／０９７９２号に開示されている組換えインスリン様増殖因子結合タンパク質１（「ＩＧＦ−ＢＰ１」）に対する親和性とを調べるために試験した。Ａ．相対的有糸分裂促進活性無血清条件下においてこれらのタンパク質が様々な量で存在する時にラット骨肉腫細胞の中に取り込まれる³Ｈ−チミジンの相対量を測定することによって、Ｃ３及びＣ２ムテインとＰＥＧ化Ｃ３及びＣ２ムテインとの相対的有糸分裂促進（増殖促進）活性を、野生型ＩＧＦ−１の相対的有糸分裂促進活性と比較した。ラット骨肉腫細胞（ＵＭＲ１０６細胞系、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，受託番号ＣＲＬ−１６６１，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄから入手）を、４８穴組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）中の穴１個当たり、７％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２ｍＭＬ−グルタミンを含むＨａｍのＦ１２培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）０．５ｍＬ中に５−６Ｘ１０⁴ 細胞の密度でプレーティングした。３７℃で７２時間インキュベートし、細胞が集密化した後に、細胞をリン酸緩衝塩類液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１００Ｕ／ｍＬペニシリンと１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンと２ｍＭＬ−グルタミンとを含む無血清ＨａｍのＦ１２培地中で２４時間プレインキュベートした。プレインキュベーションの後に、ｒＩＧＦ−１、Ｃ３及びＣ２ムテイン、並びに、ＰＥＧ化Ｃ３及びＣ２ムテインの連続希釈液（１．０−１，０００ｎｇ／ｍＬ）を含む無血清ＨａｍのＦ１２培地０．５ｍＬを、別々に更に２０−２４時間インキュベートした。その後で、各々の穴を、³Ｈ−チミジン（ＮＥＮＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ，ＤｕＰｏｎｔＣｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）０．５ μＣｉで４時間パルス標識した後で、冷ＰＢＳで３回洗浄し、取り込んだ³Ｈ−チミジンを冷７％トリクロロ酢酸で沈殿させた（Ｊ．Ｔ．ＢａｋｅｒＩｎｃ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）。９５％エタノールで洗浄した後に、細胞を０．３ＭＮａＯＨで可溶化し、シンチレーション計数のためのアリコートを取り出した。³Ｈ−チミジンを液体シンチレーション計数で定量した。全てのアッセイを三つ組で行った。Ｃ３及びＣ２ムテインとＰＥＧ化Ｃ３及びＣ２ムテインとが組換えＩＧＦ−１と同じ最大レベルの³Ｈ−チミジンのＤＮＡ中への取り込みを促進することを確認した。Ｃ３及びＣ２ムテインとＰＥＧ化Ｃ３及びＣ２ムテインとの効力は、組換えＩＧＦ−１の効力の約３分の１から約４分の１だった。組換えＩＧＦ−１のＥＤ５０（最大活性の１／２を得るために必要な用量）は５−１０ｎｇ／ｍＬであり、これに対して、非ＰＥＧ化Ｃ３及びＣ２ムテインとＰＥＧ化Ｃ３及びＣ２ムテインのＥＤ５０は３０−４０ｎｇ／ｍＬだった。これらの実験は、ＩＧＦ−１の有糸分裂促進活性がＣ３及びＣ２ムテインとＰＥＧ化Ｃ３及びＣ２ムテインとによって実質的に保持されたことを示した。³Ｈ −チミジンのＤＮＡ中への取り込みによって測定する場合に、この４つの分子全てが、細胞分裂を促進することが可能である。この４つの分子全てが同一の最大レベルまで細胞分裂を促進することが可能である。上記アッセイを使用して、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ５５、Ｃ６４、Ｃ６５、Ｃ６７、及び、Ｃ６９ＩＧＦムテインのＲＰ−４ピーク（上記参照）の相対有糸分裂促進活性と、Ｃ６９−ＰＥＧのＲＰ−４ピークの相対有糸分裂促進活性とを測定した。後者のアッセイの結果を次の表５に示す。Ｃ１２、Ｃ１６、Ｃ５５、Ｃ６７、及び、Ｃ６９ムテイン単量体のピークＩＩの有糸分裂促進活性は、適正に折り畳まれたＷＴｒＩＧＦ−Ｉ（ピークＩＩ）の有糸分裂促進活性と大きく異なってはいなかった。野生型ｒＩＧＦ−１のＥＤ₅₀ は４−６ｎｇ／ｍＬであったが、これに対して非ＰＥＧ化ムテイン単量体のＥＤ₅₀は５−８ｎｇ／ｍＬだった。表５は、様々なムテインのピークＩが、ＷＴｒＩＧＦ−ＩピークＩの生物活性に類似した適正に折り畳まれたＷＴｒＩＧＦ −Ｉの生物活性に比べて低い（５分の１から３０分の１）生物活性を有したことを示す。Ｃ６９のピークＩＩから合成したＣ６９−ＰＥＧ結合体は、Ｃ６９ピークＩＩ及び適正に折り畳まれたＷＴｒＩＧＦ−Ｉと同じ生物活性を有していた。Ｂ．ＩＧＦ−ＢＰ１に対する相対的親和性Ｃ３、Ｃ２、及びＣ６９ムテインとこれらムテインのＰＥＧ化形態の、ＩＧＦ結合タンパク質−１（ＩＧＦ−ＢＰ１）に対する相対的親和性を、ラット骨肉腫細胞に対する上記タンパク質の有糸分裂促進活性を阻害するＩＧＦ−ＢＰ１の能力を測定することによって、ＩＧＦ結合タンパク質−１に対する野生型ＩＧＦ− １の相対的親和性と比較した。ラットＵＭＲ１０６骨肉腫細胞を、４８穴組織培養プレート中の穴１個当たり、７％ウシ胎仔血清、Ｉ００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、２ｍＭＬ− グルタミンを含むＨａｍのＦ１２０．５ｍＬ中に５−６Ｘ１０⁴細胞の密度でプレーティングした。３７℃で７２時間インキュベートし、細胞が集密化した後に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１００Ｕ／ｍＬペニシリンと１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンと２ｍＭＬ−グルタミンとを含む無血清ＨａｍのＦ１２培地中で２４時間プレインキュベートした。プレインキュベーションの後に、ｒＩＧＦ−１、Ｃ３もしくはＣ２ムテイン、又は、ＰＥＧ化Ｃ３もしくはＣ２ムテインを５０ｎｇ／ｍＬ又は２００ｎｇ／ｍＬ含む無血清Ｆ１２培地０．５ｍＬを、様々な量のＩＧＦ−ＢＰ１（１００ｎｇ／ｍＬ−１Ｘ１０⁴ｎｇ／ｍＬ）と共に、別々に更に２０−２４時間インキュベートした。その後で、各々の穴を、³Ｈ−チミジン（ＮＥＮＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ，ＤｕＰｏｎｔＣｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）０．５ μＣｉで４時間パルス標識した後で、冷ＰＢＳで３回洗浄し、取り込んだ³Ｈ−チミジンを冷７％トリクロロ酢酸で沈殿させた（Ｊ．Ｔ．ＢａｋｅｒＩｎｃ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）。³Ｈ−チミジンを液体シンチレーション計数で定量した。全てのアッセイを三つ組で行った。この実験の結果から、非ＰＥＧ化Ｃ３ムテインとＰＥＧ化Ｃ３ムテインのＩＧＦＢＰ１に対する親和性が著しく低下することが明らかになった。モル比２０：１（ＩＧＦＢＲ１：ｒＩＧＦ−１）の場合には、ｒＩＧＦ−１（５０ｎｇ／ｍＬ）の有糸分裂促進活性が８０％に減少した。しかし、同一濃度の非ＰＥＧ化Ｃ３ムテインの有糸分裂促進活性は３５％に減少し、同一濃度のＰＥＧ化Ｃ３ムテインの有糸分裂促進活性は０％に減少した。同様に、上記タンパク質２００ｎｇ／ｍＬを２０倍モル過剰のＩＧＦ−ＢＰ１と共にインキュベートした時には、ｒＩＧＦ−１の有糸分裂促進活性の７０％が阻害され、一方、ＰＥＧ化Ｃ３ムテインの有糸分裂促進活性は全く阻害されなかった。非ＰＥＧ化Ｃ２ムテインとＰＥＧ化Ｃ２ムテインの両方の上記親和性は、野生型ＩＧＦ−１のそれと同一だった。非ＰＥＧ化Ｃ６９とＣ６９−ＰＥＧの両方のＩＧＦ−ＢＰ１に対する親和性は、ＷＴｒＩＧＦ−Ｉのそれとあまり異ならなかった。これらのデータは、ＰＥＧ化Ｃ３ムテインのＩＧＦＢＰ１に対する親和性がＩＧＦ−１のそれに比較して著しく低いことを示している。従って、ＰＥＧ化Ｃ３ムテインの有糸分裂促進活性は、ＩＧＦ−１の有糸分裂促進活性が阻害され得る条件の下でもＩＧＦ結合タンパク質によって阻害されることがないだろう。しかし、ＰＥＧ化Ｃ２及びＣ６９ムテインのＩＧＦＢＰ１に対する親和性は、野生型ＩＧＦ−１の同親和性と同一である。従って、ＰＥＧ化Ｃ２及びＣ６９ムテインの有糸分裂促進活性は、ＩＧＦ−１の有糸分裂促進活性が阻害され得る条件と同じ条件の下でＩＧＦ結合タンパク質によって阻害されるだろう。実施例８動物試験本発明のムテインとＰＥＧ結合体の薬動力学的特性を野生型ＩＧＦ−１の薬動力学的特性と比較するために、動物実験を行った。Ａ．動物下垂体を手術で除去した体重１１０−１２１グラムの雄ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラット（下垂体切除ラット、又は、Ｈｙｐｏｘラット）を、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＣｏ．から入手した。そのラットを、１２時間−明／１２時間−暗サイクルの照明コントロール下でケージ内に維持した。その動物は水と餌を連続的に摂取することができた。１つのケージにつき５匹の動物を収容した。ラットの体重を毎日測定し、到着後２−３週間の間に１週間当たり２グラム未満の体重増を得たラットだけを、下垂体切除に成功したラットとみなし、実験に使用した。Ｂ．方法実験Ｉでは、結合緩衝液（０．１ＭＨＥＰＥＳ−０．０５ＭＮａＨ₂ＰＯ₄ ）２ｍＬ中に溶解したＷＴｒＩＧＦ−Ｉ（１６０ｍｇ、３２０ｍｇ）、非ＰＥＧ化Ｃ２（３２０ｍｇ）、非ＰＥＧ化Ｃ３（３２０ｍｇ）、ＰＥＧ化Ｃ２（Ｃ２ −ＰＥＧ、３２０ｍｇ）、又は、ＰＥＧ化Ｃ３（Ｃ３−ＰＥＧ、３２０ｍｇ）を、動物（グループ当たり１０匹のＨｙｐｏｘラット）に３日毎（ＥＴＤ）に皮下（ｓｃ）に注射した。１０匹の動物で構成される別のグループには賦形剤０．２ｍＬを投与した。注射を７時から８時の間に行い、体重を１６時から１７時の間に記録した。最後の注射を行った日の翌日のラットの体重を最終体重とした。実験ＩＩでは、結合緩衝液（０．１ＭＨＥＰＥＳ−０．０５ＭＮａＨ₂ＰＯ₄）２ｍＬ中に溶解したＷＴｒＩＧＦ−Ｉ（３２０ｍｇ、１日１回の注射（ＳＩＤ）；３２０ｍｇＥＴＤ；６４０ｍｇＥＴＤ）又はＣ３−ＰＥＧ（３２０ｍｇＥＴＤ、６４０ｍｇＥＴＤ、９６０ｍｇＥＴＤ）を、動物（グループ当たり９匹のＨｙｐｏｘラット）に３日毎に皮下注射した。９匹の動物で構成される別のグループには賦形剤０．２ｍＬを投与した。注射を７時から８時の間に行い、体重を１６時から１７時の間に記録した。最後の注射を行った日の翌日のラットの体重を最終体重とした。実験ＩＩＩでは、賦形剤（０．１ＭＨＥＰＥＳ−０．０５ＭＮａＨ₂ＰＯ₄ ）２ｍＬ中に溶解したＣ３−ＰＥＧ（１６０ｍｇＥＴＤ、３２０ｍｇＥＴＤ）を、動物（１０匹のＨｙｐｏｘラット）に３日毎に皮下注射した。１０匹の動物で構成される別のグループには賦形剤０．２ｍＬを投与した。注射を７時から８時の間に行い、体重を１６時から１７時の間に記録した。最後の注射を行った日の翌日のラットの体重を最終体重とした。実験Ｉ及びＩＩの終了後に、ラットをＣＯ₂で窒息死させ、体重を測定した。実験ＩＩＩでは、脛骨を除去し、その骨端幅を測定した。Ｃ．結果実験ＩＷＴＩＧＦ−Ｉ１６０ｍｇ又は３２０ｍｇを３日毎に皮下注射したラットは、賦形剤を注射した動物に比較して有意な体重増を示さなかった（表６）。同様に、非ＰＥＧ化Ｃ２ＩＧＦ−１又は非ＰＥＧ化Ｃ３ムテイン３２０ｍｇを３日毎に皮下注射したラットは、賦形剤を注射した動物に比較して有意な体重増を示さなかった。３２０ｍｇのＣ２−ＰＥＧを３日毎に皮下注射したラットは４．４２±０．７４ｇの体重増を示し、３２０ｍｇのＣ３−ＰＥＧを３日毎に皮下注射したラットは５．４５±０．９８ｇの体重増を示したが、この体重増は、野生型ＩＧＦ−１を注射した動物の体重増（ｐ＜０．０１）よりも著しく大きかった。ＰＥＧ化Ｃ２又はＣ３ムテインを注射した動物の体重増は、非ＰＥＧ化Ｃ２又はＣ３ムテインを注射した動物の体重増（ｐ＜０．０５）よりも著しく大きかった。ＰＥＧ化タンパク質は明らかに有効性を示したが、同一用量のＷＴＩＧＦ− Ｉは有効性を示さなかった。驚くべきことに、ＰＥＧの付加は、その分子の生物作用能を向上させる。これらの結果は、ＰＥＧ化ムテインが、ＷＴＩＧＦ−Ｉ及び非ＰＥＧ化ＩＧＦムテインより高い薬動力学的特性を有することを示している。実験ＩＩ３２０ｍｇのＷＴＩＧＦ−Ｉを１日１回皮下注射したラットは４．０２±０．４６ｇの体重増を示し、３２０ｍｇのＷＴＩＧＦ−Ｉを３日毎に皮下注射したラットは０．８１±０．８１ｇの体重増を示し、６４０ｍｇのＷＴＩＧＦ− Ｉを３日毎に皮下注射したラットは１．４１±０．５２ｇの体重増を示した（表７）。しかし、１６０ｍｇのＣ３−ＰＥＧを３日毎に皮下注射したラットは５．２２±０．４６ｇの体重増を示し、３２０ｍｇのＣ３−ＰＥＧを３日毎に皮下注射したラットは５．５０±０．５２ｇの体重増を示し、６４０ｍｇのＣ３−ＰＥＧを３日毎に皮下注射したラットは８．６９±０．６７ｇの体重増を示し、９６０ｍｇのＣ３−ＰＥＧを３日毎に皮下注射したラットは１０．４３±０．７７ｇの体重増を示した（表６）。上記全ての用量のＣ３−ＰＥＧを３日毎に投与したことが、対応する用量のＷＴＩＧＦ−Ｉを３日毎に投与した場合に比べて著しく大きい体重増を促進した。６４０ｍｇ又は９６０ｍｇのＣ３−ＰＥＧを３日毎に注射した動物は、３２０ｍｇのＷＴＩＧＦ−Ｉを１日１回投与した動物よりも著しく大きい体重増を得た。３日毎の１６０ｍｇと３２０ｍｇのＣ３−ＰＥＧの投与は、３２０ｍｇのＷＴＩＧＦ−Ｉを１日１回投与した場合よりも著しく大きい体重増を促進したが、この相違は統計的有意性には達しなかった。実験ＩＩは、３日毎に皮下注射したＣ３−ＰＥＧが、３日毎に皮下注射したＷＴＩＧＦ−Ｉよりも高い効力を示すことを示している。あらゆる用量のＣ３− ＰＥＧが、１日１回投与した３２０ｍｇのＷＴＩＧＦ−Ｉよりも大きな体重増を促進した。Ｃ３−ＰＥＧの高い薬動力学的特性は、上記動物モデルにおいて、Ｃ３−ＰＥＧの効力をＷＴＩＧＦ−Ｉの効力よりも強力なものにする。実験ＩＩＩ１６０ｍｇのＣ３−ＰＥＧを皮下注射したラットは８．３±０．７ｇの体重増を示し、３２０ｍｇのＣ３−ＰＥＧを皮下注射したラットは９．０±０．６ｇの体重増を示した（表４）。賦形剤を与えた動物は４．２±０．３ｇの体重増を示した。Ｃ３−ＰＥＧによって誘発された体重増は、賦形剤を与えた動物の体重増よりも統計的に大きかった。同様に、Ｃ３−ＰＥＧを投与したラットの脛骨骨端幅は、賦形剤を与えた動物のそれよりも統計的に大きかった（表８）。実験ＩＩＩは、Ｃ３−ＰＥＧがＨＹＰＯＸラットの体重増を促進するばかりでなく、その骨成長も促進することを示している。これは、Ｃ３−ＰＥＧが、骨形成を誘発するための有効な薬剤である可能性があることを示している。本発明を特定の実施様態に関して説明してきたが、この説明によって本発明を限定することは意図していない。当業者には明らかな様々な変更が、本発明の思想と範囲とに含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者コー，クリステイーンアメリカ合衆国、コロラド・80303、ブルダー、キヤドー・パークウエイ・3880

Claims

【特許請求の範囲】１．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とＩＧＦのムテインとを含み、前記ＰＥＧが遊離システインにおいて前記ムテインに結合している、ポリエチレングリコール結合体。２．前記ＰＥＧが、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフラート、トレシラート、アジリジン、エキシラン、及び５−ピリジルから成る群から選択される活性基を介して前記遊離システインに結合される請求項１に記載の結合体。３．前記ＩＧＦがＩＧＦ−１である請求項１に記載の結合体。４．前記ＰＥＧが、５ｋＤａ、８．５ｋＤａ、１０ｋＤａ、及び２０ｋＤａから成る群から選択される分子量を有する請求項１に記載の結合体。５．前記ＰＥＧが８．５ｋＤａの分子量を有する請求項４に記載の結合体。６．前記ＰＥＧに結合した第２のポリペプチドを更に含む請求項１に記載の結合体。７．前記第２のポリペプチドがＩＧＦのムテインである請求項６に記載の結合体。８．非天然システインを有するＩＧＦのムティン。９．前記非天然システインが前記ムテインのＮ末端領域内に存在する請求項８に記載のムテイン。１０．前記ムテインが組換え生産物である請求項８に記載のムテイン。１１．前記ムテインがＥ．ｃｏｌｉによって発現される請求項８に記載のムテイン。１２．前記非天然システインが前記ムテインのＣ末端領域内に存在する請求項８に記載のムテイン。１３．前記ムテインがＣ６９ムテインである請求項１２に記載のムテイン。１４．そのＮ末端領域内に非天然システインを有するＩＧＦムテインの遊離システインにＰＥＧを結合させることを含む、請求項１に記載の結合体を製造するための方法。１５．マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフラート、トレシラート、アジリジン、エキシラン、及び５−ピリジルから成る群から選択される活性基を介して前記ＰＥＧを前記遊離システインに結合させる請求項１４に記載の方法。１６．前記活性基がマレイミドである請求項１４に記載の方法。１７．前記ＰＥＧをＩＧＦムテインおよび別のポリペプチドに結合させる請求項１４に記載の方法。１８．前記別のポリペプチドがＩＧＦムテインである請求項１７に記載の方法。２０．医薬上許容可能な担体中に請求項１に記載の結合体を含む医薬組成物。２１．請求項２０に記載の医薬組成物を患者に投与することを含むＩＧＦ関連疾患を治療するための方法。