ES2896475T3 - Cadenas pesadas de inmunoglobulina recombinante que comprenden un bucle de conjugación de sortasa y conjugados de las mismas - Google Patents

Cadenas pesadas de inmunoglobulina recombinante que comprenden un bucle de conjugación de sortasa y conjugados de las mismas Download PDF

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Abstract

Una cadena pesada de inmunoglobulina recombinante que comprende un dominio VH, un dominio CH1, una región bisagra abajo hasta la cisteína más C terminal de la región bisagra media, un bucle de conjugación de sortasa, un dominio CH2 y un dominio CH3, en la que el bucle de conjugación de sortasa a) consiste en al menos 16 aminoácidos localizados entre la cisteína más C terminal de la región bisagra media y la secuencia consenso (SEQ ID NO: 2; en la que X1 es L o I) en el extremo N de un dominio CH2 de la cadena pesada de inmunoglobulina, b) comprende un motivo de reconocimiento de sortasa que consiste en la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 01), en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A, c) comprende N terminal con respecto a la secuencia de (b) al menos dos aminoácidos, d) comprende C terminal con respecto a la secuencia de (b) al menos 6 aminoácidos, y e) en la que los aminoácidos C y N terminales con respecto a la secuencia de (b) no son cisteína.

Description

DESCRIPCIÓN
Cadenas pesadas de inmunoglobulina recombinante que comprenden un bucle de conjugación de sortasa y conjugados de las mismas
La presente invención se refiere a una cadena pesada de inmunoglobulina recombinante que comprende un bucle de conjugación de sortasa, a procedimientos para conjugar y/o marcar dichas cadenas pesadas de inmunoglobulina recombinante por el uso de la enzima sortasa y a los conjugados/productos marcados obtenidos por medio de dicho procedimiento.
Antecedentes de la invención
La modificación de proteínas específica del sitio es un problema complejo, especialmente con los anticuerpos usados para aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas. Los procedimientos fiables para la modificación de polipéptidos específica del sitio que sean económicos y aplicables a escala industrial son de gran importancia.
Los primeros procedimientos de funcionalización de proteínas aprovecharon la reactividad de los residuos de cisteína o bien lisina haciendo reaccionar la proteína con un exceso de reactivos reactivos a tiol o amina, tales como maleimidas o ésteres de N-hidroxisuccinimidilo, respectivamente. Son abundantes, se distribuyen ampliamente y se modifican fácilmente debido a la disponibilidad de una química de acoplamiento apropiada.
Sin embargo, la estrategia de "marcaje con lisina", cuando se usa, por ejemplo, para marcar anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, tiene varios inconvenientes: a) a menudo da como resultado una disminución apreciable en la actividad de unión a antígeno (lisina en o cerca del sitio de unión a antígeno); b) los conjugados monomarcados incluso con la misma estequiometría 1:1 consisten en mezclas que comprenden un marcador unido por medio de diferentes lisinas dentro del polipéptido y c) los rendimientos del producto 1:1 deseado son bastante bajos.
Uno de los enfoques recientes más importantes para el marcaje de proteínas específico del sitio es incorporar funcionalidades bioortogonales en proteínas en sitios específicos por medio de reacciones enzimáticas. Para una revisión reciente sobre el "marcaje enzimático de proteínas", véase M. M. Rashidian et al., Bioconjugate Chemistry 24 (2013) 1277-1294. Las enzimas usadas para la conjugación específica del sitio abarcadas en esta revisión incluyen la enzima generadora de formilglicina, sialiltransferasas, fosfopanteteiniltransferasas, modificación postraduccional con O-GlcNAc, transpeptidación mediada por sortasa ("sorfagg/ng"), transglutaminasa, farnesiltransferasa, biotina ligasa, ácido lipoico ligasa y ácido N-miristoiltransferasa.
La sortasa A (SrtA) es una enzima unida a la membrana que une proteínas de forma covalente a la pared celular bacteriana. El motivo de reconocimiento de sortasa específico en el sustrato de SrtA es L P X 1 T X 2 (SEQ ID NO: 01, en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A). La enzima sortasa escinde entre los residuos treonina (T) y X2 (G o A). El motivo de fijación en el nucleófilo de sortasa (también denominado sustrato de sortasa), es decir, la parte polipeptídica del peptidoglucano que se une al sustrato en la pared celular bacteriana, es naturalmente un motivo pentaglicina. Se ha demostrado que un motivo triglicina e incluso diglicina en el extremo N del peptidoglucano es suficiente para sustentar la reacción de SrtA (Clancy, K.W., et al., Peptide Science 94 (2010) 385-396). La reacción avanza a través de un intermedio de tioéster acil-enzima, que se resuelve por el ataque de un nucleófilo amina de la oligoglicina, enlazando de este modo de forma covalente el peptidoglucano a un sustrato proteico y regenerando la SrtA.
En el laboratorio bioquímico moderno, la SrtA se puede usar, por ejemplo, para conjugar de forma covalente péptidos sintetizados químicamente con proteínas expresadas de forma recombinante.
En el documento WO 2010/087994 se informa de procedimientos para la fijación mediada por SrtA y usos de los mismos. Los enfoques recombinantes para anticuerpos biespecíficos similares a IgG se informan por Marvin, J.S., et al. (Acta Pharmacol. Sinica 26 (2005) 649-658). Levary, D.A., et al. (PLoS one, 6 (2011) e18342.1-e18342.6) mostraron una fusión proteína-proteína catalizada por sortasa A. En el documento WO 2013/003555 se informa del uso de sortasas para instalar mangos de química clic para la fijación de proteínas.
La genomanipulación de un anticuerpo anti receptor del factor de crecimiento epidérmico en un formato monocatenario y el marcaje por fijación de proteínas mediada por sortasa A se informa por Madej, M.P., et al. (Biotechnol. Bioeng. 109 (2012) 1461-1470). Ta, H.T., et al., informan del marcado de anticuerpo monocatenario enzimático como un enfoque universal para la obtención de imágenes moleculares dirigidas y la migración dirigida de las células en las cardiovasculopatías (Cir. Res. 109 (2011) 365-373). Popp, M. et al., informan de la creación y ruptura de enlaces peptídicos: genomanipulación de proteínas usando sortasa (Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 50 (2011) 5024-5032).
El documento WO 2014/001324 divulga un procedimiento para producir un anticuerpo biespecífico que comprende la etapa de incubar (i) un fragmento Fab del anticuerpo o un anticuerpo scFv que comprende dentro de los 20 residuos de aminoácidos C terminales la secuencia de aminoácidos GnSLPXITG, en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido, con n = 1,2 o 3; (ii) un fragmento del anticuerpo de un solo brazo que comprende una cadena pesada del anticuerpo de longitud completa, una cadena ligera del anticuerpo de longitud completa y un polipéptido de la región Fc de la cadena pesada del anticuerpo, con lo que la cadena pesada del anticuerpo de longitud completa y la cadena ligera del anticuerpo de longitud completa son cadenas de anticuerpo análogas complementarias entre sí y el par de dominios variables (VH y VL) de las mismas forma un sitio de unión a antígeno, con lo que la cadena pesada del anticuerpo de longitud completa y el polipéptido de la región Fc de la cadena pesada del anticuerpo se enlazan de forma covalente entre sí por medio de uno o más enlaces disulfuro que forman una región bisagra del anticuerpo, y con lo que el polipéptido de la región Fc de la cadena pesada del anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos GGCPX4C (SEQ ID NO: 08), con lo que X4 es S o bien P, en su extremo N; y (i¡¡) una enzima sortasa A.
Se ha usado una SrtA truncada, que carece del motivo de anclaje a membrana N terminal (por ejemplo, los residuos de aminoácidos 60-206 de SrtA de Staphylococcus aureus), para el marcaje de proteínas, la inmovilización de proteínas covalente y la incorporación de funcionalidad novedosa en proteínas (Ton-That, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 12424-12429; Ilangovan, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001) 6056-6061).
Una de las clases más importantes de polipéptidos para los que es altamente deseable el marcaje específico de sitio son las inmunoglobulinas o anticuerpos. Aunque los anticuerpos completos (normalmente IgG, IgA o IgM) son ideales para la mayoría de las aplicaciones, el rendimiento de determinados procedimientos se potencia usando fragmentos de anticuerpo, tales como Fab, Fab' y F(ab')2.
Los fragmentos de anticuerpo de interés principal son fragmentos de unión a antígeno. Son posibles varios tipos de fragmentos de unión a antígeno, pero cada uno contiene al menos aquellas partes de las regiones variables de las cadenas de inmunoglobulina tanto pesadas como ligeras (VH y VL, respectivamente) requeridas para la unión a antígeno que se mantienen juntas (normalmente por enlaces disulfuro) para conservar el sitio de unión a anticuerpo.
La fragmentación de anticuerpos se logra normalmente usando, por ejemplo, proteasas que digieren o escinden determinadas porciones de la estructura de la proteína de inmunoglobulina y, si es necesario, usando agentes reductores para romper enlaces disulfuro en la región bisagra de un fragmento F(ab')2. La fragmentación enzimática es algo laboriosa, requiere la optimización de la digestión mediada por enzimas de la proteína, necesita un amplio suministro de anticuerpo (por ejemplo, 10 mg o más) para hacerla razonablemente eficaz y, a menudo, conlleva además etapas de purificación sofisticadas. La fragmentación oportuna y costosa de un anticuerpo normalmente se realiza solo cuando el anticuerpo de interés está disponible en gran cantidad y la aplicación particular lo requiere.
Los fragmentos de anticuerpo pueden, por ejemplo, marcarse químicamente usando procedimientos del estado de la técnica, con todas las desventajas, por ejemplo, con respecto al rendimiento y la reproducibilidad, mencionadas anteriormente.
La conjugación dirigida al sitio, por ejemplo, facilitada por enzimas, ha recibido recientemente una gran atención.
El marcado con sortasa, al menos en papel, podría funcionar para generar fragmentos de anticuerpo y "marcar" esos fragmentos al mismo tiempo. En teoría, un anticuerpo debería permitir la incorporación de la marca sortasa, por ejemplo, en la región Fc de un anticuerpo recombinante genomanipulado y usar esta marca sortasa para escisión y conjugación simultáneas. En teoría y dependiendo de la posición de la marca sortasa, debería ser posible por tanto, por ejemplo, obtener conjugados de fragmentos F(ab) o F(ab')2, respectivamente.
Sin embargo, cuando se intentó el marcado con sortasa con anticuerpos de otro modo naturales (es decir, solo se insertó la secuencia de reconocimiento LPETG), como en un anticuerpo monoclonal de ratón producido por un hibridoma, el enfoque no funcionó en absoluto o los rendimientos fueron bajos/decepcionantes.
Sin embargo, existiría una enorme necesidad de posibilitar el "marcado" mediado por sortasa de los fragmentos de anticuerpo más pertinentes como F(ab) o F(ab')2, respectivamente, por medio de escisión y conjugación de polipéptidos específica del sitio simultáneas a una escala económica e industrialmente aplicable.
De forma sorprendente, se ha descubierto ahora que la sortasa se puede usar para la conjugación de fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, en el marcaje de fragmentos de anticuerpo) tras la escisión mediada por sortasa de las cadenas pesadas de anticuerpos recombinantes que tienen las propiedades como se divulga a continuación en el presente documento.
Sumario de la invención
Se ha descubierto que la escisión y fijación mediada por sortasa de anticuerpos recombinantes es posible si se introduce de forma recombinante un bucle de conjugación de sortasa especial entre la cisteína más C terminal de la región bisagra media y el dominio CH2 de una cadena pesada de inmunoglobulina.
En un modo de realización, la presente invención divulga una cadena pesada de inmunoglobulina recombinante que comprende un dominio VH, un dominio CH1, una región bisagra abajo hasta la cisteína más C terminal de la región bisagra media, un bucle de conjugación de sortasa, un dominio CH2 y un dominio CH3, en el que el bucle de conjugación de sortasa: a) consiste en al menos 16 aminoácidos localizados entre la cisteína más C terminal de la región bisagra media y la secuencia consenso VFX IFPP (SEQ ID NO: 2; en la que X1 es L o I) en el extremo N de un dominio CH2 de la cadena pesada de inmunoglobulina, b) comprende un motivo de reconocimiento de sortasa que consiste en la secuencia de aminoácidos L P X 1 T X 2 (SEQ ID NO: 01), en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A, comprende N terminal con respecto a la secuencia de (b) al menos dos aminoácidos, comprende C terminal con respecto a la secuencia de (b) al menos 6 aminoácidos, y en el que los aminoácidos C y N terminales con respecto a la secuencia de (b) no son cisteína.
Se divulgan además anticuerpos que comprenden al menos dos cadenas pesadas de inmunoglobulina recombinante como se divulga a continuación en el presente documento. En un modo de realización, estos anticuerpos son de la clase IgG y tienen dos cadenas pesadas de inmunoglobulina recombinante como se divulga a continuación en el presente documento.
Un aspecto como se informa en el presente documento es un procedimiento para producir un conjugado entre un fragmento de escisión por sortasa de una cadena pesada de inmunoglobulina recombinante y un nucleófilo de sortasa que comprende incubar i) anticuerpos de clase IgG que comprenden al menos una, por ejemplo, dos cadenas pesadas de inmunoglobulina recombinante como se divulga en la presente invención, ii) un compuesto que comprende un nucleófilo de sortasa, y iii) un polipéptido con actividad sortasa, escindiendo de este modo la cadena pesada del anticuerpo recombinante después de la treonina en L P X 1 T X 2 (SEQ ID NO: 01, en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A) y conjugar el extremo N del nucleófilo de sortasa con dicha treonina.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica como parte de la invención, un conjugado que comprende un fragmento de la cadena pesada de inmunoglobulina recombinante que comprende un dominio Vh , un dominio CH1, una región bisagra abajo hasta la última cisteína de la región bisagra media, dos o más aminoácidos entre la cisteína más C terminal de la región bisagra media, la secuencia LPXT (SEQ ID NO: 03, en la que X puede ser cualquier residuo de aminoácido) y al menos dos residuos de glicina.
Descripción detallada de la invención
I. Definiciones
En la presente memoria descriptiva y reivindicaciones, la numeración de los residuos en una región Fc de la cadena pesada de inmunoglobulina es la del índice EU de Kabat (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), publicación de los NIH 91-3242).
El término "posición" indica la localización de un residuo de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Las posiciones se pueden numerar secuencialmente o de acuerdo con un formato establecido, por ejemplo, el índice EU de Kabat para la numeración de anticuerpos.
El término "anticuerpo de longitud completa" indica un anticuerpo que tiene una estructura y secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a un anticuerpo natural.
El término "cadena pesada de anticuerpo de longitud completa" indica un polipéptido que comprende en la dirección de N a C terminal un dominio variable de anticuerpo, un primer dominio constante (= dominio CH1), una región bisagra de la cadena pesada de anticuerpo, un segundo dominio constante (= dominio CH2) y un tercer dominio constante (= dominio CH3).
El término "cadena ligera de anticuerpo de longitud completa" indica un polipéptido que comprende en la dirección de N a C terminal un dominio variable de anticuerpo y un dominio constante.
El término "región bisagra" indica la parte de un polipéptido de la cadena pesada de anticuerpo que une en una cadena pesada de anticuerpo natural el dominio CH1 y el dominio CH2, por ejemplo, para la IgG1 humana de aproximadamente la posición 216 a aproximadamente la posición 238 de acuerdo con el sistema de números de EU (http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html), o de aproximadamente la posición 226 a aproximadamente la posición 243 de la numeración de Kabat. La posición 226 de acuerdo con Kabat corresponde a la posición 99 de una región constante de la cadena pesada de IgG1 humana. Las regiones bisagra de otras subclases de IgG se pueden determinar alineando con la región bisagra los residuos de cisteína de la secuencia de la subclase de IgG1 humana.
La región bisagra es habitualmente dimérica que consiste en dos polipéptidos con una secuencia de aminoácidos idéntica. La región bisagra comprende, en general, aproximadamente 25 residuos de aminoácidos y es flexible, lo que permite que las regiones de unión a antígeno se muevan independientemente. La región bisagra se puede subdividir en tres dominios: el dominio bisagra superior, el medio y el inferior (véase, por ejemplo, Roux, et al., J. Immunol. 161 (1998) 4083).
El término "región bisagra superior" de una región Fc, por ejemplo, para la IgG1 humana, indica el tramo de residuos de aminoácidos N terminal con respecto a la región bisagra media, es decir, los residuos de 216 a 225 de la región Fc de acuerdo con la numeración EU.
El término "región bisagra media", por ejemplo, para la IgG1 humana, es decir, los residuos de 226 a 230 de la región Fc de acuerdo con la numeración EU, indica el tramo de residuos de aminoácidos que comprenden los residuos de cisteína de reticulación, es abundante en prolinas y cisteínas, y está localizado entre la región bisagra superior y la inferior.
El término "región bisagra inferior" de una región Fc, por ejemplo, para la IgG1 humana, indica el tramo de residuos de aminoácidos inmediatamente C terminal con respecto a la región bisagra media, es decir, los residuos de 231 a 238 de la región Fc de acuerdo con la numeración EU.
El término "región Fc natural" indica una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc de alotipos/isoalotipos típicos encontrados en la naturaleza. Las regiones Fc humanas naturales incluyen una región Fc de IgG1 humana natural (alotipos distintos de A y A), región Fc de IgG2 humana natural, región Fc de IgG3 humana natural y región Fc de IgG4 humana natural, así como variantes naturales de las mismas.
El término "alteración" indica la mutación, adición o deleción de uno o más residuos de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos original, por ejemplo, de un anticuerpo recombinante.
El término "mutación aminoacídica" indica una modificación en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos original. Las modificaciones ejemplares incluyen sustituciones, inserciones y/o deleciones aminoacídicas.
El término "mutaciones aminoacídicas en la posición" indica la sustitución o deleción del residuo especificado, o la inserción de al menos un residuo de aminoácido contigua al residuo especificado. El término "inserción contigua a un residuo especificado" indica la inserción dentro de uno a dos residuos del mismo. La inserción puede ser N terminal o C terminal para el residuo especificado.
El término "sustitución aminoacídica" indica el reemplazo de al menos un residuo de aminoácido en una secuencia de aminoácidos original predeterminada por un residuo de aminoácido de "reemplazo" diferente. El residuo o residuos de reemplazo pueden ser un "residuo de aminoácido natural" (es decir, codificado por el código genético) y seleccionado del grupo que consiste en: alanina (Ala); arginina (Arg); asparagina (Asn); ácido aspártico (Asp); cisteína (Cys); glutamina (Gln); ácido glutámico (Glu); glicina (Gly); histidina (His); isoleucina (Ile): leucina (Leu); lisina (Lys); metionina (Met); fenilalanina (Phe); prolina (Pro); serina (Ser); treonina (Thr); triptófano (Trp); tirosina (Tyr); y valina (Val). En un modo de realización, la sustitución aminoacídica es un reemplazo por un aminoácido natural. En un modo de realización, el residuo de reemplazo no es cisteína.
La sustitución con uno o más residuos de aminoácidos no naturales también se engloba por la definición de una sustitución aminoacídica en el presente documento. Un "residuo de aminoácido no natural" indica un residuo, distinto de los residuos de aminoácidos naturales enumerados anteriormente, que puede unir de forma covalente residuo(s) de aminoácido(s) contiguo(s) en una cadena polipeptídica. Los ejemplos de residuos de aminoácidos no naturales incluyen norleucina, ornitina, norvalina, homoserina, ácido a-aminoisobutírico (Aib) y otros análogos de residuos de aminoácidos tales como los descritos en Ellman, et al., Meth. Enzym. 202 (1991) 301-336. Para generar dichos residuos de aminoácidos no naturales, se pueden usar los procedimientos de Noren, et al. (Science 244 (1989) 182) y/o Ellman, et al., (supra). En resumen, estos procedimientos implican la activación química de un ARNt supresor con un residuo de aminoácido no natural seguido por la transcripción y traducción in vitro del ARN.
El término "inserción aminoacídica" indica la incorporación de uno o más residuos de aminoácidos adicionales en una secuencia de aminoácidos original predeterminada. Una "secuencia de aminoácidos insertada" de acuerdo con la presente invención consistirá normalmente en al menos cinco aminoácidos. El/los residuo(s) de aminoácido(s) insertado(s) puede(n) ser natural(es) o no natural(es) como se define anteriormente. En un modo de realización, los residuos de aminoácidos insertados son residuos de aminoácidos naturales. En un modo de realización, los residuos de aminoácidos insertados son residuos de aminoácidos naturales pero no son cisteína. En un modo de realización, los residuos de aminoácidos insertados son residuos de aminoácidos naturales y no son ni cisteína ni prolina.
El término "deleción aminoacídica" indica la retirada de al menos un residuo de aminoácido en una posición predeterminada en una secuencia de aminoácidos.
Dentro de esta solicitud, siempre que se mencione una alteración aminoacídica, se trata de una alteración aminoacídica deliberada y no de una modificación aminoacídica aleatoria.
II. Procedimientos recombinantes
Un vector de expresión que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina recombinante, que comprende un dominio VH, un dominio CH1, una región bisagra abajo hasta la cisteína más C terminal de la región bisagra media, un bucle de conjugación de sortasa, un dominio c H2 y un dominio CH3, en el que el bucle de conjugación de sortasa: a) consiste en al menos 16 aminoácidos localizados entre la cisteína más C terminal de la región bisagra media y la secuencia consenso VFX1FPP (SEQ ID NO: 2; en la que X1 es L o I) en el extremo N de un dominio CH2 de la cadena pesada de inmunoglobulina, b) comprende un motivo de reconocimiento de sortasa que consiste en la secuencia de aminoácidos L P X 1 T X 2 (SEQ ID NO: 01), en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A, c) comprende N terminal con respecto a la secuencia de (b) al menos dos aminoácidos, d) comprende C terminal con respecto a la secuencia de (b) al menos 6 aminoácidos, y e) en el que los aminoácidos C y N terminales con respecto a la secuencia de (b) no son cisteína, se puede fabricar de acuerdo con los procedimientos del estado de la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989.)
Si bien es posible usar la traducción in vitro para producir una cadena pesada de inmunoglobulina recombinante como se divulga en el presente documento, se usará el sistema de expresiones celulares en la rutina. Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión/secreción de vectores que codifican polipéptidos incluyen células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, se pueden producir polipéptidos en bacterias, en particular cuando no se necesita glucosilación (véase, por ejemplo, los documentos US 5.648.237, US 5.789.199 y US 5.840.523, Charlton, Methods in Molecular Biology 248 (2003) 245-254 (B.K.C. Lo, (ed.), Humana Press, Totowa, NJ), que describen la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli). Después de la expresión, el polipéptido se puede aislar de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble o se puede aislar de la fracción insoluble denominada cuerpos de inclusión que se pueden solubilizar y replegar en formas bioactivas. Después de esto, el polipéptido se puede además purificar.
Además de los procariotas, los microbios eucariotas, tales como los hongos filamentosos o las levaduras, son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican polipéptidos, incluyendo hongos y cepas de levadura con vías de glucosilación que se han "humanizado", lo que da como resultado la producción de un polipéptido con un patrón de glucosilación completamente humano (véase, por ejemplo, Gemgross, Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414, y Li, et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215).
Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos glucosilados también se derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden usar junto con células de insecto, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.
Los cultivos de células vegetales también se pueden utilizar como huéspedes (véanse, por ejemplo, los documentos US 5.959.177, US 6.040.498, US 6.420.548, US 7.125.978 y US 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas)).
También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas de células de mamífero que se adaptan para cultivar en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son la línea de células COS-7 (célula CV1 de riñón de mono transformada por SV40); la línea de células HEK293 (riñón embrionario humano); la línea de células BHK (riñón de cría de hámster); la línea de células de Sertoli de ratón TM4 (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol. Reprod. 23 (1980) 243-251); la línea de células CV1 (célula de riñón de mono); la línea de células VERO-76 (célula de riñón de mono verde africano); la línea de células HELA (célula de carcinoma de cuello uterino humano); la línea de células MDCK (célula de riñón canina); la línea de células BRL-3A (célula de hígado de rata búfalo); la línea de células W138 (célula de pulmón humana); la línea de células HepG2 (célula de hígado humano); la línea de células MMT060562 (célula de tumor mamario de ratón); la línea de células TRI (por ejemplo, descrita en Mather, et al., Anal. N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68); la línea de células MRC5; y la línea de células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen la línea de células CHO (célula de ovario de hámster chino), incluyendo las líneas de células CHO negativas para DHFR (véase, por ejemplo, Urlaub, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216), y líneas de células de mieloma tales como la línea de células Y0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de polipéptidos, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, Antibody Engineering 248 (2004) 255-268 (B.K.C. Lo, (ed.), Humana Press, Totowa, NJ).
La coexpresión de una cadena pesada de anticuerpo y una cadena ligera de anticuerpo representa un modo de realización de acuerdo con la presente divulgación. Usando dicha coexpresión, se puede obtener un anticuerpo que comprende tanto una cadena pesada como una ligera, por ejemplo, un anticuerpo de clase IgG que consiste en dos cadenas pesadas recombinantes de acuerdo con la presente invención y dos cadenas ligeras.
MI. La cadena pesada de anticuerpo recombinante y usos de la misma como se informa en el presente documento
La cadena pesada de inmunoglobulina recombinante de acuerdo con la presente invención se caracteriza por la inserción intencionada de un bucle de conjugación de sortasa.
El bucle de conjugación de sortasa de acuerdo con la presente invención es una secuencia de aminoácidos artificial localizada entre la cisteína más C terminal de la región bisagra media y la secuencia consenso VFX1FPP (SEQ ID NO: 2; en la queX1 es L o I) en el extremo N de un dominio CH2 de la cadena pesada de inmunoglobulina. El bucle de conjugación de sortasa de acuerdo con la presente invención tiene adicionalmente las siguientes características esenciales: a) consiste en al menos 16 aminoácidos, b) comprende un motivo de reconocimiento de sortasa que consiste en la secuencia de aminoácidos L P X 1 T X 2 (SEQ ID NO: 01), en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A, c) comprende N terminal con respecto a la secuencia de (b) al menos dos aminoácidos, d) comprende C terminal con respecto a la secuencia de (b) al menos 6 aminoácidos, y e) los aminoácidos C y N terminales con respecto a la secuencia de (b) no son cisteína.
Como se muestra en la tabla 1, la región bisagra media de diversas cadenas pesadas de inmunoglobulina se puede identificar fácilmente por medio de la alineación de secuencia apropiada. La cisteína más C terminal en la región bisagra media se indica en negrita en la tabla 1. En la tabla 1 se dan alineaciones de secuencia típicas de secuencias consenso para las cadenas pesadas de inmunoglobulina de diversas especies.
Tabla 1: Secuencias consenso ejemplares para diversas cadenas pesadas de inmunoglobulina
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Las partes de secuencia mostradas en la tabla 1 se dan con los siguientes identificadores de secuencia: H-IgG1 (SEQ ID NO: 4); H-IgG2 (SEQ ID NO: 5); H-IgG4 (SEQ ID NO: 6); M-IgG1 (SEQ ID NO: 7); M-IgG2a(a) (SEQ ID NO: 8); M-IgG2a(b) (SEQ ID NO: 9); M-IgG2b (SEQ ID NO: 10); M-IgG3 (SEQ ID NO: 11); Rb-IgG1 (SEQ ID NO: 12); y S-IgG1 (SEQ ID NO: 13), respectivamente.
Un caso especial es H-lgG3, en la que la región bisagra superior/media comprende 3 réplicas de una secuencia idéntica y una secuencia altamente homologa adicional. El extremo C de CH1 es; T K V D K R V (SEQ ID NO: 14); la bisagra superior y media es ELKTPLGDTTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRPC)3 (SEQ ID NO: 15); y la bisagra inferior con los aminoácidos N terminales del dominio CH2 es A P E LLG G P S V F LF (SEQ ID NO: 16).
La región bisagra de un anticuerpo abarca la parte de la secuencia de la cadena pesada entre el último aminoácido de la lámina p más C terminal en el dominio CH1 (hebra G) y el primer aminoácido de la primera lámina p en el dominio CH2 (hebra A).
La secuencia de la región bisagra superior (natural o bien modificada) no es crucial para la práctica de la presente invención.
La región bisagra media comprende los residuos de cisteína que se requieren para la formación de un puente de cistina intermolecular entre dos cadenas pesadas de inmunoglobulina.
En un modo de realización, la cadena pesada de inmunoglobulina recombinante de acuerdo con la presente divulgación tiene un bucle de conjugación de sortasa que comprende al menos 7 aminoácidos C terminales con respecto a la secuencia L P X 1 T X 2 (SEQ ID NO: 01, en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A).
En un modo de realización, la cadena pesada de inmunoglobulina recombinante de acuerdo con la presente divulgación tiene un bucle de conjugación de sortasa que comprende al menos 8 aminoácidos C terminales con respecto a la secuencia L P X 1 T X 2 (SEQ ID NO: 01, en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A).
En un modo de realización, la cadena pesada de inmunoglobulina recombinante de acuerdo con la presente divulgación tiene un bucle de conjugación de sortasa que comprende al menos 9 aminoácidos C terminales con respecto a la secuencia L P X 1 T X 2 (SEQ ID NO: 01, en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A).
En un modo de realización, la cadena pesada de inmunoglobulina recombinante de acuerdo con la presente divulgación tiene un bucle de conjugación de sortasa que comprende al menos 3 aminoácidos N terminales con respecto a la secuencia L P X 1 T X 2 (SEQ ID NO: 01, en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A).
En un modo de realización, la cadena pesada de inmunoglobulina recombinante de acuerdo con la presente divulgación tiene un bucle de conjugación de sortasa que comprende al menos 4 aminoácidos N terminales con respecto a la secuencia L P X 1 T X 2 (SEQ ID NO: 01, en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A).
En un modo de realización, la cadena pesada de inmunoglobulina recombinante de acuerdo con la presente divulgación tiene un bucle de conjugación de sortasa que comprende al menos 5 aminoácidos N terminales con respecto a la secuencia L P X 1 T X 2 (SEQ ID NO: 01, en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A).
En un modo de realización, la cadena pesada de inmunoglobulina recombinante de acuerdo con la presente divulgación tiene un bucle de conjugación de sortasa que comprende al menos 6 aminoácidos N terminales con respecto a la secuencia L P X 1 T X 2 (SEQ ID NO: 01, en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A).
En un modo de realización, la cadena pesada de inmunoglobulina recombinante de acuerdo con la presente divulgación tiene un bucle de conjugación de sortasa que comprende al menos 7 aminoácidos N terminales con respecto a la secuencia L P X 1 T X 2 (SEQ ID NO: 01, en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A).
En un modo de realización, la cadena pesada de inmunoglobulina recombinante de acuerdo con la presente divulgación tiene un bucle de conjugación de sortasa que comprende al menos 8 aminoácidos N terminales con respecto a la secuencia L P X 1 T X 2 (SEQ ID NO: 01, en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A).
En un modo de realización, la cadena pesada de inmunoglobulina recombinante de acuerdo con la presente divulgación tiene un bucle de conjugación de sortasa que comprende al menos 5 aminoácidos N terminales con respecto a la secuencia L P X 1 T X 2 (SEQ ID NO: 01, en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A) y al menos 9 aminoácidos C terminales con respecto a dicha secuencia.
En un modo de realización, la cadena pesada de inmunoglobulina recombinante de acuerdo con la presente divulgación tiene un bucle de conjugación de sortasa que comprende al menos 8 aminoácidos N terminales con respecto a la secuencia L P X 1 T X 2 (SEQ ID NO: 01, en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A) y al menos 9 aminoácidos C terminales con respecto a dicha secuencia.
Siempre que se respete la longitud mínima de 16 aminoácidos de acuerdo con la presente divulgación, la longitud global de un bucle de conjugación de sortasa no parece ser crucial. No obstante, en un modo de realización, el bucle de conjugación de sortasa en una cadena pesada de inmunoglobulina recombinante de acuerdo con la presente divulgación tiene una longitud máxima de 50 aminoácidos. En otros modos de realización, el bucle de conjugación de sortasa en una cadena pesada de inmunoglobulina recombinante de acuerdo con la presente divulgación tiene una longitud máxima de 45, 40, 35 o 30 aminoácidos.
En otros modos de realización, la longitud global de un bucle de conjugación de sortasa es de al menos 17, 18, 19, 20, 21 o 22 aminoácidos, respectivamente.
Una cadena pesada de inmunoglobulina normalmente comprende un dominio VH, un dominio CH1, una región bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. Como aprecia el experto en la técnica, una cadena pesada de inmunoglobulina recombinante de acuerdo con la presente invención, además del bucle de conjugación de sortasa, puede comprender otras alteraciones como se define anteriormente en el presente documento. Como su nombre indica, la secuencia variable se puede variar de cualquier manera, siempre que se dé la especificidad de unión deseada a una diana de interés. En un modo de realización, la cadena pesada de anticuerpo recombinante que comprende un bucle de conjugación de sortasa de acuerdo con la presente invención será al menos un 90 % idéntica a la correspondiente cadena pesada de inmunoglobulina natural (en la que la región bisagra inferior y el bucle de conjugación de sortasa, respectivamente, no se usan en dicha evaluación de la identidad). En otras palabras, después de la alineación apropiada usando el programa GCG PileUp y excepto para las regiones variables y el bucle de conjugación de sortasa por una parte y la región bisagra inferior por otra parte, una cadena pesada de inmunoglobulina recombinante es al menos un 90 % idéntica a la (correspondiente) secuencia consenso para dichas cadenas pesadas de inmunoglobulina. En otros modos de realización, la identidad de una cadena pesada de inmunoglobulina recombinante será cada una de al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % en comparación con la secuencia consenso correspondiente. En un modo de realización, cada una de las secuencias del dominio CH1, dominio CH2 y el dominio CH3 de una cadena pesada de inmunoglobulina recombinante de acuerdo con la presente invención será al menos en un 90 % idéntica a la correspondiente cadena pesada de inmunoglobulina natural. En otras palabras, después de la alineación apropiada usando el programa GCG PileUp, al menos un 90 % de los aminoácidos de, por ejemplo, dicho dominio CH1 alterado de una cadena pesada de IgG1 de ratón recombinante son idénticos a los (correspondientes) aminoácidos de la secuencia consenso para el dominio CH1 de la cadena pesada de IgG1 de ratón. En otros modos de realización, la identidad de un dominio CH1 modificado, un dominio CH2 y un dominio CH3, respectivamente, será cada una de al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % en comparación con la correspondiente secuencia consenso.
Como se mencionó anteriormente, la coexpresión de una cadena pesada de anticuerpo y una cadena ligera de anticuerpo representa un modo de realización de acuerdo con la presente divulgación. Usando dicha coexpresión, especialmente en conexión con un sistema de expresión celular, se puede obtener un anticuerpo que comprende tanto una cadena pesada como una ligera. La coexpresión de una cadena pesada de inmunoglobulina (recombinante) y su correspondiente cadena ligera da lugar tanto a la formación del anticuerpo deseado como a un alto rendimiento de producción.
Existen diversos isotipos de anticuerpos humanos, por ejemplo, denominados inmunoglobulinas alfa (=IgA), inmunoglobulinas gamma (=IgG), inmunoglobulinas delta (IgD), inmunoglobulinas épsilon (IgE) e inmunoglobulinas mu (IgM). En un modo de realización, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo (de cualquiera de estos isotipos o los correspondientes isotipos de otras especies, o sus correspondientes subclases), que comprende al menos dos cadenas pesadas de inmunoglobulina recombinante como se divulga en la presente solicitud.
En un modo de realización, se describe y reivindica un anticuerpo de clase IgG que tiene dos cadenas pesadas de inmunoglobulina recombinante como se divulga en la presente solicitud.
Como ya sugiere el nombre, una cadena pesada de anticuerpo recombinante que comprende un bucle de conjugación de sortasa de acuerdo con la presente invención se puede usar en procedimientos basados en la fijación de sortasa.
En un modo de realización, la presente divulgación se refiere a un procedimiento para producir un conjugado de un fragmento de escisión por sortasa de una cadena pesada de inmunoglobulina recombinante y un nucleófilo de sortasa, comprendiendo el procedimiento incubar i) un anticuerpo que comprende al menos dos cadenas pesadas de inmunoglobulina recombinante que comprenden cada una un bucle de conjugación de sortasa en el que el bucle de conjugación de sortasa a) consiste en al menos 16 aminoácidos localizados entre la cisterna más C terminal de la región bisagra media y la secuencia consenso VFX1FPP (SEQ ID NO: 2; en la que X1 es L o I) en el extremo N de un dominio CH2 de la cadena pesada de inmunoglobulina, b) comprende un motivo de reconocimiento de sortasa que consiste en la secuencia de aminoácidos L P X 1 T X 2 (SEQ ID NO: 01), en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A, c) comprende N terminal con respecto a la secuencia de (b) al menos dos aminoácidos, d) comprende C terminal con respecto a la secuencia de (b) al menos 6 aminoácidos, y e) en el que los aminoácidos C y N terminales de la secuencia de (b) no son cisteína ii) un compuesto que comprende un nucleófilo de sortasa, y iii) un polipéptido con actividad sortasa, escindiendo de este modo la cadena pesada de anticuerpo recombinante después de la treonina en L P X 1 T X 2 (SEQ ID NO: 01, en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A) y conjugando el extremo N del nucleófilo de sortasa con dicha treonina.
Como apreciará fácilmente el experto en la técnica, dicha incubación se realizará usando condiciones de tampón apropiadas para lograr el resultado deseado, es decir, el conjugado deseado. Dichas condiciones apropiadas son bien conocidas a partir de la literatura y los tampones de fijación de sortasa estándar comprenden, por ejemplo, MgCl2.
La sortasa A (SrtA) es una enzima unida a la membrana que une proteínas de forma covalente a la pared celular bacteriana. El "motivo de reconocimiento de sortasa" o "motivo de sortasa" específico es L P X 1 T X 2 (SEQ ID NO: 01, en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A). En un modo de realización, el motivo de reconocimiento de sortasa es L P X 1 T X 2 en la que X2 es G. En un modo de realización, X1 es un aminoácido natural. En un modo de realización, X1 no es un residuo de cisterna. En un modo de realización, X1 es un aminoácido natural y no es un residuo de cisteína.
Muchas bacterias grampositivas usan sortasa para anclar de forma covalente una variedad de proteínas de superficie, incluyendo factores de virulencia, a su pared celular (peptidoglucano). Las sortasas son enzimas asociadas a la membrana. La sortasa A (SrtA) de Staphylococcus aureus natural es un polipéptido de 206 aminoácidos con una región que abarca la membrana N terminal. En una primera etapa, la sortasa A reconoce las proteínas de sustrato que contienen un motivo de reconocimiento de sortasa (L P X 1 T X 2 (SEQ ID NO: 01, en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A). La enzima sortasa escinde entre los residuos treonina (T) y X2 (G o A). La escisión enzimática del enlace amida después de Thr se realiza por medio de una Cys de sitio activo. Esta reacción de escisión peptídica da como resultado un intermedio de tioéster de sustrato de sortasa A. En una segunda etapa, el intermedio de tioéster acil-enzima se resuelve por el ataque nucleófilo de un grupo amino en el sustrato de sortasa (nucleófilo de sortasa) que comprende un motivo de fijación de sortasa. En la naturaleza, el polipéptido sustrato de sortasa corresponde a la unidad pentaglicina de peptidoglucano en S. aureus y el ataque nucleófilo da lugar a una proteína de la pared celular enlazada de forma covalente y la regeneración de sortasa A. En ausencia de nucleófilos de oligoglicina, el intermedio de acil-enzima se puede hidrolizar por una molécula de agua.
El "nucleófilo de sortasa" comprende un "motivo de fijación de sortasa" o simplemente "motivo de fijación" y una "marca de interés" o simplemente "marca". El nucleófilo de sortasa tiene de forma N terminal una oligoglicina y consiste en al menos dos residuos de glicina como su motivo de fijación. En otras palabras, el motivo de fijación de sortasa consiste en al menos dos residuos de glicina consecutivos.
En un modo de realización, el procedimiento de acuerdo con la presente solicitud se lleva a la práctica usando un nucleófilo de sortasa que comprende la marca de interés que tiene la fórmula (Gly)n-marca, en la que n es al menos 2. El motivo de fijación de sortasa (Gly)n puede ser más largo y puede consistir en 3, 4, 5 o 6 residuos de glicina, es decir, n en Gly)n-marca es 3, 4, 5 o 6. En otros modos de realización, el procedimiento de acuerdo con la presente solicitud se lleva a la práctica usando un nucleófilo de sortasa que comprende la marca de interés que tiene la fórmula (Gly)n-marca, en la que n es 3, 4, 5 o 6, respectivamente.
En la naturaleza, el motivo de fijación de sortasa en el peptidoglucano es un motivo pentaglicina. Se ha demostrado que un motivo triglicina e incluso diglicina en el extremo N es suficiente para sustentar la reacción de SrtA (Clancy, K.W., et al., Peptide Science 94 (2010) 385-396). La reacción avanza a través de un intermedio de tioéster acil-enzima, que se resuelve por el ataque de un nucleófilo amina de la oligoglicina, enlazando de forma covalente el peptidoglucano a un sustrato proteico y regenerando la SrtA. La SrtA se puede usar, por ejemplo, para conjugar de forma covalente péptidos sintetizados químicamente o sustratos que contienen péptidos que comprenden un motivo de fijación con proteínas expresadas de forma recombinante que comprenden un motivo de reconocimiento de sortasa.
La fijación/conjugación mediada por sortasa se ha comenzado a aplicar para una variedad de propósitos de genomanipulación y bioconjugación de proteínas. Esta técnica posibilita la introducción de funcionalidades naturales y sintéticas en polipéptidos recombinantes o sintetizados químicamente marcados con L P X 1 T X 2 . Los ejemplos incluyen la unión covalente de polímeros derivados de oligoglicina (por ejemplo, PEG), fluoróforos, vitaminas (por ejemplo, biotina y folato), lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, péptidos sintéticos y proteínas (por ejemplo, GFP) (véase, por ejemplo, Tsukiji, S. y Nagamune, T., ChemBioChem 10 (2009) 787-798; Popp, M.W.L. y Ploegh, H.L., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 50 (2011) 5024-5032).
Para la conjugación enzimática in vitro en un modo de realización, se usa una sortasa A truncada soluble que carece de la región que abarca la membrana (SrtA; residuos de aminoácidos 60-206 de SrtA de Staphylococcus aureus) (SEQ ID NO: 17; véase también Ton-That, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 12424-12429; Ilangovan, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001) 6056-6061).
La "marca de interés" o simplemente la "marca" comprendida en el nucleófilo de sortasa puede ser un compañero de un par de unión, un grupo funcional, un agente terapéutico (fármaco), un agente citotóxico (por ejemplo, una toxina tal como la doxorrubicina o la toxina tosferínica) y un marcador (por ejemplo, un fluoróforo tal como un tinte fluorescente como fluoresceína o rodamina, un marcador quimioluminiscente o electroquimioluminiscente, un marcador radioactivo, un complejo de quelato metálico para propósitos radioterápicos o de formación de imágenes, una enzima o una proteína fluorescente como GFP).
En un modo de realización, la marca es un compañero de un par de unión. Un "par de unión", como se usa en el presente documento, consiste en dos compañeros que se unen entre sí con alta afinidad, es decir, con una afinidad nanomolar o mejor. Los modos de realización para los pares de unión son, por ejemplo, los pares de unión que consisten en receptor y ligando, hapteno y anticuerpo antihapteno, y pares de unión basados en los pares de unión de alta afinidad naturales.
Un ejemplo de un par de unión de receptor-ligando es un par que consiste en un receptor de hormona esteroidea y la hormona esteroidea correspondiente.
Un tipo de par de unión que es adecuado para el procedimiento de acuerdo con la presente invención es un par de unión de hapteno y anticuerpo antihapteno. Un hapteno es una molécula orgánica con un peso molecular de 100 a 2000 dalton, preferentemente de 150 a 1000 dalton. Dicha molécula pequeña se puede volver inmunógena al acoplarla a una molécula transportadora y se pueden generar anticuerpos antihapteno de acuerdo con procedimientos estándar. El hapteno se puede seleccionar del grupo que comprende esteroles, ácidos biliares, hormonas sexuales, corticoesteroides, cardenólidos, glucósidos cardenólidos, bufadienólidos, sapogeninas esteroideas y alcaloides esteroideos, cardenólidos y glucósidos cardenólidos. Los representantes de estas clases de sustancias son digoxigenina, digitoxigenina, gitoxigenina, estrofantidina, digoxina, digitoxina, ditoxina, estrofantina. Otro hapteno adecuado es, por ejemplo, fluoresceína.
Los ejemplos de pares de unión basados en pares de unión de alta afinidad naturales son biotina o análogos de biotina, tales como aminobiotina, iminobiotina o destiobiotina, y avidina o estreptavidina, así como el par de unión de FimG y DsF. El par de unión biotina-(estrept)avidina es bien conocido en la técnica. Los principios básicos del par de unión FimG-DsF se describen, por ejemplo, en el documento WO2012/028697.
En un modo de realización, los pares de unión se seleccionan de hapteno y anticuerpo antihapteno, biotina o análogos de biotina tales como aminobiotina, iminobiotina o destiobiotina y avidina o estreptavidina, FimG y DsF, y receptor y ligando.
En un modo de realización, los pares de unión se seleccionan de hapteno y anticuerpo antihapteno, y biotina o análogos de biotina tales como aminobiotina, iminobiotina o destiobiotina/avidina o estreptavidina, FimG y DsF.
En un modo de realización, el par de unión es biotina (o análogos de biotina tales como aminobiotina, iminobiotina o destiobiotina) y avidina o estreptavidina.
En un modo de realización, el par de unión consiste en biotina y estreptavidina.
En un modo de realización, la marca es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en aldehido, ácido carboxílico, éster de ácido carboxílico, epóxido, éster de N-hidroxisuccinimida, grupo amino, halógeno, hidracina, hidroxilo, sulfhidrilo, maleimido, alquinilo, acida, isocianato, isotiocianato y fosforamidita, trans-cicloocteno, tetracina.
En un modo de realización, la marca es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en ácido carboxílico, éster de N-hidroxisuccinimida, grupo amino, halógeno, sulfhidrilo, maleimido, alquinilo, acida, isocianato, isotiocianato y fosforamidita.
La marca puede ser un agente terapéutico (fármaco) y, por ejemplo, puede ser un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Son conocidos una serie de anticuerpos terapéuticos dirigidos contra las moléculas de la superficie celular y sus ligandos, tales como Rituxan/MabThera/rituximab, 2H7/ocrelizumab, Zevalin/ibritumomab, Arzerra/ofatumumab (CD20), HLL2/epratuzumab, inotuzumab (CD22), Zenapax/daclizumab, Simulect/basiliximab (CD25), Herceptin/trastuzumab, pertuzumab (Her2/ERBB2), Mylotarg/gemtuzumab (CD33), Raptiva/efalizumab (Cd11a), Erbitux/cetuximab (EGFR, receptor del factor de crecimiento epidérmico), IMC-1121B (receptor 2 de VEGF), Tysabri/natalizumab (subunidad a4 de las integrinas a4p1 y a4p7), ReoPro/abciximab (gpllb-gplIa y avp3-integrina), Orthoclone OKT3/muromonab-CD3 (CD3), Benlysta/belimumab (BAFF), Tolerx/oteliximab (CD3), Soliris/eculizumab (proteína del complemento C5), Actemra/tocilizumab (IL-6R), Panorex/edrecolomab (EpCAM, molécula de adhesión de células epiteliales), CEA-CAM5/labetuzumab (CD66/CEA, antígeno carcinoembrionario), CT-11 (PD-1, receptor inhibidor de linfocitos T de muerte programada 1, CD-d279), H224G11 (receptor c-Met), SAR3419 (CD19), IMC-A12/cixutumumab (IGF-1R, receptor del factor de crecimiento insulínico 1), MEDI-575 (PDGF-R, receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas), CP-675, 206/tremelimumab (antígeno 4 del linfocito T citotóxico), RO5323441 (factor de crecimiento de la placenta o PGF), HGS1012/mapatumumab (TRAIL-R1), SGN-70 (CD70), vedotin (SGN-35)/brentuximab (CD30) y ARH460-16-2 (CD44).
La marca también puede ser un agente citotóxico seleccionado de: (i) agentes quimioterápicos, que pueden funcionar como inhibidores de microtúbulos, inhibidores de mitosis, inhibidores de topoisomerasa o intercaladores de ADN; (ii) toxinas proteicas, que pueden funcionar enzimáticamente; y (iii) radioisótopos terapéuticos.
Los agentes quimioterápicos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, maitansinoide, auristatina, dolastatina, tricoteceno, CC1065, caliqueamicina y otros antibióticos de enediina, taxano, antraciclina y estereoisómeros, isósteros, análogos o derivados de los mismos.
Las toxinas proteicas incluyen la cadena A de la difteria, los fragmentos activos de no unión de la toxina diftérica, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina (Vitetta et al (1987) Science, 238:1098), la cadena A de la abrina, la cadena A de la modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-5), inhibidor de Momordica charanda, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos (documento WO 93/21232).
Los radioisótopos terapéuticos incluyen 32P, 33P, 90Y, 125I, 131I, 131In, 153Sm, 186Re, 188Re, 211At, 212B, 212Pb y los isótopos radioactivos de Lu.
El radioisótopo se puede incorporar de formas conocidas (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57; "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" Chatal, CRC Press 1989). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminapentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para la conjugación de un radionúclido con el complejo (documento WO 94/11026).
En un modo de realización, la marca es un marcador. Se puede usar cualquier resto marcador que se pueda unir de forma covalente a la secuencia de aminoácidos del motivo de fijación de sortasa (véase, por ejemplo, Singh et al (2002) Anal. Biochem. 304:147-15; Harlow E. y Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Lundblad R. L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2.a ed. CRC Press, Boca Raton, Fla.). El marcador puede funcionar para: (i) proporcionar una señal detectable; (ii) interactuar con un segundo marcador para modificar la señal detectable proporcionada por el primer o segundo marcador, por ejemplo, para dar FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia); (iii) afectar la movilidad, por ejemplo, la movilidad electroforética o permeabilidad celular, por carga, hidrofobia, conformación u otros parámetros físicos, o (iv) proporcionar un resto de captura, por ejemplo, para modular la complejación iónica.
Están disponibles numerosos marcadores que se pueden agrupar en general en las siguientes categorías:
(a) Tintes fluorescentes, tintes quimioluminiscentes (Briggs et al. "Synthesis of Functionalized Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids", J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1 (1997) 1051-1058) y los marcadores electroquimioluminiscentes proporcionan una señal detectable y son en general aplicables para el marcaje.
Los marcadores fluorescentes o fluoróforos incluyen quelatos de tierras raras (quelatos de europio), marcadores de tipo fluoresceína que incluyen FITC, 5-carboxifluoresceína, 6-carboxifluoresceína; marcadores de tipo rodamina que incluyen TAMRA; dansilo; Lissamine; cianinas; ficoeritrinas; Texas Red; y análogos de los mismos. Los marcadores fluorescentes se pueden conjugar con el motivo de fijación de sortasa usando las técnicas divulgadas en Current Protocols in Immunology, supra, por ejemplo. Los tintes fluorescentes y los reactivos marcadores fluorescentes incluyen los que están disponibles comercialmente en Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, Oregon, EE. UU.) y Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, Ill.).
Las diferentes clases de marcadores quimioluminógenos incluyen luminol, compuestos de acridinio, coelenteracina y análogos, dioxetanos, sistemas basados en ácido peroxioxálico y sus derivados. Para los procedimientos de inmunodiagnóstico se usan predominantemente marcadores basados en acridinio (se da una visión general detallada en Dodeigne C. et al., Talanta 51 (2000) 415-439).
Las marcas de mayor pertinencia como marcadores electroquimioluminiscentes son los complejos electroquimioluminiscentes basados en rutenio e iridio, respectivamente. La electroquimioluminiscencia (e Ql ) demostró ser muy útil en aplicaciones analíticas como procedimiento altamente sensible y selectivo. Combina las ventajas analíticas del análisis quimioluminiscente (ausencia de señal óptica de fondo) con la facilidad de control de la reacción aplicando potencial de electrodo. En general, los complejos de rutenio, especialmente [Ru(Bpy)3]2+ (que libera un fotón a ~620 nm) que se regeneran con TPA (tripropilamina) en fase líquida o interfase líquido-sólido se usan como marcadores de e Ql . Recientemente también se han descrito marcadores de EQL basados en iridio (documento WO2012107419 (A1)).
(b) Los marcadores radioactivos usan radioisótopos (radionúclidos), tales como 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Gn, 86Y, 89Zr, 99Tc, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At o 131Bi.
(c) Los complejos de quelato metálico adecuados como marcadores para la formación de imágenes y con propósitos terapéuticos son bien conocidos en la técnica (documentos US 2010/0111856; US 5.342.606; US 5.428.155; US 5.316.757; US 5.480.990; US 5.462.725; US 5.428.139; US 5.385.893; US 5.739.294; US 5.750.660; US 5.834.456; Hnatowich et al., J. Immunol. Methods 65 (1983) 147-157; Meares et al., Anal. Biochem.
142 (1984) 68-78; Mirzadeh et al., Bioconjugate Chem. 1 (1990) 59-65; Meares et al., J. Cancer (1990), Supl.
10:21-26; Izard et al., Bioconjugate Chem. 3 (1992) 346-350; Nikula et al., Nucl. Med. Biol. 22 (1995) 387-90; Camera et al., Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 955-62; Kukis et al., J. Nucl. Med. 39 (1998) 2105-2110; Verel et al., J.
Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670; Camera et al., J. Nucl. Med. 21 (1994) 640-646; Ruegg et al., Cáncer Res.50 (1990) 4221-4226; Verel et al., J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670; Lee et al., Cancer Res. 61 (2001) 4474-4482; Mitchell et al., J. Nucl. Med. 44 (2003) 1105-1112; Kobayashi et al. Bioconjugate Chem 10 (1999) 103-111; Miederer et al., J. Nucl. Med. 45 (2004) 129-137; DeNardo et al., Clinical Cancer Research 4 (1998) 2483-90; Blend et al., Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18 (2003) 355-363; Nikula et al. J. Nucl. Med. 40 (1999) 166-76; Kobayashi et al., J. Nucl. Med. 39 (1998) 829-36; Mardirossian et al., Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 65-74; Roselli et al., Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14 (1999) 209-20).
(d) Las enzimas también se pueden usar como marca/marcador en un nucleófilo de sortasa. Están disponibles diversos sistemas de marcador de enzima-sustrato. En general, la enzima cataliza una alteración química de un sustrato cromógeno que se puede medir usando diversas técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que se puede medir espectrofotométricamente. De forma alternativa, la enzima puede alterar la fluorescencia o la quimioluminiscencia del sustrato. El sustrato quimioluminiscente se excita electrónicamente por una reacción química y puede a continuación emitir luz que se puede medir (usando un quimioluminómetro, por ejemplo) o dona energía a un aceptador fluorescente. Los ejemplos de marcadores enzimáticos incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; documento US 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalacindionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina (AP), (3-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tal como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares.
Los ejemplos de combinaciones de enzima-sustrato (véanse también los documentos US 4.275.149; US 4.318.980) incluyen, por ejemplo:
(i) peroxidasa de rábano picante (HRP) con peroxidasa de hidrógeno como sustrato, en la que la peroxidasa de hidrógeno oxida un precursor de tinte (por ejemplo, ortofenilendiamina (OPD) o clorhidrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB));
(ii) fosfatasa alcalina (AP) con fosfato de para-nitrofenilo como sustrato cromógeno; y
(iii) (3-D-galactosidasa ((3-D-Gal) con sustrato cromógeno (por ejemplo, p-nitrofenil-(3-D-galactosidasa) o sustrato fluorógeno 4-metilumbeliferil-(3-D-galactosidasa).
En un modo de realización, la presente invención se refiere a un conjugado producido de acuerdo con cualquiera de los procedimientos divulgados en el presente documento.
Aunque no se reivindica como parte de la invención, también se describe en el presente documento un conjugado producido de acuerdo con un procedimiento como se describe en el presente documento que comprenderá un fragmento de la cadena pesada de inmunoglobulina recombinante que comprende un dominio VH, un dominio CH1, una región bisagra abajo hasta la última cisterna de la región bisagra media, dos o más aminoácidos entre la cisterna más C terminal de la región bisagra media, la secuencia LPXT (SEQ ID NO: 03, en la que X puede ser cualquier residuo de aminoácido) y al menos dos residuos de glicina.
Como se mencionó anteriormente en el presente documento, es ventajoso producir anticuerpos completos, es decir, anticuerpos que tienen tanto una cadena pesada de inmunoglobulina recombinante como se divulga en el presente documento como una cadena ligera de inmunoglobulina. En caso de que dicho anticuerpo se use en un procedimiento de acuerdo con la presente divulgación (en la "transpeptidación mediada por sortasa"), se obtienen fragmentos de tipo F(ab')2. Estos fragmentos de tipo F(ab')2 se parecen mucho a los fragmentos F(ab')2 obtenidos por medio de procedimientos estándar. Si el mismo anticuerpo que comprende una cadena pesada recombinante como se divulga en el presente documento se usara en un procedimiento estándar o en un procedimiento de transpeptidación mediada por sortasa, las secuencias serían idénticas abajo hasta la última cisteína pero serían significativamente diferentes con respecto a los aminoácidos C terminales con respecto a la última cisteína de la región bisagra media, es decir, un procedimiento que da como resultado fragmentos F(ab')2 estándar, el otro (transpeptidación mediada por sortasa) que da como resultado fragmentos de tipo F(ab')2 bastante similares pero no idénticos. Después de la transpeptidación mediada por sortasa de estos fragmentos de tipo F(ab')2, obviamente también contendrán al menos el motivo de fijación de sortasa esencial mínimo, es decir, dos residuos de glicina.
Aunque no se reivindica como parte de la invención, en el presente documento también se divulgan conjugados que comprenden unidos entre sí por medio de un enlace de cistina dos fragmentos de la cadena pesada de inmunoglobulina recombinante que comprenden un dominio VH, un dominio CH1, una región bisagra abajo hasta la última cisteína de la región bisagra media, dos o más aminoácidos entre la cisteína más C terminal de la región bisagra media, la secuencia L P X T (SEQ ID NO: 03, en la que X puede ser cualquier residuo de aminoácido) y al menos dos residuos de glicina.
Aunque no se reivindica como parte de la invención, en el presente documento también se divulgan conjugados que comprenderán unidos entre sí por medio de un enlace de cistina dos fragmentos de la cadena pesada de inmunoglobulina recombinante, comprendiendo dichos fragmentos de la cadena pesada un dominio VH, un dominio CH1, una región bisagra abajo hasta la última cisteína de la región bisagra media, dos o más aminoácidos entre la cisteína más C terminal de la región bisagra media, la secuencia LFXT (SEQ ID NO: 03, en la que X puede ser cualquier residuo de aminoácido) y al menos dos residuos de glicina; y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina.
Los conjugados que comprenden un marcador como se informa en el presente documento pueden ser útiles en ensayos de diagnóstico, por ejemplo, para detectar un antígeno de interés en una muestra de sangre completa, plasma o suero. El conjugado marcado como se informa en el presente documento se puede emplear en cualquier procedimiento de ensayo conocido, tal como ELISA, ensayos de unión competitiva, ensayos no competitivos directos e indirectos y ensayos de inmunoprecipitación (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (1987) pp. 147-158, CRC Press, Inc.).
Los conjugados marcados como se informa en el presente documento, de forma alternativa, también serán útiles como biomarcadores y sondas de formación de imágenes por los diversos procedimientos y técnicas de formación de imágenes biomédicas y moleculares tales como: (i) RMN (resonancia magnética nuclear); (ii) MicroTAC (tomografía computarizada); (iii) SPECT (tomografía de emisión monofotónica); (iv) PET (tomografía de emisión positrónica) Tinianow, J. et al, Nuclear Medicine and Biology, 37(3) (2010) 289-297; Chen et al., Bioconjugate Chem. 15 (2004) 41-49; documento US 2010/0111856 (v) bioluminiscencia; (vi) fluorescencia; y (vii) ecografía. La inmunogammagrafía es un procedimiento de formación de imágenes en el que se administran conjugados marcados con sustancias radioactivas a un paciente humano o animal y se saca una fotografía de los sitios del cuerpo donde se localiza el conjugado (documento US 6.528.624). Los biomarcadores de formación de imágenes se pueden medir y evaluar objetivamente como un indicador de procesos biológicos normales, procesos patógenos o respuestas farmacológicas a una intervención terapéutica.
El nucleófilo de sortasa en un modo de realización consiste en el motivo de fijación de sortasa y la marca. En otro modo de realización, el nucleófilo de sortasa consiste en el motivo de fijación de sortasa, un conector y la marca. El término "conector" en el presente documento indica un resto bifuncional o multifuncional que se puede usar para conjugar (enlazar) un primer resto con un segundo resto. Los nucleófilos de sortasa que comprenden conector se pueden preparar con facilidad usando un conector que tiene dos funcionalidades reactivas.
El conector puede comprender residuos de aminoácidos que enlazan el motivo de fijación de sortasa a la marca. Los residuos de aminoácidos pueden formar una unidad dipeptídica, tripeptídica, tetrapeptídica, pentapeptídica, hexapeptídica, heptapeptídica, octapeptídica, nonapeptídica, decapeptídica, undecapeptídica o dodecapeptídica. Los residuos de aminoácidos incluyen los naturales, así como los análogos de aminoácidos no naturales, tales como, por ejemplo, citrulina o p-aminoácidos, tales como, por ejemplo, p-alanina, o ^-aminoácidos, tales como ácido 4-amino-butírico.
Típicamente, los conectores de tipo peptídicos se pueden preparar formando un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos peptídicos. Dichos enlaces peptídicos se pueden preparar, por ejemplo, de acuerdo con el procedimiento de síntesis en fase líquida (E. Schroder y K. Lubke "The Peptides", volumen 1 (1965) 76-136, Academic Press) que es bien conocido en el campo de la química de péptidos.
En otro modo de realización, el conector puede comprender, consistir en o estar sustituido con grupos que modulan la solubilidad o reactividad. Por ejemplo, un sustituyente cargado tal como sulfonato (SO3') o amonio en el conector puede incrementar la solubilidad en agua del nucleófilo de sortasa. Un conector que consiste en un polímero tal como PEG también puede presentar efectos positivos, por ejemplo, puede dar lugar a la reducción de la unión no específica.
Como se muestra en los ejemplos a continuación, los conjugados de tipo F(ab')2 producidos con un procedimiento de acuerdo con la presente invención presentan ventajas apreciables en comparación con los conjugados de F(ab')2 obtenidos por procedimientos del estado de la técnica.
Descripción de las figuras
Figura 1 Esquema de reacción de sortasa; (A) polipéptido que contiene el motivo de reconocimiento LPXTG; (B) nucleófilo de sortasa
Figura 2 Esquema de un protocolo de escisión y conjugación de una etapa mediado por sortasa. Los símbolos mostrados son como sigue:
VL, VH, CL, CH1, CH2, CH3 = dominios comunes de una IgG
G = glucosilación
BCS = bucle de conjugación de sortasa
Marca = marca sortasa con nucleófilo
Figura 3 Estructura del nucleófilo de sortasa que comprende un motivo de fijación GGGG y una marca biotina.
Figura 4 Seguimiento de la escisión mediada por sortasa;
cromatogramas seleccionados obtenidos por seguimiento con GPC de la reacción de escisión tomados a 1 h, 3 h, 10 h y 15 h, respectivamente, después del inicio de la reacción.
(A) IgG; (B) fragmento F(ab')2 biotinilado de forma C terminal;
(C) fragmento Fcy
Figura 5 Resultados de la evaluación comparativa de un conjugado del estado de la técnica y un conjugado de acuerdo con la presente divulgación; se muestran las señales de EQL para un fragmento F(ab')2 escindido enzimáticamente (papaína) marcado con biotina-NHS (A) y un fragmento F(ab')2 escindido por sortasa/conjugado con biotina (B).
Figura 6 Resultados de la evaluación comparativa de un conjugado del estado de la técnica y un conjugado de acuerdo con la presente divulgación; se muestran las señales de EQL para una IgG marcada con biotina-NHS (A) y un fragmento F(ab')2 escindido por sortasa/conjugado con biotina (B).
Los siguientes ejemplos, figuras y secuencias se proporcionan para ayudar al entendimiento de la presente invención, de la que su verdadero alcance se expone en las reivindicaciones adjuntas.
Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con propósitos de claridad de entendimiento, las descripciones y ejemplos no se deben interpretar como limitantes del alcance de la invención, que se define por las reivindicaciones.
Ejemplos
Técnicas de ADN recombinante
Se usaron procedimientos estándar para manipular el ADN como se describe en Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Se usaron los reactivos biológicos moleculares de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Síntesis de genes y oligonucleótidos
Se prepararon los segmentos génicos deseados por síntesis química en Geneart GmbH (Ratisbona, Alemania). Los fragmentos génicos sintetizados se clonaron en un plásmido de E. coli para propagación/amplificación. Las secuencias de ADN de los fragmentos génicos subclonados se verificaron por secuenciación de ADN. De forma alternativa, fragmentos de ADN sintético cortos se ensamblaron por hibridación de oligonucleótidos sintetizados químicamente o por medio de PCR. Se prepararon los oligonucleótidos respectivos por metabion GmbH (Planegg-Martinsried, Alemania).
Descripción del plásmido de expresión de mamífero básico/estándar
Para la expresión de un gen/proteína deseado (por ejemplo, la cadena pesada de anticuerpo de longitud completa, la cadena ligera de anticuerpo de longitud completa o una cadena de Fc que contiene una oligoglicina en su extremo N) se usa una unidad de transcripción que comprende los siguientes elementos funcionales:
- el potenciador y promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (P-CMV), incluyendo el intrón A, - una región 5' no traducida de inmunoglobulina de la cadena pesada humana (5'UTR),
- una secuencia señal de la cadena pesada de inmunoglobulina murina,
- un gen/proteína que se va a expresar (por ejemplo, la cadena pesada de anticuerpo de longitud completa), y - la secuencia de poliadenilación de la somatotropina bovina (pA BGH).
Además de la unidad de expresión/casete que incluye el gen deseado que se va a expresar, el plásmido de expresión de mamífero básico/estándar contiene
- un origen de replicación del vector pUC18 que permite la replicación de este plásmido en E. coli y
- un gen de beta-lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina en E. coli.
Determinación de proteínas
Se determinó la concentración de proteínas de polipéptidos purificados determinando la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado sobre la base de la secuencia de aminoácidos del polipéptido.
Ejemplo 1
Generación de un plásmido de expresión para sortasa A de S. aureus soluble
El gen de la sortasa codifica una molécula de sortasa A de Staphylococcus aureus (60-206) truncada de forma N terminal (secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17).
El plásmido de expresión para la expresión transitoria de sortasa soluble en células HEK293 comprendía además del casete de expresión de sortasa soluble un origen de replicación del vector pUC18, que permite la replicación de este plásmido en E. coli, y un gen de beta-lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina en E. coli.
La unidad de transcripción de la sortasa soluble comprendía los siguientes elementos funcionales:
- el potenciador y promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (P-CMV), incluyendo el intrón A, - una región 5' no traducida de inmunoglobulina de la cadena pesada humana (5'UTR),
- una secuencia señal de la cadena pesada de inmunoglobulina murina,
- una marca de purificación que codifica ácido nucleico,
- una sortasa A de S. aureus truncada de forma N terminal que codifica ácido nucleico, y
- la secuencia de poliadenilación de la somatotropina bovina (pA BGH).
La secuencia de aminoácidos de la sortasa soluble madura es QAKPQIPKDKSKVAGYIEIPDADIKEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEENESLD DQNISIAGHTFIDRPNYQFTNLKAAKKGSMVYFKVGNETRKYKMTSIRDV KPTDVGVLDEQKGKDKQLTLITCDDYNEKTGVWEKRKTFVATEVK (SEQ ID NO: 17). La marca de purificación tiene la secuencia de aminoácidos MRGSHHHHHHGS (SEQ ID NO: 18).
Ejemplo 2
Expresión transitoria y caracterización analítica de cadenas pesadas de inmunoglobulina recombinante que comprenden un bucle de conjugación de sortasa
La producción recombinante se realizó por transfección transitoria de células HEK293 (derivadas de la línea de células de riñón embrionario humano 293) cultivadas en medio F17 (Invitrogen Corp.). Para la transfección, se usó el reactivo de transfección "293-Fectin" (Invitrogen). Se realizó la transfección como se especifica en las instrucciones del fabricante. Se obtuvieron los sobrenadantes de cultivo celular de tres a siete (3-7) días después de la transfección. Se almacenaron los sobrenadantes a temperatura reducida (por ejemplo, -80 °C).
La información general con respecto a la expresión recombinante de inmunoglobulinas humanas, por ejemplo, en células HEK293 se da en: Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203.
Las cadenas pesadas de inmunoglobulina recombinante de una subclase M-IgG1 que comprende un bucle de conjugación de sortasa se han purificado por captura en un material de lecho cromatográfico de Protein A Sepharose (por ejemplo, MabSelect Sure, Ge Healtcare) en condiciones ligeramente básicas (por ejemplo, pH 8,0). La IgG se ha eluido del material del lecho usando un tampón de ácido cítrico (100 mM, pH 4,0) y finalmente se ha purificado en una etapa de pulido en una columna de GPC (por ejemplo, Superdex 200 Increase, GE Healtcare) en condiciones cromatográficas apropiadas (por ejemplo, tampón fosfato 100 mM, pH 7,4).
Se determinó la concentración de proteínas de un polipéptido purificado midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado sobre la base de la secuencia de aminoácidos. Se analizó la pureza por cromatografía de GPC así como SDS-PAGE en presencia y ausencia de un agente reductor (1,4-ditiotreitol 5 mM) y tinción con azul brillante de Coomassie.
La identidad de las cadenas pesadas de inmunoglobulina recombinante expresadas que comprenden un bucle de conjugación de sortasa se confirmó por ESI-EM-TOF en términos de comparación del peso molecular teórico y determinado experimentalmente de tanto la cadena ligera como la pesada de la inmunoglobulina recombinante. Ejemplo 3
Síntesis y producción de vectores para inmunoglobulina recombinante
Se usaron procedimientos estándar para manipular el ADN como se describe en Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Se usaron los reactivos biológicos moleculares de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
En detalle, los segmentos génicos deseados de tanto las cadenas ligeras como pesadas de inmunoglobulina recombinante que comprenden la secuencia que codifica un bucle de conjugación de sortasa se generaron por técnicas de clonación basadas en PCR convencionales. Por tanto, el ADNc de los genes que codifican la ligera y la pesada del anticuerpo deseado se amplificó con oligonucleótidos/cebadores específicos de gen que contienen sitios de restricción para la clonación molecular. La secuencia que codifica un bucle de conjugación de sortasa se introdujo en una estrategia de PCR de dos etapas usando cebadores que contienen un bucle de conjugación de sortasa en combinación con cebadores específicos de genes. Se prepararon los oligonucleótidos respectivos por metabion GmbH (Planegg-Martinsried, Alemania) o ThermoFisher.
De forma alternativa, se prepararon los segmentos génicos deseados de tanto las cadenas ligeras como las pesadas de inmunoglobulina recombinante que comprenden la secuencia que codifica un bucle de conjugación de sortasa por síntesis química en GeneArt® ThermoFisher.
Los fragmentos génicos sintetizados se clonaron en un vector lanzadera de E. coli para propagación/amplificación en E. coli y expresión transitoria en células HEK293. Las secuencias de ADN de los fragmentos génicos subclonados se verificaron por secuenciación de ADN.
Para la expresión de un gen/proteína deseado (por ejemplo, la cadena pesada de anticuerpo de longitud completa que comprende un bucle de conjugación de sortasa, la cadena ligera de anticuerpo de longitud completa) se usa una unidad de transcripción que comprende los siguientes elementos funcionales:
- el potenciador y promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (P-CMV)
- una secuencia señal de la cadena pesada de inmunoglobulina que incluye un intrón
- un gen/proteína que se va a expresar (que comprende un bucle de conjugación de sortasa, la cadena ligera de anticuerpo de longitud completa), y
- la secuencia de poliadenilación de la somatotropina bovina (pA BGH).
Además de la unidad de expresión/casete que incluye el gen deseado que se va a expresar, el plásmido de expresión de mamífero básico/estándar contiene
- un origen de replicación del vector pUC18 que permite la replicación de este plásmido en E. coli y
- un gen de beta-lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina en E. coli.
Ejemplo 4
Fusión de glucosa deshidrogenasa y oligoglicina biotinilada mediada por sortasa
Con el procedimiento como se explica a continuación, se puede determinar la actividad de una reacción de conjugación/acoplamiento enzimática mediada por sortasa fotométricamente fusionando una glucosa deshidrogenasa como enzima indicadora a un motivo de aminoácidos de sortasa (LPETG o LPETA) y usándolo como primer sustrato. Como segundo sustrato se usa oligoglicina u oligoalanina biotinilada (nucleófilo). Cuando se añade la sortasa a una solución que contiene el primer y el segundo sustrato, se forma un conjugado por conjugación mediada por sortasa del primer y el segundo sustrato que es una enzima indicadora biotinilada. La enzima indicadora biotinilada se puede recuperar usando microesferas magnéticas recubiertas de estreptavidina. Cuando se añade un sustrato para la enzima indicadora, se puede detectar el producto por el cambio de densidad óptica.
Se mezcló la sortasa purificada con sus sustratos, es decir, una glucosa deshidrogenasa que contenía el motivo LPETG o LPETA (20 |jM) y un derivado de biotina que contenía glicinas o alaninas N terminales (330 |jM) en tampón Tris 50 mM, pH 7,5 que contenía NaCI 200 mM. Se incubó la mezcla de reacción a 37 °C durante dos horas. Se detuvo la reacción por adición de un exceso de 10 a 20 veces de tampón de inhibición (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM, CaCh 10 mM, yodoacetamida 5 mM). Se centrifugó la mezcla de reacción detenida durante 10 min a 5000 x g. Se añadió el sobrenadante (50 j l) a 100 j l de tampón Tris 50 mM (pH 7,5) que comprendía NaCl 200 mM, CaCh 10 mM y se añadieron microesferas magnéticas recubiertas con estreptavidina y se incubó durante 30 min a 30 °C a 200 rpm. A continuación, se lavaron las microesferas magnéticas cinco veces con 300 j l de tampón de lavado cada una (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM, CaCh 10 mM, 5 mg/ml de BSA, Triton X-100 al 0,1 %) en placas de múltiples pocillos con fondo en V usando un imán y una bomba de vacío. Posteriormente, se resuspenden las microesferas en 100 j l de tampón de prueba de citrato y se transfieren 10-80 j l de las mismas a un nuevo pocillo. A esto se le añadieron 150 j l de tampón de prueba (citrato de sodio 0,2 M, pH 5,8, 0,3 g/l de 4-nitrosoanilina, CaCl2 1 mM, glucosa 30 mM).
La cinética de la enzima indicadora se mide durante un período de tiempo de 5 min a 620 nm. La actividad de la enzima indicadora es proporcional a la cantidad de enzima inmovilizada, que es proporcional a la cantidad de enzima biotinilada y esta es proporcional a la actividad de la sortasa.
Ejemplo 5
Fusión de inmunoglobulina recombinante que comprende un bucle de conjugación de sortasa mediada por sortasa
Con el procedimiento como se explica a continuación, una escisión enzimática de una IgG que comprende un bucle de conjugación de sortasa (sustrato 1) y una reacción de conjugación/acoplamiento posterior de una marca de biotina (sustrato 2). Cuando se añade la sortasa a una solución que contiene el primer y el segundo sustrato, se forma un fragmento F(ab')2 biotinilado de forma C terminal por conjugación mediada por sortasa del primer y el segundo sustrato (véase la figura 2).
La secuencia de aminoácidos del bucle de conjugación de sortasa en la cadena pesada de una inmunoglobulina IgG se diseña de acuerdo con procedimientos estándar. Una secuencia ejemplar de una cadena pesada de inmunoglobulina G1 de ratón fue como sigue:
(Dominio VH)-(dominio CH1)-(región bisagra con bucle de conjugación de sortasa insertado = VPRDCGCKPCICTGSGSGGVLPETGVGSGSGGAGSGSS) (SEQ ID NO: 19) - (dominio CH2)-(dominio CH3)
En la que la secuencia 19 (SEQ ID NO: 19) comprende las siguientes partes:
VPRDCGCKPCICT (SEQ ID NO: 20) = región bisagra superior y media y el bucle de conjugación de sortasa GSGSGGVLPETGVGSGSGGAGSGSS (SEO ID NO: 21).
La estructura del nucleófilo de sortasa que comprende el motivo de fijación (GGGG) y la marca (biotina) se puede diseñar como se requiera. (Un ejemplo de dicha estructura se da en la figura 3).
Se mezcló sortasa purificada (20 j M) con sus sustratos, es decir, inmunoglobulina recombinante que comprende un bucle de conjugación de sortasa (30 j M) y un derivado de biotina que contiene un motivo nucleófilo GGGG N terminal (1500 j M) en tampón Tris 50 mM, pH 8,0 que contiene KCl 150 mM y CaCl25 mM. Se incubó la mezcla de reacción a 37 °C durante 17 horas (durante la noche). Se detuvo la reacción por adición de EDTA 0,5 M, pH 7,5 a 5 mM en la mezcla de reacción.
Se realizó el seguimiento del avance de la reacción de escisión por cromatografía GPC (GFC300 Tosoh; tampón fosfato 100 mM, pH 7,0; 1 ml/min; detección a 280 nm) así como SDS PAGE. La cantidad residual de IgG completa disminuyó por debajo de un 5 % en menos de 6 horas después de la adición de sortasa en la mezcla de reacción y por debajo de un 3,6 % en menos de 15 horas, respectivamente.
El fragmento F(ab')2 escindido y conjugado con biotina se purificó usando un material de lecho cromatográfico de Protein A Sepharose (por ejemplo, MabSelect Sure, GE Healtcare) en condiciones ligeramente básicas (por ejemplo, pH 8,0). La IgG residual así como la parte Fc se han capturado en el material del lecho. La fracción de flujo continuo de un F(ab')2 biotinilado se ha concentrado por una membrana de ultrafiltración (15 MWCO, Amicon-Ultra) y finalmente se purificó en una etapa de pulido en una columna de GPC (por ejemplo, Superdex 200 Increase, GE Healtcare) en condiciones cromatográficas apropiadas (por ejemplo, tampón fosfato 50 mM, KCl 150 mM, pH 7,4).
La identidad de la inmunoglobulina recombinante escindida/conjugada que comprende un bucle de conjugación de sortasa con un F(ab')2 biotinilado se confirmó por ESI-EM-TOF en términos de comparación del peso molecular teórico y determinado experimentalmente. La velocidad de incorporación de biotina es exactamente 2 (cada cadena pesada está en una forma escindida y biotinilada de forma C terminal). El rendimiento del procedimiento de escisión/conjugación/purificación fue de aprox. un 33 % (el rendimiento teórico máximo es de aprox. un 60 %); compárese con el rendimiento de un fragmento F(ab')2 monobiotinilado conjugado con NHS de aprox. un 10-15 %. Las pruebas funcionales se describen en los ejemplos 7 y 8, respectivamente.
Ejemplo 6
Fusión de inmunoglobulina de conejo recombinante que comprende un bucle de conjugación de sortasa mediada por sortasa
Con el procedimiento como se explica en el ejemplo 5, se sometió a prueba una escisión enzimática de una quimera de IgG de conejo/ratón, clon B que comprende un bucle de conjugación de sortasa (sustrato 1) y una reacción de conjugación/acoplamiento posterior de una marca de biotina (sustrato 2).
La secuencia de aminoácidos del bucle de conjugación de sortasa en la cadena pesada de una inmunoglobulina IgG se diseña esencialmente como se describe en el ejemplo 5.
Se mezcló sortasa purificada (40 |jM) con sus sustratos, es decir, inmunoglobulina recombinante que comprende un bucle de conjugación de sortasa (60 j M) y un derivado de biotina que contiene un motivo nucleófilo g Gg G N terminal (3000 j M) en tampón Tris 50 mM, pH 8,0 que contiene KCl 150 mM y CaCh 5 mM. Se incubó la mezcla de reacción a 37 °C durante 17 horas (durante la noche). Se detuvo la reacción por adición de EDTA 0,5 M, pH 7,5 a 5 mM en la mezcla de reacción.
Se realizó el seguimiento del avance de la reacción de escisión por cromatografía GPC (GFC300 Tosoh; tampón fosfato 100 mM, pH 7,0; 1 ml/min; detección a 280 nm) así como por SDS PAGE. La cantidad residual de IgG de longitud completa, es decir, no escindida con sortasa, disminuyó por debajo de un 10 % en menos de 15 horas. El producto F(ab')2 se biotiniló completamente con una velocidad de incorporación de biotina de 2 (datos no mostrados).
Ejemplo 7
Datos del inmunoensayo usando un fragmento F(ab')2 convencional y un fragmento similar a F(ab')2 como se produjo en el ejemplo 5
El conjugado de F(ab')2 biotinilado preparado de acuerdo con el protocolo mediado por sortasa presentado (véase el ejemplo 5) se comparó con un fragmento F(ab')2 preparado con pepsina monobiotinilada conjugada con NHS del mismo anticuerpo monoclonal.
En el primer caso, la biotina se une dirigida al sitio al extremo C de las cadenas pesadas que consisten en un bucle de conjugación de sortasa que proporciona una población homogénea definida de fragmentos conjugados (véase el ejemplo 5).
En el segundo caso, la biotina se une estocásticamente a diferentes lisinas de un fragmento F(ab')2 de acuerdo con protocolos estándar. Para obtener conjugados de anticuerpos monobiotinilados se añadió sulfato de amonio 0,5-1 M a la solución de conjugado. La solución se pasó a través de un adsorbente de muteína de estreptavidina (véase el documento DE19637718) equilibrado con fosfato de potasio 50 mM (pH 7,5), KCl 150 mM, sulfato de amonio 0,5-1 M. Los anticuerpos sin ninguna biotina acoplada/unida a ellos no se pueden unir al adsorbente y se eliminaron por lavado. Los conjugados de anticuerpos monobiotinilados se eluyeron con fosfato de potasio 50 mM (pH 7,5), KCl 150 mM y DMSO al 2 %. Los conjugados de anticuerpos con más de una biotina por anticuerpo se eluyeron después de esto con fosfato de potasio 50 mM (pH 7,5), KCl 150 mM y biotina 2 mM. La fracción monobiotinilada obtenida comprende una población heterogénea de diferentes fragmentos F(ab')2 monobiotinilados.
Se realizó la evaluación comparativa usando un ensayo de electroquimioluminiscencia con TSH experimental. Las mediciones se llevaron a cabo en un formato de ensayo no competitivo en un analizador cobas® e411 de Roche. La detección de señales en el analizador cobas® e411 se basa en electroquimioluminiscencia. En este ensayo no competitivo, el conjugado de biotina (es decir, el anticuerpo de captura) se inmoviliza sobre la superficie de una microesfera magnética recubierta con estreptavidina. El anticuerpo de detección tiene un catión rutenio complejado como resto de señalización. En presencia de analito, el complejo cromógeno de rutenio se une a la fase sólida y emite luz a 620 nm después de la excitación en el electrodo de platino comprendido en la celda de medición del analizador cobas® e601. La salida de señal está en unidades de luz arbitrarias. Las mediciones se realizaron con calibradores enriquecidos con TSH, así como con muestras de suero humano adquiridas de varias fuentes.
El ensayo con TSH experimental se llevó a cabo como sigue. Se incubaron conjuntamente 50 j l de muestra de suero humano o de calibrador enriquecido, 35 j l de 2 jg/m l de conjugado de anticuerpo de captura-biotina y 50 j l de 1 jg/m l de conjugado de marcador de rutenio de anticuerpo de detección durante 9 minutos, seguido de la adición de 40 |jl de micropartículas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina. Se incubó la mezcla durante 9 minutos adicionales. Posteriormente, se detectó la TSH (por medio de la señal electroquimioluminiscente generada en estos experimentos).
Los resultados o calibradores obtenidos en un Elecsys con TSH experimental se resumen en la tabla a continuación. Los resultados demuestran que una biotinilación dirigida al sitio de forma C terminal de un fragmento F(ab')2 es beneficiosa sobre un fragmento F(ab')2 monobiotinilado conjugado estocásticamente a través de lisinas libres. La dinámica del ensayo se incrementó de 92 a 145 para el calibrador 6 y de 6,8 a 10,2 para el calibrador 2, respectivamente (véase la figura 5). Los valores del blanco no se vieron afectados.
Figure imgf000020_0001
Ejemplo 8
Datos del inmunoensayo usando un fragmento F(ab')2 como se produjo en el ejemplo 5 y un conjugado de IgG convencional
El conjugado de F(ab')2 biotinilado preparado de acuerdo con el protocolo mediado por sortasa presentado (véase el ejemplo 5) se comparó con una IgG monobiotinilada conjugada con NHS del mismo anticuerpo monoclonal.
En el primer caso, la biotina se une dirigida al sitio al extremo C de las cadenas pesadas que consisten en un bucle de conjugación de sortasa que proporciona una población homogénea definida de fragmentos conjugados (véase el ejemplo 5).
En el segundo caso, la biotina se une estocásticamente a diferentes lisinas de una IgG de acuerdo con protocolos estándar. Para obtener un anticuerpo monobiotinilado, se ha aplicado un procedimiento para la preparación de un conjugado convencional descrito en el ejemplo 6.
La evaluación comparativa se realizó usando un ensayo de electroquimioluminiscencia pTau experimental. Las mediciones se llevaron a cabo en un formato de ensayo no competitivo en un analizador cobas® e601 de Roche. La detección de señales en el analizador cobas® e601 se basa en electroquimioluminiscencia. La realización técnica de un ensayo no competitivo se describe en el ejemplo 6.
El ensayo de fosfo-Tau(181P) experimental se llevó a cabo como sigue. Se incubaron conjuntamente 55 j l de muestra de suero humano o de calibrador enriquecido, 50 j l de 1 jg/m l de conjugado de anticuerpo de captura-biotina y 60 j l de 2 jg/m l de conjugado de marcador de rutenio de anticuerpo de detección durante 9 minutos, seguido de la adición de 35 j l de micropartículas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina. Se incubó la mezcla durante 9 minutos adicionales. Posteriormente, se detectó el fósforo-Tau (por medio de la señal electroquimioluminiscente generada en estos experimentos).
Los resultados de los calibradores obtenidos en un fosfo-Tau Elecsys experimental se resumen en la tabla a continuación. Los resultados demuestran que una biotinilación dirigida al sitio de forma C terminal de un fragmento F(ab')2 es beneficiosa sobre una IgG monobiotinilada conjugada estocásticamente a través de lisinas libres. La dinámica del ensayo se incrementó de 57 a 86 para el calibrador 7 y de 3,0 a 4,1 para el calibrador 3, respectivamente (véase la figura 6). Los valores del blanco no se vieron afectados.
Figure imgf000021_0001

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una cadena pesada de inmunoglobulina recombinante que comprende un dominio VH, un dominio CH1, una región bisagra abajo hasta la cisteína más C terminal de la región bisagra media, un bucle de conjugación de sortasa, un dominio CH2 y un dominio CH3, en la que el bucle de conjugación de sortasa
a) consiste en al menos 16 aminoácidos localizados entre la cisteína más C terminal de la región bisagra media y la secuencia consenso VFX1FPP (SEQ ID NO: 2; en la que X1 es L o I) en el extremo N de un dominio CH2 de la cadena pesada de inmunoglobulina,
b) comprende un motivo de reconocimiento de sortasa que consiste en la secuencia de aminoácidos L P X IT X 2 (SEQ ID NO: 01), en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A,
c) comprende N terminal con respecto a la secuencia de (b) al menos dos aminoácidos,
d) comprende C terminal con respecto a la secuencia de (b) al menos 6 aminoácidos, y
e) en la que los aminoácidos C y N terminales con respecto a la secuencia de (b) no son cisteína.
2. La cadena pesada de inmunoglobulina recombinante de la reivindicación 1, en la que dicho bucle de conjugación de sortasa comprende al menos 9 aminoácidos C terminales con respecto a la secuencia L P X 1 T X 2 (SEQ ID NO: 01, en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A).
3. La cadena pesada de inmunoglobulina recombinante de la reivindicación 1 o 2, en la que dicho bucle de conjugación de sortasa comprende al menos 5 aminoácidos N terminales con respecto a la secuencia L P X 1 T X 2 (SEQ ID NO: 01, en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A).
4. La cadena pesada de inmunoglobulina recombinante de la reivindicación 1 o 2, en la que dicho bucle de conjugación de sortasa comprende al menos 8 aminoácidos N terminales con respecto a la secuencia L P X 1 T X 2 (SEQ ID NO: 01, en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A).
5. La cadena pesada de inmunoglobulina recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho bucle de conjugación de sortasa comprende al menos 5 aminoácidos N terminales con respecto a la secuencia L P X 1 T X 2 (SEQ ID NO: 01, en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A), y al menos 9 aminoácidos C terminales con respecto a dicha secuencia.
6. La cadena pesada de inmunoglobulina recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho bucle de conjugación de sortasa comprende al menos 8 aminoácidos N terminales con respecto a la secuencia L P X 1 T X 2 (SEQ ID NO: 01, en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A), y al menos 9 aminoácidos C terminales con respecto a dicha secuencia.
7. La cadena pesada de inmunoglobulina recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicho bucle de conjugación de sortasa tiene una longitud máxima de 50 aminoácidos.
8. Un anticuerpo que comprende al menos dos cadenas pesadas de inmunoglobulina recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Un anticuerpo de clase IgG que tiene dos cadenas pesadas de inmunoglobulina recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
10. Un procedimiento para producir un conjugado de un fragmento de escisión por sortasa de una cadena pesada de inmunoglobulina recombinante y un nucleófilo de sortasa que comprende incubar
i) el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7 u 8,
ii) un compuesto que comprende un nucleófilo de sortasa,
iii) un polipéptido con actividad sortasa,
escindiendo de este modo la cadena pesada de anticuerpo recombinante después de la treonina en L P X 1 T X 2 (SEQ ID NO: 01, en la que X1 puede ser cualquier residuo de aminoácido y X2 es G o A) y conjugando el extremo N del nucleófilo de sortasa con dicha treonina.
11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el nucleófilo de sortasa comprende la marca de interés y tiene la fórmula (Gly)n-marca, en la que n es al menos 2.
12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el nucleófilo de sortasa comprende la marca de interés y tiene la fórmula (Gly)n-marca y en la que n se selecciona de 2, 3, 4, 5 o 6.
13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el nucleófilo de sortasa comprende la marca de interés y tiene la fórmula (Gly)n-marca, en la que n es como máximo 30.
14. Un conjugado producido de acuerdo con cualquiera de los procedimientos de las reivindicaciones 10 a 13.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11566082B2 (en) 2014-11-17 2023-01-31 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
WO2017050889A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant immunoglobulin heavy chains comprising a sortase conjugation loop and conjugates thereof
CN109311948B (zh) 2016-05-11 2022-09-16 思拓凡生物工艺研发有限公司 清洁和/或消毒分离基质的方法
EP3455243B1 (en) 2016-05-11 2021-03-24 Cytiva BioProcess R&D AB Separation matrix
JP7106187B2 (ja) 2016-05-11 2022-07-26 サイティバ・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ 分離マトリックスを保存する方法
US10703774B2 (en) 2016-09-30 2020-07-07 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US10889615B2 (en) 2016-05-11 2021-01-12 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
US10730908B2 (en) 2016-05-11 2020-08-04 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US10654887B2 (en) 2016-05-11 2020-05-19 Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab Separation matrix
WO2023108093A2 (en) * 2021-12-10 2023-06-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Affinity purification, proximity-based sortase ligation, and detection of proteins with precursor peptides and b1 proteins from lasso peptide biosynthesis systems

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
US5316757A (en) 1984-10-18 1994-05-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Synthesis of polyazamacrocycles with more than one type of side-chain chelating groups
US5342606A (en) 1984-10-18 1994-08-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Polyazamacrocyclic compounds for complexation of metal ions
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
US5739294A (en) 1991-12-10 1998-04-14 The Dow Chemical Company Bicyclopol yazamacrocyclophosphonic acid complexes for use as contrast agents
US5480990A (en) 1991-12-10 1996-01-02 The Dow Chemical Company Bicyclopolyazamacrocyclocarboxylic acid complexes for use as contrast agents
US5428139A (en) 1991-12-10 1995-06-27 The Dow Chemical Company Bicyclopolyazamacrocyclophosphonic acid complexes for use as radiopharmaceuticals
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
ATE196606T1 (de) 1992-11-13 2000-10-15 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörpern, die gegen ein differenzierung-antigen gerichtet sind, dessen expression auf menschliche b lymphozyt beschränkt ist, für die behandlung von b-zell-lymphoma
US5462725A (en) 1993-05-06 1995-10-31 The Dow Chemical Company 2-pyridylmethylenepolyazamacrocyclophosphonic acids, complexes and derivatives thereof, for use as contrast agents
US5385893A (en) 1993-05-06 1995-01-31 The Dow Chemical Company Tricyclopolyazamacrocyclophosphonic acids, complexes and derivatives thereof, for use as contrast agents
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5834456A (en) 1996-02-23 1998-11-10 The Dow Chemical Company Polyazamacrocyclofluoromonoalkylphosphonic acids, and their complexes, for use as contrast agents
DE19637718A1 (de) 1996-04-01 1997-10-02 Boehringer Mannheim Gmbh Rekombinante inaktive Core-Streptavidin Mutanten
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
NZ517906A (en) 1999-10-04 2003-01-31 Medicago Inc Cloning of genomic sequences encoding nitrite reductase (NiR) for use in regulated expression of foreign genes in host plants
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
US20110111856A1 (en) 2008-06-04 2011-05-12 Andrew William White Slot machine group tournament management and scoring system
EP2391714B2 (en) 2009-01-30 2019-07-24 Whitehead Institute for Biomedical Research Methods for ligation and uses thereof
WO2012028697A1 (en) 2010-09-01 2012-03-08 Eth Zürich, Institute Of Molecular Biology And Biophysics Affinity purification system based on donor strand complementation
BR112013019503B1 (pt) 2011-02-09 2021-05-25 F. Hoffmann-La Roche Ag composto quimioluminescente à base de irídio, conjugado, usos de um composto e método para medir um analito
CN103764665A (zh) * 2011-06-28 2014-04-30 怀特黑德生物医学研究所 使用分选酶安装用于蛋白质连接的点击化学柄
WO2013155526A2 (en) 2012-04-13 2013-10-17 Whitehead Institute For Biomedical Research Sortase- modified vhh domains and uses thereof
CN104395339A (zh) * 2012-06-27 2015-03-04 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于选择并产生含有至少两种不同结合实体的定制高度选择性和多特异性靶向实体的方法及其用途
CA2871882A1 (en) * 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
KR20150052085A (ko) * 2012-09-14 2015-05-13 에프. 호프만-라 로슈 아게 2개 이상의 상이한 단위를 포함하는 분자의 제조 및 선별 방법, 및 이의 용도
EP2777714A1 (en) 2013-03-15 2014-09-17 NBE-Therapeutics LLC Method of producing an immunoligand/payload conjugate by means of a sequence-specific transpeptidase enzyme
TR201806642T4 (tr) 2015-05-14 2018-06-21 NuCana plc Kanser tedavileri.
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