ES2587574T3 - Conjugados proteicos para la pegilación por transamidación mediada por tripsina y métodos - Google Patents

Conjugados proteicos para la pegilación por transamidación mediada por tripsina y métodos Download PDF

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Abstract

Un método para la producción de un polipéptido conjugado con un resto de poli (etilenglicol) que comprende las siguientes etapas a) incubar un polipéptido de fusión, que está codificado por un ácido nucleico que comprende en dirección 5' a 3' i) un ácido nucleico que codifica el polipéptido, ii) un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 01, y iii) un ácido nucleico que codifica un marcador de Estrep, y un polipéptido diana, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 02 y que se conjuga de manera covalente con un resto de poli (etilenglicol) en el resto de lisina C terminal, con el mutante de tripsina D 189K, K60E, N143H, E151H, y b) recuperar y producir de este modo el polipéptido conjugado con un resto de poli (etilenglicol).

Description

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interpretarse como una limitación, se proporciona únicamente como un ejemplo, ya que la presente invención puede practicarse con casi cualquier polipéptido. El verdadero alcance de la invención se expone en las reivindicaciones adjuntas.
Construcciones ejemplares portaban un marcador de His, un espaciador y un sitio de escisión de IgA proteasa (sitio IgA) N terminal del polipéptido de IGF-I (parte) y el sitio de escisión de tripsina (sitio tryp) y opcionalmente un marcador de estreptavidina (marcador de estrep) C terminal del polipéptido IGF-I (parte) (véase también Figura 1):
Marcador de His -espaciador -Sitio de IgA -wt-hIGF -sitio tryp -marcador de estrep (SEQ ID NO: 10)
Marcador de His -espaciador -Sitio de IgA -wt-hIGF -sitio tryp (SEQ ID NO: 11)
Marcador de His -espaciador -Sitio de IgA -hIGF (K27R, K65R) -sitio tryp (SEQ ID NO: 12)
Pueden llevarse a cabo experimentos para determinar la cinética de la reacción de transesterificación catalizada por el mutante de tripsina-4x en un volumen final de tan poco como 400 μl.
El polipéptido de fusión que comprende IGF-I para modificar de forma específica de sitio puede incubarse con tampón de tris (hidroximetano) aminometano (TRIS) 2 M (concentración final de 0, 2 M), pH 8,0, el nucleófilo (RHAK6CF (SEQ ID NO: 02) o RHAK-MCa-PEG20000 (SEQ ID NO: 02)), y clorhidrato de guanidinio (Gdm-HCl) antes de la reacción enzimática. Sin quedar ligada a la teoría, de esta manera la solubilidad de la construcción de IGF podría mantenerse y la concentración pequeña de clorhidrato de guanidinio probablemente induciría una desnaturalización parcial y, por lo tanto, proporcionaría una mejor accesibilidad del extremo C terminal con "sitio de tripsina" durante la reacción enzimática. El mutante de tripsina-4x puede preincubarse en presencia de iones Zn2+. Puede conseguirse buena actividad enzimática combinando las dos mezclas de reacción A y B comprendiendo la mezcla A el polipéptido de fusión que comprende IGF-I y comprendiendo la mezcla B el mutante de tripsina-4x. Las mezclas de reacción pueden tener un valor de pH de pH 8,0. La mezcla de reacción total puede incubarse a 30 °C mientras se agita suavemente. Puede aplicarse un tiempo de reacción total de 180 min y pueden tomarse muestras cada 30 min. La reacción enzimática puede detenerse formando complejo de los iones Zn2+ con EDTA. Finalmente, el volumen puede ajustarse añadiendo una solución de tampón (tampón S que comprende TRIS 100 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0), hasta un factor de dilución final de 1:2. Las muestras pueden analizarse por SEC. Dependiendo de qué marcador se use, pueden aplicarse diferentes columnas de SEC. Por ejemplo, para RHAK-6CF puede usarse una columna peptídica Superdex™ con un intervalo de separación de 100 – 7.000 Da, para RHAK-MCa-PEG20000 puede usarse una columna Superdex™ 75 con un intervalo de separación de 3.000 – 70.000 Da (GE Healthcare).
El rendimiento para modificación específica de sitio con RHAK-6CF puede determinarse de la siguiente manera. Puede prepararse una serie de diluciones de concentración de RHAK-6CF libre (0,5, 1, 5, 10, 25, 50 y 100 μg/ml). Puede usarse tampón S como un disolvente, ya que la fluorescencia de RHAK-6CF es sensible al pH. Pueden analizarse muestras de calibración por SEC. Las áreas pico de RHAK-6CF que comprenden picos resultantes de emisión de radiación a 514 nm pueden determinarse para las diferentes concentraciones y representarse, proporcionando de este modo una curva de calibración. Las muestras de reacción pueden analizarse por SEC de la misma manera que las muestras de calibración y puede determinarse el área pico del producto fluorescente. La cantidad de RHAK-6CF formado y por lo tanto el rendimiento de modificación específica de sitio con este nucleófilo pueden determinarse usando la curva de calibración.
Para todas las construcciones el rendimiento aumentó con el tiempo. Después de aproximadamente 150 min puede obtenerse un rendimiento máximo. La construcción wt-hIGF-sitio de tripsina-marcador de estrep proporcionó los mejores resultados con un rendimiento de 17,5 % después de 150 min. Por el contrario, wt-hIGF-sitio de tripsina y mut-hIGF (K27R, K65R) proporcionaron resultados máximos menores y relativamente iguales de 11,9 % después de 150 min y 13,0 % después de 180 min, respectivamente. El aumento del rendimiento con el tiempo durante la modificación específica de sitio con RHAK-6CF se muestra en la Figura 2B.
Cuando se usó RHAK-MCa-PEG20000 como un nucleófilo, se produjeron problemas en la separación de RHAKMCa-PEG20000 no conjugado, libre e IGF-I marcado con RHAK-MCa-PEG20000. Esto puede deberse al tamaño similar del nucleófilo y el producto de conjugación. Por lo tanto, no fue posible determinar el rendimiento para modificación específica de sitio mediante el aumento del producto en este caso y fue necesario un enfoque diferente. Debido a que solamente se produciría una única modificación específica de sitio, la reducción de IGF-I (educto) no modificado puede ser equivalente a un aumento en el producto de conjugación. La reducción de IGF-I no modificado se estimó mediante el área pico de cromatograma de HPLC resultante de la absorbancia a 226 nm. Como para la modificación con RHAK-6CF, el rendimiento para modificación con RHAK-MCa-PEG20000 aumentó con el tiempo (Figura 3 y 4). Con la construcción wt-hIGF-sitio de tryp-marcador de estrep pudo obtenerse sorprendentemente el mayor rendimiento después de 180 min con 23,1 %. Se obtuvieron resultados casi iguales para mut-IGF (K27R, K65R)-sitio tryp (20,6 % después de 180 min) y wt-hIGF-sitio tryp (19,9 % después de 180 min).
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SEQ ID NO: 28
Secuencia de aminoácidos de IGF-I humano monopegilado que comprende un marcador de His N terminal y un sitio de escisión de IgA proteasa. SEQ ID NO: 29 Secuencia de aminoácidos de IGF-I humano monopegilado.
Descripción de las figuras
Figura 1 Representación esquemática de diferentes construcciones. Figura 2 Curva de calibración RHAK-6CF (A) y rendimiento de marcaje de RHAK-6CF (B).
A: una serie de diluciones con las siguientes concentraciones preparadas en Tris 100 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0 se analizó usando SEC: 0,5, 1, 5, 10, 25, 50, 100 μg/ml. El área pico de la emisión de RHAK-6CF a 514 nm se determinó y representó en relación con la concentración. Se muestran el coeficiente de determinación (R2) y la ecuación para la línea de tendencia aplicada. Cada punto de datos es el resultado de 3 experimentos repetitivos y se muestra ± el error típico.
B: se prepararon reacciones de marcaje de acuerdo con 4.3.8 para marcaje de RHAK-6CF. Las muestras se analizaron mediante SEC. (izquierda): wt-hIGF -sitio tryp -marcador de estrep, (medio): wt-hIGF -sitio tryp, (derecha): mut-hIGF (K27R, K65R) -sitio tryp.
Figura 3 Comparación del rendimiento en modificación específica de sitio con RHAK-6CF o RHAK-MCa-PEG20000. (izquierda): RHAK-6CF, (derecha): RHAK-MCa-PEG20000. Figura 4 Aumento dependiente del tiempo de IGF-I modificado en el extremo C terminal en condiciones optimizadas (nucleófilo: RHAK-MCa-PEG20000).
Abreviaturas:
"lado de tripsina" Secuencia de aminoácidos YRHAAG 6-CF Carboxifluoresceína Gdm-HCl Clorhidrato de guanidinio Marcador de His Marcador de polihistidina MCa Metilcoumarina PEG Poli (etilenglicol) Estrep Estreptavidina TRIS 2-amino-1-hidroximetil-1,3-propanodiol Tryp "Sitio de tripsina" IGF-I Factor de crecimiento de tipo insulina 1 mutante de tripsina-4x Tripsina mutante D 189K, K60E, N143H, E151H
Materiales y métodos:
Cromatografía de exclusión por tamaño analítica Tampón: TRIS 0,5 M, NaCI 0,15 M, pH 7,5 Columna: Péptido Superdex™ 10/300 GL Sistema: Dionex
Método: se llevó a cabo elución isocrática con un caudal de 0,5 ml/min. El tiempo de ciclo total fue de 70 min. Se inyectaron 50 μl de la muestra. El ciclo de separación se rastreó siguiendo las señales de absorbancia a 220 y 280 nm.
Cromatografía de exclusión por tamaño durante el marcaje Tampón: TRIS 10 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0 Columna: Péptido Superdex™ 10/300 GL (marcaje de RHAK-6CF) Superdex™ 75
10/300 GL (marcaje de RHAK-MCa-PEG20000)
Sistema: Gynkotek (marcaje de RHAK-6CF) Dionex (marcaje de RHAK-MCa-PEG20000, véase Tabla 8)
Método de marcaje de Se llevó a cabo elución isocrática con un caudal de 0,5 ml/min. El tiempo de RHAK-6CF: ciclo total fue de 60 min.
Método de marcaje de Se llevó a cabo elución isocrática con un caudal de 0,75 ml/min. RHAK-MCa-PEG20000:
El tiempo de ciclo total fue de 45 min. Se inyectaron 50 μl de muestra (250 μl por cuestiones preparatorias). El ciclo de separación se rastreó siguiendo las señales de absorbancia a 220 nm, 280 nm, 320 nm (marcaje de RHAK-MCa-PEG20000) y la señal de fluorescencia
(extinción = 490 nm, emisión = 514 nm) (marcaje de RHAK-6CF).
Ejemplo 1
Modificación específica de sitio
Se consiguió marcaje específico de sitio de construcciones de IGF-I con RHAK-6CF y RHAK-MCa-PEG20000.
Tabla 2:
Componentes para modificación específica de sitio. Se proporcionan concentraciones y especificaciones para soluciones de reserva.
Componente
Concentración de solución de reserva en
wt-hIGF -sitio tryp -marcador de estrep
2 mg/ml en tampón de acetato sódico 10 mM, pH 4,5
wt-hIGF -sitio tryp
2 mg/ml en tampón de acetato sódico 10 mM, pH 4,5
mut-hIGF (K27R, K65R) -sitio tryp
2 mg/ml en tampón de acetato sódico 10 mM, pH 4,5
Mutante de tripsina 4x
200 μM en HCl 1 mM
TRIS
2 M en H2O, pH 8,0
Tampón S (Tris, NaCl)
100 mM, 150 mM en H2O, pH 8,0
RHAK-MCa-PEG20000
200 mg/ml en H2O
RHAK-6CF
10 mg/ml en H2O
Gdm-HCl
4 M en H2O
ZnCl2
20 mM en H2O
Tabla 3:
Controles realizados para reacciones de modificaciones específicas de sitio. Los controles n.º 1, n.º 3a, n.º 3b se realizaron para cada construcción de hIGF-I.
Control
Construcción de hIGF-I Mutante de tripsina 4x RHAK-6CF RHAK MCa-PEG20000
n.º 1
+ + - -
n.º 2a
- - + -
n.º 2b
- - - +
n.º 3a
+ + + -
n.º 3b
+ + - +
Cada construcción se marcó con RHAK-6CF o RHAK-MCa-PEG20000. Además se realizaron controles de acuerdo con la Tabla 2.
15 Las concentraciones de los diferentes compuestos en las reacciones de marcaje finales se enumeran en la Tabla 4. Todas las reacciones se realizaron en tubos siliconados de 650 μl. Las proteínas se diluyeron en tampón de TRIS 2 M. Posteriormente se añadieron el péptido marcado y clorhidrato de guanidinio. Esta mezcla (A) se incubó a 30 °C durante 10 min. La mezcla B que consistía en mutante de tripsina 4x, ZnCl2 y tampón S (TRIS 100 mM, NaCl
20 150 mM, pH 8,0) se incubó en las mismas condiciones que la mezcla A. El volumen necesario de tampón S se eligió para proporcionar un volumen de reacción total de 400 μl para las reacciones de marcaje y 250 μl para controles. Las mezclas A y B se combinaron e incubaron a 30 °C mientras se agitaban suavemente.
Para detener la reacción enzimática la mezcla se reacción se combinó con la mitad de su volumen con EDTA 10 mM 25 (preparado en tampón S) y el mismo volumen de tampón S para un factor de dilución de 1:2. Se aplicó un tiempo de reacción total de 180 min.
Tabla 4:
Concentraciones de todos los compuestos para modificación específica de sitio en reacciones. Se aplicó un volumen de reacción de 400 μl para reacciones de marcaje y 250 μl para controles. Las reacciones se realizaron usando RHAK-6CF o RHAK-MCa-PEG20000 como un marcador.
Mezcla
Componente wt-hIGF-I sitio de tripsina marcador de estrep wt-hIGF-I sitio de tripsina mut-hIGF-I (K27R, K65R) sitio de tripsina
A
Proteína 1 mg/ml 107,1 μM 1 mg/ml 120,6 μM 1 mg/ml 119,7 μM
RHAK-6CF
1,17 mg/ml 1071 μM 1,32 mg/m l 1206 μM 1,31 mg/ml 1197 μM
RHAK-MCa-PEG20000
24,6 mg/ml 1071 μM 27,7 mg/m l 1206 μM 27,5 mg/ml 1197 μM
TRIS
200 mM 200 mM 200 mM
Gdm HCl
200 mM 200 mM 200 mM
B
Mutante de tripsina 4x 20 μM 20 μM 20 μM
ZnCl2
100 μM 100 μM 100 μM
Tampón S (Tris, NaCl)
añadir a volumen final añadir a volumen final añadir a volumen final
Ejemplo 2
5 Optimización de modificación específica de sitio
La reacción se llevó a cabo en un volumen de 1000 μl a temperatura ambiente. El mutante de tripsina-4x se preincubó en presencia de ZnCl2 y el marcador de PEG durante 10 min a 30 °C. A continuación se añadió guanidinio HCl y wt-hIGF-sitio de tryp-sitio de estrep para conseguir las concentraciones finales proporcionadas
10 posteriormente. La mezcla de reacción se incubó durante hasta 54 horas a 20 °C. Se consiguió un rendimiento de producto de > 25 % después de 24 h alcanzando un máximo de 32,6% después de 52 horas (véase Figura 4).
Condiciones de reacción:
15 wt hIGF-I sitio de tripsina marcador de estrep 100 μM mutante de tripsina 4x 2 μM RHAK-MCa-PEG20000 500 μM ZnCl2 10 μM HEPES 100 mM
20 NaCl 150 mM CaCl2 1 mM Gdm HCl 200 mM
Ejemplo 3 25 Fosforilación de IGF-IR in vitro mediante variantes de IGF-I mutantes y wt recombinantes e IGF-I monopegilado
Se usó un ELISA específico de fosfo-IGF-IR para cuantificar la activación de IGF-IR mediante las variantes de IGF-I diferentes. Después de privación de suero durante una noche, se incubaron células NIH-3T3 recombinantes que 30 expresaban IGF-IR humano con diferentes concentraciones de variantes de IGF-I para permitir la unión y activación del IGF-IR en un contexto celular. Después de la estimulación, las células se sometieron a lisis usando tampón de lisis frío (MES 25 mM, pH 6,5, NaCl 150 mM, Triton-X100 2 %, β-octilglucósido 60 mM, Na3VO4 2 mM, inhibidor de proteasa Complete™) para conservar el estado de fosforilación. Se usó un anticuerpo monoclonal biotinilado contra la cadena alfa de IGF-IR humano (MAK<hu IGF-IRα>hu-1a-IgG-Bi, Roche Diagnostics GmbH) para capturar IGF-IR 35 total en la superficie de una microplaca recubierta con estreptavidina, y se usó un anticuerpo monoclonal contra Tyr1135/1136 fosforilado dentro del dominio de quinasa IGF-IR (Cell Signaling n.º 3024L) para determinar la fracción de IGF-IR activado. Se usaron células estimuladas con IGF-I humano 10 nM como control máximo, las células sin estimulación como control mínimo. El porcentaje de activación del IGF-IR se calculó como (resultado mínimo)/(máximo – mínimo). Los valores de CI50/CE50 de determinaron por ajuste de curvas usando software
40 GraphPad Prism 4,0.

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  1. imagen1
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EP10153275 2010-02-11
EP10153275 2010-02-11
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