JP2013518922A

JP2013518922A - Ｉｇｆ−ｉポリ（エチレングリコール）コンジュゲート

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Publication number: JP2013518922A
Application number: JP2012552344A
Authority: JP
Inventors: ヘッセ，フリーデリーケ; ヘース，エーファ; ミュラー，シュテファニー; トロスト−グロス，エーファ・マリア
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2010-02-11
Filing date: 2011-02-04
Publication date: 2013-05-23
Anticipated expiration: 2031-02-04
Also published as: US20120309679A1; KR20120137364A; US20170267736A1; EP2533813B1; MX2012008148A; BR112012019992A2; KR101485646B1; HK1171375A1; ES2587574T3; JP5749744B2; RU2012138553A; CN102740896B; CA2786340C; RU2584572C2; CA2786340A1; CN102740896A; JP2015145402A; MX339559B; WO2011098400A1; JP6014194B2

Abstract

ａ）５’から３’の方向に、ポリペプチドをコードする核酸、および配列番号０１のトリプシン部位をコードする核酸を含む発現構築物をコードする核酸を提供する工程
ｂ）細胞においてａ）の核酸を発現させ、そして細胞および／または培養培地から発現構築物を回収する工程、
ｃ）Ｃ末端リジン残基においてポリ（エチレングリコール）と共有結合的にコンジュゲートした配列番号０２のアミノ酸配列を有するターゲットペプチドを提供する工程、
ｄ）発現構築物およびターゲットペプチドを、トリプシン突然変異体Ｄ１８９Ｋ、Ｋ６０Ｅ、Ｎ１４３Ｈ、Ｅ１５１Ｈと共にインキュベーションする工程、および
ｅ）インキュベーション混合物から１つのポリ（エチレングリコール）にコンジュゲートしたポリペプチドを回収しそれにより産生する工程
を含む、１つのポリ（エチレングリコール）にコンジュゲートしたポリペプチドの産生法を本明細書において報告する。

Description

本明細書において、ポリ（エチレングリコール）残基を含む第１ポリペプチドを選択的で酵素的にＣ末端で第２ポリペプチドへとコンジュゲーションするための方法、すなわち酵素的ＰＥＧ化のための方法を報告する。

発明の背景
タンパク質療法の重要性は過去数十年間かけて非常に大きくなった。なぜなら、このクラスの薬物は以前には処置できなかった疾病を標的としているからである。タンパク質薬物の製剤化は困難である。なぜなら、その分子サイズが伝統的な低分子量物質とは非常に異なるからである。さらに、タンパク質は、適切な機能性に必須であるその二次構造および三次構造のようないくつかの他の特徴を有する。それらは多くのタイプの分解または修飾を受けやすく、そしてその製剤は確実に安定でなければならず、そしてその効果的で安全なターゲット用量内に留まっていなければならない。

薬学的化合物としてのタンパク質の関与する他の問題は、患者内で引き起こされ、例えば、免疫学的反応、体内からの急速なクリアランスによる半減期の減少、並びに、その作用を発揮する前に薬物を破壊するタンパク質分解的開裂などがある（Brown, L.R., Expert Opinion Drug Deliv. 2 (2005) 29-42）。

これらの問題に対処するための１つのアプローチは、タンパク質分子に化学的変化を含めることであり、例えば、タンパク質薬物に１つ以上のポリ（エチレングリコール）残基を共有結合的に付着させることである。この手順はＰＥＧ化と呼ばれる。ＰＥＧ化の利点は、得られるコンジュゲートの分子量および水力学的サイズの増加である。新たなコンジュゲートには、タンパク質分解酵素並びに中和抗体または免疫細胞がより容易に近づきにくくなる。結果として、ＰＥＧ化は望ましくない開裂から薬物を防ぎ、そしてアレルギー性副作用の可能性を低下させる。増大したサイズはまた体内からのクリアランスにも影響を及ぼす。なぜなら、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートはあまりにも大きくて腎による限外濾過によって除去できないからである（Veronese, F.M. and Pasut, G., Drug Discovery Today 10 (2005) 1451-1458; Brown, L.R., Expert Opinion Drug Deliv. 2 (2005) 29-42）。ポリ（エチレングリコール）それ自体も新たな薬物の特性を大きく改善させる。さらにＰＥＧに毒性がないことも大きな利点である。総合すれば、ＰＥＧ化は、血液循環中のタンパク質医薬の寿命を増加させるための周知の方法である（Kozlowski, A. and Harris, M.J., Journal of Controlled Release 72 (2001) 217-224）。多種多様なＰＥＧ化タンパク質薬物、例えばシェリングプラウからのPEG-Intron（登録商標）、ファイザーからのSomavert（登録商標）およびロシュファーマシューティカルズからのPegasys（登録商標）が市販されている（Pasut, G., et al., Expert Opinion on Therapeutic Patents 14 (2004) 859-894）。

温和な条件、高い化学的特異性および位置特異性、並びに適切な生成物の収量を有する酵素的で部位特異的な改変に対する関心は高い。この分野におけるいくつかの試みがなされている。Mao et al. (Mao, H., et al., J. Am. Chem. Soc. 126 (2004) 2670-2671)は、Ｃ末端改変のためのソルターゼにより媒介されるタンパク質ライゲーション法を開発した。Sato (Sato, H., Advanced Drug Delivery Reviews 54 (2002) 487-504)は、トランスグルタミナーゼに対する特別な基質配列を受け継いだインタクトおよびキメラなタンパク質に、トランスグルタミナーゼを使用してポリ（エチレングリコール）を部位特異的に導入するシステムを確立した。天然タンパク質のＮ末端を改変するために、免疫グロブリンＡプロテアーゼ（ＩｇＡプロテアーゼ）がLewinska et al. (Lewinska, M., et al. Bioconjugate Chemistry 15 (2004) 231-234)によって使用されている。突然変異したトリプシン酵素はHoess et al. (WO 2006/015879)によって開発された。

発明の要約
本明細書において、１つ以上のポリ（エチレングリコール）分子（群）へのポリペプチドの選択的なＣ末端における共有結合的なコンジュゲーションのための方法が報告されている。これは、ポリ（エチレングリコール）に共有結合的にコンジュゲーションした小さなペプチドが、ＰＥＧ化しようとする対象のポリペプチドに酵素的に移行されるという方法である。トリプシン開裂部位に対してＣ末端にあるＳｔｒｅｐタグの存在が、Ｃ末端における部位特異的改変を増強することが判明した。

本明細書に報告されているような第１の局面は、
ａ）５’から３’の方向に、
ｉ）ポリペプチドをコードする核酸、および
ｉｉ）配列番号０１のアミノ酸配列をコードする核酸
を含む融合ポリペプチドをコードする核酸を提供する工程
ｂ）細胞においてａ）の核酸を発現させ、そして細胞および／または培養培地から融合ポリペプチドを回収する工程、
ｃ）Ｃ末端リジン残基においてポリ（エチレングリコール）残基と共有結合的にコンジュゲートした配列番号０２のアミノ酸配列を有するターゲットペプチドを提供する工程、
ｄ）融合ポリペプチドおよびターゲットペプチドを、トリプシン突然変異体Ｄ１８９Ｋ、Ｋ６０Ｅ、Ｎ１４３Ｈ、Ｅ１５１Ｈと共にインキュベーションする工程、および
ｅ）インキュベーション混合物から１つのポリ（エチレングリコール）残基にコンジュゲートしたポリペプチドを回収しそれにより生産する工程
を含む、ポリ（エチレングリコール）残基にコンジュゲートしたポリペプチドの生産方法である。

１つの態様において、インキュベーションは、
ｉ）融合ポリペプチドおよびターゲットペプチドを緩衝溶液中で塩酸グアニジウムと共にインキュベーションし、
ｉｉ）トリプシン突然変異体Ｄ１８９Ｋ、Ｋ６０Ｅ、Ｎ１４３Ｈ、Ｅ１５１ＨをＺｎ（ＩＩ）塩と共にインキュベーションし、そして
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）のインキュベーション混合物を合わせそしてインキュベーションすることを含む。

本明細書において報告したような方法の１つの態様において、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＰＥＧ化しようとするポリペプチド、トリプシン−４Ｘ−突然変異体（trypsin-4x-mutant）の開裂部位、およびＳｔｒｅｐタグを含む。別の態様において、融合ポリペプチドをコードする核酸は、５’から３’の方向に、ｉ）ＰＥＧ化しようとするポリペプチドをコードする核酸、ｉｉ）配列番号０１のアミノ酸配列をコードする核酸、およびｉｉｉ）配列番号１３または２７のＳｔｒｅｐタグをコードする核酸を含む。

別の態様において、インキュベーションは合計で１５０分間から１８０分間である。さらなる態様において、融合ポリペプチドをコードする核酸はさらにｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列をコードする核酸を含む。１つの態様において、前記ポリペプチドはヒトＩＧＦ−Ｉである。

１つの態様において、インキュベーションはＨＥＰＥＳ緩衝溶液中で行なう。さらなる態様において、ＨＥＰＥＳ緩衝溶液中のインキュベーションは少なくとも２０時間である。別の態様において、インキュベーションは２０時間から５４時間である。さらに別の態様において、インキュベーションは２０℃で行なう。

１つの態様において、融合ポリペプチドは、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２から選択されたアミノ酸配列を有する。さらなる態様において、融合ポリペプチドをコードする核酸は、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸である。

本明細書において報告したような１つの局面はまた、配列番号２８または配列番号２９のアミノ酸配列を有し、そしてＣ末端リジン残基で１つのポリ（エチレングリコール）残基にコンジュゲートしたポリペプチドである。

本明細書において報告したような１つの局面は、配列番号２８もしくは配列番号２９のアミノ酸配列を有し、そしてＣ末端リジン残基において１つのポリ（エチレングリコール）残基とコンジュゲートしたポリペプチド、または本明細書において報告したような方法を用いて得られたポリペプチドを含む、薬学的組成物である。

本明細書において報告したようなさらなる局面は、アルツハイマー病の処置のための医薬品の製造のための、配列番号２８もしくは配列番号２９のアミノ酸配列を有し、そしてＣ末端リジン残基において１つのポリ（エチレングリコール）残基とコンジュゲートしたポリペプチド、または本明細書において報告したような方法を用いて得られたポリペプチドの使用である。

本明細書において報告したようなさらなる局面は、医薬品としての使用のための、配列番号２８もしくは配列番号２９のアミノ酸配列を有し、そしてＣ末端リジン残基において１つのポリ（エチレングリコール）残基とコンジュゲートしたポリペプチド、または本明細書において報告したような方法を用いて得られたポリペプチドである。

本明細書において報告したような１つの局面は、アルツハイマー病の処置または予防における使用のための、配列番号２８もしくは配列番号２９のアミノ酸配列を有し、そしてＣ末端リジン残基において１つのポリ（エチレングリコール）残基とコンジュゲートしたポリペプチド、または本明細書において報告したような方法を用いて得られたポリペプチドである。

本明細書において報告したような別の局面は、配列番号２８もしくは配列番号２９のアミノ酸配列を有し、そしてＣ末端リジン残基において１つのポリ（エチレングリコール）残基とコンジュゲートしたポリペプチド、または本明細書において報告したような方法を用いて得られたポリペプチドの治療有効量をそれを必要とする被験体に投与することを含む、処置方法である。

本明細書において報告したような局面はまた、配列番号２８または配列番号２９のアミノ酸配列を含み、そしてＣ末端リジン残基において１つのポリ（エチレングリコール）残基とコンジュゲートしたポリペプチドである。

本明細書において報告したようなさらなる局面は、配列番号２８または配列番号２９のアミノ酸配列を含み、そしてＣ末端リジン残基において１つのポリ（エチレングリコール）残基とコンジュゲートしたポリペプチドを含む薬学的組成物である。本明細書において報告したような別の局面は、神経変性疾患の処置のための、配列番号２８または配列番号２９のアミノ酸配列を含み、そしてＣ末端リジン残基において１つのポリ（エチレングリコール）残基とコンジュゲートしたポリペプチドである。１つの態様において神経変性疾患はアルツハイマー病である。

発明の詳細な説明
本明細書において１つ（またはそれ以上）のポリ（エチレングリコール）残基（群）への選択的でＣ末端における共有結合的ポリペプチドのコンジュゲーションのための方法を報告する。これは、ポリ（エチレングリコール）残基に共有結合的にコンジュゲートした小さなペプチドが、ＰＥＧ化しようとするポリペプチドに酵素的に移行される方法である。

本明細書において報告したような酵素的方法は、伝統的で化学的で特別な基質を必要とする手法に代わるものを提供する。本方法を適用することによって、アイソフォームの分離はもはや必要ではない。なぜなら単一の部位特異的な改変が得られるからである。さらに、温和な反応条件がタンパク質の変性を防ぎ、従って、生成物の減少を制限する。さらに、天然に存在するポリペプチドを部位特異的にモノＰＥＧ化し、工学操作した突然変異体を過剰にすることが可能である。

本明細書において使用する「アミノ酸」という用語は、直接的にまたは前駆体の形態で核酸によってコードされ得るカルボキシα−アミノ酸の基を示す。個々のアミノ酸は、３つのヌクレオチド、いわゆるコドンまたは塩基トリプレットからなる核酸によってコードされる。各アミノ酸は少なくとも１つのコドンによってコードされる。これは「遺伝子コードの縮重」として知られる。本出願内で使用する「アミノ酸」という用語は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、およびバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシα−アミノ酸を示す。

本発明を実施するのに有用である当業者に知られている方法および技術は、例えば、Ausubel, F.M. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997), Wiley and Sons; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載されている。

本明細書において使用する「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性である任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収／再吸収遅延剤などを含む。１つの態様において担体は注射または点滴に適している。薬学的に許容される担体は、無菌水性液剤または分散剤、および無菌注射液剤または分散剤の調製のための無菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当技術分野において公知である。水に加えて、担体は、例えば、等張緩衝生理食塩水溶液である。

「ポリ（エチレングリコール）残基」または「ＰＥＧ」または「ＰＥＧ分子」という用語は、主な画分または部分としてポリ（エチレングリコール）を含む分子または残基を示す。このようなポリ（エチレングリコール）は、結合反応に必要であるか、分子の化学合成から生じるか、または分子の部分の最適な距離のためのスペーサーである、１つ以上のさらなる化学基（群）を含み得る。これらのさらなる化学基は、ポリ（エチレングリコール）の分子量の計算には使用されない。さらに、このようなポリ（エチレングリコール）は、互いに連結した１つ以上のポリ（エチレングリコール）鎖を含み得る。１つより多くのポリ（エチレングリコール）鎖を有するポリ（エチレングリコール）は複数のアームを持つまたは分岐したポリ（エチレングリコール）と呼ばれる。種々のポリオール（グリセロール、ペンタエリスリトール、およびソルビトールを含む）にポリエチレンオキシドを付加することによって、分岐したポリ（エチレングリコール）を調製することができる。分岐したポリ（エチレングリコール）は、例えば、EP 0 473 084およびUS 5,932,462に報告されている。１つの態様において、ポリ（エチレングリコール）残基は分子量２０〜３５ｋＤａのポリ（エチレングリコール）残基であり、そして直鎖状のポリ（エチレングリコール）残基である。別の態様において、ポリ（エチレングリコール）残基は３５ｋＤａを超える、特に４０ｋＤａの分子量を有するポリ（エチレングリコール）残基であり、そして分岐したポリ（エチレングリコール）残基である。さらなる態様において、ポリ（エチレングリコール）残基は４０ｋＤａの重量を有し、そして２つのアームを有するポリ（エチレングリコール）残基である。

「ＰＥＧ化」という用語は、ポリペプチドのＮ末端および／または内部リジン残基におけるポリ（エチレングリコール）分子の共有結合連結を示す。ポリペプチドのＰＥＧ化は、最先端の当技術分野において広く知られており、そして例えば、Veronese, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417によって概説されている。種々の官能基および種々の分子量を有するポリ（エチレングリコール）分子、直鎖状および分岐状ＰＥＧ並びに種々の連結基を使用して、ＰＥＧ分子をポリペプチドに連結させることができる（また、Francis, G.E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18; Delgado, C., et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9 (1992) 249-304も参照）。ポリペプチドのＰＥＧ化は、水溶液中で、例えばＷＯ００/４４７８５に記載のようにＰＥＧ化試薬を用いて、１つの態様においては、分子量５ｋＤａ〜４０ｋＤａのＮＨＳにより活性化された鎖状または分岐状ＰＥＧ分子を使用して実施することができる。ＰＥＧ化はまた、Lu, Y., et al., Reactive Polymers 22 (1994) 221-229に従って固相で実施することもできる。無作為ではなく、Ｎ末端がＰＥＧ化されたポリペプチドもＷＯ９４/０１４５１に従って産生することができる。

「ポリペプチド」は、天然で産生されたものであれ合成で産生されたものであれ、ペプチド結合によって共有結合的に接続されたアミノ酸残基からなるポリマーである。約２０アミノ酸残基未満のポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれ得、一方、２つ以上のポリペプチドからなるか、または１００アミノ酸残基より長い長さを有する１つのポリペプチドを含む分子は、「タンパク質」と呼ばれ得る。ポリペプチドはまた、非アミノ酸成分、例えば糖質基、金属イオン、またはカルボン酸エステルを含み得る。非アミノ酸成分は、ポリペプチドが発現されている細胞によって加えられ得、そして細胞のタイプによって異なり得る。ポリペプチドは、本明細書において、そのアミノ酸骨格構造またはそれをコードする核酸の点から定義される。糖質基などの付加は一般的には明記されていないが、それにも関わらず存在し得る。

Hoess et al.は、加水分解に対するトリプシンの主な親和性を克服することのできる、トリプシン突然変異体Ｄ１８９Ｋ、Ｋ６０Ｅ、Ｎ１４３Ｈ、Ｅ１５１Ｈ（trypsin-4x-mutant）を作製した。さらにこの突然変異体は、Ｃ末端におけるリジンおよびアルギニンの有意なタンパク質分解を示さない。trypsin-4x-mutantは、特異的なモチーフ、すなわちチロシン−アルギニン−ヒスチジン（ＹＲＨ）配列を認識する。trypsin-4x-mutantは、ヒスチジン残基間にＺｎ^２＋イオンを含むキレート複合体を構築することによってこの認識部位と特異的に相互作用することができる。この認識配列がヒトポリペプチド中に出現する確率は非常に低い。従って、複数の部位特異的改変および／または望ましくない開裂はかなり可能性が低い。trypsin-4x-mutantによって確実に最善に認識されるためのこの配列のさらなる改変により、チロシン−アルギニン−ヒスチジン−アラニン−アラニン−グリシン（ＹＲＨＡＡＧ）（配列番号０１）のアミノ酸配列からなる改変された「トリプシン部位」である特異的なタグが開発された。このペプチドはポリペプチドのＣ末端に隔合し得、従ってtrypsin-4x-mutantのための基質を構築する。さらに、部位特異的ＰＥＧ化を可能とするのにターゲットペプチドが必要である。このペプチドは「トリプシン部位」と重複し、そしてアルギニン−ヒスチジン−アラニン−リジン（ＲＨＡＫ）（配列番号０２）のアミノ酸配列からなる。このターゲットペプチドは多種多様な分子に酵素的に移行され得る。trypsin-4x-mutantは、チロシン残基とヒスチジン残基の間のペプチド結合を開裂し、これにより「トリプシン部位」（ＲＨＡＡＧ）（配列番号０３）の一部を置換する。短い非天然アミノ酸配列（ＹＲＨＡＫ）（配列番号０４）は、タンパク質と付着した求核試薬との間に留まる。しかしながら、この短い伸長は付着した求核試薬（例えばポリ（エチレングリコール）残基）によってかなり遮蔽され、従って、このペプチドの免疫原性活性はかなり可能性が低い。

trypsin-4x-mutantにおける改変は、加水分解副反応を完全に排除することはできない。従って、本明細書において報告したような方法の１つの態様におけるように、正しい時期に複合体Ｚｎ^２＋イオンにエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を添加することによって、または本明細書において報告したような方法の別の態様におけるように、ｐＨを酸性レベルに調整し、適切な酵素の機能に必要とされるｐＨ範囲としないことによって反応を停止した場合にのみ、最大収量を達成することができる。

いくつかの組換えタンパク質は、例えば、その後の精製工程を容易にするために、またはさもなければ単に宿主細胞における適切な産生を確実にするにはあまりにも小さい構築物の発現を可能とするために、特別な融合タグを含む。いくつかのよく確立されたタグはヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）またはＳｔｒｅｐタグである。Ｈｉｓタグは金属アフィニティークロマトグラフィーを通して融合タンパク質を精製するのに使用できるが、Ｓｔｒｅｐタグは、ストレプトアビジンカラムを使用する融合タンパク質の精製に適用される（Terpe, K., Appl. Microbiol. Biotechnol. 60 (2003) 523-533）。いくつかの環境下では、例えば医薬品用に、または単に必要であれば適切なリフォールディングを確実にするためにこれらのタグを開裂することが必要である。規定の認識部位を有するプロテアーゼを使用する酵素的開裂が最も望ましいアプローチである。淋菌に由来する免疫グロブリンＡプロテアーゼ（ＩｇＡプロテアーゼ）が本明細書において報告したような方法の１つの態様において使用される。ＩｇＡプロテアーゼの認識部位は、Yaa Pro a Xaa Proとして報告されている（ＹａａはＰｒｏを意味するか、または稀にＡｌａ、ＧｌｙまたはＴｈｒ：ＰｒｏＡｌａ、ＰｒｏＧｌｙ、またはＰｒｏＴｈｒと組み合わせたＰｒｏを意味し；ＸａａはＴｈｒ、ＳｅｒまたはＡｌａを意味する）。淋菌由来のＩｇＡプロテアーゼに対する合成ペプチド基質は公知の自己タンパク質分解部位である（例えばWood and Burton, Infection and Immunity 59 (1991) 1818-1822参照）。ＩｇＡプロテアーゼについて知られている認識部位は、以下の配列を含み、「a」は、切断される結合の位置を示し：

最初の３つが最も頻繁に選択される。

従って、１つの態様において融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、Ｈｉｓタグ、スペーサー、ＩｇＡプロテアーゼ開裂部位（ＩｇＡ部位）、対象のポリペプチド、trypsin-4x-mutant開裂部位（ｔｒｙｐ部位）および場合によりストレプトアビジンタグ（ｓｔｒｅｐタグ）を含む。

trypsin-4x-mutantを使用する部位特異的改変の酵素的技術は、このタイプの改変に必須である付属物を有する特別な構築物を作ることを必要とした。

従って本明細書において報告したような方法の１つの態様において、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＰＥＧ化しようとするポリペプチド、trypsin-4x-mutant開裂部位およびＳｔｒｅｐタグを含む。別の態様において融合ポリペプチドをコードする核酸は、５’から３’の方向に、ｉ）ＰＥＧ化しようとするポリペプチドをコードする核酸、ｉｉ）配列番号０１のアミノ酸配列をコードする核酸、およびｉｉｉ）配列番号１３または２７のＳｔｒｅｐタグをコードする核酸を含む。

それ故、本明細書において報告したような１つの局面は、
ａ）５’から３’の方向にｉ）ポリペプチドをコードする核酸、およびｉｉ）配列番号０１のアミノ酸配列をコードする核酸を含む核酸によってコードされる融合ポリペプチド、および配列番号０２のアミノ酸配列を有し、そしてＣ末端リジン残基においてポリ（エチレングリコール）残基と共有結合的にコンジュゲートしたターゲットポリペプチドを、トリプシン突然変異体Ｄ１８９Ｋ、Ｋ６０Ｅ、Ｎ１４３Ｈ、Ｅ１５１Ｈと共にインキュベーションする工程、そして
ｂ）インキュベーション混合物から１つのポリ（エチレングリコール）残基にコンジュゲートしたポリペプチドを回収およびそれにより産生する工程
を含む、ポリ（エチレングリコール）残基にコンジュゲートしたポリペプチドを産生するための方法である。

１つの態様において、融合ポリペプチドは、５’から３’の方向に、ｉ）ＰＥＧ化しようとするポリペプチドをコードする核酸、ｉｉ）配列番号０１のアミノ酸配列をコードする核酸、およびｉｉｉ）配列番号１３または２７のアミノ酸配列をコードする核酸を含む、核酸によってコードされる。

１つの態様において、前記方法は、第１工程として：
ａ−１）５’から３’の方向に
ｉ）ＰＥＧ化しようとするポリペプチドをコードする核酸
ｉｉ）配列番号０１のアミノ酸配列をコードする核酸、および
ｉｉｉ）配列番号１３または２７のアミノ酸配列をコードする核酸
を含む融合ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養し、そして細胞および／または培養培地から融合ポリペプチドを回収することを含む。

１つの態様において、インキュベーションは
ｉ）融合ポリペプチドおよびターゲットペプチドを緩衝溶液中で塩酸グアニジウムと共にインキュベーションし、
ｉｉ）トリプシン突然変異体Ｄ１８９Ｋ、Ｋ６０Ｅ、Ｎ１４３Ｈ、Ｅ１５１ＨをＺｎ（ＩＩ）塩と共にインキュベーションし、
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）のインキュベーション混合物を合わせそしてインキュベーションすることを含む。

本発明は、本発明が行なわれた時期には研究室に十分な量で入手可能であったＩＧＦ−Ｉタンパク質を使用することによって以下に例示されている。これは制限と捉えるべきではなく、単に一例として提供される。なぜなら本発明はほぼどのポリペプチドを用いても実践され得るからである。本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。

例示的な構築物は、Ｈｉｓタグ、スペーサーおよびＩＧＦ−Ｉポリペプチド（部分）のＮ末端のＩｇＡプロテアーゼ開裂部位（ＩｇＡ部位）およびトリプシン開裂部位（ｔｒｙｐ部位）および場合によりＩＧＦ−Ｉポリペプチド（部分）のＣ末端のストレプトアビジンタグ（ｓｔｒｅｐタグ）を有していた（図１も参照）：

trypsin-4x-mutantによって触媒されるエステル交換反応の動態を決定するための実験は、４００μlという少量の最終容量で行なうことができる。

部位特異的に改変しようとするＩＧＦ−Ｉを含む融合ポリペプチドを、酵素反応の前に、２Ｍトリス（ヒドロキシメタン）アミノメタン（ＴＲＩＳ）緩衝液（最終濃度０．２Ｍ）、ｐＨ８．０、求核試薬（ＲＨＡＫ−６ＣＦ（配列番号０２）またはＲＨＡＫ−ＭＣａ−ＰＥＧ２００００（配列番号０２））、および塩酸グアニジウム（Ｇｄｍ−ＨＣｌ）と共にインキュベーションすることができる。理論によって固めたくはないが、このようにＩＧＦ構築物の溶解度を維持することができ、そして低濃度の塩酸グアニジウムがおそらく部分的な変性を誘導し、従って、酵素反応中にＣ末端が「トリプシン部位」とより良好に近づきやすくなった。trypsin-4x-mutantをＺｎ^２＋イオンの存在下でプレインキュベーションすることができる。２つの反応混合物ＡおよびＢ（混合物ＡはＩＧＦ−Ｉを含む融合ポリペプチドを含み、混合物Ｂはtrypsin-4x-mutantを含む）を合わせることによって良好な酵素活性を達成することができる。反応混合物は、ｐＨ８．０のｐＨ値を有し得る。全反応混合物を穏やかに振とうしながら３０℃でインキュベーションすることができる。１８０分間の全反応時間を適用し得、そして試料を３０分間毎に取り出し得る。Ｚｎ^２+イオンとＥＤＴＡとの錯体を形成することによって酵素反応を停止し得る。最後に、緩衝溶液（１００mMトリス、１５０mM ＮａＣｌを含む緩衝液Ｓ、ｐＨ８．０）を１：２の最終希釈比となるまで加えることによって容量を調整することができる。試料をＳＥＣによって分析することができる。どの標識を使用するかに依存して、異なるＳＥＣカラムを適用することができる。例えば、ＲＨＡＫ−６ＣＦでは１００〜７０００Ｄａの分離範囲を有するSuperdex（登録商標）ペプチドカラムを使用することができ、ＲＨＡＫ−ＭＣａ−ＰＥＧ２００００では３０００〜７００００Ｄａの分離範囲を有するSuperdex（登録商標）７５カラムを使用することができる（GE Healthcare）。

ＲＨＡＫ−６ＣＦを用いての部位特異的改変についての収率は、以下のように決定することができる。遊離ＲＨＡＫ−６ＣＦの濃度希釈シリーズを調製することができる（０．５、１、５、１０、２５、５０および１００μg/ml）。緩衝液Ｓを溶媒として使用することができる。なぜならＲＨＡＫ−６ＣＦ蛍光はｐＨ感受性であるからである。検量試料をＳＥＣによって分析することができる。５１４nmにおける照射放出から生じたＲＨＡＫ−６ＣＦを含むピークのピーク面積を、種々の濃度について決定することができ、そしてプロットし、これにより検量曲線を得る。反応試料を検量試料と同じようにＳＥＣによって分析することができ、そして蛍光産物のピーク面積を決定することができる。形成されたＲＨＡＫ−６ＣＦの量および従って求核試薬を用いての部位特異的改変の収率を、検量曲線を使用することによって決定することができる。

全ての構築物について収率は時間と共に増加した。約１５０分後に最大収率を得ることができる。構築物ｗｔ−ｈＩＧＦ−トリプシン部位−ｓｔｒｅｐタグが最善の結果を与え、１５０分後に１７．５％の収率であった。これに対して、ｗｔ−ｈＩＧＦ−トリプシン部位およびｍｕｔ−ｈＩＧＦ（Ｋ２７Ｒ、Ｋ６５Ｒ）は、それぞれ、１５０分後に１１．９％および１８０分後に１３．０％というより小さくそして比較的等しい最大結果を与えた。ＲＨＡＫ−６ＣＦを用いての部位特異的改変中の時間に伴う収率の増加を図２Ｂに示す。

ＲＨＡＫ−ＭＣａ−ＰＥＧ２００００を求核試薬として使用した場合、遊離したコンジュゲートしていないＲＨＡＫ−ＭＣａ−ＰＥＧ２００００と、ＲＨＡＫ−ＭＣａ−ＰＥＧ２００００で標識されたＩＧＦ−Ｉの分離の問題が起こった。これは、求核試薬とコンジュゲーション産物のサイズが類似していることに起因し得る。従って、この場合には産物の増加を通して部位特異的改変についての収率を決定することは不可能であり、そして異なるアプローチが必要であった。唯だ１つの部位特異的改変が起こるであろうため、改変されていないＩＧＦ−Ｉ（排出物）の減少は、コンジュゲーション産物の増加に等しくあり得る。改変されていないＩＧＦ−Ｉの減少を、２２６nmにおける吸光度から生じたＨＰＬＣクロマトグラムピーク面積を通して推定した。ＲＨＡＫ−６ＣＦを用いての改変と同様に、ＲＨＡＫ−ＭＣａ−ＰＥＧ２００００を用いての改変の収率は時間と共に増加した（図３および４）。構築物ｗｔ−ｈＩＧＦ−ｔｒｙｐ部位−ｓｔｒｅｐタグを用いて驚くべきことに１８０分後に２３．１％で最も高い収率が得られた。ほぼ同じ結果が、ｍｕｔ−ＩＧＦ（Ｋ２７Ｒ、Ｋ６５Ｒ）−ｔｒｙｐ部位（１８０分後に２０．６％）およびｗｔ−ｈＩＧＦ−ｔｒｙｐ部位（１８０分後に１９．９％）について得られた。

種々の融合ポリペプチドのＲＨＡＫ−６ＦまたはＲＨＡＫ−ＭＣａ−ＰＥＧ２００００のいずれかを用いての部位特異的改変の比較を表１に示す。一般に、ＲＨＡＫ−ＭＣａ−ＰＥＧ２００００を用いての改変が、ＲＨＡＫ−６ＣＦを用いての改変よりも高い収率を有した。しかしＰＥＧ化しようとするポリペプチドもまた収率に影響を及ぼした。構築物ｗｔ−ｈＩＧＦ−ｔｒｙｐ部位−ｓｔｒｅｐタグを用いると、ターゲットポリペプチド（または求核試薬）に関係なく最も高い収率を得ることができる。構築物ｗｔ−ｈＩＧＦ−ｔｒｙｐ部位およびｍｕｔ−ｈＩＧＦ−ｔｒｙｐ部位はほぼ同じ結果をもたらした。従って、Ｓｔｒｅｐタグの存在は、Ｃ末端における部位特異的酵素的改変を増強することが判明した。

モノおよびＣ末端部位特異的改変を確認するために、標識されたＩＧＦ−Ｉ構築物を質量分析によって分析することができる。この目的のために、各構築物のＲＨＡＫ−６ＣＦを用いての部位特異的改変のために４００μlの反応液を使用することができる。反応液を３０℃で１５０分間インキュベーションすることができ、そしてその後、２００μlの１０mM ＥＤＴＡ溶液の添加によって停止することができる。その後、２００μlの緩衝液Ｓの添加によって反応溶液を１：２に希釈することができる。全標識反応液をサイズ排除クロマトグラフィーによって精製することができる。ＲＨＡＫ−６ＣＦを含むＩＧＦ−Ｉ融合ポリペプチドを回収しそして濃縮することができる。精製され部位特異的に改変されたＩＧＦ−Ｉ構築物を続いて、全分子量について質量分析技術によって分析することができる。消化物（Ａｓｐ−Ｎ−消化物）から生じたフラグメントの分子量により、全ての構築物についてＲＨＡＫ−６ＣＦを用いての単一でＣ末端における部位特異的改変が確認された。

従って、trypsin-4x-mutantを使用したＣ末端における部位特異的改変により「トリプシン部位」を有する工学操作されたポリペプチド、例えばＩＧＦ−Ｉを改変するための、新規な酵素的方法が判明した。この新たな技術を使用して、不均一で活性の減少した改変を得るリスクを伴うことなく、ポリペプチド、例えば野生型ヒトＩＧＦ−Ｉを部位特異的に改変することができた。これらの望ましくない副生成物が過去においてＰＥＧ化の適用を制限してきた。この新たな酵素的アプローチはＰＥＧ化タンパク質性医薬品の調製に容易に使用することができる。ＰＥＧを含むターゲットポリペプチドの代わりに、他の可能性のある求核試薬、例えば蛍光ダイ、ビオチン、糖類、およびその他を含む／コンジュゲートしているターゲットポリペプチドも使用することができる。短いペプチドＲＨＡＫ（配列番号０２）を単に付加するだけで、trypsin-4x-mutantシステムを用いての転移にこれらを使用することができる。

ｗｔ−ｈＩＧＦ−ｔｒｙｐ部位−ｓｔｒｅｐタグ構築物の酵素的ＰＥＧ化のための反応条件を、標識（ＲＨＡＫ−ＭＣａ−ＰＥＧ２００００）の量およびtrypsin-4x-mutantの量を減少させることによって、並びに、ＴＲＩＳ緩衝液をＨＥＰＥＳ緩衝液に置換することによってさらに最適化した。

以下の実施例、配列表および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に示されている。本発明の精神から逸脱することなく、示された手順に改変を行なうことができることが理解される。

配列表の説明
配列番号０１改変されたトリプシン部位（ｔｒｙｐ部位）
配列番号０２部位特異的ＰＥＧ化のために必要とされるターゲットペプチド
配列番号０３トリプシン部位の置換部分
配列番号０４残りのペプチド配列
配列番号０５〜０９および１４〜２６ＩｇＡ−プロテアーゼ開裂部位
配列番号１０Ｈｉｓタグ−スペーサー−ＩｇＡ部位−ｗｔ-ｈＩＧＦ−ｔｒｙｐ部位−ｓｔｒｅｐタグ
配列番号１１Ｈｉｓタグ−スペーサー−ＩｇＡ部位−ｗｔ-ｈＩＧＦ−ｔｒｙｐ部位
配列番号１２Ｈｉｓタグ−スペーサー−ＩｇＡ部位−ｈＩＧＦ（Ｋ２７Ｒ、Ｋ６５Ｒ)−ｔｒｙｐ部位
配列番号１３および２７Ｓｔｒｅｐタグ
配列番号２８Ｎ末端ｈｉｓタグおよびＩｇＡプロテアーゼ開裂部位を含む、モノＰＥＧ化ヒトＩＧＦ−Ｉのアミノ酸配列
配列番号２９モノＰＥＧ化ヒトＩＧＦ−Ｉのアミノ酸配列

種々の構築物の図解。ＲＨＡＫ−６ＣＦの検量曲線（Ａ）およびＲＨＡＫ−６ＣＦ標識の収率（Ｂ）。Ａ：１００mMトリス、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ８．０中で調製した以下の濃度を有する希釈シリーズを、ＳＥＣを使用して分析した：０．５、１、５、１０、２５、５０、１００μg/ml。５１４nmにおけるＲＨＡＫ−６ＣＦの発光のピーク面積を決定し、そして濃度に対してプロットした。決定係数（Ｒ^２）および適用したトレンドラインの式が示されている。各データ点は３回の反復実験の結果であり、そして±標準誤差で示されている。Ｂ：標識反応液を、ＲＨＡＫ−６ＣＦの標識のために４．３．８に従って調製した。試料をＳＥＣによって分析した。（左）：ｗｔ−ｈＩＧＦ−ｔｒｙｐ部位−ｓｔｒｅｐタグ、（中央）：ｗｔ−ｈＩＧＦ−ｔｒｙｐ部位、（右）：ｍｕｔ−ｈＩＧＦ（Ｋ２７Ｒ、Ｋ６５Ｒ）−ｔｒｙｐ部位。ＲＨＡＫ−６ＣＦまたはＲＨＡＫ−ＭＣａ−ＰＥＧ２００００を用いての部位特異的改変の収率の比較。（左）：ＲＨＡＫ−６ＣＦ、（右）：ＲＨＡＫ−ＭＣａ−ＰＥＧ２００００。最適化条件下におけるＣ末端において改変されたＩＧＦ−Ｉの時間依存的増加（求核試薬：ＲＨＡＫ−ＭＣａ−ＰＥＧ２００００）。

略称：
「トリプシン側」アミノ酸配列ＹＲＨＡＡＧ
６−ＣＦカルボキシフルオレセイン
Ｇｄｍ−ＨＣｌ塩酸グアニジウム
Ｈｉｓタグポリヒスチジンタグ
ＭＣａメチルクマリン
ＰＥＧポリ（エチレングリコール）
Ｓｔｒｅｐストレプトアビジン
ＴＲＩＳ２−アミノ−１−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール
Ｔｒｙｐ「トリプシン部位」
ＩＧＦ−Ｉインシュリン様成長因子１
trypsin-4x-mutant 突然変異体トリプシンＤ１８９Ｋ、Ｋ６０Ｅ、Ｎ１４３Ｈ、Ｅ１５１Ｈ

材料および方法：
分析用サイズ排除クロマトグラフィー
緩衝液：０．５Ｍトリス、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５
カラム：Superdex（登録商標）ペプチド１０/３００ＧＬ
システム：Dionex
方法：均一濃度での溶出を、０．５ml/分の流速で行なった。全サイクル時間は７０分間であった。５０μlの試料を注入した。分離の経過を、２２０および２８０nmにおける吸光度シグナルを追うことによって追跡した。

標識中のサイズ排除クロマトグラフィー
緩衝液：１００mMトリス、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ８．０
カラム：Superdex（登録商標）ペプチド１０/３００ＧＬ（ＲＨＡＫ−６ＣＦ標識）
Superdex（登録商標）７５１０/３００ＧＬ（ＲＨＡＫ−ＭＣａ−ＰＥＧ２００００標識）
システム：Gynkotek（ＲＨＡＫ−６ＣＦ標識）
Dionex（ＲＨＡＫ−ＭＣａ−ＰＥＧ２００００標識、表８参照）
ＲＨＡＫ−６ＣＦ標識法：均一濃度での溶出を、０．５ml/分の流速で行なった。全サイクル時間は６０分間であった。
ＲＨＡＫ−ＭＣａ−ＰＥＧ２００００標識法：均一濃度での溶出を０．７５ml/分の流速で行なった。
全サイクル時間は４５分間であった。
５０μlの試料（調製の問題のため２５０μl）を注入した。分離の経過を、２２０nm、２８０nm、３２０nmにおける吸光度シグナル（ＲＨＡＫ−ＭＣａ−ＰＥＧ２００００標識）および蛍光シグナル（吸光＝４９０nm、発光＝５１４nm）（ＲＨＡＫ−６ＣＦ標識）を追うことによって追跡した。

実施例１
部位特異的改変
ＩＧＦ−Ｉ構築物の部位特異的標識は、ＲＨＡＫ−６ＣＦおよびＲＨＡＫ−ＭＣａ−ＰＥＧ２００００を用いて達成された。

各構築物をＲＨＡＫ−６ＣＦまたはＲＨＡＫ−ＭＣａ−ＰＥＧ２００００のいずれかで標識した。さらに表２に記載の対照も実施した。

最終の標識反応における種々の化合物の濃度を表４に列挙する。全ての反応を６５０μlのシリコン化チューブ中で実施した。タンパク質を２Ｍトリス緩衝液中で希釈した。続いて、標識したペプチドおよび塩酸グアニジウムを加えた。この混合物（Ａ）を３０℃で１０分間インキュベーションした。trypsin 4x mutant、ＺｎＣｌ_２および緩衝液Ｓ（１００mMトリス、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）からなる混合物Ｂを混合物Ａと同じ条件でインキュベーションした。緩衝液Ｓの必要な容量は、標識反応では４００μlおよび対照については２５０μlの全反応容量となるように選択される。混合物ＡおよびＢを合わせ、そして穏やかに振とうしながら３０℃でインキュベーションした。

酵素反応を停止するために、反応混合物を、その容量の半分の１０mM ＥＤＴＡ（緩衝液Ｓ中において調製）および同容量の緩衝液Ｓと、希釈係数１：２で合わせた。１８０分間の全反応時間を適用した。

実施例２
部位特異的改変の最適化
反応を室温で１０００μlの容量中で行なった。trypsin-4x-mutantを、ＺｎＣｌ_２およびＰＥＧ標識の存在下において３０℃で１０分間プレインキュベーションした。その後、塩酸グアニジウムおよびｗｔ−ｈＩＧＦ−ｔｒｙｐ部位−ｓｔｒｅｐ部位を加えて、以下に示した最終濃度を達成した。反応混合物を２０℃で５４時間までインキュベーションした。２４時間後に２５％を超える生成物の収率が達成され、５２時間後には最大の３２．６％に到達した（図４参照）。

反応条件：
１００μM ｗｔｈＩＧＦ−Ｉトリプシン部位Ｓｔｒｅｐタグ
２μM Trypsin 4x mutant
５００μM ＲＨＡＫ−ＭＣａ−ＰＥＧ２００００
１０μM ＺｎＣｌ_２
１００mM ＨＥＰＥＳ
１５０mM ＮａＣｌ
１mM ＣａＣｌ_２
２００mM ＧｄｍＨＣｌ

実施例３
組換えｗｔおよび突然変異体ＩＧＦ−Ｉ変異体並びにモノＰＥＧ化ＩＧＦ−ＩによるインビトロにおけるＩＧＦ−ＩＲリン酸化
ホスホＩＧＦ−ＩＲ特異的ＥＬＩＳＡを使用して、種々のＩＧＦ−Ｉ変異体によるＩＧＦ−ＩＲの活性化を定量した。一晩かけて血清を枯渇させた後、ヒトＩＧＦ−ＩＲを発現する組換えＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、種々の濃度のＩＧＦ−Ｉ変異体と共にインキュベーションして、細胞内容物におけるＩＧＦ−ＩＲの結合および活性化を可能とした。刺激後、冷溶解緩衝液（２５mM ＭＥＳ、ｐＨ６．５、１５０mM ＮａＣｌ、２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、６０mM βオクチルグリコシド、２mM Ｎａ_３ＶＯ_４、Complete（登録商標）プロテアーゼ阻害剤）を使用して細胞を溶解にかけ、リン酸化状態を保存した。ヒトＩＧＦ−ＩＲα鎖に対するビオチニル化モノクローナル抗体（ＭＡＫ＜ｈｕＩＧＦ−ＩＲα＞ｈｕ−１ａ−ＩｇＧ−Ｂｉ、Roche Diagnostics GmbH）を使用して、全ＩＧＦ−ＩＲをストレプトアビジンでコーティングされたマイクロプレートの表面に捕捉させ、そしてＩＧＦ−ＩＲキナーゼドメイン内のリン酸化Ｔｙｒ１１３５／１１３６に対するモノクローナル抗体（Cell Signaling3024L番）を使用して活性化ＩＧＦ−ＩＲの画分を決定した。１０nMヒトＩＧＦ−Ｉで刺激した細胞を最大対照として使用し、刺激なしの細胞を最小対照として使用した。ＩＧＦ−ＩＲの活性化率を（結果−最小）／（最大−最小）として計算した。ＩＣ_５０／ＥＣ_５０値を、GraphPad Prism 4.0ソフトウェアを使用して曲線をあてはめることによって決定した。

Claims

以下の工程
ａ）５’から３’の方向にｉ）ポリペプチドをコードする核酸、およびｉｉ）配列番号０１のアミノ酸配列をコードする核酸、を含む核酸によってコードされる融合ポリペプチド、並びに配列番号０２のアミノ酸配列を有し、そしてＣ末端リジン残基においてポリ（エチレングリコール）残基と共有結合的にコンジュゲートしているターゲットポリペプチドを、トリプシン突然変異体Ｄ１８９Ｋ、Ｋ６０Ｅ、Ｎ１４３Ｈ、Ｅ１５１Ｈと共にインキュベーションする工程、そして
ｂ）１つのポリ（エチレングリコール）残基にコンジュゲートしたポリペプチドを回収およびそれにより生産する工程
を含む、ポリ（エチレングリコール）残基にコンジュゲートしたポリペプチドの生産方法。
インキュベーションが、
ｉ）融合ポリペプチドおよびターゲットペプチドを緩衝溶液中で塩酸グアニジウムと共にインキュベーションし、
ｉｉ）トリプシン突然変異体Ｄ１８９Ｋ、Ｋ６０Ｅ、Ｎ１４３Ｈ、Ｅ１５１ＨをＺｎ（ＩＩ）塩と共にインキュベーションし、そして
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）のインキュベーション混合物を合わせそしてインキュベーションすること
を含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
融合ポリペプチドが、５’から３’の方向に、
ｉ）ポリペプチドをコードする核酸、
ｉｉ）配列番号０１のアミノ酸配列をコードする核酸、および
ｉｉｉ）配列番号１３または配列番号２７のアミノ酸配列をコードする核酸
を含む核酸によってコードされることを特徴とする、請求項１〜２のいずれか１項記載の方法。
インキュベーションが１５０分間から１８０分間であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
工程ａ）の核酸がさらに、
ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列をコードする核酸
を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
インキュベーションをＨＥＰＥＳ緩衝溶液中で行なうことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
ポリペプチドがヒトＩＧＦ−Ｉであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
融合ポリペプチドが、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項７記載の方法。
融合ポリペプチドをコードする核酸が、配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
配列番号２８または配列番号２９のアミノ酸配列を有し、そしてＣ末端リジン残基において１つのポリ（エチレングリコール）残基とコンジュゲートしたポリペプチド。
請求項１０記載のポリペプチドまたは請求項７〜９のいずれか１項記載の方法を用いて得られたポリペプチドを含む薬学的組成物。
アルツハイマー病の処置のための医薬品の製造のための、請求項１０記載のポリペプチドまたは請求項７〜９のいずれか１項記載の方法を用いて得られたポリペプチドの使用。
医薬品として使用するための、請求項１０記載のポリペプチドまたは請求項７〜９のいずれか１項記載の方法を用いて得られたポリペプチド。
アルツハイマー病の処置または予防のための、請求項１０記載のポリペプチドまたは請求項７〜９のいずれか１項記載の方法を用いて得られたポリペプチド。
請求項１０記載のポリペプチドまたは請求項７〜９のいずれか１項記載の方法を用いて得られたポリペプチドの治療有効量をそれを必要とする被験体に投与することを含む、処置方法。