KR20150052085A - 2개 이상의 상이한 단위를 포함하는 분자의 제조 및 선별 방법, 및 이의 용도 - Google Patents

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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본원에서는 (a) C-말단 소포체 잔류 신호를 가지는 가용성 스타필로코쿠스 아우레우스 (S. aureus) 소르타아제 A를 암호화하는 핵산, (b) C-말단에 소르타아제 모티프에 이어서 소포체 잔류 신호를 포함하는 제 1 폴리펩타이드 도메인을 암호화하는 핵산, 및 (c) N-말단에 적어도 디글라이신을 포함하는 제 2 폴리펩타이드 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계로서, 여기서, 상기 세포는 상기 제 1 폴리펩타이드 도메인과 상기 제 2 폴리펩타이드 도메인의 소르타아제 A 접합체를 분비하는 것인 단계, 이에 의해 2개 이상의 폴리펩타이드 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 제조하는 단계를 포함하는, 2개 이상의 폴리펩타이드 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 제조 방법이 보고된다.

Description

2개 이상의 상이한 단위를 포함하는 분자의 제조 및 선별 방법, 및 이의 용도 {METHOD FOR THE PRODUCTION AND SELECTION OF MOLECULES COMPRISING AT LEAST TWO DIFFERENT ENTITIES AND USES THEREOF}
본원에서는 소르타아제 A와 같은 트랜스펩티다아제를 사용함으로써 결합 단위 (binding entity), 효과기 단위 또는 페이로드 (payload) 와 같은 2개의 상이한 단위의 조합에 의해 형성된 분자의 제조 및 선별 방법이 보고되는데, 여기서, 상기 2개 이상의 상이한 단위는 생체내에서 연결된다. 이것은 소르타아제 및 상기 단위 중 하나에 소포체 잔류 신호를 부가함으로써 달성된다.
지난 수년간, 항체, 항체 단편, 및 세포 표면 수용체에 대한 리간드를 포함한 광범위한 특이적 치료 단백질이 개발되었고, 임상적으로 시험되었다. 단백질의 예는 항체, Fc-영역 접합체 또는 표적화 전달 비히클이다. 이들 치료 단백질의 일부는 소형 분자 약물, 효소, 방사성동위원소, 단백질 독소, 및 환자에 대한 특이적 전달을 위한 다른 독소와 같은 몇가지 부류의 치료 독소에 접합되었다.
질환 부위에 대한 효과적인 전달은 임의의 치료 분자의 높은 효능 및 낮은 독성을 위한 전제 조건이다. 예를 들면, 항체는 이러한 맥락에서 관여할 수 있다. 항체가 그 자체로 치료제가 아닌 경우, 항체에 대한 효과기 분자의 접합은 인체내의 목적 부위에서의 약물의 정밀한 국소화를 달성하도록 해 준다. 이것은 이러한 표적 영역 내의 유효 약물 농도를 증가시켜, 제제의 치료 효능을 최적화시켜 준다. 더욱이, 표적화 전달을 이용하여, 임상의는 치료제의 전체 투약량을 낮추고, 이렇게 함으로써 전신 노출을 최소화할 수 있다 - 특히 약물 페이로드가 관련 독성을 가지는지 또는 만성 질환의 치료에 사용되는지와 특히 관련하는 경우 (예를 들면, 문헌 [McCarron, P.A., et al., Mol. Interventions 5 (2005) 368-380] 참조).
WO 2010/087994에서, 리게이션 방법 및 이의 용도가 보고되어 있다. IgG-유사 이중특이적 항체에 대한 재조합 접근법이 문헌 [Marvin, J.S., Acta Pharmacol. Sinica 26 (2005) 649-658] 에 보고되어 있다. 문헌 [Levary, D.A., et al., PLoS one, 6 (2011) e18342.1-e18342.6] 은 소르타아제 A에 의해 촉매된 단백질-단백질 융합을 보고하고 있다. WO 2013/003555에서, 단백질 리게이션에 대한 클릭 화학 핸들을 설치하기 위한 소르타아제의 용도가 보고되어 있다.
문헌 [Strijbis, K. et al., Traffic 13 (2012) 780-789] 은 소르타아제를 사용하는 생세포에서의 단백질 리게이션을 보고하고 있다. Ca2+-의존성 스타필로코쿠스 아우레우스 (S. aureus) 소르타아제 A는 세포 내에서 작용하지만, Ca2+-의존성 스트렙토코쿠스 피오제네스 (S. pyogenes) 소르타아제 A는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 와 포유동물 HEK293T 세포 둘 다의 세포질 및 소포체 (endoplasmic reticulum: ER) 루멘에서 작용하는 것으로 상기 문헌에 명시되어 있다.
본원에서는 스타필로코쿠스 아우레우스 (S. aureus)의 Ca2+-의존성 효소 소르타아제 A를 사용함으로써 제 1 폴리펩타이드 도메인과 제 2 폴리펩타이드 도메인의 효소-촉매된 (즉, 효소적) 접합체를 생체 세포 내에서 제조하는 방법이 보고되는데, 여기서, 상기 폴리펩타이드 도메인 중 하나와 상기 가용성 소르타아제 A 효소는 소포체 잔류 신호 서열을 함유한다.
이러한 기술은, 예를 들면, 제 1 군의 폴리펩타이드 도메인 (예를 들면, 항체 가변 도메인의 동족 쌍과 같은 제 1 군의 결합 도메인) 과 제 2 군의 폴리펩타이드 도메인 (예를 들면, 항체 가변 도메인의 동족 쌍과 같은 그러나 제 1 군의 것들과 다른 에피토프/항원에 대해 유도되는 제 2 군의 결합 도메인, 또는 일군의 페이로드 분자) 의 조합의 라이브러리의 신속한 생산에 특히 적합하다. 이러한 라이브러리는, 예를 들면, HEK 세포에서의 일시적 형질감염에 의해 용이하게 생성될 수 있으며, 생성된 조합은 이후에, 예를 들면, 의도하는 생물학적 효과 또는 의도하는 특성을 위해 스크리닝될 수 있다.
본원에 보고되는 하나의 측면은 하기 단계를 포함하는, 2개 이상의 폴리펩타이드 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 제조 방법이다:
- 다음을 포함하는 세포를 배양하는 단계로서,
a) C-말단 소포체 잔류 신호를 가지는 가용성 소르타아제 A를 암호화하는 핵산,
b) C-말단 또는 C-말단 영역에 소르타아제 모티프에 이어서 소포체 잔류 신호를 포함하는 제 1 폴리펩타이드 도메인을 암호화하는 핵산, 및
c) N-말단에 2개 이상의 글라이신 잔기의 올리고글라이신 모티프를 포함하는 제 2 폴리펩타이드 도메인을 암호화하는 핵산,
여기서, 상기 세포는 상기 제 1 폴리펩타이드 도메인과 상기 제 2 폴리펩타이드 도메인의 소르타아제 A (-매개된/-촉매된) 접합체를 분비하는 것인 단계,
이에 의해 2개 이상의 폴리펩타이드 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 제조하는 단계.
본원에 보고되는 하나의 측면은 하기 단계를 포함하는, 2개 이상의 결합 단위를 포함하는 다중특이적 바인더의 제조 방법이다:
- 다음을 포함하는 세포를 배양하는 단계로서,
a) C-말단 소포체 잔류 신호를 가지는 가용성 소르타아제 A를 암호화하는 핵산,
b) C-말단 또는 C-말단 영역에 소르타아제 모티프에 이어서 소포체 잔류 신호를 포함하는 제 1 결합 단위를 암호화하는 핵산, 및
c) N-말단에 적어도 디글라이신을 포함하는 제 2 결합 단위를 암호화하는 핵산,
여기서, 상기 세포는 상기 제 1 결합 단위와 상기 제 2 결합 단위의 소르타아제 A (-매개된/-촉매된) 접합체를 분비하고,
여기서, 상기 제 1 결합 단위는 제 1 항원 또는 표적에 특이적으로 결합하고, 상기 제 2 결합 단위는 제 2 항원 또는 표적에 특이적으로 결합하는 것인 단계,
이에 의해 2개 이상의 결합 단위를 포함하는 다중특이적 바인더를 제조하는 단계.
모든 측면의 하나의 실시형태에서, 소르타아제 A는 스타필로코쿠스 아우레우스 (S. aureus) 의 소르타아제 A이다. 하나의 실시형태에서, C-말단 소포체 잔류 신호를 가지는 (가용성) 소르타아제 A를 암호화하는 핵산은 서열 번호: 51 또는 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 암호화한다.
본원에서는 치료를 필요로 하는 환자에서 암 또는 바이러스 감염과 같은 질환의 치료를 위한 맞춤형의 고도로 특이적인 다중특이적 치료 분자의 제조 방법이 보고되는데, 여기서, 상기 치료 분자는 환자의 질환 특징 및/또는 환자의 유전자형/표현형에 적합화된다.
이러한 적합화는 환자의 질환 보유/영향받은 세포의 유전자형/표현형을 고려하여 맞춤형 분자를 제조함으로써 달성된다.
제 1 단계에서, 치료 분자가 표적으로 하고자 의도하는 세포의 유전자형/표현형 (예를 들면, 질환 특이적 세포 표면 분자의 존재 및 수/양) 을 결정한다. 이것은, 예를 들면, 형광 라벨된 단일특이적 (치료 또는 진단) 항체를 이용하여 혈액 및/또는 생검 물질로부터 유도되는 환자 세포의 면역조직화학 염색 (IHC, 면역조직화학) 과 같은 세포 영상화 기술에 의해 달성될 수 있다. 대안적으로, 세포의 유전자형/표현형은 FACS-기반의 방법을 이용하여 라벨된 치료 또는 진단 항체에 의해 염색한 후 분석될 수 있다. 광학 영상화, 분자 영상화, 형광 영상화, 생체발광 영상화, MRI, PET, SPECT, CT 및 생체 현미경검사를 포함한 생체내 영상화 기술도 또한 환자의 질환-관련 세포의 유전자형/표현형의 결정에 이용될 수 있다. 환자의 질환-관련 세포의 유전자형/표현형에 따라, 표적/결합 단위의 맞춤형 조합이 선택될 수 있으며, 치료 분자에서 조합된다. 이러한 치료 분자는, 예를 들면, 이중특이적 항체일 수 있다.
이러한 맞춤형 치료 분자는 i) 고도로 특이적이며, ii) 양호한 치료 효능을 가지고, iii) 통상적으로 선택되는 치료제와 비교하여 보다 적고/적거나 덜 심각한 부작용을 유발할 것이다. 이것은 치료 분자에, 예를 들면, 의도하는 작용 부위로 치료 페이로드를 전달하기 위한 개선된 표적화 및/또는 개선된 맞춤형 전달 특성을 부여함으로써 달성될 수 있다.
예를 들면, 암 세포와 같은 작용 부위로의 치료 분자의 개선된 전달은 통상적으로 선택되는 치료 분자와 비교하여 표적화 치료 분자에 대한 보다 높은/증가된 선택성 및/또는 특이성에 의해 달성될 수 있다. 치료 분자는 상이한 단백질 (예를 들면, 2개의 상이한 표면 마커) 에 특이적으로 결합하거나 이에 의해 결합될 수 있는 2개 이상의 단위를 포함한다.
맞춤형 치료 분자의 선택성 및/또는 특이성 증가는 두 표적 단위의 이들의 각 표적/에피토프에 대한 동시 결합에 의해, 또는 상호작용 파트너에 의한 두 폴리펩타이드 도메인의 동시 결합에 의해, 또는 이들의 혼합에 의해 달성될 수 있다.
자신의 각 표적/에피토프에 대한 낮은 친화성 내지 중간 정도의 친화성을 가지는 2개의 결합 단위의 조합이 특히 적합하다. 추가적으로, 오프-표적 결합 (off-target binding) 이 크게 감소되거나 심지어 완전히 제거될 수 있다.
본원에 보고되는 방법에 의해, 예를 들면, 암 세포와 같은 세포의 표면에서 발견되는 2개의 표면 마커에 특이적으로 지정되는 이중특이적 바인더, 예를 들면, 이중특이적 항체를 맞춤형 제작하는 것이 가능한 것으로 밝혀졌다. 결합 특이성이 출발 성분에 의해 개별적으로 제공되므로, 세포, 예를 들면, 암 세포 상에 존재하는 표면 마커를 결정하고, 효소적 절차에 의해 이들 표면 마커 또는 이들의 각각의 리간드에 특이적으로 결합하는 각각의 항체 단편을 접합함으로써 간단히 다중특이적 표적 및 결합 분자를 맞춤형 제작하는 것이 가능하다. 효소적 접합이 효소 소르타아제 A에 의해, 하나의 실시형태에서는 스타필로코쿠스 아우레우스 (S. aureus)의 소르타아제 A에 의해 수행되므로, 생성되는 이중 특이적 바인더 (이중특이적 항체) 는 아미노산 서열 LPXTG (서열 번호: 01, 여기서, X는 임의의 아미노산 잔기일 수 있다) 의 존재를 특징으로 한다.
본원에 보고되는 하나의 측면은 하기 단계를 포함하는, 2개의 상이한 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 다중특이적 바인더의 선별 방법이다:
- 제 1 결합 단위와 제 2 결합 단위의 상이한 조합을 포함하는 다수의 다중특이적 바인더로부터 2개의 상이한 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 다중특이적 바인더를 선별하는 단계.
본원에 보고되는 하나의 측면은 하기 단계를 포함하는, 이중특이적 항체의 선별 방법이다:
(i) 세포 함유 샘플에 존재하는 세포 표면 마커를 결정하고, 이로부터 적어도 제 1 표면 마커 및 제 2 표면 마커를 선별하는 단계,
(ii) (a) 20개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 LPXTG (서열 번호: 01, 여기서, X는 임의의 아미노산 잔기일 수 있다) 에 이어서 소포체 잔류 신호 KDEL (서열 번호: 02) 를 포함하는 항체 Fab 또는 scFab 단편 또는 scFv 항체를 암호화하는 핵산으로서, 여기서, 상기 항체 Fab 또는 scFab 단편 또는 scFv 항체는 상기 제 1 세포 표면 마커 또는 이의 리간드에 특이적으로 결합하는 것인 핵산, (b) 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드를 포함하는 1개의 팔을 가진 항체 단편을 암호화하는 핵산으로서, 여기서, 상기 전장 항체 중쇄 및 전장 항체 경쇄는 서로 상보적인 동족 항체 쇄이고, 이의 가변 도메인 (VH 및 VL) 의 쌍은 상기 제 2 표면 마커 또는 이의 리간드에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, 상기 전장 항체 중쇄 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드는 항체 힌지 영역을 형성하는 1개 이상의 디설파이드 결합을 통해 서로 공유적으로 연결되어 있고, 상기 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드는 이의 N-말단에 올리고글라이신 Gm (m = 2 또는 3 또는 4 또는 5) 아미노산 서열을 가지는 것인 핵산, 및 (c) C-말단 소포체 잔류 신호를 가지는 가용성 소르타아제 A를 암호화하는 핵산으로 세포를 형질감염시키는 단계, 및
이에 의해 이중특이적 항체를 제조하는 단계.
본원에 보고되는 하나의 측면은 하기 단계를 포함하는, 항원 결합 부위의 조합의 결정 방법이다:
(i) (a) 제 1 다수의 항체 Fab 또는 scFab 단편 또는 scFv 항체 단편의 각 구성원으로서, 여기서, 상기 각 구성원은 20개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 LPXTG (서열 번호: 01, 여기서, X는 임의의 아미노산 잔기일 수 있다) 에 이어서 소포체 잔류 신호 KDEL (서열 번호: 02) 을 포함하고, 상기 Fab 또는 scFab 단편 또는 scFv 항체는 제 1 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 것인 각 구성원을, (b) 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드를 포함하는 다수의 1개의 팔을 가진 항체 단편의 각 구성원으로서, 여기서, 상기 전장 항체 중쇄 및 전장 항체 경쇄는 서로 상보적인 동족 항체 쇄이고, 이의 가변 도메인 (VH 및 VL) 의 쌍은 제 2 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, 상기 전장 항체 중쇄 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드는 항체 힌지 영역을 형성하는 1개 이상의 디설파이드 결합을 통해 서로 공유적으로 연결되어 있고, 상기 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드는 소르타아제 A-촉매된 효소적 반응에 의해 이의 N-말단에 올리고글라이신 Gm (m = 2 또는 3 또는 4 또는 5) 아미노산 서열을 가지는 것인 각 구성원과 조합함으로써 제조된 다수의 이중특이적 항체의 결합 특이성 및/또는 선택성 및/또는 친화성 및/또는 효과기 기능 및/또는 생체내 반감기를 결정하는 단계, 및
(ii) 적절한 결합 특이성 및/또는 선택성 및/또는 친화성 및/또는 효과기 기능 및/또는 생체내 반감기를 가지는 이중특이적 항체를 선택하고, 이에 의해 항원 결합 부위의 조합을 결정하는 단계.
모든 측면의 하나의 실시형태에서, 소르타아제 A는 스타필로코쿠스 아우레우스 (S. aureus)의 소르타아제 A이다. 하나의 실시형태에서, C-말단 소포체 잔류 신호를 가지는 (가용성) 소르타아제 A를 암호화하는 핵산은 서열 번호: 51 또는 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 암호화한다.
본원에 보고되는 하나의 측면은 본원에 보고되는 방법에 의해 수득되는 이중특이적 항체이다.
본원에 보고되는 하나의 측면은 중쇄 중 하나에 아미노산 서열 LPXTG (서열 번호: 01, 여기서, X는 임의의 아미노산 잔기일 수 있다) 를 포함하는 이중특이적 항체이다.
하기에서, 본원에 보고되는 모든 측면의 실시형태가 제공된다.
하나의 실시형태에서, 다수의 다중특이적 바인더의 구성원은 각각 본원에 보고되는 방법에 의해 수득된다.
하나의 실시형태에서, 다중특이적 바인더는 이의 결합 특이성 및/또는 선택성 및/또는 친화성 및/또는 효과기 기능 및/또는 생체내 반감기에 근거하여 선택된다.
하나의 실시형태에서, 상기 결합 단위는 항체 중쇄 가변 도메인과 항체 경쇄 가변 도메인의 동족 쌍이다.
하나의 실시형태에서, 상기 다중특이적 바인더는 2개 또는 4개의 결합 단위를 포함하는 이중특이적 항체이다.
하나의 실시형태에서, 상기 제 1 폴리펩타이드 도메인 및 제 2 폴리펩타이드 도메인은 전장 항체, scFv, scFab, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 Fc-영역 단편, 항체 경쇄 가변 도메인과 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍, 항원 결합 항체 단편, VH, VL, CH1, CH2, CH3, CH4, CL, 항체 힌지 영역, 사이토카인, 수용체, 수용체 리간드, 검출가능한 라벨, 태그 및 결합 쌍의 파트너로부터 서로 독립적으로 선택된다.
하나의 실시형태에서, 상기 소포체 잔류 신호는 서열 번호:　02 (KDEL), 서열 번호: 03 (HDEL) 또는 서열 번호: 04 (SFIXXXXMP) 로부터 선택된다.
하나의 실시형태에서, 상기 소르타아제 모티프는 LPXTG (서열 번호: 01, 여기서, X는 임의의 아미노산 잔기일 수 있다) 이다.
하나의 실시형태에서, 상기 제 1 결합 도메인 또는 제 1 결합 단위는 20개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 LPXTG (서열 번호: 01, 여기서, X는 임의의 아미노산 잔기일 수 있다) 를 가진다.
하나의 실시형태에서, 상기 세포는 포유동물 세포 또는 효모 세포이다. 하나의 실시형태에서, 상기 포유동물 세포는 HEK 세포, CHO 세포 또는 BHK 세포로부터 선택된다.
하나의 실시형태에서, 상기 Fc-영역은 위치 329에서의 자연 발생적 아미노산 잔기의 돌연변이 및 위치 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322 및 331에서의 아미노산 잔기를 포함하는 군으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 잔기의 상이한 잔기로의 1개 이상의 추가의 돌연변이를 포함하고, 여기서, 상기 Fc-영역 내의 잔기는 Kabat의 EU 인덱스에 따라 번호지정된다. 이들 특정 아미노산 잔기의 변화는 비-수식된 (야생형) Fc-영역과 비교하여 Fc-영역의 효과기 기능의 변경을 초래한다.
하나의 실시형태에서, 상기 결합 단위는 다르핀 도메인 기반 결합 단위, 안티칼린 도메인 기반 결합 단위, T-세포 수용체 단편, 예를 들면, scTCR 도메인 기반 결합 단위, 카멜 VH 도메인 기반 결합 단위, 열번째 피브로넥틴 3 도메인 기반 결합 단위, 테나신 도메인 기반 결합 단위, 캐드헤린 도메인 기반 결합 단위, ICAM 도메인 기반 결합 단위, 티틴 도메인 기반 결합 단위, GCSF-R 도메인 기반 결합 단위, 사이토카인 수용체 도메인 기반 결합 단위, 글리코시다아제 억제제 도메인 기반 결합 단위, 슈퍼옥사이드 디스무타아제 도메인 기반 결합 단위, 또는 항체 단편, 예를 들면, Fab 또는 scFab 또는 scFv 단편의 군으로부터 선택된다 (또는 제 1 결합 단위 및 제 2 결합 단위는 이들로부터 서로 독립적으로 선택된다).
하나의 실시형태에서, 제 1 폴리펩타이드 도메인은 i) 이의 C-말단 아미노산 서열 영역 내에 (즉, 20개의 C-말단 아미노산 잔기 내에) 아미노산 서열 LPXTG (서열 번호: 01, 여기서, X는 임의의 아미노산 잔기일 수 있다) 및 ii) 이의 C-말단에 소포체 잔류 신호 KDEL (서열 번호: 02) 을 포함하고, 제 2 폴리펩타이드 도메인은 이의 N-말단에 올리고글라이신 Gm (m = 2 또는 3 또는 4 또는 5) 을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 제 2 폴리펩타이드 도메인 또는 제 2 결합 단위는 이의 N-말단에 올리고글라이신 Gm (m = 2 또는 3 또는 4 또는 5) 아미노산을 포함한다.
본원에 보고되는 하나의 측면은 본원에 보고되는 다중특이적 바인더를 포함하는 약제학적 제형이다.
본원에 보고되는 하나의 측면은 약제의 제조에서 본원에 보고되는 다중특이적 바인더의 용도이다.
하나의 실시형태에서, 약제는 암의 치료를 위한 것이다.
본원에 보고되는 하나의 측면은 본원에 보고되는 유효량의 다중특이적 바인더를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 가진 개체의 치료 방법이다.
본원에 보고되는 하나의 측면은 본원에 보고되는 유효량의 다중특이적 바인더를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서의 암 세포의 파괴 방법이다.
본원에 보고되는 하나의 측면은 본원에 보고되는 이중특이적 항체를 포함하는 약제학적 제형이다.
본원에 보고되는 하나의 측면은 약제의 제조에서 본원에 보고되는 이중특이적 항체의 용도이다.
하나의 실시형태에서, 약제는 암의 치료를 위한 것이다.
본원에 보고되는 하나의 측면은 본원에 보고되는 유효량의 이중특이적 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 가진 개체의 치료 방법이다.
본원에 보고되는 하나의 측면은 본원에 보고되는 유효량의 이중특이적 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서의 암 세포의 파괴 방법이다. 본원에 보고되는 모든 측면의 하나의 실시형태에서, Fc-영역은 인간 Fc-영역 또는 이의 변이체이다.
하나의 실시형태에서, 인간 항체 Fc-영역은 인간 IgG1 서브클래스 또는 인간 IgG2 서브클래스 또는 인간 IgG3 서브클래스 또는 인간 IgG4 서브클래스의 것이다.
하나의 실시형태에서, 항체 Fc-영역은 인간 IgG1 서브클래스 또는 인간 IgG4 서브클래스의 인간 항체 Fc-영역이다.
하나의 실시형태에서, 인간 항체 Fc-영역은 아미노산 위치 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322, 329 및/또는 331 중 1개 이상에서의 자연 발생적 아미노산 잔기의 상이한 잔기로의 돌연변이를 포함하고, 여기서, 상기 항체 Fc-영역 내의 잔기는 Kabat의 EU 인덱스에 따라 번호지정된다.
하나의 실시형태에서, 인간 항체 Fc-영역은 위치 329에서의 자연 발생적 아미노산 잔기의 돌연변이 및 위치 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322 및 331에서의 아미노산 잔기를 포함하는 군으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 잔기의 상이한 잔기로의 1개 이상의 추가의 돌연변이를 포함하고, 여기서, 상기 Fc-영역 내의 잔기는 Kabat의 EU 인덱스에 따라 번호지정된다. 이들 특정 아미노산 잔기의 변화는 비-수식된 (야생형) Fc-영역과 비교하여 Fc-영역의 효과기 기능의 변경을 초래한다.
하나의 실시형태에서, 인간 항체 Fc-영역은 상응하는 야생형 IgG Fc-영역을 포함하는 접합체와 비교하여 인간 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA 및/또는 FcγRI에 대한 감소된 친화성을 가진다.
하나의 실시형태에서, 인간 항체 Fc-영역 내의 위치 329에서의 아미노산 잔기는 글라이신 또는 아르기닌으로 치환되거나, Fc 영역 내에 프롤린 샌드위치를 파괴하기에 충분히 큰 아미노산 잔기로 치환된다.
하나의 실시형태에서, 자연 발생적 아미노산 잔기의 인간 항체 Fc-영역 내의 돌연변이는 S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D, P329G 및/또는 P331S 중 1개 이상이다.
하나의 실시형태에서, 돌연변이는, 항체 Fc-영역이 인간 IgG1 서브클래스의 것인 경우에는 L234A 및 L235A이거나, 항체 Fc-영역이 인간 IgG4 서브클래스의 것인 경우에는 S228P 및 L235E이다.
하나의 실시형태에서, 항체 Fc-영역은 돌연변이 P329G를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 항체 Fc-영역은 제 1 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드 내에서의 돌연변이 T366W와, 제 2 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드 내에서의 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V를 포함하고, 여기서, 번호지정은 Kabat의 EU 인덱스에 따른다.
하나의 실시형태에서, 항체 Fc-영역은 제 1 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드 내에서의 돌연변이 S354C와 제 2 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드 내에서의 돌연변이 Y349C를 포함한다.
도 1: C-말단에 소포체 잔류 신호를 포함하는 가용성 소르타아제 A를 위한 발현 플라스미드의 플라스미드 맵.
도 2: 쿠마씨 염색된 SDS-겔, 환원 조건; scFab-GS-His6-GS-LPETGGS-KDEL (레인 1), scFab-GS-His6-GAPPPS-LPETGGS-KDEL (레인 2), (GGGGS)2-scFab (레인 3), 가용성 소르타아제 A-KDEL (레인 4), 조합 1+3+4 (플라스미드 비율 2.5 : 5 : 1) (레인 5), 조합 2+3+4 (플라스미드 비율 2 : 8 : 1) (레인 6) 로 형질감염된 HEK293 세포의 배양물 상청액; scFab-GS-His6-GS-LPETGGS-KDEL 및 scFab-GS-His6-GAPPPS-LPETGGS-KDEL은 주로 세포 내에서 유지되고, (GGGGS)2-scFab는 발현되어 배지에 분비되고 (약 50 kDa), 조합의 경우에는 효소적 접합체의 약 100 kDa에서의 밴드가 관찰될 수 있다.
도 3: 쿠마씨 염색된 SDS-겔, 환원 조건; scFab-GS-His6-GS-LPETGGS-KDEL (레인 1), scFab-GS-His6-GAPPPS-LPETGGS-KDEL (레인 2), (GGGGS)2-scFab (레인 3), 가용성 소르타아제 A-KDEL (레인 4), 조합 1+3+4 (플라스미드 비율 2.5 : 5 : 1) (레인 5), 조합 2+3+4 (플라스미드 비율 2 : 8 : 1) (레인 6) 로 형질감염된 HEK293 세포의 세포 용해물 (좌측); scFab-GS-His6-GS-LPETGGS-KDEL 및 scFab-GS-His6-GAPPPS-LPETGGS-KDEL은 주로 세포 내에서 유지된다.
도 4: 도 2 및 도 3으로부터의 겔과 동일한 샘플을 사용하고 동일한 조건 하에 수행된 SDS 겔의 웨스턴 블롯 분석; scFab-LPXTG 분자 및 접합 생성물은 항-His-태그 항체 (PentaHis-AK (Qiagen)) 으로 검출되고; 조합의 경우에는 효소적 접합체의 약 100 kDa에서의 밴드가 관찰될 수 있다.
1. 정의
본 명세서 및 특허청구범위에서, 면역글로불린 중쇄 Fc-영역 내에서의 잔기의 번호지정은 Kabat의 EU 인덱스에 따른다 (문헌 [Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242], 본원에 참조로 명백히 포함된다).
용어 "변경"이란, 모 아미노산 서열 내에서의 1개 이상의 아미노산 잔기의 돌연변이, 부가 또는 결실을 의미한다.
용어 "태그"란, 특이적 결합 특성을 가지는 펩타이드 결합을 통해 서로 연결된 아미노산 잔기의 서열을 의미한다. 하나의 실시형태에서, 태그는 친화성 또는 정제 태그이다. 하나의 실시형태에서, 태그는 Arg-태그, His-태그, Flag-태그, 3xFlag-태그, Strep-태그, Nano-태그, SBP-태그, c-myc-태그, S-태그, 칼모듈린-결합-펩타이드, 셀룰로오스-결합-도메인, 키틴-결합-도메인, GST-태그 또는 MBP-태그로부터 선택된다. 하나의 실시형태에서, 태그는 서열 번호: 05 (RRRRR) 또는 서열 번호: 06 (RRRRRR) 또는 서열 번호:　07 (HHHHHH) 또는 서열 번호: 08 (KDHLIHNVHKEFHAHAHNK) 또는 서열 번호: 09 (DYKDDDDK) 또는 서열 번호: 10 (DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK) 또는 서열 번호: 11 (AWRHPQFGG) 또는 서열 번호: 12 (WSHPQFEK) 또는 서열 번호: 13 (MDVEAWLGAR) 또는 서열 번호: 14 (MDVEAWLGARVPLVET) 또는 서열 번호: 15 (MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP) 또는 서열 번호:　16 (EQKLISEEDL) 또는 서열 번호: 17 (KETAAAKFERQHMDS) 또는 서열 번호: 18 (KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL) 또는 서열 번호: 19 (셀룰로오스 결합 도메인) 또는 서열 번호: 20 (셀룰로오스 결합 도메인) 또는 서열 번호: 21 (TNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEP SNVPALWQLQ) 또는 서열 번호: 22 (GST-태그) 또는 서열 번호: 23 (MBP-태그) 로부터 선택된다.
용어 "항원 결합 항체 단편"이란, 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 전장 항체의 일부를 포함하는 전장 항체 이외의 분자를 의미한다. 항체 단편의 예는 Fv, scFv, Fab, scFab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 다이아바디, 선형 항체, 단일 쇄 항체 분자 (예를 들면, scFv) 및 항체 단편로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 및 하기 기재된 기타 단편을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 문헌 [Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134] 를 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해, 예를 들면, 문헌 [Plueckthun, A., In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315] 를 참조하고; 또한 WO 93/16185; US 5,571,894 및 US 5,587,458을 참조한다. 회수 수용체 (salvage receptor) 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 가지는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의를 위해, US 5,869,046을 참조한다.
항체 단편은 온전한 항체의 단백질가수분해 소화 또는 절단 뿐만 아니라 본원에 기재된 재조합 숙주 세포 (예를 들면, 대장균 (E. coli) 또는 파지 또는 진핵 세포) 에 의한 생성을 포함하나 이에 한정되지 않는 각종 기술에 의해 제조될 수 있다.
용어 "이중특이적 항체"란, 제 1 항원 또는 에피토프와 제 2 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 분자를 의미하며, 여기서, 상기 제 1 항원 또는 에피토프는 상기 제 2 항원 또는 에피토프와 상이하다.
이중특이적 항체 형식은, 예를 들면, WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 및 WO 2010/145793에 기재되어 있다.
용어 항체의 "클래스"란, 중쇄에 의해 보유되는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 의미한다. 인간에서는 항체의 5개의 주요 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 수개는 서브클래스 (동형), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인을 암호화하는 유전자 분절은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 호칭된다. 추가로, 인간 기원의 항체에 존재하는 경쇄의 2개의 클래스: 카파 및 람다가 존재하는데, 이들은 이들의 동족 중쇄 파트너와 조합하여 온전한 항체를 형성할 수 있다. 카파 또는 람다 경쇄를 암호화하는 유전자는 각각 κ 및 λ로 호칭된다.
용어 "효과기 기능"이란, 항체의 Fc-영역에 기인하는 생물학적 활성을 의미하며, 이것은 항체 클래스 및/또는 서브클래스에 따라 다르다. 항체 효과기 기능의 예는 다음을 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성 (complement dependent cytotoxicity: CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC); 항체-의존적 세포성 식세포작용 (antibody-dependent cellular phagocytosis: ADCP); 세포 표면 수용체 (예를 들면, B-세포 수용체) 의 하향조절; 및 B-세포 활성화. 이러한 기능은, 예를 들면, 식균 또는 용균 활성을 가지는 면역 세포 상의 Fc 수용체에 대한 Fc-영역의 결합에 의해, 또는 보체계의 성분들에 대한 Fc-영역의 결합에 의해 달성될 수 있다.
제제, 예를 들면, 약제학적 제형의 "유효량"이란, 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하는데 필요한 시간 동안 투약량에서의 유효량을 말한다.
용어 "Fc-영역"이란, 면역글로불린의 C-말단 영역을 의미한다. Fc-영역은 2개의 디설파이드-연결된 항체 중쇄 단편 (중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드 쇄) 을 포함하는 이량체 분자이다. Fc-영역은 온전한 (전장) 항체의 파파인 소화 또는 IdeS 소화 또는 트립신 소화에 의해 생성될 수 있거나, 재조합에 의해 생성될 수 있다.
전장 항체 또는 면역글로불린으로부터 수득가능한 Fc-영역은 적어도 전장 중쇄의 잔기 226 (Cys) 에서부터 C-말단까지를 포함하고, 따라서, 힌지 영역의 일부 및 2개 또는 3개의 불변 영역 도메인, 즉, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 IgE 및 IgM 클래스 항체의 경우에서 부가적/추가의 CH4 도메인을 포함한다. US 5,648,260 및 US 5,624,821로부터, Fc-영역 내에서의 정의된 아미노산 잔기의 수식은 표현형 효과를 초래하는 것으로 알려져 있다.
2개의 동일하거나 동일하지 않은 항체 중쇄 단편을 포함하는 이량체 Fc-영역의 형성은, 포함된 CH3 도메인의 비-공유적 이량체화에 의해 매개된다 (관여하는 아미노산 잔기에 대해서는, 예를 들면, 문헌 [Dall'Acqua, Biochem. 37 (1998) 9266-9273] 참조). Fc-영역은 힌지 영역 내에서의 디설파이드 결합의 형성에 의해 공유적으로 안정화된다 (예를 들면, 문헌 [Huber, et al., Nature 264 (1976) 415-420; Thies, et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 67-79] 참조). CH3-CH3 도메인 상호작용의 이량체화를 방해하기 위한 CH3 도메인 내의 아미노산 잔기 변화의 도입은, 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 결합에 악영향을 미치지 않는데, 이는 CH3-CH3-도메인 이량체화에 관여하는 잔기는 CH3 도메인의 내부 경계면에 위치하는 반면, Fc-영역-FcRn 상호작용에 관여하는 잔기는 CH2-CH3 도메인의 외부에 위치하기 때문이다.
Fc-영역의 효과기 기능과 연관되는 잔기는 전장 항체 분자에 대해 확인되었을 때 힌지 영역, CH2 및/또는 CH3 도메인 내에 위치한다. Fc-영역 연관되는/매개되는 기능은 다음과 같다:
(i) 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC),
(ii) 보체 (C1q) 결합성 활성화 및 보체-의존적 세포독성 (CDC),
(iii) 항체-의존적 세포성 식세포작용 (ADCP),
(iv) 항원-항체 복합체 (면역 복합체) 의 식세포작용/청소,
(v) 일부 경우에서의 사이토카인 방출, 및
(vi) 항체 및 항원-항체 복합체의 반감기/청소율.
Fc-영역 연관되는 효과기 기능은 Fc-영역과 효과기 기능 특이적 분자 또는 수용체의 상호작용에 의해 촉발/개시된다. 대개, IgG1 서브클래스의 항체는 수용체 활성화를 달성할 수 있는 반면, IgG2 및 IgG4 서브클래스의 항체는 효과기 기능을 가지지 않거나 제한된 효과기 기능을 가진다.
효과기 기능 유발 수용체는 Fc 수용체 유형 (및 하위-유형) FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII이다. IgG1 서브클래스와 연관되는 효과기 기능은, FcγR 및 C1q 결합에 관여하는, L234A 및/또는 L235A와 같은 하부 힌지 영역에 특정 아미노산 변화를 도입함으로써 감소될 수 있다. 또한, 특히 CH2 및/또는 CH3 도메인 내에 위치하는 특정 아미노산 잔기는, 혈류 내의 항체 분자 또는 Fc-영역 융합 폴리펩타이드의 순환 반감기의 조절과 연관된다. 순환 반감기는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 에 대한 Fc-영역의 결합에 의해 결정된다.
용어 "인간 Fc-영역"이란, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인의 적어도 일부를 함유하는 인간 기원의 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 의미한다. 하나의 실시형태에서, 인간 IgG 항체 중쇄 Fc-영역은 약 Glu216에서부터 또는 약 Cys226에서부터 또는 약 Pro230에서부터, 중쇄의 카르복실-말단까지 이른다. 그러나, 항체 Fc-영역의 C-말단 라이신 (Lys447) 은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다.
IgG1 서브클래스의 야생형 인간 Fc-영역의 폴리펩타이드 쇄는 하기 아미노산 서열을 가진다:
Figure pct00001
IgG4 서브클래스의 야생형 인간 Fc-영역의 폴리펩타이드 쇄는 하기 아미노산 서열을 가진다:
Figure pct00002
용어 "전장 항체"란, 고유의 항체 구조와 실질적으로 동일한 구조 및 아미노산 서열을 가지는 항체 뿐만 아니라 본원에서 보고되는 Fc-영역을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다.
용어 "전장 항체 중쇄"란, N-말단에서부터 C-말단 방향으로 항체 가변 도메인, 제 1 불변 도메인, 항체 중쇄 힌지 영역, 제 2 불변 도메인 및 제 3 불변 도메인, 및 일부 경우에서 제 4 불변 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다.
용어 "항체 중쇄 Fc-영역"이란, 항체 중쇄 힌지 영역, 제 1 불변 도메인 (보통 CH2 도메인) 및 제 2 불변 도메인 (보통 CH3 도메인) 을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다.
용어 "CH2 도메인"이란, 대략적으로 EU 위치 231에서부터 EU 위치 340까지 (Kabat에 따른 EU 번호지정 체계) 를 포괄하는 항체 중쇄 폴리펩타이드의 부분을 의미한다. 하나의 실시형태에서, CH2 도메인은 하기 아미노산 서열을 가진다:
Figure pct00003
CH2 도메인은 다른 도메인과 가까이에서 짝을 이루고 있지 않는 점에서 독특하다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지형 탄수화물 쇄가 온전한 고유의 Fc-영역의 2개의 CH2 도메인 사이에 삽입되어 있다. 상기 탄수화물은 도메인-도메인 짝짓기를 대체할 수 있고 CH2 도메인을 안정화하는 것을 도울 수 있는 것으로 추측되어 왔다 [Burton, Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206].
용어 "CH3 도메인"이란, 대략적으로 EU 위치 341에서부터 EU 위치 446까지를 포괄하는 항체 중쇄 폴리펩타이드의 부분을 의미한다. 하나의 실시형태에서, CH3 도메인은 하기 아미노산 서열을 가진다:
Figure pct00004
용어 "전장 항체 경쇄"란, N-말단에서부터 C-말단 방향으로 항체 가변 도메인 및 불변 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다.
용어 "힌지 영역"이란, 야생형 항체 중쇄 내에서 CH1 도메인 및 CH2 도메인을 연결하는 항체 중쇄 폴리펩타이드의 부분, 예를 들면, Kabat의 EU 번호 처계에 따른 약 위치 216에서부터 약 위치 230까지 또는 Kabat의 EU 번호 체계에 따른 약 위치 226에서부터 약 위치 230까지를 의미한다. 다른 IgG 서브클래스의 힌지 영역은 IgG1 서브클래스 서열의 힌지 영역 시스테인 잔기와 나란히 정렬시킴으로써 확인될 수 있다.
힌지 영역은 보통 동일한 아미노산 서열을 가지는 2개의 폴리펩타이드로 이루어진 이량체 분자이다. 힌지 영역은 일반적으로 약 25개의 아미노산 잔기를 포함하고, 항원 결합 영역을 서로 독립적으로 움직일 수 있게 할 정도로 유연하다. 힌지 영역은 다음의 3개의 도메인으로 세분될 수 있다: 상부, 중간 및 하부 힌지 도메인 (예를 들면, 문헌 [Roux, et al., J. Immunol. 161 (1998) 4083] 참조).
Fc-영역의 용어 "하부 힌지 영역"이란, 중간 (중심) 힌지 영역 바로 옆의 C-말단에 있는 아미노산 잔기의 스트레치 (stretch), 즉 Kabat의 EU 번호지정에 따른 Fc-영역의 잔기 233 내지 239를 의미한다.
용어 "야생형 Fc-영역"이란, 자연에서 발견되는 Fc-영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 의미한다. 야생형 인간 Fc-영역은 고유의 인간 IgG1 Fc-영역 (비-A 및 A 동종이인자형), 고유의 인간 IgG2 Fc-영역, 고유의 인간 IgG3 Fc-영역 및 고유의 인간 IgG4 Fc-영역 뿐만 아니라 이들의 자연 발생적 변이체를 포함한다.
용어 "개체" 또는 "피험자"란, 포유동물을 의미한다. 포유동물은 가축 (예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들면, 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들면, 원숭이), 토끼 및 설치류 (예를 들면, 마우스 및 래트) 를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시형태에서, 개체 또는 피험자는 인간이다.
기준 폴리펩타이드 서열에 관한 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"이란, 서열을 나란히 정렬하고 갭을 도입하여, 필요에 따라, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하고, 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 후, 기준 폴리펩타이드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적의 서열 정렬은 당해 기술분야의 통상의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당해 기술분야의 통상의 기술자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함한, 서열 정렬을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원에서의 목적을 위해, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램의 저작자는 Genentech, Inc.이고, 소스 코드는 사용자 문서와 함께 미국 저작권청 (U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559 소재) 에 제출되었는데, 여기서, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 South San Francisco, California 소재의 Genentech, Inc.로부터 공개적으로 입수가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D 를 포함한 UNIX 운영 체제 상에서 사용하기 위해 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 달라지지 않는다.
ALIGN-2를 아미노산 서열 비교에 이용하는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B와의 또는 이에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성 (이것은 주어진 아미노산 서열 B와의 또는 이에 대한 특정 % 아미노산 서열 동일성을 가지거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 대체하여 표현될 수 있다) 은 다음과 같이 산출된다:
100 × 분수 X/Y
여기서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 그 프로그램의 A와 B의 정렬에서 동일한 매치 (match) 로서 채점된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B 내의 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않은 것으로 인식될 것이다. 구체적으로 달리 명시되지 않는다면, 본원에서 사용되는 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 바로 직전 단락에서 기재된 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 수득된다.
용어 "약제학적 제형"이란, 그안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성을 유효하도록 허용하는 형태인 제제로서, 제형을 투여할 피험자에게 수용불가능할 정도로 독성인 추가의 성분을 함유하지 않은 제제를 의미한다.
"약제학적으로 허용가능한 담체"란, 피험자에게 무독성인, 활성 성분 이외의, 약제학적 제형 중의 성분을 의미한다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 완충액, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
용어 "환자의 표현형"이란, 환자로부터의 일종의 세포 내의 세포 표면 분자/수용체의 조성을 의미한다. 조성은 정량적 조성 뿐만 아니라 정성적 조성일 수 있다. 유전자형이 결정되는/주어지는 세포는 단일 세포이거나, 세포들을 포함하는 샘플일 수 있다.
용어 "위치"란, 폴리펩타이드의 아미노산 서열 내의 아미노산 잔기의 위치를 의미한다. 위치는 순차적으로 또는 확립된 형식, 예를 들면, 항체 번호지정을 위한 Kabat의 EU 인덱스에 따라 번호지정될 수 있다.
용어 "수용체"란, 1개 이상의 리간드에 결합할 수 있는 폴리펩타이드를 의미한다. 하나의 실시형태에서, 수용체는 세포외 리간드-결합 도메인, 및 임의로 다른 도메인 (예를 들면, 막관통 도메인, 세포내 도메인 및/또는 막 앵커) 을 가지는 세포-표면 수용체이다. 본원에 기재된 검정에서 평가되는 수용체는 온전한 수용체 또는 이의 단편 또는 유도체 (예를 들면, 1개 이상의 이종 폴리펩타이드에 융합된 수용체의 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질) 일 수 있다. 더욱이, 이의 결합 특성에 대해 평가되는 수용체는 세포 내에 존재하거나 분리되고, 임의로 검정 플레이트 또는 일부 다른 고체상에 코팅될 수 있다.
본원에 사용되는 "치료" (및 이의 문법적 변형, 예를 들면, "치료하다" 또는 "치료함") 이란, 치료하고자 하는 개체의 자연적 경과를 변형하기 위한 시도에서의 임상적 개입을 말하고, 예방을 위해 수행되거나 임상 병리학의 과정 동안 수행될 수 있다. 목적하는 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발의 방지, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 축소, 전이 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항체는 질환의 발달을 지연시키거나 질환의 진행을 둔화시키기 위해 사용된다.
II. 제 1 및 제 2 폴리펩타이드 도메인을 포함하는 맞춤형 분자
본원에 보고되는 모듈식 접근법을 사용함으로써 맞춤형 치료 폴리펩타이드를 제공할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이들 폴리펩타이드는, 이들이 형성되는 폴리펩타이드 도메인에 관해서 맞춤형이다.
2개의 폴리펩타이드 도메인을 조합하는 것에 의한 이러한 치료제의 맞춤형 생산을 사용하여, 이중 표적화 (2개의 결합 단위의 조합, 이중특이적 또는 다중 특이적 바인더), 표적화 및 페이로드 전달 (결합 단위 (표적화) 와 효과기 단위 (페이로드) 의 조합, 예를 들면, 항체-접합체) 또는 조합된 수용체 억제 (2개의 수용체 및/또는 리간드의 조합) 과 같은 상이한 작용 방식을 조합할 수 있다. 생성된 치료제는 개별 폴리펩타이드 도메인의 작용 방식을 동시에 수행하는 단일 치료 분자이다. 이로 인해, 예를 들면, 단일 도메인 치료 분자와 비교하여 부가적/상승적 효과가 예측될 수 있다.
이미 이용가능한 치료 단위, 예를 들면, 치료 항체로부터 유래된 것을 사용함으로써, 다중-도메인 치료 분자의 신속하고 용이한 생성을 달성할 수 있다.
예를 들면, 결합능 (avidity) 조작된 결합 분자/항체는 단일 세포 상에 존재하는 2개 이상의 세포 표면 마커에 결합할 수 있다. 이러한 결합은, 모든/양쪽 결합 단위가 세포에 동시에 결합하는 경우에만 결합한다 (avid). 이러한 목적을 위해, 낮은 내지 중간, 낮은 내지 높은, 또는 중간 내지 높은 아핀 (affine) 항체가 특히 적합하다. 이것은 또한 다른 한편으로는 스크리닝 과정 동안 결합 특이성의 보다 덜 특이적인 조합을 배제하는 것을 가능하게 한다.
이러한 접근법에 의해, 맞춤형 및 따라서 고도로 효과적인 치료 분자의 생성이 가능하다. 이들 분자는 더 적거나 덜 심각한/감소된 부작용을 가질 것인데, 이는 이들의 개선된 특성, 예를 들면, 개선된 표적화 전달 (예를 들면, 종양 세포에 대한 페이로드) 과 (2개 이상의 결합 분자를 포함하는) 표적 성분의 높은 선택성 및 특이성에 근거한 표적 세포에 대한 개선된 표적화 때문이다.
다중특이적 바인더의 더 높은 선택성 및 특이성은 2개의 "낮은 친화성" 바인더의 조합의 동시 결합 (결합능) 에 의해 발생되는데, 이것은 가능한 "오프-표적" 결합을 전적으로 감소시키거나 방지한다.
본원에 보고되는 방법
본원에 보고되는 하나의 측면은 하기 단계를 포함하는, 2개 이상의 폴리펩타이드 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 제조 방법이다:
- 다음을 포함하는 세포를 배양하는 단계로서,
a) C-말단 소포체 잔류 신호를 가지는 가용성 소르타아제 A를 암호화하는 핵산,
b) C-말단 또는 C-말단 영역에 소르타아제 모티프에 이어서 소포체 잔류 신호를 포함하는 제 1 폴리펩타이드 도메인을 암호화하는 핵산, 및
c) N-말단에 적어도 디글라이신 모티프를 포함하는 제 2 폴리펩타이드 도메인을 암호화하는 핵산,
여기서, 상기 세포는 상기 제 1 폴리펩타이드 도메인과 상기 제 2 폴리펩타이드 도메인의 소르타아제 A (-리게이트된) 접합체를 분비하는 것인 단계,
이에 의해 2개 이상의 폴리펩타이드 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 제조하는 단계.
본원에 보고되는 하나의 측면은 하기 단계를 포함하는, 2개 이상의 결합 단위를 포함하는 다중특이적 바인더의 제조 방법이다:
- 다음을 포함하는 세포를 배양하는 단계로서,
a) C-말단 소포체 잔류 신호를 가지는 가용성 소르타아제 A를 암호화하는 핵산,
b) C-말단 또는 C-말단 영역에 소르타아제 모티프에 이어서 소포체 잔류 신호를 포함하는 제 1 결합 단위를 암호화하는 핵산, 및
c) N-말단에 적어도 디글라이신 모티프를 포함하는 제 2 결합 단위를 암호화하는 핵산,
여기서, 상기 세포는 상기 제 1 결합 단위와 상기 제 2 결합 단위의 소르타아제 A (-리게이트된) 접합체를 분비하고,
여기서, 상기 제 1 결합 단위는 제 1 항원 또는 표적에 특이적으로 결합하고, 상기 제 2 결합 단위는 제 2 항원 또는 표적에 특이적으로 결합하는 것인 단계,
이에 의해 2개 이상의 결합 단위를 포함하는 다중특이적 바인더를 제조하는 단계.
본원에 보고되는 하나의 측면은 하기 단계를 포함하는, 2개의 상이한 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 다중특이적 바인더의 선별 방법이다:
- 제 1 결합 단위와 제 2 결합 단위의 상이한 조합을 포함하는 다수의 다중특이적 바인더로부터, 2개의 상이한 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 다중특이적 바인더를 선별하는 단계.
본원에 보고되는 하나의 측면은 하기 단계를 포함하는, 이중특이적 항체의 선별 방법이다:
(i) 세포 함유 샘플에 존재하는 세포 표면 마커를 결정하고, 이로부터 적어도 제 1 표면 마커 및 제 2 표면 마커를 선별하는 단계,
(ii) (a) 20개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 LPXTG (서열 번호: 01, 여기서, X는 임의의 아미노산 잔기일 수 있다) 에 이어서 소포체 잔류 신호 KDEL (서열 번호: 02) 를 포함하는 항체 Fab 단편 또는 항체 scFab 또는 scFv 항체를 암호화하는 핵산으로서, 여기서, 상기 Fab 단편 또는 scFab 단편 또는 scFv 항체는 상기 제 1 표면 마커 또는 이의 리간드에 특이적으로 결합하는 것인 핵산, (b) 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드를 포함하는 1개의 팔을 가진 항체 단편을 암호화하는 핵산으로서, 여기서, 상기 전장 항체 중쇄 및 전장 항체 경쇄는 서로 상보적인 동족 항체 쇄이고, 이의 가변 도메인 (VH 및 VL) 의 쌍은 상기 제 2 표면 마커 또는 이의 리간드에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, 상기 전장 항체 중쇄 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드는 항체 힌지 영역을 형성하는 1개 이상의 디설파이드 결합을 통해 서로 공유적으로 연결되어 있고, 상기 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드는 이의 N-말단에 올리고글라이신 Gm (m = 2 또는 3 또는 4 또는 5) 아미노산 서열을 가지는 것인 핵산, 및 (c) C-말단 소포체 잔류 신호를 가지는 가용성 소르타아제 A를 암호화하는 핵산으로 세포를 형질감염시키는 단계, 및
이에 의해 이중특이적 항체를 제조하는 단계.
본원에 보고되는 하나의 측면은 하기 단계를 포함하는, 항원 결합 부위의 조합의 결정 방법이다:
(i) (a) 제 1 다수의 항체 Fab 단편 또는 항체 scFab 단편 또는 scFv 항체 단편의 각 구성원으로서, 여기서, 상기 각 구성원은 20개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 LPXTG (서열 번호: 01, 여기서, X는 임의의 아미노산 잔기일 수 있다) 에 이어서 소포체 잔류 신호 KDEL (서열 번호: 02) 을 포함하고, 상기 Fab 단편 또는 scFab 단편 또는 scFv 항체는 제 1 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 것인 각 구성원을, (b) 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드를 포함하는 다수의 1개의 팔을 가진 항체 단편의 각 구성원으로서, 여기서, 상기 전장 항체 중쇄 및 전장 항체 경쇄는 서로 상보적인 동족 항체 쇄이고, 이의 가변 도메인 (VH 및 VL) 의 쌍은 제 2 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, 상기 전장 항체 중쇄 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드는 항체 힌지 영역을 형성하는 1개 이상의 디설파이드 결합을 통해 서로 공유적으로 연결되어 있고, 상기 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드는 소르타아제 A-매개된 효소적 커플링 반응을 사용하여 이의 N-말단에 올리고글라이신 Gm (m = 2 또는 3 또는 4 또는 5) 아미노산 서열을 가지는 것인 각 구성원과 조합함으로써 제조된 다수의 이중특이적 항체의 결합 특이성 및/또는 선택성 및/또는 친화성 및/또는 효과기 기능 및/또는 생체내 반감기를 결정하는 단계, 및
(ii) 적절한 결합 특이성 및/또는 선택성 및/또는 친화성 및/또는 효과기 기능 및/또는 생체내 반감기를 가지는 이중특이적 항체를 선택하고, 이에 의해 항원 결합 부위의 조합을 결정하는 단계.
하기에서, 본원에 보고되는 모든 방법의 실시형태가 제공된다.
모든 측면의 하나의 실시형태에서, 소르타아제 A는 스타필로코쿠스 아우레우스 (S. aureus)의 소르타아제 A이다. 하나의 실시형태에서, C-말단 소포체 잔류 신호를 가지는 (가용성) 소르타아제 A를 암호화하는 핵산은 서열 번호: 51 또는 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 암호화한다.
하나의 실시형태에서, 다수의 다중특이적 바인더의 구성원은 각각 본원에 보고되는 방법에 의해 수득된다.
하나의 실시형태에서, 다중특이적 바인더는 이의 결합 특이성 및/또는 선택성 및/또는 친화성 및/또는 효과기 기능 및/또는 생체내 반감기에 근거하여 선택된다.
하나의 실시형태에서, 상기 결합 단위는 항체 중쇄 가변 도메인과 항체 경쇄 가변 도메인의 동족 쌍이다.
하나의 실시형태에서, 상기 다중특이적 바인더는 2개 또는 4개의 결합 단위를 포함하는 이중특이적 항체이다.
하나의 실시형태에서, 상기 제 1 폴리펩타이드 도메인 및 제 2 폴리펩타이드 도메인은 전장 항체, scFv, scFab, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 Fc-영역 단편, 항체 경쇄 가변 도메인과 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍, 항원 결합 항체 단편, VH, VL, CH1, CH2, CH3, CH4, CL, 항체 힌지 영역, 사이토카인, 수용체, 수용체 리간드, 검출가능한 라벨, 태그 및 결합 쌍의 파트너로부터 서로 독립적으로 선택된다.
하나의 실시형태에서, 상기 소포체 잔류 신호는 서열 번호:　02 (KDEL), 서열 번호: 03 (HDEL) 또는 서열 번호: 04 (SFIXXXXMP) 로부터 선택된다.
하나의 실시형태에서, 상기 소르타아제 모티프는 LPXTG (서열 번호: 01, 여기서, X는 임의의 아미노산 잔기일 수 있다) 이다.
하나의 실시형태에서, 상기 제 1 결합 도메인 또는 제 1 결합 단위는 20개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 LPXTG (서열 번호: 01, 여기서, X는 임의의 아미노산 잔기일 수 있다) 를 가진다.
하나의 실시형태에서, 상기 세포는 포유동물 세포 또는 효모 세포이다. 하나의 실시형태에서, 상기 포유동물 세포는 HEK 세포, CHO 세포 또는 BHK 세포로부터 선택된다.
하나의 실시형태에서, 상기 Fc-영역은 위치 329에서의 자연 발생적 아미노산 잔기의 돌연변이 및 위치 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322 및 331에서의 아미노산 잔기를 포함하는 군으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 잔기의 상이한 잔기로의 1개 이상의 추가의 돌연변이를 포함하고, 여기서, 상기 Fc-영역 내의 잔기는 Kabat의 EU 인덱스에 따라 번호지정된다. 이들 특정 아미노산 잔기의 변화는 비-수식된 (야생형) Fc-영역과 비교하여 Fc-영역의 효과기 기능의 변경을 초래한다.
하나의 실시형태에서, 상기 결합 단위는 다르핀 도메인 기반 결합 단위, 안티칼린 도메인 기반 결합 단위, T-세포 수용체 단편, 예를 들면, scTCR 도메인 기반 결합 단위, 카멜 VH 도메인 기반 결합 단위, 열번째 피브로넥틴 3 도메인 기반 결합 단위, 테나신 도메인 기반 결합 단위, 캐드헤린 도메인 기반 결합 단위, ICAM 도메인 기반 결합 단위, 티틴 도메인 기반 결합 단위, GCSF-R 도메인 기반 결합 단위, 사이토카인 수용체 도메인 기반 결합 단위, 글리코시다아제 억제제 도메인 기반 결합 단위, 슈퍼옥사이드 디스무타아제 도메인 기반 결합 단위, 또는 항체 단편, 예를 들면, Fab 또는 scFab 또는 scFv 단편의 군으로부터 선택된다 (또는 제 1 결합 단위 및 제 2 결합 단위는 이들로부터 서로 독립적으로 선택된다).
하나의 실시형태에서, 제 1 폴리펩타이드 도메인은 i) 이의 C-말단 아미노산 서열 영역 내에 (즉, 20개의 C-말단 아미노산 잔기 내에) 아미노산 서열 LPXTG (서열 번호: 01, 여기서, X는 임의의 아미노산 잔기일 수 있다) 및 ii) 이의 C-말단에 소포체 잔류 신호 KDEL (서열 번호: 02) 을 포함하고, 제 2 폴리펩타이드 도메인은 이의 N-말단에 올리고글라이신 Gm (m = 2 또는 3 또는 4 또는 5) 을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 제 2 폴리펩타이드 도메인 또는 제 2 결합 단위는 이의 N-말단에 올리고글라이신 Gm (m = 2 또는 3 또는 4 또는 5) 아미노산을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 인간 항체 Fc-영역은 인간 IgG1 서브클래스 또는 인간 IgG2 서브클래스 또는 인간 IgG3 서브클래스 또는 인간 IgG4 서브클래스의 것이다.
하나의 실시형태에서, 상기 항체 Fc-영역은 인간 IgG1 서브클래스 또는 인간 IgG4 서브클래스의 인간 항체 Fc-영역이다.
하나의 실시형태에서, 인간 항체 Fc-영역은 아미노산 위치 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322, 329 및/또는 331 중 1개 이상에서의 자연 발생적 아미노산 잔기의 상이한 잔기로의 돌연변이를 포함하고, 여기서, 상기 항체 Fc-영역 내의 잔기는 Kabat의 EU 인덱스에 따라 번호지정된다.
하나의 실시형태에서, 인간 항체 Fc-영역은 위치 329에서의 자연 발생적 아미노산 잔기의 돌연변이 및 위치 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322 및 331에서의 아미노산 잔기를 포함하는 군으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 잔기의 상이한 잔기로의 1개 이상의 추가의 돌연변이를 포함하고, 여기서, 상기 Fc-영역 내의 잔기는 Kabat의 EU 인덱스에 따라 번호지정된다. 이들 특정 아미노산 잔기의 변화는 비-수식된 (야생형) Fc-영역과 비교하여 Fc-영역의 효과기 기능의 변경을 초래한다.
하나의 실시형태에서, 인간 항체 Fc-영역은 상응하는 야생형 IgG Fc-영역을 포함하는 접합체와 비교하여 인간 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA 및/또는 FcγRI에 대한 감소된 친화성을 가진다.
하나의 실시형태에서, 인간 항체 Fc-영역 내의 위치 329에서의 아미노산 잔기는 글라이신 또는 아르기닌, 또는 Fc 영역 내에 프롤린 샌드위치를 파괴하기에 충분히 큰 아미노산 잔기로 치환된다.
하나의 실시형태에서, 자연 발생적 아미노산 잔기의 인간 항체 Fc-영역 내의 돌연변이는 S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D, P329G 및/또는 P331S 중 1개 이상이다.
하나의 실시형태에서, 돌연변이는, 항체 Fc-영역이 인간 IgG1 서브클래스의 것인 경우에는 L234A 및 L235A이거나, 항체 Fc-영역이 인간 IgG4 서브클래스의 것인 경우에는 S228P 및 L235E이다.
하나의 실시형태에서, 항체 Fc-영역은 돌연변이 P329G를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 항체 Fc-영역은 제 1 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드 내에서의 돌연변이 T366W와, 제 2 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드 내에서의 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V를 포함하고, 여기서, 번호지정은 Kabat의 EU 인덱스에 따른다.
하나의 실시형태에서, 항체 Fc-영역은 제 1 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드 내에서의 돌연변이 S354C와 제 2 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드 내에서의 돌연변이 Y349C를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 항체 Fc-영역은, 위치 329에서의 아미노산 잔기 프롤린의 돌연변이 이외에도, 항체 Fc-영역 접합체의 증가된 안정성과 상관관계가 있는 Fc-영역 내의 아미노산 잔기의 1개 이상의 추가의 부가, 돌연변이 또는 결실을 포함한다.
하나의 실시형태에서, Fc-영역 내의 아미노산 잔기의 추가의 부가, 돌연변이 또는 결실은, Fc-영역이 IgG4 서브클래스의 것인 경우, Fc-영역의 위치 228 및/또는 235에 존재한다. 하나의 실시형태에서, 위치 228에서의 아미노산 잔기 세린 및/또는 위치 235에서의 아미노산 잔기 류신은 다른 아미노산에 의해 치환된다. 하나의 실시형태에서, 항체 Fc-영역 접합체는 위치 228에서 프롤린 잔기 (세린 잔기의 프롤린 잔기로의 돌연변이) 를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항체 Fc-영역 접합체는 위치 235에서 글루탐산 잔기 (류신 잔기의 글루탐산 잔기로의 돌연변이) 를 포함한다.
하나의 실시형태에서, Fc-영역은 3개의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 3개의 아미노산 돌연변이는 P329G, S228P 및 L235E 돌연변이 (P329G SPLE) 이다.
하나의 실시형태에서, Fc-영역 내의 아미노산 잔기의 추가의 부가, 돌연변이 또는 결실은, Fc-영역이 IgG1 서브클래스의 것인 경우, Fc-영역의 위치 234 및/또는 235에 존재한다. 하나의 실시형태에서, 위치 234에서의 아미노산 잔기 류신 및/또는 위치 235에서의 아미노산 잔기 류신은 다른 아미노산으로 돌연변이된다.
하나의 실시형태에서, Fc-영역은 위치 234에서 아미노산 돌연변이를 포함하는데, 여기서, 류신 아미노산 잔기는 알라닌 아미노산 잔기로 돌연변이 되어 있다.
하나의 실시형태에서, Fc-영역은 위치 235에서 아미노산 돌연변이를 포함하는데, 여기서, 류신 아미노산 잔기는 류신 아미노산 잔기로 돌연변이되어 있다.
하나의 실시형태에서, Fc-영역은 위치 329에서 아미노산 돌연변이를 포함하는데, 여기서, 프롤린 아미노산 잔기는 글라이신 아미노산 잔기로 돌연변이되어 있고, 위치 234에서 아미노산 돌연변이를 포함하는데, 여기서, 류신 아미노산 잔기는 알라닌 아미노산 잔기로 돌연변이되어 있고, 위치 235에서 아미노산 돌연변이를 포함하는데, 여기서, 류신 아미노산 잔기는 알라닌 아미노산 잔기로 돌연변이되어 있다.
FcRn에 대한 증가된 친화성을 가지는 Fc-영역 변이체는 보다 긴 혈청 반감기를 가지며, 이러한 분자는, 예를 들면, 만성 질환 또는 장애를 치료하기 위해, 투여되는 항체 Fc-영역 접합체의 긴 전신 반감기가 요구되는 포유동물의 치료 방법에서 유용한 적용을 가질 것이다.
감소된 FcRn 결합 친화성을 가지는 항체 Fc-영역 접합체는 보다 짧은 혈청 반감기를 가지고, 이러한 분자는, 예를 들면, 독성 부작용을 회피하거나 생체내 진단 영상화 적용을 위해, 투여되는 항체 Fc-영역 접합체의 보다 짧은 전신 반감기가 요구되는 포유동물의 치료 방법에서 유용한 적용을 가진다. 감소된 FcRn 결합 친화성을 가지는 Fc-영역 융합 폴리펩타이드 또는 접합체는 태반을 통과할 가능성이 보다 적고, 따라서, 임신 여성에서의 질환 또는 장애의 치료에서 이용될 수 있다.
FcRn에 대한 변경된 결합 친화성을 가지는 Fc-영역은, 하나의 실시형태에서, 아미노산 위치 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 및/또는 447 중 1개 이상에서 아미노산 변경을 가지는 Fc-영역이다.
Fc-영역은, 하나의 실시형태에서, 아미노산 위치 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 및/또는 447에서 1개 이상의 아미노산 변경을 가지는 Fc-영역이다.
FcRn에 대한 증가된 결합을 나타내는 Fc-영역은, 하나의 실시형태에서, 아미노산 위치 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 및/또는 434에서 1개 이상의 아미노산 변경을 포함한다.
하나의 실시형태에서, Fc-영역은 IgG1 서브클래스의 Fc-영역이고, 아미노산 돌연변이 P329G, 및/또는 L234A 및 L235A를 포함한다.
하나의 실시형태에서, Fc-영역은 IgG4 서브클래스의 Fc-영역이고, 아미노산 돌연변이 P329G, 및/또는 S228P 및 L235E를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 항체 Fc-영역은 제 1 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드 내의 돌연변이 T366W와, 제 2 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드 내의 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V를 포함하고, 여기서, 번호지정은 Kabat의 EU 인덱스에 따른다.
하나의 실시형태에서, 항체 Fc-영역은 제 1 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드 내의 돌연변이 S354C와 제 2 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드 내의 돌연변이 Y349C를 포함한다.
소르타아제 A를 사용하는 효소적 접합
다중 도메인 폴리펩타이드는 효소 소르타아제 A를 사용함으로써 생체내에서 수득될 수 있다.
다수의 그람-양성 박테리아는 소르타아제를 사용하여 독성 인자를 포함한 각종 표면 단백질을 이들의 세포벽 (펩티도글리칸) 에 공유적으로 고정시킨다. 소르타아제는 막 관련 효소이다. 야생형 스타필로코쿠스 아우레우스 소르타아제 A (SrtA) 는 N-말단 막 관통 영역을 가지는 206개의 아미노산의 폴리펩타이드이다. 제 1 단계에서, 소르타아제 A는 LPXTG (서열 번호: 01) 아미노산 서열 모티프를 함유하는 기질 단백질을 인식하고, Thr과 Gly 사이의 아미드 결합을 활성-부위 Cys에 의해 절단한다. 이러한 펩타이드 절단 반응은 소르타아제 A-기질 티오에스테르 중간체를 초래한다. 제 2 단계에서, 티오에스테르 아실-효소 중간체는 올리고글라이신 함유 제 2 기질 폴리펩타이드 (스타필로코쿠스 아우레우스 내의 펩티도글리칸의 펜타글라이신 유닛에 상응함) 의 아미노기의 친핵성 공격에 의해 분해되어, 공유적으로 연결된 세포벽 단백질 및 소르타아제 A의 재생을 초래한다. 올리고글라이신 친핵체의 부재시, 상기 아실-효소 중간체는 물 분자에 의해 가수분해될 수 있다.
소르타아제-매개된 리게이션/접합은 각종 단백질 조작 및 생물접합 목적을 위해 적용되기 시작하였다. 이러한 신기술은 LPXTG-태그된 재조합 또는 화학 합성된 폴리펩타이드 내로 천연 및 합성 작용기의 도입을 가능하게 해준다. 그 예는 올리고글라이신 유도된 중합체 (예를 들면, PEG), 형광단, 비타민 (예를 들면, 비오틴 및 폴레이트), 지질, 탄수화물, 핵산, 합성 펩타이드 및 단백질 (예를 들면, GFP) 의 공유적 부착을 포함한다 [Tsukiji, S. and Nagamune, T., ChemBioChem 10 (2009) 787-798; Popp, M.W.-L. 및 Ploegh, H.L., Angew. Chem. Int. Ed. 50 (2011) 5024-5032].
아미노 성분의 트리글라이신 및 심지어 디글라이신 모티프는 SrtA-매개된 리게이션 단계에 충분한 것으로 밝혀졌다 [Clancy, K.W., et al., Peptide Science 94 (2010) 385-396].
효소적 접합을 위해, 막 관통 영역을 결여하는 가용성 절단형 소르타아제 A (SrtA; 스타필로코쿠스 아우레우스 SrtA의 아미노산 잔기 60-206) 가 사용될 수 있다 [Ton-That, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 12424-12429; Ilangovan, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001) 6056-6061].
1개 이상의 N-말단에 올리고글라이신 모티프 (Gm, m = 2 또는 3 또는 4 또는 5) 를 포함하는 임의의 폴리펩타이드 도메인은 진핵 세포 (예를 들면, HEK293 세포, CHO 세포) 의 상청액으로부터 발현 및 정제될 수 있다.
하나의 폴리펩타이드 쇄의 C-말단에 SrtA 인지 모티프를 포함하는 결합 단위 (예를 들면, scFv, scFab 또는 다르핀과 같은 단일 쇄 항원 결합 폴리펩타이드, 또는 dsFv 또는 Fab와 같은 다중 쇄 항원 결합 폴리펩타이드) 는 진핵 세포 (예를 들면, HEK293 세포, CHO 세포) 의 상청액으로부터 별현 및 정제될 수 있다.
"콤비매트릭스 (Combimatrix)" 접근법
항체 Fab 단편과 같은 제 1 결합 단위를, 전장 중쇄 및 이의 동족 전장 경쇄 및 디설파이드 연결된 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드를 포함하는 1개의 팔을 가진 항체 단편 또는 제 2 항체 Fab 단편과 같은 다른 특이적 결합 단위와 조합하는 것이 바람직하다. 추가로, 제 1 결합 단위가 다수의 상이한 다른 결합 단위와 연결될 때 보다 양호한 특성을 나타내는지 여부를 스크리닝하는 것이 가능하다. 소위 콤비매트릭스 접근법을 이용하여, 다수의 결합 단위의 조합은 용이한 방식으로 처리될 수 있다. 제 2 결합 단위가 상이한 표적/에피토프/항원에 결합할 수 있거나, 동일한 항원에 결합하지만 상이한 에피토프에 결합할 수 있거나, 동일한 에피토프에 결합하지만 단일 결합 단위의 상이한 변이체 (예를 들면, 인간화 후보) 에 결합할 수 있음을 지적해야 한다.
이러한 시나리오에서, 자동화 플랫폼 공정이 수행될 수 있다. 예를 들면, 96-웰 플레이트 또는 다른 고속 처리 형식을 이용하는 임의의 플랫폼, 예를 들면, Eppendorf epMotion 5075vac 피펫팅 로봇이 적합하다.
첫번째로, 결합 단위를 암호화하는 작제물의 클로닝을 수행한다. 결합 단위를 암호화하는 핵산을 가지는 플라스미드는 일반적으로 유전자 합성 또는 PCR 증폭에 의해 수득되며, 이로써 하나의 암호화된 결합 단위의 C-말단 영역은 소르타아제-모티브 및 소포체 잔류 신호를 함유하고, 각각의 다른 결합 단위의 N-말단 영역은 2개 이상의 연속적 글라이신 잔기 (디글라이신) 를 포함하는/이들로 이루어진 N-말단 올리고글라이신 모티프를 포함한다. 플라스미드는 개별적으로 다중-웰 플레이트의 각 웰에 이동된다 (전체 플레이트에 주입할 수 있다). 이후, 플라스미드를 결합 단위-암호화 영역을 절단하는 제한 효소 믹스로 소화시킨다. 모든 플라스미드에 대해 오직 1개의 제한 효소 믹스만이 필요한 방식으로 모든 유전자 합성 및/또는 PCT 프라이머를 디자인하는 것이 바람직하다. 이후, 임의적 세정 단계에 의해 정제된 DNA 단편이 수득된다. 이들 단편은 상기에 언급된 것과 동일한 제한 효소 믹스에 의해 수용체 벡터로부터 제외된 플라스미드 골격에 리게이션된다. 대안적으로, 클로닝 절차는 SLIC-매개된 클로닝 단계에 의해 수행될 수 있다. 리게이션 후, 자동화 플랫폼은 모든 리게이션 믹스를 적격 대장균 세포 (예를 들면, Top10 Multi Shot, Invitrogen) 가 있는 추가의 다중-웰 플레이트에 옮기고, 형질전환 반응이 수행된다. 세포를 목적하는 밀도까지 배양한다. 배양 혼합물의 분취액으부터, 글리세롤 모액을 수득할 수 있다. 배양물로부터 플라스미드를 분리한다 (예를 들면, 플라스미드 분리 미니 키트 (예를 들면, NucleoSpin 96 플라스미드, Macherey & Nagel) 이용). 분취액을 적절한 제한 효소 믹스로 소화시키고, SDS-겔 전기영동 (예를 들면, E-Gel 48, Invitrogen) 에 의해 플라스미드 정체를 확인한다. 이후, 대조군 서열분석 반응을 수행하기 위해 플라스미드의 분취액을 새로운 플레이트에 주입할 수 있다.
다음 단계에서, 결합 단위를 발현시킨다. 이를 위해, HEK 세포를 다중-웰 플레이트 (예를 들면, 48-웰-플레이트) 에 시딩 (seeding) 하고, C-말단 소포체 잔류 신호를 보유하는 가용성 소르타아제를 암호화하는 플라스미드와 함께 각각의 분리된 플라스미드 조합 (적절한 골격 벡터 내에 결합 단위-암호화 영역을 포함함) 으로 형질감염시킨다. 따라서, HEK 세포를 다음과 같은 3개의 발현 플라스미드로 함께 형질감염시킨다: i) C-말단 His-태그, 소르타아제 모티프 및 소포체 잔류 신호 (N-말단에서부터 C-말단 방향으로) 를 가지는 결합 단위를 암호화하는 플라스미드, ii) 2개 이상의 글라이신 잔기의 N-말단 올리고글라이신 모티프를 가지는 결합 단위를 암호화하는 플라스미드, 및 iii) C-말단 소포체 잔류 신호를 가지는 가용성 소르타아제를 암호화하는 플라스미드. 형질감염된 HEK 세포를 수일 동안 배양하고, 후속적으로 배양물 상청액을 (예를 들면, 진공 스테이션을 이용하여 1.2 ㎛ 및 0.22 ㎛ 필터 플레이트를 통해 여과시킴으로써) 수확한다. 예를 들면, ELISA를 수행함으로써 역가를 모니터링할 수 있다.
결합 단위는 생체내에서의 발현 동안 소르타아제-매개된 펩타이드전이 반응을 이용하여 서로 연결된다. 이것은 C-말단 소르타아제 인지 모티프를 포함하는 결합 도메인이 소포체 잔류 신호를 포함하기 때문에 달성된다. 사용되는 가용성 소르타아제는 C-말단에 동일한 소포체 잔류 신호를 포함한다. 따라서, 두 분자는 소포체 내에 거의 완전히 유지된다. 제 2 폴리펩타이드 도메인의 소포체 내로의 진입시, 효소적 접합 반응이 일어나고, 효소적 펩타이드전이 반응 동안 제거되는 소포체 잔류 신호를 가지지 않은 효소적 접합체가 배양 배지에 분비된다. 상기 접합체를 His-태그 선별 절차를 이용하여 배양물로부터 수확하고 (배양물 상청액은, 예를 들면, His MultiTrap HP 플레이트 (GE Healthcare) 상에서 적용된다), 여과하는데, 여기서, His-태그를 포함하고 있는 모든 분자들은 매트릭스 (즉, 접합체) 에 결합되고, 적절한 용출 완충액에 의한 세정 후 용출될 수 있는 반면, 다른 모든 분자들은 크로마토그래피 물질에 결합하지 않을 것이다.
다중특이적 결합 분자는 콤비매트릭스 접근법을 이용하여 제조될 수 있다 (하기 표 참조).
Figure pct00005
다중-웰 플레이트의 제 1 열의 웰은 (96-웰 플레이트에 대해 아라비아 숫자, 예를 들면, 1 내지 11로 지정된) C-말단 소르타아제 모티프를 포함하는 제 1 결합 단위를 암호화하는 상이한 플라스미드를 나타낸다. 동일한 플레이트의 제 1 행의 웰은 (제 1 행을 배제하고, 문자, 예를 들면, A 내지 G로 지정되는) N-말단/N-말단 영역에 올리고글라이신을 포함하는 제 2 결합 단위를 암호화하는 상이한 플라스미드를 나타낸다. 이후, 제 1 행의 제 1 결합 단위를 암호화하는 모든 플라스미드를, 제 1 행의 제 2 결합 단위를 암호화하는 모든 플라스미드와 조합하고 (예를 들면, 96-웰 플레이트에서 77개의 조합을 생성함), 숫자와 문자의 조합 (예를 들면, 1A 내지 11G) 을 지정한다. 추가로, 소르타아제를 암호화하는 플라스미드를 모든 웰에 첨가한다. 모든 조합을 HEK 세포에 함께 형질감염시키고, 이로써 소포체 잔류 신호를 포함하는 소르타아제 A에 의해 생체내에서 발현하고 접합시킨다. 효소적 생체내 접합을 수행한 후, 임의적 정제 단계를 수행할 수 있다. 이어서, 다중특이적 결합 분자들은 생화학 또는 세포-기반 검정법에서 평가하기 위한 준비가 된다.
III. 재조합 방법
폴리펩타이드-암호화 벡터의 클로닝 및/또는 발현/분비에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재되는 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들면, 폴리펩타이드는, 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않을 때, 박테리아에서 생산될 수 있다 (예를 들면, 대장균에서의 항체 분절의 발현을 기재하고 있는, US 5,648,237, US 5,789,199 및 US 5,840,523, 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology 248 (2003) 245-254 (B.K.C. Lo, (ed.), Humana Press, Totowa, NJ] 참조). 발현 후, 폴리펩타이드는 가용성 분획 중의 박테리아 세포 페이스트로부터 분리될 수 있거나, 가용화되어 생체활성 형태로 되접힐 수 있는 불용성 분획, 소위 봉입체로부터 분리될 수 있다. 이후, 폴리펩타이드를 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물에 추가하여, 사상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물은 폴리펩타이드-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이며, 이것은 글리코실화 경로가 "인간화"되어 일부 또는 전부 인간 글리코실화 패턴을 가지는 폴리펩타이드의 생성을 초래하는 진균 및 효모 균주를 포함한다 (예를 들면, 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414, 및 Li, et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215] 참조).
글리코실화된 폴리펩타이드의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물) 로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큐로바이러스 균주가 확인되었다.
식물 세포 배양물도 또한 숙주로서 이용될 수 있다 (예를 들면, US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978 및 US 6,417,429 (유전자이식 식물에서 항체의 생산을 위한 PLANTIBODIES™ 기술을 기재하고 있음) 참조).
척추동물 세포도 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액 배약물 중에서 성장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 COS-7 세포주 (SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포; HEK293 세포주 (인간 배아 신장); BHK 세포주 (아기 햄스터 신장); TM4 마우스 세르톨리 세포주 (예를 들면, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23 (1980) 243-251] 에 기재된 바와 같은 TM4 세포); CV1 세포주 (원숭이 신장 세포); VERO-76 세포주 (아프리카 녹색 원숭이 신장 세포); HELA 세포주 (인간 자궁경부암 세포); MDCK 세포주 (개 신장 세포); BRL-3A 세포주 (버팔로 래트 간 세포); W138 세포주 (인간 폐 세포); HepG2 세포주 (인간 간 세포); MMT 060562 세포주 (마우스 유방암 세포); TRI 세포주 (예를 들면, 문헌 [Mather, et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68] 에 기재된 바와 같음); MRC5 세포주; 및 FS4 세포주이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 CHO 세포주 (중국 햄스터 난소 세포), 예를 들면, DHFR 음성 CHO 세포주 (문헌 [Urlaub, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216] 참조), 및 골수종 세포주, 예를 들면, Y0, NS0 및 Sp2/0 세포주를 포함한다. 폴리펩타이드 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토에 대해, 예를 들면, 문헌 [Yazaki, and Wu, Methods in Molecular Biology, Antibody Engineering 248 (2004) 255-268 (B.K.C. Lo, (ed.), Humana Press, Totowa, NJ] 을 참조한다.
IV. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 임의의 이중특이적 항체는 생물학적 샘플 중의 하나 또는 두 항체의 존재를 검출하는데 유용하다. 본원에 사용되는 용어 "검출함"이란, 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플은 암 세포의 생검과 같은 세포 또는 조직을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 진단 또는 검출 방법에서 사용하기 위한 이중특이적 항체가 제공된다. 추가의 측면에서, 생물학적 샘플 중의 암 세포의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 이중특이적 항체의 이의 항원 또는 항원들에 대한 결합을 허용하는 조건 하에 생물학적 샘플을 본원에 기재되는 이중특이적 항체와 접촉시키고, 상기 이중특이적 항체와 이의 항원 또는 항원들 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다.
본 발명의 항체를 사용하여 진단될 수 있는 증상의 예는 암을 포함한다.
특정 실시형태에서, 라벨된 이중특이적 항체가 제공된다. 라벨은 직접적으로 검출되는 라벨 또는 잔기 (예를 들면 형광, 발색, 전자-밀도, 화학발광 및 방사성 라벨) 뿐만 아니라, 예를 들면, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 효소 또는 리간드와 같은 잔기를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 라벨의 예는 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예를 들면, 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라아제, 예를 들면, 반딧불이 루시페라아제 및 박테리아 루시페라아제 (US 4,737,456), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 서양고추냉이 퍼옥시다아제 (horseradish peroxidase: HRP), 알칼리성 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 당류 옥시다아제, 예를 들면, 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제 및 글루코오스-6-포스페이트 데하이드로게나아제, 헤테로사이클릭 옥시다아제, 예를 들면, 우리카아제 및 크산틴 옥시다아제 (염료 전구체를 산화하기 위해 과산화수소를 이용하는 효소, 예를 들면, HRP, 락토퍼옥시다아제 또는 마이크로퍼옥시다아제와 커플링됨), 비오틴/아비딘, 스핀 라벨, 박테리오파지 라벨, 안정한 자유 라디칼 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
V. 약제학적 제형
본원에 보고되는 이중특이적 항체의 약제학적 제형은 목적하는 정도의 순도를 가지는 이러한 항체를 1개 이상의 임의적인 약제학으로 허용가능한 담체 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)]) 와 혼합함으로써, 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다. 약제학으로 허용가능한 담체는 일반적으로 사용되는 투약량 및 농도에서 수령자에게 무독성이며, 완충액, 예를 들면, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 산화방지제, 예를 들면, 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예를 들면, 옥타데실 디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들면, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10개의 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리(비닐피롤리돈); 아미노산, 예를 들면, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물, 예를 들면, 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예를 들면, EDTA; 당류, 예를 들면, 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예를 들면, 나트륨; 금속 착물 (예를 들면, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본원의 약제학으로 허용가능한 담체의 예는 틈새 약물 분산제 (interstitial drug dispersion agent), 예를 들면, 가용성 중성-활성 히알루로니다아제 당단백질 (soluble neutral-active hyaluronidase glycoprotein: sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다아제 당단백질, 예를 들면, rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.) 를 추가로 포함한다. 특정 sHASEGP 및 사용 방법 (rhuPH20 포함) 의 예는 US 2005/0260186 및 US 2006/0104968에 기재되어있다. 하나의 측면에서, sHASEGP는 1개 이상의 추가의 글리코사미노글리카나아제, 예를 들면, 콘드로이티나아제와 조합된다.
동결건조 항체 제형의 예는 US 6,267,958에 기재되어 있다. 수성 항체 제형은 US 6,171,586 및 WO 2006/044908에 기재된 것들을 포함하며, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.
본원의 제형은 또한 치료하는 특정한 징후에 필요한 1개 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 주지 않는 상보적 활성을 가지는 것들을 함유할 수 있다. 이러한 활성 성분은 적합하게는 의도하는 목적에 효과적인 양으로 조합으로 존재한다.
활성 성분은, 예를 들면, 액적형성 (coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 미세구체, 미세유화액, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 미세유화액 중의 각각 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸 메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)] 에 개시되어 있다.
지효성 제제가 제조될 수 있다. 지효성 제제의 적절한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하는데, 여기서, 상기 매트릭스는 성형품, 예를 들면, 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균된다. 멸균은, 예를 들면, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
치료 방법 및 조성물
본원에 제공되는 임의의 이중특이적 항체는 치료 방법에 사용될 수 있다.
하나의 측면에서, 약제로서 사용하기 위한 이중특이적 항체가 제공된다. 추가의 측면에서, 암 치료에 사용하기 위한 이중특이적 항체가 제공된다. 특정 실시형태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항체가 제공된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유효량의 이중특이적 항체를 암을 가진 개체에게 투여하는 것을 포함하는 암을 가진 개체의 치료 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항체를 제공한다. 하나의 이러한 실시형태에서, 상기 방법은, 예를 들면, 하기에 기재된 바와 같은 유효량의 1개 이상의 추가의 치료제를 상기 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명은 암 세포를 제거/사멸/용해하는데 사용하기 위한 이중특이적 항체를 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 암 세포를 제거/사멸/용해하기 위한 유효량의 이중특이적 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는 개체에서 암 세포의 제거/사멸/용해 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항체를 제공한다. 임의의 상기 실시형태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 약제의 제조 또는 조제에서의 이중특이적 항체의 용도를 제공한다. 하나의 실시형태에서, 상기 약제는 암의 치료를 위한 것이다. 추가의 실시형태에서, 상기 약제는 유효량의 약제를 암을 가진 개체에게 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법에서 사용하기 위한 것이다. 하나의 이러한 실시형태에서, 상기 방법은, 예를 들면, 하기에 기재된 바와 같은 유효량의 1개 이상의 추가의 치료제를 상기 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가의 실시형태에서, 상기 약제는 암 세포를 제거/사멸/용해하기 위한 것이다. 추가의 실시형태에서, 상기 약제는 암 세포를 제거/사멸/용해하기 위한 유효량의 약제를 개체에게 투여하는 것을 포함하는 개체에서 암 세포의 제거/사멸/용해 방법에 사용하기 위한 것이다. 임의의 상기 실시형태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가의 측면에서, 암의 치료 방법을 제공한다. 하나의 실시형태에서, 상기 방법은 유효량의 이중특이적 항체를 암을 가진 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 하나의 이러한 실시형태에서, 상기 방법은 하기에 기재된 바와 같은 유효량의 1개 이상의 추가의 치료제를 상기 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 상기 실시형태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 개체에서 암 세포를 제거/사멸/용해하는 방법을 제공한다. 하나의 실시형태에서, 상기 방법은 암 세포를 제거/사멸/용해하기 위한 유효량의 이중특이적 항체를 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 하나의 실시형태에서, "개체"는 인간이다.
추가의 측면에서, 본 발명은, 예를 들면, 임의의 상기 치료 방법에 사용하기 위한 본원에 제공되는 임의의 이중특이적 항체를 포함하는 약제학적 제형을 제공한다. 하나의 실시형태에서, 약제학적 제형은 본원에 제공되는 임의의 이중특이적 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 다른 실시형태에서, 약제학적 제형은 본원에 제공되는 임의의 이중특이적 항체 및 1개 이상의 추가적인 치료제를 포함한다.
본 발명의 항체는 치료에서 단독으로 또는 다른 제제와 병용하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 1개 이상의 추가의 치료제와 함께 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 추가의 치료제는 세포독성제 또는 화학치료제이다.
상기에 언급한 이러한 병용 요법은 병용 투여 (2개 이상의 치료제가 동일한 제형 또는 별도의 제형에 포함되어 있는 경우) 및 별도 투여를 포함하는데, 이러한 경우에서, 본 발명의 항체의 투여는 추가의 치료제 및/또는 보조제의 투여 이전에, 이와 동시에 및/또는 이후에 일어날 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 방사선 요법과 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 (및 임의의 추가의 치료제) 는, 예를 들면, 비경구, 폐내 및 비강내, 및 국소 치료에 바람직한 경우, 병변내 투여를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 피내 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들면, 투여가 간단한지 또는 만성인지에 부분적으로 의존하여, 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 수행될 수 있다. 다양한 시점에서의 단일 또는 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 투여 스케쥴이 본원에서 고려된다.
본 발명의 항체는 양호한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제형화, 투약 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려되는 요인은 치료할 특정 장애, 치료할 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 병태, 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴, 및 의사에게 공지된 기타 요인을 포함된다. 항체는 반드시 그럴 필요는 없지만, 문제의 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 1개 이상의 제제와 함께 임의로 제형화된다. 이러한 다른 제제의 유효량은 제형에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기에 논의된 다른 요인들에 좌우된다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 것과 동일한 투약량으로 및 투여 경로에 의해, 또는 본원에 기재된 투약량의 약 1% 내지 99%의 범위로, 또는 적절한 것으로 경험적으로/임상적으로 결정된 임의의 경로에 의해 및 임의의 투약량으로 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체 (단독으로 또는 1개 이상의 다른 추가의 치료제와 병용하여 사용할 때) 의 적절한 투약량은 치료할 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 치료, 항체에 대한 환자의 임상 이력 및 반응, 및 주치의의 재량에 좌우될 것이다. 항체는 1회 또는 일련의 치료에서 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 항체 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들면, 0.5 mg/kg - 10 mg/kg) 은, 예를 들면, 1회 이상의 별도 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투약량일 수 있다. 하나의 전형적인 1일 투약량은, 상기에 언급된 요인에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수일에 걸쳐 또는 보다 장기간의 반복 투여의 경우, 병태에 따라, 목적하는 질환 증상의 억제가 나타날 때까지, 치료는 일반적으로 지속될 것이다. 항체의 투약량의 하나의 예는 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이들의 임의의 조합) 의 1개 이상의 투약량을 환자에게 투여할 수 있다. 이러한 투약량을 간헐적으로, 예를 들면, 매주 또는 3주 마다 (예를 들면, 환자는 약 2회 내지 약 20회, 또는, 예를 들면, 약 6회 투약량의 항체를 수용할 수 있을 정도로) 투여할 수 있다. 초기의 보다 높은 투약량에 이어서 1회 이상의 보다 낮은 투약량을 투여할 수 있다. 그러나, 다른 투약량 요법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정법에 의해 용이하게 모니터링될 수 있다.
임의의 상기 제형 또는 치료 방법은 이중특이적 항체 대신에 또는 이에 추가하여 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
VII. 제조 물품
본 발명의 다른 측면에서, 상기에 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기와, 용기 상의 또는 이와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들면, 병, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 각종 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 그 자체인 조성물을 보유하거나, 병태를 치료, 예방 및/또는 진단하는데 효과적인 다른 조성물과 조합된 조성물을 보유하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들면, 용기는 정맥내 용액 백이거나, 피하 주사침에 의해 관통가능한 마개를 가지는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 1개 이상의 활성제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은, 조성물이 선택된 병태의 치료에 사용됨을 나타낸다. 또한, 제조 물품은 (a) 내부에 함유된 조성물을 가지는 제 1 용기로서, 여기서, 상기 조성물은 본 발명의 항체를 포함하는 것인 제 1 용기; 및 (b) 내부에 함유된 조성물을 가지는 제 2 용기로서, 여기서, 상기 조성물은 추가의 세포독성제 또는 치료제를 포함하는 것인 제 2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 실시형태의 제조 물품은, 조성물이 특정 병태를 치료하는데 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제조 물품은 정균 주사용수 (bacteriostatic water for injection: BWFI), 인산-완충된 식염수, 링거액 및 덱스트로오스 용액과 같은 약제학으로 허용가능한 완충액을 포함하는 제 2 (또는 제 3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 다른 완충액, 희석제, 필터, 주사바늘 및 시린지를 포함한, 상업적 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 제조 물품은 이중특이적 항체 대신에 또는 이에 추가하여 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기에 제공된 일반적인 기재내용이 주어지는 경우, 다양한 다른 실시형태가 실행될 수 있는 것으로 이해된다.
상술한 발명이 이해를 명확하게 할 목적으로 예시 및 실시예에 의해 다소 상세하게 기재되었지만, 기재내용 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 말아야 한다.
재료 및 방법
재조합 DNA 기술
문헌 [Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)] 에 기재된 표준 방법을 사용하여 DNA를 조작하였다. 분자 생물학적 시약을 제조사의 설명서에 따라 사용하였다.
유전자 및 올리고뉴클레오타이드 합성
목적하는 유전자 분절은 Geneart GmbH (Regensburg, Germany) 에서 화학 합성에 의해 제조하였다. 합성된 유전자 분절을 증식/증폭을 위해 대장균 플라스미드 내로 클로닝하였다. 서브클로닝된 유전자 분절의 DNA 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 대안적으로, 화학 합성된 올리고뉴클레오타이드를 어닐링함으로써 또는 PCR을 통해 짧은 합성 DNA 분절을 어셈블리하였다. 각각의 올리고뉴클레오타이드를 metabion GmbH (Planegg-Martinsried, Germany) 에 의해 제조하였다.
단백질 결정
정제된 폴리펩타이드의 단백질 농도는 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 기초하여 산출된 몰 흡광 계수를 사용하여 280㎚에서 광학 밀도 (OD) 를 측정함으로써 결정하였다.
실시예 1
단일 쇄 Fab 항체 단편을 포함한 항체 및 항체 단편을 위한 발현 플라스미드의 생성
목적하는 단백질을 인간 배아 신장 세포 (HEK 293) 의 일시적 형질감염에 의해 발현시켰다. 목적하는 유전자/단백질 (예를 들면, 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄, scFab 단편, 또는 N-말단에 올리고글라이신을 함유하는 Fc-쇄) 의 발현을 위해, 하기 기능적 요소들을 포함하는 전사 유닛을 사용하였다:
- 인트론 A를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스 (P-CMV) 로부터의 조기 발현 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-미번역 영역 (5'UTR),
- 쥐 면역글로불린 중쇄 신호 서열 (SS),
- 발현될 유전자/단백질, 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH pA).
발현될 목적하는 유전자를 포함하는 발현 유닛/카세트에 추가하여, 기본/표준 포유동물 발현 플라스미드는 하기를 함유한다:
- 대장균에서 이러한 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18로부터의 복제 원점, 및
- 대장균에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자.
a) C-말단 His-태그 소르타아제 모티프 및 ER 잔류 신호를 가지는 단일 쇄 Fab 단편 (scFab) 을 위한 발현 플라스미드의 생성
C-말단 His-태그에 이어서 소르타아제 인지 모티프 및 소포체 (ER) 잔류 신호를 포함하는 scFab 암호화 융합 유전자는, 짧은 GS 서열 요소 (GSHHHHHHGSLPETGGSKDEL (서열 번호: 29) 에 의해 각각 분리된, 각각의 서열 요소 (His6-태그 (HHHHHH, 서열 번호: 07), 소르타아제 모티프 (LPETGGS, 서열 번호: 28) 및 ER 잔류 신호 (KDEL, 서열 번호: 02) 를 암호화하는 DNA 단편을 래트-인간 키메라 단일 쇄 Fab 분자 (Vkappa-huCkappa-링커-Vheavy-huCH1) 에 융합함으로써 어셈블리되었다.
HEK293 세포에서 C-말단 His-태그, 소르타아제 모티프 및 ER 잔류 신호 융합 단백질을 가지는 scFab 단편의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는, C-말단 His-태그, 소르타아제 모티프 및 ER 잔류 신호 발현 카세트를 가지는 scFab 단편 이외에도, 대장균에서 이러한 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18로부터의 복제 원점, 및 대장균에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자를 포함하였다. C-말단 His-태그, 소르타아제 모티프 및 ER 잔류 신호 융합 유전자를 가지는 scFab 단편의 전사 유닛은 하기의 기능적 요소를 포함한다:
- 인트론 A를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스 (P-CMV) 로부터의 조기 발현 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-미번역 영역 (5'UTR),
- 쥐 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- scFab (Vkappa-huCkappa-링커-Vheavy-huCH1) 을 암호화하는 핵산,
- His-태그를 암호화하는 핵산,
- 소르타아제 인지 모티프를 암호화하는 핵산,
- ER 잔류 신호를 암호화하는 핵산, 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH pA).
C-말단 His-태그, 소르타아제 모티프 및 ER 잔류 신호 융합 단백질을 가지는 항-트랜스페린 수용체 항체 3D8의 성숙 scFab 단편의 아미노산 서열은 하기이다:
Figure pct00006
b) N-말단 글라이신-세린 모티프를 가지는 단일 쇄 Fab 단편 (scFab) 을 위한 발현 플라스미드의 생성
N-말단 글라이신-세린 모티프를 포함하는 scFab 융합 유전자는, 각각의 서열 요소 ((G4S)2, 서열 번호: 31) 를 암호화하는 DNA 단편을 래트-인간 키메라 단일 쇄 Fab 분자 (Vkappa-huCkappa-링커-Vheavy-huCH1) 에 융합함으로써 어셈블리되었다.
HEK293 세포에서 N-말단 글라이신-세린 모티프를 가지는 scFab 단편의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는, N-말단 글라이신-세린 모티프 발현 카세트를 가지는 scFab 단편 이외에도, 대장균에서 이러한 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18로부터의 복제 원점, 및 대장균에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자를 포함하였다. N-말단 글라이신-세린 모티프 융합 유전자를 가지는 scFab 단편의 전사 유닛은 하기의 기능적 요소를 포함한다:
- 인트론 A를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스 (P-CMV) 로부터의 조기 발현 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-미번역 영역 (5'UTR),
- 쥐 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- (G4S)2 모티프를 암호화하는 핵산,
- scFab (Vkappa-huCkappa-링커-Vheavy-huCH1) 를 암호화하는 핵산, 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH pA).
N-말단 글라이신-세린 모티프를 가지는 항-트랜스페린 수용체 항체 3D8의 성숙 scFab 단편의 아미노산 서열은 하기이다:
Figure pct00007
c) N-말단 3중 글라이신 모티프를 가지는 항체 Fc-영역 단편 (FC) 을 위한 발현 플라스미드의 생성
N-말단 3중 글라이신 모티프를 포함하는 FC 융합 유전자는, 각각의 서열 요소 (GGG, 서열 번호: 33) 를 암호화하는 DNA 단편을 인간 항체 중쇄 Fc-영역 분자에 융합함으로써 어셈블리되었다.
HEK293 세포에서 N-말단 3중 글라이신 모티프를 가지는 항체 Fc-영역 단편의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는, N-말단 3중 글라이신 모티프 발현 카세트를 가지는 항체 중쇄 Fc-영역 이외에도, 대장균에서 이러한 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18로부터의 복제 원점, 및 대장균에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자를 포함하였다. N-말단 3중 글라이신 모티프 융합 유전자를 가지는 항체 Fc-영역 단편 (FC)의 전사 유닛은 하기의 기능적 요소를 포함한다:
- 인트론 A를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스 (P-CMV) 로부터의 조기 발현 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-미번역 영역 (5'UTR),
- 쥐 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- GGG 를 암호화하는 핵산,
- Fc-영역을 암호화하는 핵산, 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH pA).
N-말단 3중 글라이신 모티프를 가지는 성숙 항체 Fc-영역 단편의 아미노산 서열은 하기이다:
Figure pct00008
d) 항체 중쇄 및 경쇄를 위한 발현 플라스미드
하기 폴리펩타이드/단백질을 암호화하는 발현 플라스미드를 상기에 개략적으로 서술된 방법에 따라 제작하였다:
- T366W 돌연변이를 함유하는 서브클래스 IgG1의 인간 중쇄 불변 영역과 조합된 페르투주맙 중쇄 가변 도메인:
Figure pct00009
- 인간 카파 경쇄 불변 영역과 조합된 페르투주맙 경쇄 가변 도메인:
Figure pct00010
- T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 함유하는 서브클래스 IgG1의 인간 중쇄 불변 영역과 조합된 트라스투주맙 중쇄 가변 도메인:
Figure pct00011
- 인간 카파 경쇄 불변 영역과 조합된 트라스투주맙 경쇄 가변 도메인:
Figure pct00012
- C-말단 GGGSHHHHHHGSLPETGGSKDEL 아미노산 서열을 함유하는 서브클래스 IgG1의 인간 중쇄 불변 영역 1 (CH1) 및 페르투주맙 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 VH-CH1 단편:
Figure pct00013
- C-말단 GSHHHHHHGSLPETGGSKDEL 서열을 함유하는 서브클래스 IgG1의 인간 중쇄 불변 영역 1 (CH1) 및 페르투주맙 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 VH-CH1 단편:
Figure pct00014
- C-말단 HHHHHHGSLPETGGSKDEL 서열을 함유하는 서브클래스 IgG1의 인간 중쇄 불변 영역 1 (CH1) 및 페르투주맙 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 VH-CH1 단편:
Figure pct00015
- C-말단 GGGSHHHHHHGSLPETGGSGSKDEL 서열을 함유하는 서브클래스 IgG1의 인간 중쇄 불변 영역 1 (CH1) 및 트라스투주맙 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 VH-CH1 단편:
Figure pct00016
- C-말단 GSHHHHHHGSLPETGGSGSKDEL 서열을 함유하는 서브클래스 IgG1의 인간 중쇄 불변 영역 1 (CH1) 및 트라스투주맙 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 VH-CH1 단편:
Figure pct00017
- C-말단 HHHHHHGSLPETGGSGSKDEL 서열을 함유하는 서브클래스 IgG1의 인간 중쇄 불변 영역 1 (CH1) 및 트라스투주맙 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 VH-CH1 단편:
Figure pct00018
- N-말단 GGGDKTHTCPPC 서열을 함유하는 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 가지는 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드 (인간 IgG1(CH2-CH3)):
Figure pct00019
- N-말단 GGHTCPPC 서열을 함유하는 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 가지는 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드 (인간 IgG1(CH2-CH3)):
Figure pct00020
- N-말단 GGCPPC 서열을 함유하는 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 가지는 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드 (인간 IgG1(CH2-CH3)):
Figure pct00021
- N-말단 GGGDKTHTCPPC 서열을 함유하는 T366W 돌연변이를 가지는 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드 (인간 IgG1(CH2-CH3)):
Figure pct00022
- N-말단 GGHTCPPC 서열을 함유하는 T366W 돌연변이를 가지는 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드 (인간 IgG1(CH2-CH3)):
Figure pct00023
- N-말단 GGCPPC 서열을 함유하는 T366W 돌연변이를 가지는 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드 (인간 IgG1(CH2-CH3)):
Figure pct00024
실시예 2
C-말단 ER 잔류 신호를 가지는 가용성 스타필로코쿠스 아우레우스 ( S. aureus ) 소르타아제 A를 위한 발현 플라스미드의 생성
C-말단 ER 잔류 신호를 포함하는 소르타아제 융합 유전자는, ER 잔류 신호 (KDEL) 를 암호화하는 DNA 단편을 N-말단 절단형 스타필로코쿠스 아우레우스 (S. aureus) 소르타아제 A (60-206) 분자에 융합함으로써 어셈블리되었다 (SrtA-KDEL).
HEK293 세포에서 ER 잔류 신호를 가지는 가용성 소르타아제의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는, ER 잔류 신호 발현 카세트를 가지는 가용성 소르타아제 이외에도, 대장균에서 이러한 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18로부터의 복제 원점, 및 대장균에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자를 포함하였다. ER 잔류 신호를 가지는 가용성 소르타아제의 전사 유닛은 하기의 기능적 요소를 포함한다:
- 인트론 A를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스 (P-CMV) 로부터의 조기 발현 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-미번역 영역 (5'UTR),
- 쥐 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- N-말단 절단형 스타필로코쿠스 아우레우스 소르타아제 A 를 암호화하는 핵산,
- ER 잔류 신호를 암호화하는 핵산, 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH pA).
N-말단 절단형 스타필로코쿠스 아우레우스 소르타아제 A의 C-말단 아미노산 잔기가 이미 라이신 (K) 이기 때문에, 오직 아미노산 서열 DEL만이 기능적 ER 잔류 신호 (KDEL) 를 확립하기 위해 효소의 C-말단에서 융합되어야 한다.
ER 잔류 신호 (KDEL) 를 가지는 성숙 가용성 소르타아제의 아미노산 서열은 하기이다:
Figure pct00025
GSKDEL 소포체 잔류 신호를 가지는 성숙 가용성 소르타아제의 아미노산 서열은 하기이다:
Figure pct00026
실시예 3
소르타아제-매개된 펩타이드전이에 의해 생체내에서 생성된 접합체의 일시적 발현, 정제 및 분석적 특성화
접합체를 F17 배지 (Invitrogen Corp.) 에서 배양된 일시적 형질감염된 HEK293 세포 (인간 배아 신장 세포주 293-유래) 에서 생체내에서 생성하였다. 형질감염을 위해, "293-Free" Transfection Reagent (Novagen) 를 사용하였다. 상기에 기재된 N-말단 및 C-말단 확장된 scFab 분자 뿐만 아니라 가용성 소르타아제는 각각 개별 발현 플라스미드로부터 발현되었다. 형질감염을 제조사의 설명서에 명시된 바와 같이 수행하였다. 융합 단밸질 함유 세포 배양물 상청액을 형질감염 후 3일 내지 7일 (3-7일)에 수확하였다. 상청액을 정제할 때까지 감소된 온도 (예를 들면, -80℃) 에서 보관하였다.
예를 들면, HEK293 세포에서의 인간 면역글로불린의 재조합 발현에 관한 일반적인 정보는 문헌 [Meissner, P., et al., Biotechnol.　Bioeng. 75 (2001) 197-203] 에서 제공된다.
배양물 상청액을 여과하고, 이어서 Ni2+-이온 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. Ni Sepharose™ 고성능 His-Trap HP (GE Healthcare) 를 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 His-태그를 포함하는 분비 단백질을 포획하였다. 500 mM NaCl 및 30 mM 이미다졸을 함유하는 10 mM Tris 완충액 pH 7.5로 세정함으로써 미결합 단백질을 제거하였다. 결합된 His-태그 함유 단백질을 500 mM NaCl 및 500 mM 이미다졸을 함유하는 10 mM Tris 완충액 pH 7.5로 용출시켰다. Superdex 200™ (GE Healthcare) 크기 배제 크로마토그래피를 제 2 정제 단계로서 사용하였다. 크기 배제 크로마토그래피를 20　mM 히스티딘 완충액, 0.14 M NaCl, pH 6.0 중에서 수행하였다. 140 mM NaCl을 함유하는 10 mM 히스티딘 완충액 pH 6.0에 회수된 단백질을 투석하고, -80℃에서 보관하였다.
상기 단백질의 단백질 농도는 아미노산 서열에 기초하여 산출된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서 광학 밀도 (OD) 를 측정함으로써 결정하였다. 순도는 환원제 (5 mM 1,4-디티오트레이톨) 의 존재 및 부재 하에 SDS-PAGE 및 쿠마씨 브릴리언트 블루 (Coomassie brilliant blue)에 의한 염색으로 분석하였다. Fc-융합 단백질 제제의 응집물 함량은 SK3000SWxl 분석용 크기 배제 컬럼 (Tosohaas, Stuttgart, Germany) 을 사용하는 고성능 SEC에 의해 결정하였다. 감소된 Fc-융합 단백질의 아미노산 골격의 무결성은 펩타이드-N-글리코시다아제 F (Roche Applied Science) 에 의한 효소 처리에 의해 N-글리칸의 제거 후 Nano Electrospray QTOF 질량 분석법에 의해 확인하였다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Method for the production and selection of molecules comprising at least two different entities and uses thereof <130> 31245 WO <150> EP12184473.2 <151> 2012-09-14 <160> 52 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X can be any amino acid residue <400> 1 Leu Pro Xaa Thr Gly 1 5 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Lys Asp Glu Leu 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 3 His Asp Glu Leu 1 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Adenovirus type 2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(7) <223> X can be any amino acid residue <400> 4 Ser Phe Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Met Pro 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Arg-tag <400> 5 Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Arg-tag 2 <400> 6 Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Y407V mutation containing a N-terminal gghtcppc sequence <400> 46 Gly Gly His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 1 5 10 15 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 20 25 30 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 35 40 45 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 50 55 60 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 65 70 75 80 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 85 90 95 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 100 105 110 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys 115 120 125 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 130 135 140 Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 145 150 155 160 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 165 170 175 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp 180 185 190 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 195 200 205 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 210 215 220 Gly Lys 225 <210> 47 <211> 224 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain Fc-region polypeptide (human IgG1(CH2-CH3)) with T366S, L368A and Y407V mutation containing a N-terminal ggcppc sequence <400> 47 Gly Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 1 5 10 15 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 20 25 30 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 35 40 45 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 50 55 60 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 65 70 75 80 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 85 90 95 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 100 105 110 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu 115 120 125 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys 130 135 140 Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 145 150 155 160 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 165 170 175 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 180 185 190 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 195 200 205 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 48 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain Fc-region polypeptide (human IgG1(CH2-CH3)) with T366W mutation containing a N-terminal gggdkthtcppc sequence <400> 48 Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 1 5 10 15 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 20 25 30 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 35 40 45 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 50 55 60 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 65 70 75 80 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 85 90 95 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 100 105 110 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 115 120 125 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 130 135 140 Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 145 150 155 160 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 165 170 175 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 180 185 190 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 195 200 205 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 210 215 220 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 49 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain Fc-region polypeptide (human IgG1(CH2-CH3)) with T366W mutations containing a N-terminal gghtcppc sequence <400> 49 Gly Gly His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 1 5 10 15 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 20 25 30 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 35 40 45 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 50 55 60 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 65 70 75 80 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 85 90 95 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 100 105 110 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 115 120 125 Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 130 135 140 Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 145 150 155 160 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 165 170 175 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 180 185 190 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 195 200 205 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 210 215 220 Gly Lys 225 <210> 50 <211> 224 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain Fc-region polypeptide (human IgG1(CH2-CH3)) with T366W mutation containing a N-terminal ggcppc sequence <400> 50 Gly Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 1 5 10 15 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 20 25 30 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 35 40 45 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 50 55 60 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 65 70 75 80 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 85 90 95 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 100 105 110 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 115 120 125 Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys 130 135 140 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 145 150 155 160 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 165 170 175 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 180 185 190 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 195 200 205 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 51 <211> 150 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mature soluble sortase with ER retention signal <400> 51 Gln Ala Lys Pro Gln Ile Pro Lys Asp Lys Ser Lys Val Ala Gly Tyr 1 5 10 15 Ile Glu Ile Pro Asp Ala Asp Ile Lys Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro 20 25 30 Ala Thr Pro Glu Gln Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Ala Glu Glu Asn 35 40 45 Glu Ser Leu Asp Asp Gln Asn Ile Ser Ile Ala Gly His Thr Phe Ile 50 55 60 Asp Arg Pro Asn Tyr Gln Phe Thr Asn Leu Lys Ala Ala Lys Lys Gly 65 70 75 80 Ser Met Val Tyr Phe Lys Val Gly Asn Glu Thr Arg Lys Tyr Lys Met 85 90 95 Thr Ser Ile Arg Asp Val Lys Pro Thr Asp Val Gly Val Leu Asp Glu 100 105 110 Gln Lys Gly Lys Asp Lys Gln Leu Thr Leu Ile Thr Cys Asp Asp Tyr 115 120 125 Asn Glu Lys Thr Gly Val Trp Glu Lys Arg Lys Ile Phe Val Ala Thr 130 135 140 Glu Val Lys Asp Glu Leu 145 150 <210> 52 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mature soluble sortase with GSKDEL ER retention signal <400> 52 Gln Ala Lys Pro Gln Ile Pro Lys Asp Lys Ser Lys Val Ala Gly Tyr 1 5 10 15 Ile Glu Ile Pro Asp Ala Asp Ile Lys Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro 20 25 30 Ala Thr Pro Glu Gln Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Ala Glu Glu Asn 35 40 45 Glu Ser Leu Asp Asp Gln Asn Ile Ser Ile Ala Gly His Thr Phe Ile 50 55 60 Asp Arg Pro Asn Tyr Gln Phe Thr Asn Leu Lys Ala Ala Lys Lys Gly 65 70 75 80 Ser Met Val Tyr Phe Lys Val Gly Asn Glu Thr Arg Lys Tyr Lys Met 85 90 95 Thr Ser Ile Arg Asp Val Lys Pro Thr Asp Val Gly Val Leu Asp Glu 100 105 110 Gln Lys Gly Lys Asp Lys Gln Leu Thr Leu Ile Thr Cys Asp Asp Tyr 115 120 125 Asn Glu Lys Thr Gly Val Trp Glu Lys Arg Lys Ile Phe Val Ala Thr 130 135 140 Glu Val Lys Gly Ser Lys Asp Glu Leu 145 150

Claims (19)

  1. 하기 단계를 포함하는, 2개 이상의 폴리펩타이드 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 제조 방법:
    - 다음을 포함하는 세포를 배양하는 단계로서,
    a) C-말단 소포체 잔류 신호를 가지는 가용성 스타필로코쿠스 아우레우스 (S. aureus) 소르타아제 A를 암호화하는 핵산,
    b) C-말단에 소르타아제 모티프에 이어서 소포체 잔류 신호를 포함하는 제 1 폴리펩타이드 도메인을 암호화하는 핵산, 및
    c) N-말단에 적어도 디글라이신을 포함하는 제 2 폴리펩타이드 도메인을 암호화하는 핵산,
    여기서, 상기 세포는 상기 제 1 폴리펩타이드 도메인과 상기 제 2 폴리펩타이드 도메인의 소르타아제 A 접합체를 분비하는 것인 단계,
    이에 의해 2개 이상의 폴리펩타이드 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 제조하는 단계.
  2. 하기 단계를 포함하는, 2개 이상의 결합 단위 (binding entiety) 를 포함하는 다중특이적 바인더의 제조 방법:
    - 다음을 포함하는 세포를 배양하는 단계로서,
    a) C-말단 소포체 잔류 신호를 가지는 가용성 스타필로코쿠스 아우레우스 소르타아제 A를 암호화하는 핵산,
    b) C-말단에 소르타아제 모티프에 이어서 소포체 잔류 신호를 포함하는 제 1 결합 단위를 암호화하는 핵산, 및
    c) N-말단에 적어도 디글라이신을 포함하는 제 2 결합 단위를 암호화하는 핵산,
    여기서, 상기 세포는 상기 제 1 결합 단위와 상기 제 2 결합 단위의 소르타아제 A 접합체를 분비하고,
    여기서, 상기 제 1 결합 단위는 제 1 항원 또는 표적에 특이적으로 결합하고, 상기 제 2 결합 단위는 제 2 항원 또는 표적에 특이적으로 결합하는 것인 단계,
    이에 의해 2개 이상의 결합 단위를 포함하는 다중특이적 바인더를 제조하는 단계.
  3. 하기 단계를 포함하는, 2개의 상이한 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 다중특이적 바인더의 선별 방법:
    - 제 1 결합 단위와 제 2 결합 단위의 상이한 조합을 포함하는 다수의 다중특이적 바인더로부터, 2개의 상이한 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 다중특이적 바인더를 선별하는 단계로서,
    여기서, 상기 다수의 다중특이적 바인더의 구성원은 각각 제 2 항에 따른 방법에 의해 수득되는 것인 단계.
  4. 제 3 항에 있어서, 다중특이적 바인더는 이의 결합 특이성 및/또는 선택성 및/또는 친화성 및/또는 효과기 기능 및/또는 생체내 반감기에 근거하여 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단위는 항체 중쇄 가변 도메인과 항체 경쇄 가변 도메인의 동족 쌍인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중특이적 바인더는 2개 또는 4개의 결합 단위를 포함하는 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 제 1 폴리펩타이드 도메인 및 제 2 폴리펩타이드 도메인은 전장 항체, scFv, scFab, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 Fc-영역 단편, 항체 경쇄 가변 도메인과 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍, VH, VL, CH1, CH2, CH3, CH4, CL, 항체 힌지 영역, 사이토카인, 수용체, 수용체 리간드, 검출가능한 라벨, 태그 및 결합 쌍의 파트너로부터 서로 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소포체 잔류 신호는 서열 번호:　02 (KDEL), 서열 번호: 03 (HDEL) 또는 서열 번호: 04 (SFIXXXXMP) 로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소르타아제 모티프는 LPXTG (서열 번호: 01, 여기서, X는 임의의 아미노산 잔기일 수 있다) 인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 결합 도메인 또는 제 1 결합 단위는 20개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 LPXTG (서열 번호: 01, 여기서, X는 임의의 아미노산 잔기일 수 있다) 를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포 또는 효모 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 HEK 세포, CHO 세포 또는 BHK 세포로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 하기 단계를 포함하는, 이중특이적 항체의 선별 방법:
    (i) 세포 함유 샘플에 존재하는 세포 표면 마커를 결정하고, 이로부터 적어도 제 1 표면 마커 및 제 2 표면 마커를 선별하는 단계,
    (ii) (a) 20개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 LPXTG (서열 번호: 01, 여기서, X는 임의의 아미노산 잔기일 수 있다) 에 이어서 소포체 잔류 신호 KDEL (서열 번호: 02) 를 포함하는 항체 Fab 단편 또는 항체 scFab 또는 scFv 항체를 암호화하는 핵산으로서, 여기서, 상기 Fab 단편 또는 scFv 항체는 상기 제 1 표면 마커 또는 이의 리간드에 특이적으로 결합하는 것인 핵산, (b) 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드를 포함하는 1개의 팔을 가진 (one-armed) 항체 단편을 암호화하는 핵산으로서, 여기서, 상기 전장 항체 중쇄 및 전장 항체 경쇄는 서로 상보적인 동족 항체 쇄이고, 이의 가변 도메인 (VH 및 VL) 의 쌍은 상기 제 2 표면 마커 또는 이의 리간드에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, 상기 전장 항체 중쇄 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드는 항체 힌지 영역을 형성하는 1개 이상의 디설파이드 결합을 통해 서로 공유적으로 연결되어 있고, 상기 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드는 이의 N-말단에 올리고글라이신 Gm (m = 2 또는 3 또는 4 또는 5) 아미노산 서열을 가지는 것인 핵산, 및 (c) C-말단 소포체 잔류 신호를 가지는 가용성 스타필로코쿠스 아우레우스 소르타아제 A를 암호화하는 핵산으로 세포를 형질감염시키는 단계, 및
    이에 의해 이중특이적 항체를 제조하는 단계.
  14. 하기 단계를 포함하는, 항원 결합 부위의 조합의 결정 방법:
    (i) (a) 제 1 다수의 항체 Fab 단편 또는 scFv 항체 단편의 각 구성원으로서, 여기서, 상기 각 구성원은 20개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 LPXTG (서열 번호: 01, 여기서, X는 임의의 아미노산 잔기일 수 있다) 에 이어서 소포체 잔류 신호 KDEL (서열 번호: 02) 를 포함하고, 상기 Fab 단편 또는 scFv 항체는 제 1 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 것인 각 구성원을, (b) 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드를 포함하는 다수의 1개의 팔을 가진 항체 단편의 각 구성원으로서, 여기서, 상기 전장 항체 중쇄 및 전장 항체 경쇄는 서로 상보적인 동족 항체 쇄이고, 이의 가변 도메인 (VH 및 VL) 의 쌍은 제 2 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, 상기 전장 항체 중쇄 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드는 항체 힌지 영역을 형성하는 1개 이상의 디설파이드 결합을 통해 서로 공유적으로 연결되어 있고, 상기 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드는 스타필로코쿠스 아우레우스 소르타아제 A-매개된 세포내 효소적 커플링 반응을 통해 이의 N-말단에 올리고글라이신 Gm (m = 2 또는 3 또는 4 또는 5) 아미노산 서열을 가지는 것인 각 구성원과 조합함으로써 제조된 다수의 이중특이적 항체의 결합 특이성 및/또는 선택성 및/또는 친화성 및/또는 효과기 기능 및/또는 생체내 반감기를 결정하는 단계, 및
    (ii) 적절한 결합 특이성 및/또는 선택성 및/또는 친화성 및/또는 효과기 기능 및/또는 생체내 반감기를 가지는 이중특이적 항체를 선택하고, 이에 의해 항원 결합 부위의 조합을 결정하는 단계.
  15. 제 6 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되는 이중특이적 항체.
  16. 중쇄 중 하나에 아미노산 서열 LPXTG (서열 번호: 01, 여기서, X는 임의의 아미노산 잔기일 수 있다) 를 포함하는 이중특이적 항체.
  17. 제 6 항 내지 제 13 항, 또는 제 15 항 또는 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, Fc-영역은 위치 329에서의 자연 발생적 아미노산 잔기의 돌연변이 및 위치 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322 및 331에서의 아미노산 잔기를 포함하는 군으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 잔기의 상이한 잔기로의 1개 이상의 추가의 돌연변이를 포함하고, 여기서, 상기 Fc-영역 내의 잔기는 Kabat의 EU 인덱스에 따라 번호지정되는 것을 특징으로 하는 방법 또는 항체.
  18. 제 15 항 또는 제 16 항 또는 제 17 항에 따른 이중특이적 항체를 포함하는 약제학적 제형.
  19. 약제의 제조에서의 제 15 항 또는 제 16 항 또는 제 17 항에 따른 이중특이적 항체의 용도.
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