JP2018531235A6 - ソルターゼ・コンジュゲート化ループを含む組換え免疫グロブリン重鎖およびそのコンジュゲート - Google Patents

Abstract

本開示は、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、中央ヒンジ領域の最もＣ末端のシステインまでのヒンジ領域、ソルターゼ・コンジュゲート化ループ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む、組換え免疫グロブリン重鎖であって、ソルターゼ・コンジュゲート化ループが、ａ）中央ヒンジ領域の最もＣ末端のシステインおよび免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインのＮ末端のＶＦＸ１ＦＰＰ（配列番号２；式中、Ｘ１はＬまたはＩである）コンセンサス配列の間に位置する、少なくとも１６アミノ酸からなり、ｂ）アミノ酸配列ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１）からなるソルターゼ認識モチーフを含み、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである、ｃ）（ｂ）の配列のＮ末端に少なくとも２つのアミノ酸を含み、ｄ）（ｂ）の配列のＣ末端に少なくとも６つのアミノ酸を含み、そしてｅ）ここで（ｂ）の配列のＣおよびＮ末端のアミノ酸はシステインではない、前記組換え免疫グロブリン重鎖、ならびに酵素ソルターゼに基づく部位特異的コンジュゲート化におけるその使用に関する。

Description

本発明は、ソルターゼ・コンジュゲート化ループを含む組換え免疫グロブリン重鎖、酵素ソルターゼの使用によってこうした組換え免疫グロブリン重鎖をコンジュゲート化し、そして／または標識するための方法、ならびに前記方法を通じて得たコンジュゲート／標識産物に関する。

背景技術
タンパク質の部位特異的修飾は、診断または療法適用のために用いる抗体では特に困難な問題である。経済的であり、そして産業規模で適用可能である、部位特異的ポリペプチド修飾に関する信頼性がある方法が非常に重要である。

タンパク質官能化の初期の方法は、タンパク質と過剰なチオールまたはアミン反応性試薬、例えばマレイミドまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルをそれぞれ反応させることによる、システインまたはリジン残基のいずれかの反応性を利用した。これらは豊富であり、広く分布し、そして適切なカップリング化学反応が適用可能であるため容易に修飾される。

しかし、「リジン標識」戦略は、例えば抗体またはその抗原結合断片を標識するために用いる際、いくつかの欠点を有する：ａ）しばしば、抗原結合活性の有意な減少を生じる（抗原結合部位中またはその近傍のリジン）；ｂ）モノ標識コンジュゲートは、同じ１：１化学量であっても、ポリペプチド内のリジンの異なるものを通じて付着する標識を含む混合物からなる、そしてｃ）望ましい１：１産物の収率は低い。

部位特異的タンパク質標識のための最も重要な最近のアプローチの１つは、酵素反応を通じて、特定の部位でタンパク質に生体直交型官能性を取り込むことである。「タンパク質の酵素標識」に関する最近の概説に関しては、Ｍ． Ｒａｓｈｉｄｉａｎら， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４ （２０１３） １２７７−１２９４を参照されたい。この概説に含まれる部位特異的コンジュゲート化に用いる酵素には、ホルミルグリシン生成酵素、シアリルトランスフェラーゼ、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ翻訳後修飾、ソータギング、トランスグルタミナーゼ、ファルネシルトランスフェラーゼ、ビオチンリガーゼ、リポ酸リガーゼ、およびＮ−ミリストイルトランスフェラーゼが含まれる。

ソルターゼＡ（ＳｒｔＡ）は、タンパク質を細菌細胞壁に共有結合させる、膜結合酵素である。ＳｒｔＡ基質上の特異的ソルターゼ認識モチーフは、ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである）である。ソルターゼ酵素は、残基スレオニン（Ｔ）およびＸ２（ＧまたはＡ）の間を切断する。ソルターゼ求核剤（ソルターゼ基質とも称される）上の連結モチーフ、すなわち細菌細胞壁上の基質に付着するようになるペプチドグリカンのポリペプチド部分は、天然には、ペンタグリシンモチーフである。ペプチドグリカンのＮ末端のトリグリシン、そしてさらにはジグリシンモチーフであっても、ＳｒｔＡ反応を補助するために十分であることが示されてきている（Ｃｌａｎｃｙ， Ｋ．Ｗ．ら， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９４ （２０１０） ３８５−３９６）。反応はチオエステル・アシル酵素中間体を通じて進行し、該中間体は、オリゴグリシン由来のアミン求核剤の攻撃によって分解され、それによって、ペプチドグリカンはタンパク質基質に共有結合し、そしてＳｒｔＡは再生される。

現代の生化学実験室においては、ＳｒｔＡは、例えば組換え的に発現されたタンパク質に、化学的に合成されたペプチドを共有的にコンジュゲート化するために使用可能である。

ＷＯ ２０１０／０８７９９４において、ＳｒｔＡ仲介連結法およびその使用が報告される。ＩｇＧ様二重特異性抗体に関する組換えアプローチは、Ｍａｒｖｉｎ， Ｊ．Ｓ．ら（Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｉｎｉｃａ ２６ （２００５） ６４９−６５８）によって報告される。Ｌｅｖａｒｙ， Ｄ．Ａ．ら（ＰＬｏＳ ｏｎｅ， ６ （２０１１） ｅ１８３４２．１−ｅ１８３４２．６）は、ソルターゼＡによって触媒されるタンパク質−タンパク質融合を示した。ＷＯ ２０１３／００３５５５において、タンパク質連結のためのクリックケミストリーハンドルをインストールするためのソルターゼの使用が報告される。

抗上皮増殖因子受容体抗体を一本鎖形式にする操作、およびソルターゼＡ仲介性タンパク質連結による標識が、Ｍａｄｅｊ， Ｍ．Ｐ．ら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． １０９ （２０１２） １４６１−１４７０）によって報告される。Ｔａ， Ｈ．Ｔ．らは、心臓血管疾患におけるターゲティング分子画像化および細胞ホーミングへの普遍的アプローチとして、酵素性一本鎖抗体タグ化を報告する（Ｃｉｒ． Ｒｅｓ． １０９ （２０１１） ３６５−３７３）。Ｐｏｐｐ， Ｍ．らは、ソルターゼを用いた、ペプチド結合作製および破壊、すなわちタンパク質操作を報告する（Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇ． ５０ （２０１１） ５０２４−５０３２）。

Ｎ末端膜係留モチーフを欠く一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＳｒｔＡ（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＳｒｔＡのアミノ酸残基６０〜２０６）は、タンパク質標識、共有タンパク質固定、およびタンパク質内への新規官能性の取り込みに用いられてきている（Ｔｏｎ−Ｔｈａｔ， Ｈ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６ （１９９９） １２４２４−１２４２９； Ｉｌａｎｇｏｖａｎ， Ｈ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９８ （２００１） ６０５６−６０６１）。

部位特異的標識が非常に望ましいポリペプチドの最も重要なクラスの１つは、免疫グロブリンまたは抗体である。完全抗体（通常、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ）は、大部分の適用で理想的であるが、特定の処置の性能は、抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２を用いることによって増進される。

もっとも興味深い抗体断片は、抗原結合断片である。いくつかのタイプの抗原結合断片が可能であるが、各々は、抗体結合部位を保存するように、ともに保持された（通常、ジスルフィド結合によって）抗原結合に必要な重鎖および軽鎖免疫グロブリン鎖（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）両方の可変領域の少なくともこれらの部分を含有する。

抗体断片化は、通常、例えば免疫グロブリンタンパク質構造の特定の部分を消化するかまたは切断するプロテアーゼを用い、そして必要な場合、Ｆ（ａｂ’）２断片のヒンジ領域中のジスルフィド結合を分割するための還元剤を用いて、達成される。酵素による断片化は、幾分労力を要し、タンパク質の酵素仲介性消化の最適化を必要とし、妥当な程度に効率的にするために十分な抗体供給（例えば１０ｍｇまたはそれより多く）を必要とし、そしてしばしば、さらに洗練された精製工程を伴う。時間が掛かり、そして費用を要する抗体断片化は、通常、関心対象の抗体が大量に入手可能であり、そして特定の用途がそれを要求する場合にのみ行われる。

抗体断片は、例えば、現状技術の方法を用いて、化学的に標識可能であるが、すべての不都合な点、例えば上述の収率および再現性に関するものを伴う。
例えば酵素によって促進される、部位特異的コンジュゲート化は、近年、非常に注目を集めている。

ソルターゼタグ化は、少なくとも理論上、抗体断片を生成し、そして同時に、これらの断片を「タグ化」するように働きうる。理論的には、抗体は、例えば遺伝子操作された組換え抗体のＦｃ領域中に、ソルターゼタグを取り込み、そしてこのソルターゼタグを、切断およびそれと同時のコンジュゲート化に用いることが可能であるはずである。理論的には、そしてソルターゼタグの位置に応じて、こうして、例えばそれぞれＦ（ａｂ）またはＦ（ａｂ’）２断片のコンジュゲートを得ることが可能であるはずである。

しかし、ソルターゼタグ化を、ハイブリドーマによって産生されるマウスモノクローナル抗体におけるように、その他の点では天然である抗体（すなわち認識配列ＬＰＥＴＧのみが挿入されたもの）で試みると、このアプローチはまったく働かないか、または収率が低い／不満足なものであった。

しかし、経済的かつ産業的に適用可能な規模で、切断およびそれと同時の部位特異的ポリペプチド・コンジュゲート化を通じて、それぞれ、Ｆ（ａｂ）またはＦ（ａｂ’）２のようなもっとも適切な抗体断片のソルターゼ仲介性「タグ化」を可能にする、非常に大きな必要性が存在する。

驚くべきことに、本明細書において、以下に開示するような特性を有する組換え抗体重鎖のソルターゼ仲介性切断に際して、（例えば抗体断片標識における）抗体断片のコンジュゲート化に、ソルターゼを使用可能であることが、ここで見出されてきている。

発明の要旨
組換え抗体のソルターゼ仲介性切断および連結は、特殊なソルターゼ・コンジュゲート化ループが中央ヒンジ領域の最もＣ末端のシステインおよび免疫グロブリン重鎖のＣＨ２ドメインの間に組換え的に導入されている場合に可能であることが見出されてきている。

１つの態様において、本発明は、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、中央ヒンジ領域の最もＣ末端のシステインまでのヒンジ領域、ソルターゼ・コンジュゲート化ループ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む、組換え免疫グロブリン重鎖であって、ソルターゼ・コンジュゲート化ループが：ａ）中央ヒンジ領域の最もＣ末端のシステインおよび免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインのＮ末端のＶＦＸ１ＦＰＰ（配列番号２；式中、Ｘ１はＬまたはＩである）コンセンサス配列の間に位置する、少なくとも１６アミノ酸からなり、ｂ）アミノ酸配列ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１）からなるソルターゼ認識モチーフを含み、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである、（ｂ）の配列のＮ末端に少なくとも２つのアミノ酸を含み、（ｂ）の配列のＣ末端に少なくとも６つのアミノ酸を含み、そしてここで（ｂ）の配列のＣおよびＮ末端のアミノ酸はシステインではない、前記組換え免疫グロブリン重鎖を開示する。

さらに開示するのは、本明細書において以下に開示するような、少なくとも２つの組換え免疫グロブリン重鎖を含む抗体である。１つの態様において、これらの抗体は、ＩｇＧクラスのものであり、そして本明細書において以下に開示するような、２つの組換え免疫グロブリン重鎖を有する。

本明細書に報告するような１つの側面は、組換え免疫グロブリン重鎖のソルターゼ切断断片およびソルターゼ求核剤の間のコンジュゲートを産生するための方法であって、ｉ）本発明に開示するような、少なくとも１つ、例えば２つの組換え免疫グロブリン重鎖を含むＩｇＧクラス抗体、ｉｉ）ソルターゼ求核剤を含む化合物、およびｉｉｉ）ソルターゼ活性を持つポリペプチドをインキュベーションし、それによって、ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである）中のスレオニンの後ろで組換え抗体重鎖を切断し、そして前記スレオニンにソルターゼ求核剤のＮ末端をコンジュゲート化する工程を含む、前記方法である。

１つの態様において、本出願は、本明細書に開示するような方法にしたがって産生されるコンジュゲート、例えばＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、中央ヒンジ領域の最後のシステインまでのヒンジ領域、中央ヒンジ領域の最もＣ末端のシステイン、配列ＬＰＸＴ（配列番号０３、式中、Ｘはいずれのアミノ酸残基であってもよい）の間の２またはそれより多いアミノ酸、および少なくとも２つのグリシン残基を含む、組換え免疫グロブリン重鎖断片を含む、コンジュゲートに関する。

ソルターゼ反応スキーム；（Ａ）ＬＰＸＴＧ認識モチーフを含有するポリペプチド；（Ｂ）ソルターゼ求核剤 ソルターゼ仲介性一工程切断およびコンジュゲート化プロトコルのスキーム。示す記号は以下のとおりである：ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３＝ＩｇＧの共通ドメインＧ＝グリコシル化ＳＣＬ＝ソルターゼ・コンジュゲート化ループタグ＝求核剤を含むソルターゼ・タグ ＧＧＧＧ連結モチーフおよびビオチン・タグを含むソルターゼ求核剤の構造。 ソルターゼ仲介性切断の監視；反応開始後、それぞれ１時間、３時間、１０時間および１５時間で採取した切断反応のＧＰＣ監視によって得られる選択したクロマトグラム。（Ａ）ＩｇＧ；（Ｂ）Ｃ末端ビオチン化Ｆ（ａｂ’）２断片；（Ｃ）Ｆｃγ断片。 ソルターゼ仲介性切断の監視；反応開始後、それぞれ１時間、３時間、１０時間および１５時間で採取した切断反応のＧＰＣ監視によって得られる選択したクロマトグラム。（Ａ）ＩｇＧ；（Ｂ）Ｃ末端ビオチン化Ｆ（ａｂ’）２断片；（Ｃ）Ｆｃγ断片。 現状技術のコンジュゲートおよび本開示記載のコンジュゲートの比較評価の結果；ビオチン−ＮＨＳ標識された酵素（パパイン）切断Ｆ（ａｂ’）２断片（Ａ）およびソルターゼ切断／ビオチン・コンジュゲート化Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｂ）のＥＣＬシグナルを示す。 現状技術のコンジュゲートおよび本開示記載のコンジュゲートの比較評価の結果；ビオチン−ＮＨＳ標識されたＩｇＧ（Ａ）およびソルターゼ切断／ビオチン・コンジュゲート化Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｂ）のＥＣＬシグナルを示す。

Ｉ．定義
本明細書および請求項において、免疫グロブリン重鎖Ｆｃ領域中の残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ（本明細書に明白に援用される、Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．ら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， 米国国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ（１９９１）， ＮＩＨ公報９１−３２４２）のＥＵインデックスのものである。

用語「位」は、ポリペプチドのアミノ酸配列中のアミノ酸残基の位置を示す。位は、連続して、または確立された形式、例えば抗体番号付けのためのＫａｂａｔのＥＵインデックスにしたがって、番号付けされてもよい。

用語「全長抗体」は、天然抗体に実質的に同一である構造およびアミノ酸配列を有する抗体を示す。
用語「全長抗体重鎖」は、ＮからＣ末端方向に、抗体可変ドメイン、第一の定常ドメイン（＝ＣＨ１ドメイン）、抗体重鎖ヒンジ領域、第二の定常ドメイン（＝ＣＨ２ドメイン）、および第三の定常ドメイン（＝ＣＨ３ドメイン）を含むポリペプチドを示す。

用語「全長抗体軽鎖」は、ＮからＣ末端方向に、抗体可変ドメインおよび定常ドメインを含むポリペプチドを示す。
用語「ヒンジ領域」は、野生型抗体重鎖において、ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメインを連結する抗体重鎖ポリペプチドの部分を示し、例えばヒトＩｇＧ１に関しては、ＥＵ番号付け系（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌ）にしたがって約２１６位〜約２３８位、またはＫａｂａｔ番号付けの約２２６位〜約２４３位である。Ｋａｂａｔにしたがった２２６位は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域の９９位に対応する。他のＩｇＧサブクラスのヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１サブクラス配列のヒンジ領域システイン残基と整列させることによって決定可能である。

ヒンジ領域は、通常、同一アミノ酸配列を持つ２つのポリペプチドからなる二量体性である。ヒンジ領域は、一般的に、約２５アミノ酸残基を含み、そして柔軟であって、抗原結合領域が独立に動くことが可能である。ヒンジ領域は、３つのドメイン：上部、中央、および下部ヒンジドメインに細分割可能である（例えば、Ｒｏｕｘら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ. １６１（１９９８）４０８３を参照されたい）。

用語、Ｆｃ領域の「上部ヒンジ領域」は、例えばヒトＩｇＧ１に関して、中央ヒンジ領域に対してＮ末端のアミノ酸残基ストレッチ、すなわちＥＵ番号付けにしたがってＦｃ領域の残基２１６〜２２５を示す。

用語「中央ヒンジ領域」は、例えばヒトＩｇＧ１に関して、すなわちＥＵ番号付けにしたがってＦｃ領域の残基２２６〜２３０は、架橋システイン残基を含むアミノ酸残基ストレッチを示し、プロリンおよびシステインが豊富であり、そして上部および下部ヒンジ領域の間に位置する。

用語、Ｆｃ領域の「下部ヒンジ領域」は、例えばヒトＩｇＧ１に関して、中央ヒンジ領域に対してすぐＣ末端側のアミノ酸残基ストレッチ、すなわちＥＵ番号付けにしたがってＦｃ領域の残基２３１〜２３８を示す。

用語「野生型Ｆｃ領域」は、天然に見られる典型的なアロタイプ／イソアロタイプのＦｃ領域のアミノ酸配列に同一であるアミノ酸配列を示す。野生型ヒトＦｃ領域には、天然ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（非ＡおよびＡアロタイプ）、天然ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域、天然ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域、および天然ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域、ならびにその天然存在変異体が含まれる。

用語「改変」は、例えば組換え抗体の、親アミノ酸配列における１またはそれより多いアミノ酸残基の突然変異、付加、または欠失を示す。
用語「アミノ酸突然変異」は、親アミノ酸配列のアミノ酸配列における修飾を示す。例示的な修飾には、アミノ酸置換、挿入、および／または欠失が含まれる。

用語「位でのアミノ酸突然変異」は、明記する残基の置換または欠失、あるいは明記する残基に隣接した少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入を示す。用語「明記する残基に隣接した挿入」は、その１〜２残基以内の挿入を示す。挿入は、明記する残基に対してＮ末端またはＣ末端側であることも可能である。

用語「アミノ酸置換」は、異なる「置換」アミノ酸残基での、あらかじめ決定した親アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を示す。単数または複数の置換残基は、「天然存在アミノ酸残基」（すなわち遺伝暗号にコードされるもの）であってもよく、そして：アラニン（Ａｌａ）；アルギニン（Ａｒｇ）；アスパラギン（Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）；システイン（Ｃｙｓ）；グルタミン（Ｇｌｎ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ）；グリシン（Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉｌｅ）；ロイシン（Ｌｅｕ）；リジン（Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐｒｏ）；セリン（Ｓｅｒ）；スレオニン（Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｔｒｐ）；チロシン（Ｔｙｒ）；およびバリン（Ｖａｌ）からなる群より選択される。１つの態様において、アミノ酸置換は天然存在アミノ酸による置換である。１つの態様において、置換残基はシステインではない。

１またはそれより多い非天然存在アミノ酸残基での置換もまた、本明細書のアミノ酸置換の定義に含まれる。「非天然存在アミノ酸残基」は、ポリペプチド鎖中で、隣接アミノ酸残基（単数または複数）と共有結合可能である、上に列挙する天然存在アミノ酸残基以外の残基を示す。非天然存在アミノ酸残基の例には、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）およびＥｌｌｍａｎら， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍ． ２０２（１９９１）３０１−３３６に記載されるものなどの他のアミノ酸残基類似体が含まれる。こうした非天然存在アミノ酸残基を生成するため、Ｎｏｒｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４（１９８９）１８２）および／またはＥｌｌｍａｎら（上記）の方法を用いてもよい。簡潔には、これらの方法は、サプレッサーｔＲＮＡを非天然存在アミノ酸残基で化学的に活性化し、その後、該ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳を伴う。

用語「アミノ酸挿入」は、あらかじめ決定した親アミノ酸配列内への１またはそれより多いさらなるアミノ酸残基の取り込みを示す。本発明にしたがって「挿入されるアミノ酸配列」は、通常、少なくとも５つのアミノ酸からなるであろう。挿入されるアミノ酸残基（単数または複数）は、上に定義するように、天然存在であってもまたは非天然存在であってもよい。１つの態様において、挿入されるアミノ酸残基は、天然存在アミノ酸残基である。１つの態様において、挿入されるアミノ酸残基は、天然存在アミノ酸残基であるが、システインではない。１つの態様において、挿入されるアミノ酸残基は、天然存在アミノ酸残基であり、そしてシステインでもまたはプロリンでもない。

用語「アミノ酸欠失」は、アミノ酸配列中のあらかじめ決定した位での少なくとも１つのアミノ酸残基の除去を示す。
本出願内で、アミノ酸改変に言及する場合はいつでも、計画的なアミノ酸改変であり、そして無作為なアミノ酸修飾ではない。

ＩＩ．組換え法
ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、中央ヒンジ領域の最もＣ末端のシステインまでのヒンジ領域、ソルターゼ・コンジュゲート化ループ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む、組換え免疫グロブリン重鎖をコードする発現ベクターであって、ソルターゼ・コンジュゲート化ループが：ａ）中央ヒンジ領域の最もＣ末端のシステインおよび免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインのＮ末端のＶＦＸ１ＦＰＰ（配列番号２；式中、Ｘ１はＬまたはＩである）コンセンサス配列の間に位置する、少なくとも１６アミノ酸からなり、ｂ）アミノ酸配列ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１）からなるソルターゼ認識モチーフを含み、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである、ｃ）（ｂ）の配列のＮ末端に少なくとも２つのアミノ酸を含み、ｄ）（ｂ）の配列のＣ末端に少なくとも６つのアミノ酸を含み、そしてｅ）ここで（ｂ）の配列のＣおよびＮ末端のアミノ酸はシステインではない、前記発現ベクターは、現状技術の方法にしたがって製造可能である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー， １９８９を参照されたい）。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を用いて、本明細書に開示するような組換え免疫グロブリン重鎖を産生することが可能であるが、細胞発現系がルーチンに用いられるであろう。ポリペプチドをコードするベクターのクローニングまたは発現／分泌に適した宿主細胞には、本明細書に記載する原核または真核細胞が含まれる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要とされない場合には、細菌中で産生されてもよい（例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）における抗体断片の発現を記載する、ＵＳ ５，６４８，２３７、ＵＳ ５，７８９，１９９およびＵＳ ５，８４０，５２３、Ｃｈａｒｌｔｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８（２００３）２４５−２５４（Ｂ．Ｋ．Ｃ． Ｌｏ（監修）， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ニュージャージー州トトワ）を参照されたい）。発現後、ポリペプチドを可溶性分画中の細菌細胞ペーストから単離してもよいし、または不溶性分画から、いわゆる封入体を単離して、これを可溶化し、そして生体活性型に再フォールディングしてもよい。その後、ポリペプチドをさらに精製してもよい。

原核生物に加えて、真核微生物、例えば糸状菌または酵母は、ポリペプチドをコードするベクターの適切なクローニングまたは発現宿主であり、これには、グリコシル化経路が「ヒト化」され、部分的にまたは完全にヒトグリコシル化パターンを持つポリペプチドの産生を生じる真菌および酵母株が含まれる（例えば、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２２（２００４）１４０９−１４１４、およびＬｉら， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２４（２００６）２１０−２１５を参照されたい）。

グリコシル化ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞と組み合わせて、特にスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションに使用可能である、多くのバキュロウイルス株が同定されてきている。

植物細胞培養物もまた、宿主として利用可能である（例えば、ＵＳ ５，９５９，１７７、ＵＳ ６，０４０，４９８、ＵＳ ６，４２０，５４８、ＵＳ ７，１２５，９７８およびＵＳ ６，４１７，４２９（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ^ＴＭ技術を記載する）を参照されたい）。

脊椎動物細胞もまた、宿主として使用可能である。例えば、懸濁中で増殖するように適応した哺乳動物細胞株が有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＣＯＳ−７細胞株（ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞）；ＨＥＫ２９３細胞株（ヒト胚性腎臓）；ＢＨＫ細胞株（ベビーハムスター腎臓）；ＴＭ４マウス・セルトリ細胞株（例えばＭａｔｈｅｒ， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ２３（１９８０）２４３−２５１に記載されるようなＴＭ４細胞）；ＣＶ１細胞株（サル腎臓細胞）；ＶＥＲＯ−７６細胞株（アフリカミドリザル腎臓細胞）；ＨＥＬＡ細胞株（ヒト子宮頸癌細胞）；ＭＤＣＫ細胞株（イヌ腎臓細胞）；ＢＲＬ−３Ａ細胞株（バッファローラット肝臓細胞）；Ｗ１３８細胞株（ヒト肺細胞）；ＨｅｐＧ２細胞株（ヒト肝臓細胞）；ＭＭＴ ０６０５６２細胞株（マウス乳腺腫瘍細胞）；ＴＲＩ細胞株（例えば、Ｍａｔｈｅｒら， Ａｎａｌ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ３８３（１９８２）４４−６８に記載されるもの）；ＭＲＣ５細胞株；およびＦＳ４細胞株である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＲ陰性ＣＨＯ細胞株（例えばＵｒｌａｕｂら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７（１９８０）４２１６を参照されたい）を含むＣＨＯ細胞株（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、ならびに骨髄腫細胞株、例えばＹ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０細胞株が含まれる。ポリペプチド産生に適した、特定の哺乳動物宿主細胞株の概説に関しては、例えば、ＹａｚａｋｉおよびＷｕ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｉｅｅｒｉｎｇ ２４８（２００４）２５５−２６８（Ｂ．Ｋ．Ｃ． Ｌｏ（監修）， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ニュージャージー州トトワ）を参照されたい。

抗体重鎖および抗体軽鎖の同時発現は、本開示にしたがった１つの態様に相当する。こうした同時発現を用い、重鎖および軽鎖の両方を含む抗体、例えば本発明にしたがった２つの組換え重鎖および２つの軽鎖からなるＩｇＧクラス抗体が得られうる。

ＩＩＩ．本明細書に報告するような組換え抗体重鎖およびその使用
本発明記載の組換え免疫グロブリン重鎖は、ソルターゼ・コンジュゲート化ループの意図的な挿入によって特徴付けられる。

本発明記載のソルターゼ・コンジュゲート化ループは、中央ヒンジ領域の最もＣ末端のシステイン、および免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインのＮ末端のＶＦＸ１ＦＰＰ（配列番号２；式中、Ｘ１はＬまたはＩである）コンセンサス配列の間に位置する，人工的なアミノ酸配列である。本発明記載のソルターゼ・コンジュゲート化ループは、さらに、以下の本質的な特性を有する：ａ）少なくとも１６アミノ酸からなり、ｂ）アミノ酸配列ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１）からなるソルターゼ認識モチーフを含み、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである、ｃ）（ｂ）の配列のＮ末端に少なくとも２つのアミノ酸を含み、ｄ）（ｂ）の配列のＣ末端に少なくとも６つのアミノ酸を含み、そしてｅ）（ｂ）の配列のＣおよびＮ末端のアミノ酸はシステインではない。

表１に示すように、多様な免疫グロブリン重鎖の中央ヒンジ領域は、適切な配列整列を通じて、容易に同定可能である。中央ヒンジ領域の最もＣ末端のシステインを、表１において、太字で示す。表１において、多様な種由来の免疫グロブリン重鎖に関するコンセンサス配列の典型的な配列整列を示す。

表１：多様な免疫グロブリン重鎖の例示的なコンセンサス配列

表１に示す配列部分を、以下の配列同定子の下に示す：それぞれ、Ｈ−ＩｇＧ１（配列番号４）； Ｈ−ＩｇＧ２（配列番号５）； Ｈ−ＩｇＧ４（配列番号６）； Ｍ−ＩｇＧ１（配列番号７）； Ｍ−ＩｇＧ２ａ（ａ）（配列番号８）； Ｍ−ＩｇＧ２ａ（ｂ）（配列番号９）； Ｍ−ＩｇＧ２ｂ（配列番号１０）； Ｍ−ＩｇＧ３（配列番号１１）； Ｒｂ−ＩｇＧ（配列番号１２）；およびＳ−ＩｇＧ（配列番号１３）。

特殊な場合は、Ｈ−ＩｇＧ３であり、上部／中央ヒンジ領域が、同一配列の３つの複製物および１つのさらなる非常に相同な配列を含む。ＣＨ１のＣ末端は；ＴＫＶＤＫＲＶ（配列番号１４）であり；上部および中央ヒンジはＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（ＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＰＣ）３（配列番号１５）であり；そしてＣＨ２ドメインのＮ末端アミノ酸を含む下部ヒンジは、ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦ（配列番号１６）である。

抗体のヒンジ領域は、ＣＨ１ドメイン（Ｇ鎖）の最もＣ末端のβシートの最後のアミノ酸およびＣＨ２ドメイン（Ａ鎖）の最初のβシートの最初のアミノ酸の間の重鎖配列部分に渡る。

上部ヒンジ領域の配列（天然であってもまたは修飾されていても）は、本発明の実施に重要ではない。
中央ヒンジ領域は、２つの免疫グロブリン重鎖の間の分子間システイン架橋の形成に必要なシステイン残基を含む。

１つの態様において、本開示記載の組換え免疫グロブリン重鎖は、配列ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである）のＣ末端に少なくとも７アミノ酸を含むソルターゼ・コンジュゲート化ループを有する。

１つの態様において、本開示記載の組換え免疫グロブリン重鎖は、配列ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである）のＣ末端に少なくとも８アミノ酸を含むソルターゼ・コンジュゲート化ループを有する。

１つの態様において、本開示記載の組換え免疫グロブリン重鎖は、配列ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである）のＣ末端に少なくとも９アミノ酸を含むソルターゼ・コンジュゲート化ループを有する。

１つの態様において、本開示記載の組換え免疫グロブリン重鎖は、配列ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである）のＮ末端に少なくとも３アミノ酸を含むソルターゼ・コンジュゲート化ループを有する。

１つの態様において、本開示記載の組換え免疫グロブリン重鎖は、配列ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである）のＮ末端に少なくとも４アミノ酸を含むソルターゼ・コンジュゲート化ループを有する。

１つの態様において、本開示記載の組換え免疫グロブリン重鎖は、配列ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである）のＮ末端に少なくとも５アミノ酸を含むソルターゼ・コンジュゲート化ループを有する。

１つの態様において、本開示記載の組換え免疫グロブリン重鎖は、配列ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである）のＮ末端に少なくとも６アミノ酸を含むソルターゼ・コンジュゲート化ループを有する。

１つの態様において、本開示記載の組換え免疫グロブリン重鎖は、配列ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである）のＮ末端に少なくとも７アミノ酸を含むソルターゼ・コンジュゲート化ループを有する。

１つの態様において、本開示記載の組換え免疫グロブリン重鎖は、配列ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである）のＮ末端に少なくとも８アミノ酸を含むソルターゼ・コンジュゲート化ループを有する。

１つの態様において、本開示記載の組換え免疫グロブリン重鎖は、配列ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである）のＮ末端に少なくとも５アミノ酸および前記配列のＣ末端に少なくとも９アミノ酸を含むソルターゼ・コンジュゲート化ループを有する。

１つの態様において、本開示記載の組換え免疫グロブリン重鎖は、配列ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである）のＮ末端に少なくとも８アミノ酸および前記配列のＣ末端に少なくとも９アミノ酸を含むソルターゼ・コンジュゲート化ループを有する。

本開示記載の１６アミノ酸の最小長が尊重されている限り、ソルターゼ・コンジュゲート化ループの全長は重要ではないようである。にもかかわらず、１つの態様において、本開示記載の組換え免疫グロブリン重鎖中のソルターゼ・コンジュゲート化ループは、最長５０アミノ酸である。さらなる態様において、本開示記載の組換え免疫グロブリン重鎖中のソルターゼ・コンジュゲート化ループは、最長４５、４０、３５または３０アミノ酸である。

さらなる態様において、ソルターゼ・コンジュゲート化ループの全長は、それぞれ、少なくとも１７、１８、１９、２０、２１または２２アミノ酸である。
免疫グロブリン重鎖は、通常、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。当業者が認識するであろうように、本発明記載の組換え免疫グロブリン重鎖において、ソルターゼ・コンジュゲート化ループに加えて、本明細書において上に定義するようなさらなる改変を含んでもよい。名前が示すように、可変配列は、関心対象のターゲットに対する所望の結合特異性が与えられている限り、いかなる方式で多様であってもよい。１つの態様において、本発明記載のソルターゼ・コンジュゲート化ループを含む組換え抗体重鎖は、対応する天然存在免疫グロブリン重鎖に、少なくとも９０％同一であろう（式中、下部ヒンジ領域およびソルターゼ・コンジュゲート化ループは、それぞれ、同一性のこうした評価においては用いられない）。言い換えると、ＧＣＧ ＰｉｌｅＵｐプログラムを用い、そして可変領域ならびに一方のソルターゼ・コンジュゲート化ループおよび他方の下部ヒンジ領域を除いた、適切な整列後、組換え免疫グロブリン重鎖は、前記免疫グロブリン重鎖に関する（対応する）コンセンサス配列と少なくとも９０％同一である。他の態様において、組換え免疫グロブリン重鎖の同一性は、対応するコンセンサス配列と比較した際、各々、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であろう。１つの態様において、本発明記載の組換え免疫グロブリン重鎖のＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン配列の各々は、対応する天然存在免疫グロブリン重鎖に、少なくとも９０％同一であろう。言い換えると、ＧＣＧ ＰｉｌｅＵｐプログラムを用いた適切な整列後、例えば組換えマウスＩｇＧ１重鎖のこうした改変ＣＨ１ドメインのアミノ酸の少なくとも９０％が、マウスＩｇＧ１重鎖ＣＨ１ドメインのコンセンサス配列の（対応する）アミノ酸に同一である。他の態様において、修飾ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの同一性は、それぞれ、各々、対応するコンセンサス配列に比較した際、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であろう。

上述のように、抗体重鎖および抗体軽鎖の同時発現は、本開示記載の１つの態様に相当する。こうした同時発現を、特に、細胞発現系と関連付けて用いると、重鎖および軽鎖の両方を含む抗体が得られうる。（組換え）免疫グロブリン重鎖およびその対応する軽鎖の同時発現は、所望の抗体の形成ならびに高い産生収量の両方を導く。

ヒト抗体の多様なアイソタイプがあり、例えばアルファ免疫グロブリン（＝ＩｇＡ）、ガンマ免疫グロブリン（＝ＩｇＧ）、デルタ免疫グロブリン（ＩｇＤ）、イプシロン免疫グロブリン（ＩｇＥ）およびミュー免疫グロブリン（ＩｇＭ）と称される。１つの態様において、本開示は、本出願に開示するような少なくとも２つの組換え免疫グロブリン重鎖を含む抗体（これらのアイソタイプまたは他の種由来の対応するアイソタイプ、あるいはその対応するサブクラスのいずれか）に関する。

１つの態様において、本出願に開示するような、２つの組換え免疫グロブリン重鎖を有するＩｇＧクラス抗体を記載し、そして請求する。
名称がすでに示唆するように、本発明記載のソルターゼ・コンジュゲート化ループを含む組換え抗体重鎖を、ソルターゼ連結に基づく方法において使用可能である。

１つの態様において、本開示は、組換え免疫グロブリン重鎖のソルターゼ切断断片およびソルターゼ求核剤のコンジュゲートを産生するための方法であって、ｉ）各々、ソルターゼ・コンジュゲート化ループを含む少なくとも２つの組換え免疫グロブリン重鎖を含む抗体であって、ソルターゼ・コンジュゲート化ループが、ａ）中央ヒンジ領域の最もＣ末端のシステインおよび免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインのＮ末端のＶＦＸ１ＦＰＰ（配列番号２；式中、Ｘ１はＬまたはＩである）コンセンサス配列の間に位置する、少なくとも１６アミノ酸からなり、ｂ）アミノ酸配列ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１）からなるソルターゼ認識モチーフを含み、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである、ｃ）（ｂ）の配列のＮ末端に少なくとも２つのアミノ酸を含み、ｄ）（ｂ）の配列のＣ末端に少なくとも６つのアミノ酸を含み、そしてｅ）ここで（ｂ）の配列のＣおよびＮ末端のアミノ酸はシステインではない、前記抗体、ｉｉ）ソルターゼ求核剤を含む化合物、ならびにｉｉｉ）ソルターゼ活性を持つポリペプチドをインキュベーションし、それによって、ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである）中のスレオニンの後ろで組換え抗体重鎖を切断し、そして前記スレオニンにソルターゼ求核剤のＮ末端をコンジュゲート化する工程を含む、前記方法に関する。

当業者が容易に認識するであろうように、こうしたインキュベーションは、望ましい結果、すなわち所望のコンジュゲートを達成するために適した緩衝液条件を用いて実行されるであろう。こうした適切な条件は、文献から周知であり、そして標準的なソルターゼ連結緩衝液は、例えばＭｇＣｌ_２を含む。

ソルターゼＡ（ＳｒｔＡ）は、タンパク質を細菌細胞壁に共有結合させる、膜結合酵素である。特異的「ソルターゼ認識モチーフ」または「ソルターゼ・モチーフ」は、ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである）である。１つの態様において、ソルターゼ認識モチーフは、ＬＰＸ１ＴＸ２であり、式中、Ｘ２はＧである。１つの態様において、Ｘ１は天然存在アミノ酸である。１つの態様において、Ｘ１はシステイン残基ではない。１つの態様において、Ｘ１は天然存在アミノ酸であり、そしてシステイン残基ではない。

多くのグラム陽性細菌は、ソルターゼを用いて、細胞壁（ペプチドグリカン）に、病原性因子を含む多様な表面タンパク質を共有的に係留する。ソルターゼは、膜会合酵素である。野生型黄色ブドウ球菌ソルターゼＡ（ＳｒｔＡ）は、Ｎ末端膜貫通領域を持つ、２０６アミノ酸のポリペプチドである。第一の段階において、ソルターゼＡは、ソルターゼ認識モチーフ（ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである））を含有する基質タンパク質を認識する。ソルターゼ酵素は、残基スレオニン（Ｔ）およびＸ２（ＧまたはＡ）の間を切断する。Ｔｈｒの後ろのアミド結合の酵素的切断は、活性部位Ｃｙｓによる。このペプチド切断反応は、ソルターゼＡ基質チオエステル中間体を生じる。第二の段階において、チオエステル・アシル酵素中間体が、ソルターゼ連結モチーフを含むソルターゼ基質（ソルターゼ求核剤）中のアミノ基の求核性攻撃によって分解される。天然には、ソルターゼ基質ポリペプチドは、黄色ブドウ球菌中のペプチドグリカンのペンタグリシン単位に対応し、そして求核性攻撃は、共有連結細胞壁タンパク質およびソルターゼＡの再生を導く。オリゴグリシン求核剤の非存在下で、アシル酵素中間体は、水分子によって加水分解されうる。

「ソルターゼ求核剤」は、「ソルターゼ連結モチーフ」または単に「連結モチーフ」および「関心対象のタグ」または単に「タグ」を含む。ソルターゼ求核剤は、N末端にオリゴグリシンを有し、そして連結モチーフとして少なくとも２つのグリシン残基からなる。言い換えると、ソルターゼ連結モチーフは、少なくとも２つの連続グリシン残基からなる。

１つの態様において、式（Ｇｌｙ）ｎ−タグ、式中、ｎは少なくとも２である、を有する、関心対象のタグを含む、ソルターゼ求核剤を用いて、本出願記載の方法を実施する。ソルターゼ連結モチーフ（Ｇｌｙ）_ｎは、より長くてもよく、そして３、４、５、または６グリシン残基からなってもよく、すなわち、（Ｇｌｙ）ｎ−タグ中のｎは３、４、５、または６である。さらなる態様において、式（Ｇｌｙ）ｎ−タグ、式中、ｎはそれぞれ３、４、５、または６である、を有する、関心対象のタグを含むソルターゼ求核剤を用いて、本出願記載の方法を実施する。

天然には、ペプチドグリカン上のソルターゼ連結モチーフは、ペンタグリシン・モチーフである。Ｎ末端のトリグリシン、そしてさらにはジグリシンモチーフでさえ、ＳｒｔＡ反応を支持するには十分であることが示されてきている（Ｃｌａｎｃｙ， Ｋ．Ｗ．ら， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９４（２０１０）３８５−３９６）。反応は、チオエステル・アシル酵素中間体を通じて進行し、該中間体は、オリゴグリシン由来のアミン求核剤の攻撃によって分解され、ペプチドグリカンはタンパク質基質に共有結合し、そしてＳｒｔＡは再生される。ＳｒｔＡは、例えば、化学的に合成されたペプチドまたは連結モチーフを含むペプチド含有基質を、ソルターゼ認識モチーフを含む組換え的に発現されたタンパク質に共有的にコンジュゲートするために使用可能である。

ソルターゼ仲介連結／コンジュゲート化は、多様なタンパク質操作およびバイオコンジュゲート化目的のために適用され始めてきている。この技術は、ＬＰＸ１ＴＸ２タグ化組換えまたは化学合成ポリペプチド内への、天然および合成官能性の導入を可能にする。例には、オリゴグリシン誘導体化ポリマー（例えばＰＥＧ）、フルオロフォア、ビタミン（例えばビオチンおよび葉酸）、脂質、炭水化物、核酸、合成ペプチドおよびタンパク質（例えばＧＦＰ）の共有結合が含まれる（例えば、Ｔｓｕｋｉｊｉ， Ｓ．およびＮａｇａｍｕｎｅ， Ｔ．， ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １０ （２００９） ７８７−７９８； Ｐｏｐｐ， Ｍ．Ｗ．Ｌ．およびＰｌｏｅｇｈ， Ｈ．Ｌ．， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ５０ （２０１１） ５０２４−５０３２を参照されたい）。

１つの態様において、ｉｎ ｖｉｔｒｏの酵素連結に関しては、膜貫通領域を欠く可溶性一部切除ソルターゼＡ（ＳｒｔＡ；黄色ブドウ球菌ＳｒｔＡのアミノ酸残基６０〜２０６）を用いる（配列番号１７；Ｔｏｎ−Ｔｈａｔ， Ｈ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６ （１９９９） １２４２４−１２４２９； Ｉｌａｎｇｏｖａｎ， Ｈ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９８ （２００１） ６０５６−６０６１もまた参照されたい）。

ソルターゼ求核剤に含まれる「関心対象のタグ」または単に「タグ」は、結合対、官能基、療法剤（薬剤）、細胞傷害剤（例えばドキソルビシンまたは百日咳毒素などの毒素）および標識（例えばフルオロフォア、例えばフルオレセインまたはローダミンのような蛍光色素、化学発光または電気化学発光標識、放射性標識、画像化または放射療法目的のための金属キレート複合体、酵素あるいはＧＦＰのような蛍光タンパク質）のパートナーであってもよい。

１つの態様において、タグは、結合対のパートナーである。本明細書で用いるような結合対は、互いに高いアフィニティ、すなわち１ナノモル・アフィニティまたはそれより優れたアフィニティで結合する、２つのパートナーからなる。結合対に関する態様は、例えば、受容体およびリガンド、ハプテンおよび抗ハプテン抗体からなる結合対、ならびに天然存在高アフィニティ結合対に基づく結合対である。

受容体−リガンド結合対の１つの例は、ステロイドホルモン受容体および対応するステロイドホルモンからなる対である。
本発明記載の方法に適した結合対の１つのタイプは、ハプテンおよび抗ハプテン抗体結合対である。ハプテンは、１００〜２０００ダルトン、好ましくは１５０〜１０００ダルトンの分子量を持つ有機分子である。こうした小分子は、キャリアー分子とカップリングすることによって免疫原性にすることが可能であり、そして抗ハプテン抗体は、標準法にしたがって生成可能である。ハプテンは、ステロール、胆汁酸、性ホルモン、コルチコイド、カルデノリド、カルデノリド−グリコシド、ブファジエノリド、ステロイド−サポゲニンおよびステロイドアルカロイド、カルデノリドおよびカルデノリド−グリコシドを含む群より選択可能である。これらの物質クラスの代表は、ジゴキシゲニン、ジギトキシゲニン、ギトキシゲニン、ストロファンチジン、ジゴキシン、ジギトキシン、ジトキシン、ストロファンチンである。別の適切なハプテンは、例えばフルオレセインである。

天然存在高アフィニティ結合対に基づく結合対の例は、ビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン、およびアビジンまたはストレプトアビジン、ならびにＦｉｍＧおよびＤｓＦ結合対である。ビオチン−（ストレプト）アビジン結合対は、当該技術分野に周知である。ＦｉｍＧ−ＤｓＦ結合対の基本的原理は、例えば、ＷＯ２０１２／０２８６９７に記載される。

１つの態様において、結合対は、ハプテンおよび抗ハプテン抗体、ビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＦｉｍＧおよびＤｓＦ、ならびに受容体およびリガンドより選択される。

１つの態様において、結合対は、ハプテンおよび抗ハプテン抗体およびビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン／アビジンまたはストレプトアビジン、ＦｉｍＧおよびＤｓＦより選択される。

１つの態様において、結合対はビオチン（またはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン）およびアビジンまたはストレプトアビジンである。

１つの態様において、結合対は、ビオチンおよびストレプトアビジンからなる。
１つの態様において、タグは、アルデヒド、カルボン酸、カルボン酸エステル、エポキシド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、アミノ基、ハロゲン、ヒドラジン、ヒドロキシル、スルフィドリル、マレイミド、アルキニル、アジド、イソシアネート、イソチオシアネートおよびホスホロアミダイト、トランス−シクロオクテン、テトラジンからなる群より選択される官能基である。

１つの態様において、タグは、カルボン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、アミノ基、ハロゲン、スルフィドリル、マレイミド、アルキニル、アジド、イソシアネート、イソチオシアネートおよびホスホロアミダイトからなる群より選択される官能基である。

タグは、療法剤（薬剤）であってもよく、そして例えば抗体またはその抗原結合断片であってもよい。細胞表面分子に対して向けられる多くの療法抗体およびそのリガンドが知られており、例えば、リツキサン／マブテラ／リツキシマブ、２Ｈ７／オクレリズマブ、ゼバリン／イブリズモマブ、アルゼラ／オファツムマブ（ＣＤ２０）、ＨＬＬ２／エプラツズマブ、イノツゾマブ（ＣＤ２２）、ゼナパックス／ダクリズマブ、シムレクト／バシリキシマブ（ＣＤ２５）、ハーセプチン／トラスツズマブ、ペルツズマブ（Ｈｅｒ２／ＥＲＢＢ２）、マイロターグ／ゲムツズマブ（ＣＤ３３）、ラプティバ／エファリズマブ（Ｃｄ１１ａ）、エルビタックス／セツキシマブ（ＥＧＦＲ、上皮増殖因子受容体）、ＩＭＣ−１１２１Ｂ（ＶＥＧＦ受容体２）、タイサブリ／ナタリズマブ（α４β１およびα４β７インテグリンのα４サブユニット）、レオプロ／アブシキシマブ（ｇｐＩＩｂ−ｇｐＩＩａおよびαｖβ３インテグリン）、オルトクローンＯＫＴ３／ムロモナブ−ＣＤ３（ＣＤ３）、ベンリスタ／ベリムマブ（ＢＡＦＦ）、Ｔｏｌｅｒｘ／オテリキシマブ（ＣＤ３）、ソリリス／エクリズマブ（ＣＤ５補体タンパク質）、アクテムラ／トシリズマブ（ＩＬ−６Ｒ）、パノレックス／エドレコロマブ（ＥｐＣＡＭ、上皮細胞接着分子）、ＣＥＡ−ＣＡＭ５／ラベツズマブ（ＣＤ６６／ＣＥＡ、癌胎児性抗原）、ＣＴ−１１（ＰＤ−１、プログラム死−１ Ｔ細胞阻害性受容体、ＣＤ−ｄ２７９）、Ｈ２２４Ｇ１１（ｃ−Ｍｅｔ受容体）、ＳＡＲ３４１９（ＣＤ１９）、ＩＭＣ−Ａ１２／シズツムマブ（ＩＧＦ−１Ｒ、インスリン様増殖因子１受容体）、ＭＥＤＩ−５７５（ＰＤＧＦ−Ｒ、血小板由来増殖因子受容体）、ＣＰ−６７５、２０６／トレメリムマブ（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４）、ＲＯ５３２３４４１（胎盤増殖因子またはＰＧＦ）、ＨＧＳ１０１２／マパツムマブ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）、ＳＧＮ−７０（ＣＤ７０）、ベドチン（ＳＧＮ−３５）／ブレンツキシマブ（ＣＤ３０）、およびＡＲＨ４６０−１６−２（ＣＤ４４）がある。

タグはまた：（ｉ）微小管阻害剤、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、またはＤＮＡ挿入剤として機能しうる化学療法剤；（ｉｉ）酵素的に機能しうるタンパク質毒素；および（ｉｉｉ）療法性放射性同位体より選択される細胞傷害剤であってもよい。

例示的な化学療法剤には、限定されるわけではないが、メイタンシノイド、オーリスタチン、ドラスタチン、トリコテセン、ＣＣ１０６５、カリケアマイシンおよび他のエンジイン抗生物質、タキサン、アントラサイクリン、および立体異性体、アイソスター、その類似体または誘導体が含まれる。

タンパク質毒素には、ジフテリア−Ａ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖（Ｖｉｔｅｔｔａら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３８：１０９８）、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンシンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−５）、ニガウリ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセン（ＷＯ ９３／２１２３２）が含まれる。

療法性放射性同位体には、３２Ｐ、３３Ｐ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、１５３Ｓｍ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、２１２Ｂ、２１２Ｐｂ、およびＬｕの放射性同位体が含まれる。

放射性同位体は、既知の方法（Ｆｒａｋｅｒら（１９７８） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ８０： ４９−５７；「免疫シンチグラフィにおけるモノクローナル抗体」 Ｃｈａｔａｌ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９）で取り込むことも可能である。炭素１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、複合体に放射性核種をコンジュゲート化するための例示的なキレート剤である（ＷＯ ９４／１１０２６）。

１つの態様において、タグは標識である。ソルターゼ連結モチーフアミノ酸配列に共有結合可能ないずれの標識部分が使用可能である（例えば、Ｓｉｎｇｈら（２００２） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０４：１４７−１５； Ｈａｒｌｏｗ Ｅ．およびＬａｎｅ， Ｄ．（１９９９） Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー； Ｌｕｎｄｂｌａｄ Ｒ． Ｌ．（１９９１） Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ， 第２版 ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， フロリダ州ボカラトンを参照されたい）。標識は：（ｉ）検出可能シグナルを提供するか；（ｉｉ）第二の標識と相互作用して、例えばＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を生じる第一または第二の標識によって提供される検出可能シグナルを修飾するか；（ｉｉｉ）電荷、疎水性、形状、または他の物理的パラメータによって、移動度、例えば電気泳動移動度または細胞浸透性に影響を及ぼすか、あるいは（ｉｖ）捕捉部分を提供して、例えばイオン性複合体化を調節するように機能しうる。

多くの標識が利用可能であり、これらは一般的に、以下のカテゴリーに分類可能である：
（ａ）蛍光色素、化学発光色素（Ｂｒｉｇｇｓら 「官能化蛍光色素の合成、ならびにアミンまたはアミノ酸へのそのカップリング」 Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， Ｐｅｒｋｉｎ−Ｔｒａｎｓ． １ （１９９７） １０５１−１０５８）および電気化学発光標識は、検出可能シグナルを提供し、そして一般的に標識のために適用可能である。

蛍光標識またはフルオロフォアには、希土類キレート（ユーロピウムキレート）、ＦＩＴＣ、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセインを含むフルオレセイン型標識；ＴＡＭＲＡを含むローダミン型標識；ダンシル；リサミン；シアニン；フィコエリトリン；テキサスレッド；およびその類似体が含まれる。例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、上記に開示される技術を用いて、蛍光標識をソルターゼ連結モチーフにコンジュゲート化してもよい。蛍光色素および蛍光標識試薬には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、米国オレゴン州）およびＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．（イリノイ州ロックフォード）より商業的に入手可能なものが含まれる。

化学発光標識の異なるクラスには、ルミノール、アクリジニウム化合物、セレンテラジンおよび類似体、ジオキセタン、過酸化シュウ酸およびその誘導体に基づく系が含まれる。免疫診断法には、主にアクリジニウムに基づく標識が用いられる（詳細な概説は、Ｄｏｄｅｉｇｎｅ Ｃ．ら， Ｔａｌａｎｔａ ５１（２０００）４１５−４３９に提供される）。

電気化学発光標識として主に適しているタグは、それぞれ、ルテニウムおよびイリジウムに基づく電気化学発光複合体である。電気化学発光（ＥＣＬ）は、高感度で、そして選択的な方法として、分析適用において非常に有用であることが立証された。これは、化学発光分析の分析上の利点（バックグラウンド光学シグナルが存在しない）と、電極電位を適用することによる反応調節の容易さを組み合わせている。一般的に、ルテニウム複合体、特に液相または液体−固体界面で、ＴＰＡ（トリプロピルアミン）で再生する［Ｒｕ（Ｂｐｙ）３］２＋（〜６２０ｎｍで光子を放出する）が、ＥＣＬ標識として用いられる。近年、イリジウムに基づくＥＣＬ標識もまた記載されてきている（ＷＯ２０１２１０７４１９（Ａ１））。

（ｂ）放射性標識は、放射性同位体（放射性核種）、例えば３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６８Ｇｎ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９９ＴＣ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、または１３１Ｂｉを利用する。

（ｃ）画像化および療法目的のための標識として適した金属キレート複合体は、当該技術分野に周知である。（ＵＳ ２０１０／０１１１８５６； ＵＳ ５，３４２，６０６； ＵＳ ５，４２８，１５５； ＵＳ ５，３１６，７５７； ＵＳ ５，４８０，９９０； ＵＳ ５，４６２，７２５； ＵＳ ５，４２８，１３９； ＵＳ ５，３８５，８９３； ＵＳ ５，７３９，２９４； ＵＳ ５，７５０，６６０； ＵＳ ５，８３４，４５６； Ｈｎａｔｏｗｉｃｈら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５ （１９８３） １４７−１５７； Ｍｅａｒｅｓら， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １４２ （１９８４） ６８−７８； Ｍｉｒｚａｄｅｈら， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １ （１９９０） ５９−６５； Ｍｅａｒｅｓら， Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ （１９９０）， Ｓｕｐｐｌ． １０：２１−２６； Ｉｚａｒｄら， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ３ （１９９２） ３４６−３５０； Ｎｉｋｕｌａら， Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ２２ （１９９５） ３８７−９０； Ｃａｍｅｒａら， Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ２０ （１９９３） ９５５−６２； Ｋｕｋｉｓら， Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ３９ （１９９８） ２１０５−２１１０； Ｖｅｒｅｌら， Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ４４ （２００３） １６６３−１６７０； Ｃａｍｅｒａら， Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ２１ （１９９４） ６４０−６４６； Ｒｕｅｇｇら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５０ （１９９０） ４２２１−４２２６； Ｖｅｒｅｌら， Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ４４ （２００３） １６６３−１６７０； Ｌｅｅら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６１ （２００１） ４４７４−４４８２； Ｍｉｔｃｈｅｌｌら， Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ４４ （２００３） １１０５−１１１２； Ｋｏｂａｙａｓｈｉら Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １０ （１９９９） １０３−１１１； Ｍｉｅｄｅｒｅｒら， Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ４５ （２００４） １２９−１３７； ＤｅＮａｒｄｏら， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４ （１９９８） ２４８３−９０； Ｂｌｅｎｄら， Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ １８ （２００３） ３５５−３６３； Ｎｉｋｕｌａら Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ４０ （１９９９） １６６−７６； Ｋｏｂａｙａｓｈｉら， Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ３９ （１９９８） ８２９−３６； Ｍａｒｄｉｒｏｓｓｉａｎら， Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ２０ （１９９３） ６５−７４； Ｒｏｓｅｌｌｉら， Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， １４ （１９９９） ２０９−２０）。

（ｄ）酵素もまた、ソルターゼ求核剤中のタグ／標識として使用可能である。多様な酵素−基質標識系が利用可能である。酵素は、一般的に、多様な技術を用いて測定可能である色素原基質の化学改変を触媒する。例えば、酵素は基質中の色変化を触媒可能であり、こうした変化は分光光度的に測定可能である。あるいは、酵素は、基質の蛍光または化学発光を改変可能である。化学発光基質は、化学反応によって電気的に励起され、そして次いで、測定可能な（例えば化学発光系を用いる）光を放出することも可能であるし、またはエネルギーを蛍光受容体に供与する。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ（例えばホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；ＵＳ ４，７３７，４５６）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、例えばセイヨウワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（例えばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ等が含まれる。

酵素基質の組み合わせの例（ＵＳ ４，２７５，１４９； ＵＳ ４，３１８，９８０もまた参照されたい）には、例えば、以下が含まれる：
（ｉ）セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と、基質としての過酸化水素、ここで、過酸化水素は、色素前駆体（例えばオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する；
（ｉｉ）アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と、色素原基質としてのパラ−ニトロフェニルリン酸；および
（ｉｉｉ）β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）と、色素原基質（例えばｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）または蛍光原基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ。

１つの態様において、本発明は、本明細書開示の方法いずれかにしたがって産生されるコンジュゲートに関する。
１つの態様において、本明細書に記載するような方法にしたがって産生されるコンジュゲートは、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、中央ヒンジ領域の最後のシステインまでのヒンジ領域、中央ヒンジ領域の最もＣ末端のシステイン、配列ＬＰＸＴ（配列番号０３、式中、Ｘはいずれのアミノ酸残基であってもよい）の間の２またはそれより多いアミノ酸および少なくとも２つのグリシン残基を含む、組換え免疫グロブリン重鎖断片を含むであろう。

本明細書において、上記に言及するように、完全抗体、すなわち本明細書に開示するような組換え免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の両方を有する抗体を産生することが好適である。こうした抗体が、本開示にしたがった方法において（「ソータギング」において）用いられた場合、Ｆ（ａｂ’）２様断片が得られる。これらのＦ（ａｂ’）２様断片は、標準法を通じて得られるＦ（ａｂ’）２断片とよく似ている。本明細書に開示するような組換え重鎖を含む同じ抗体を、標準的方法またはソータギング法において、用いる場合、配列は最後のシステインまでは同一であろうが、中央ヒンジ領域の最後のシステインのＣ末端側のアミノ酸に関しては有意に異なり、すなわち一方の方法は、標準的なＦ（ａｂ’）２断片を生じ、もう一方（ソータギング）は、非常に類似であるが、同一でない、Ｆ（ａｂ’）２様断片を生じる。ソータギング後、これらのＦ（ａｂ’）２様断片は、明らかに、少なくとも最小必須ソルターゼ連結モチーフ、すなわち２つのグリシン残基もまた含有するであろう。

１つの態様において、本明細書に開示するようなコンジュゲートは、システイン結合を通じて互いに結合した、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、中央ヒンジ領域の最後のシステインまでのヒンジ領域、中央ヒンジ領域の最もＣ末端のシステイン、配列ＬＰＸＴ（配列番号０３、式中、Ｘはいずれのアミノ酸残基であってもよい）の間の２またはそれより多いアミノ酸および少なくとも２つのグリシン残基を含む、２つの組換え免疫グロブリン重鎖断片を含む。

１つの態様において、本明細書に開示するようなコンジュゲートは、システイン結合を通じて互いに結合した、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、中央ヒンジ領域の最後のシステインまでのヒンジ領域、中央ヒンジ領域の最もＣ末端のシステイン、配列ＬＰＸＴ（配列番号０３、式中、Ｘはいずれのアミノ酸残基であってもよい）の間の２またはそれより多いアミノ酸および少なくとも２つのグリシン残基を含む、２つの組換え免疫グロブリン重鎖断片；ならびに２つの免疫グロブリン軽鎖を含むであろう。

本明細書に報告するような標識を含むコンジュゲートは、例えば全血、血漿または血清試料中の関心対象の抗原を検出するための診断アッセイにおいて、有用でありうる。本明細書に報告するような標識コンジュゲートは、いずれの既知のアッセイ法、例えばＥＬＩＳＡ、競合結合アッセイ、直接および間接的サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイで使用可能である（Ｚｏｌａ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （１９８７） ｐｐ． １４７−１５８， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）。

あるいは、本明細書に報告するような標識コンジュゲートは、例えば以下のような生物医学的および分子画像化の多様な方法および技術によって、画像化バイオマーカーおよびプローブとしてもまた有用であろう：（ｉ）ＭＲＩ（磁気共鳴画像化）；（ｉｉ）マイクロＣＴ（コンピュータ断層撮影）；（ｉｉｉ）ＳＰＥＣＴ（単一光子放射断層撮影）；（ｉｖ）ＰＥＴ（ポジトロン断層撮影） Ｔｉｎｉａｎｏｗ， Ｊ．ら， Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ３７（３） （２０１０） ２８９−２９７； Ｃｈｅｎら， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １５ （２００４） ４１−４９； ＵＳ ２０１０／０１１１８５６ （ｖ）生物発光；（ｖｉ）蛍光；および（ｖｉｉ）超音波。免疫シンチグラフィは、放射性物質で標識したコンジュゲートを動物またはヒト患者に投与し、そしてコンジュゲートが局在する体の部位の写真を撮影する、画像化法である（ＵＳ ６，５２８，６２４）。画像化バイオマーカーは、正常生物学的プロセス、病的プロセス、または療法介入に対する薬理学的反応の指標として、客観的に測定および評価可能である。

１つの態様において、ソルターゼ求核剤は、ソルターゼ連結モチーフおよびタグからなる。さらなる態様において、ソルターゼ求核剤は、ソルターゼ連結モチーフ、リンカーおよびタグからなる。用語「リンカー」は、本明細書において、第一の部分と第二の部分をコンジュゲート化する（連結する）ために用いられていることも可能な、二官能性または多官能性部分を示す。リンカーを含むソルターゼ求核剤は、２つの反応性官能基を有するリンカーを用いて、好適に調製可能である。

リンカーは、ソルターゼ連結モチーフをタグに連結するアミノ酸残基を含んでもよい。アミノ酸残基は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチドまたはドデカペプチド単位を形成してもよい。アミノ酸残基には、天然存在のもの、ならびに非天然存在アミノ酸類似体、例えばシトルリンまたはβ−アミノ酸、例えばβ−アラニン、またはω−アミノ酸、例えば４−アミノ酪酸が含まれる。

典型的には、ペプチド型リンカーは、２またはそれより多いアミノ酸および／またはペプチド断片間にペプチド結合を形成することによって調製可能である。こうしたペプチド結合は、例えば、ペプチド化学分野に周知である、液相合成法（Ｅ． ＳｃｈｒｏｄｅｒおよびＫ． Ｌｕｂｋｅ ”Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”， 第１巻（１９６５） ７６−１３６， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）にしたがって調製可能である。

別の態様において、リンカーは、可溶性または反応性を調節する基を含むか、こうした基からなるか、またはこうした基で置換されていてもよい。例えば、リンカー中の荷電置換基、例えばスルホネート（ＳＯ_３ ⁻）またはアンモニウムは、ソルターゼ求核剤の水溶性を増加させうる。ＰＥＧ等のポリマーからなるリンカーもまた、有益な効果を示す可能性があり、例えば非特異的結合の減少を導きうる。

以下の実施例に示すように、本発明記載の方法で産生されるＦ（ａｂ’）２様コンジュゲートは、現状技術の方法によって得られるＦ（ａｂ’）２コンジュゲートに比較した際、有意な利点を示す。

以下の実施例、図および配列は、本発明の理解を補助するために提供され、本発明の真の範囲は付随する請求項に示される。示す方法において、本発明の精神から逸脱することなく修飾を行うことが可能であることが理解される。

前述の発明は、理解を明確にする目的のため、例示および例によって、ある程度詳細に記載されているが、説明および例は、本発明の範囲を限定するとみなされてはならない。

組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー， １９８９に記載されるような標準法を用いて、ＤＮＡを操作した。製造者の指示にしたがって、分子生物学試薬を用いた。

遺伝子およびオリゴヌクレオチド合成
Ｇｅｎｅａｒｔ ＧｍｂＨ（ドイツ、レーゲンスブルグ）で、化学合成によって、所望の遺伝子セグメントを調製した。合成した遺伝子断片を、増幅／拡大のため、大腸菌プラスミド内にクローニングした。サブクローニングした遺伝子断片のＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定によって検証した。あるいは、化学的に合成したオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって、またはＰＣＲを通じて、短い合成ＤＮＡ断片を組み立てた。ｍｅｔａｂｉｏｎ ＧｍｂＨ（ドイツ、プラネック−マルティンスリート）によって、それぞれのオリゴヌクレオチドを調製した。

基本的／標準哺乳動物発現プラスミドの説明
所望の遺伝子／タンパク質（例えば全長抗体重鎖、全長抗体軽鎖、またはＮ末端にオリゴグリシンを含有するＦｃ鎖）の発現のため、以下の機能要素を含む転写単位を用いる：
−イントロンＡを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の極初期エンハンサーおよびプロモーター（Ｐ−ＣＭＶ）、
−ヒト重鎖免疫グロブリン５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
−ネズミ免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−発現しようとする遺伝子／タンパク質（例えば全長抗体重鎖）、および
−ウシ成長ホルモン・ポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）。

発現しようとする所望の遺伝子を含む発現単位／カセットに加えて、基本的／標準的哺乳動物発現プラスミドは、以下を含有する
−大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８由来の複製起点、および
−大腸菌においてアンピシリン耐性を与える、ベータ−ラクタマーゼ遺伝子。

タンパク質決定
ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて計算したモル消光係数を用いて、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を決定することによって、精製ポリペプチドのタンパク質濃度を決定した。

実施例１
可溶性黄色ブドウ球菌ソルターゼＡの発現プラスミドの生成
ソルターゼ遺伝子は、Ｎ末端一部切除黄色ブドウ球菌ソルターゼＡ（６０〜２０６）分子（配列番号１７のアミノ酸配列）をコードする。

ＨＥＫ２９３細胞における可溶性ソルターゼの一過性発現のための発現プラスミドは、可溶性ソルターゼ発現カセットに加えて、大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８由来の複製起点、および大腸菌においてアンピシリン耐性を与えるベータ−ラクタマーゼ遺伝子を含んだ。

可溶性ソルターゼの転写単位は、以下の機能性要素を含んだ：
−イントロンＡを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の極初期エンハンサーおよびプロモーター（Ｐ−ＣＭＶ）、
−ヒト重鎖免疫グロブリン５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
−ネズミ免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−精製タグをコードする核酸、
−Ｎ末端一部切除黄色ブドウ球菌ソルターゼＡをコードする核酸、および
−ウシ成長ホルモン・ポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）。

成熟可溶性ソルターゼのアミノ酸配列は、

である。
精製タグは、アミノ酸配列ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳ（配列番号１８）を有する。

実施例２
ソルターゼ・コンジュゲート化ループを含む組換え免疫グロブリン重鎖の一過性発現および分析特徴付け
Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で培養したＨＥＫ２９３細胞（ヒト胚性腎臓細胞株２９３由来）の一過性トランスフェクションによって、組換え体産生を行った。トランスフェクションには、「２９３−フェクチン」トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。製造者の指示に明記されるように、トランスフェクションを行った。トランスフェクションの３〜７日後、細胞培養上清を採取した。低温（例えば−８０℃）で、上清を保存した。

例えばＨＥＫ２９３細胞におけるヒト免疫グロブリンの組換え体発現に関する一般的な情報は：Ｍｅｉｓｓｎｅｒ， Ｐ．ら， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ７５ （２００１） １９７−２０３に提供される。

ソルターゼ・コンジュゲート化ループを含むＭ−ＩｇＧ１サブクラスの組換え免疫グロブリン重鎖は、わずかに塩基性条件（例えばｐＨ８．０）のプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィベッド材料（例えばＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で捕捉することによって精製されている。ＩｇＧは、クエン酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ４．０）を用いて、ベッド材料から溶出され、そして最終的に、適切なクロマトグラフィ条件（例えば１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）の下で、ＧＰＣカラム（例えばＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上の精錬（ｐｏｌｉｓｈ）工程で精製されている。

アミノ酸配列に基づいて計算したモル消光係数を用いて、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することによって、精製ポリペプチドのタンパク質濃度を決定した。ＧＰＣクロマトグラフィ、ならびに還元剤（５ｍＭ １，４−ジチオスレイトール）の存在下および非存在下のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブリリアントブルーでの染色によって、純度を分析した。

組換え免疫グロブリンの軽鎖および重鎖の両方の理論的および実験的に決定された分子量の比較に関して、ＥＳＩ ＴＯＦ ＭＳによって、ソルターゼ・コンジュゲート化ループを含む発現された組換え免疫グロブリン重鎖の同一性を確認した。

実施例３
組換え免疫グロブリンのためのベクターの合成および産生
Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー， １９８９に記載されるように、標準法を用いて、ＤＮＡを操作した。製造者の指示にしたがって、分子生物学試薬を用いた。

詳細には、ソルターゼ・コンジュゲート化ループをコードする配列を含む組換え免疫グロブリンの軽鎖および重鎖の両方の所望の遺伝子セグメントを、慣用的ＰＣＲに基づくクローニング技術によって生成した。したがって、所望の抗体の軽鎖および重鎖をコードする遺伝子のｃＤＮＡを、分子クローニング用の制限部位を含有する遺伝子特異的オリゴヌクレオチド／プライマーで増幅した。遺伝子特異的プライマーと組み合わせて、プライマーを含有するソルターゼ・コンジュゲート化ループを用いた２工程ＰＣＲ戦略で、ソルターゼ・コンジュゲート化ループをコードする配列を導入した。ｍｅｔａｂｉｏｎ ＧｍｂＨ（ドイツ、プラネック−マルティンスリート）またはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒによって、それぞれのオリゴヌクレオチドを調製した。

あるいは、ソルターゼ・コンジュゲート化ループをコードする配列を含む組換え免疫グロブリンの軽鎖および重鎖の両方の所望の遺伝子セグメントのいずれかを、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒでの化学合成によって、調製した。

合成した遺伝子断片を、大腸菌における拡大／増幅、およびＨＥＫ２９３細胞における一過性発現のため、大腸菌シャトルベクター内にクローニングした。サブクローニングした遺伝子断片のＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定によって検証した。

所望の遺伝子／タンパク質（例えばソルターゼ・コンジュゲート化ループを含む全長抗体重鎖、全長抗体軽鎖）の発現のため、以下の機能要素を含む転写単位を用いる：
−ヒトサイトメガロウイルス由来の極初期エンハンサーおよびプロモーター（Ｐ−ＣＭＶ）
−イントロンを含む免疫グロブリン重鎖シグナル配列
−発現しようとする遺伝子／タンパク質（ソルターゼ・コンジュゲート化ループを含むもの、全長抗体重鎖）、および
−ウシ成長ホルモン・ポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）。

発現しようとする所望の遺伝子を含む発現ユニット／カセットに加えて、基本的／標準的哺乳動物発現プラスミドは
−大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８由来の複製起点、および
−大腸菌においてアンピシリン耐性を与えるベータ−ラクタマーゼ遺伝子
を含有する。

実施例４
グルコースデヒドロゲナーゼおよびビオチン化オリゴグリシンのソルターゼ仲介性融合
以下に概略するような方法で、レポーター酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼを、ソルターゼアミノ酸モチーフ（ＬＰＥＴＧまたはＬＰＥＴＡ）に融合させ、そしてこれを第一の基質として用いることによって、ソルターゼ仲介性酵素コンジュゲート化／カップリング反応の活性を測光的に決定可能である。第二の基質としてビオチン化オリゴグリシンまたはオリゴアラニンを用いる（求核剤）。第一および第二の基質を含有する溶液にソルターゼを添加した際、ビオチン化レポーター酵素である、第一および第二の基質のソルターゼ仲介性コンジュゲート化によって、コンジュゲートが形成される。ストレプトアビジン・コーティング磁気ビーズを用いて、ビオチン化レポーター酵素を回収してもよい。レポーター酵素のための基質を添加する場合、光学密度の変化によって、産物を検出可能である。

２００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．５中、精製ソルターゼを、その基質、すなわちＬＰＥＴＧまたはＬＰＥＴＡモチーフを含有するグルコース・デヒドロゲナーゼ（２０μＭ）およびＮ末端グリシンまたはアラニンを含有するビオチン誘導体（３３０μＭ）と混合した。反応混合物を３７℃で２時間インキュベーションした。１０〜２０倍過剰の阻害緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭヨードアセトアミド）を添加することによって、反応を停止した。停止した反応混合物を５０００ｘｇで１０分間遠心分離した。上清（５０μＬ）を、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）１００μＬに添加し、そしてストレプトアビジン・コーティング磁気ビーズを添加し、そして２００ｒｐｍ、３０℃で３０分間インキュベーションした。その後、Ｖ底マルチウェルプレート中で、磁石および真空ポンプを用いて、各３００μＬ洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で、磁気ビーズを５回洗浄した。その後、ビーズを１００μＬクエン酸試験緩衝液中に再懸濁し、そしてその１０〜８０μＬを新規ウェルにトランスファーした。そこに１５０μＬ試験緩衝液（０．２Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．８、０．３ｇ／Ｌ ４−ニトロソアニリン、１ｍＭ ＣａＣｌ２、３０ｍＭグルコース）を添加した。

レポーター酵素の動力学を、６２０ｎｍで、５分間の期間に渡って測定する。レポーター酵素の活性は、固定される酵素の量に比例し、これは、ビオチン化酵素の量に比例し、そしてこれは、ソルターゼの活性に比例する。

実施例５
ソルターゼ・コンジュゲート化ループを含む、組換え免疫グロブリンのソルターゼ仲介性融合
以下に概説する方法を用いて、ソルターゼ・コンジュゲート化ループを含むＩｇＧ（基質１）の酵素切断、およびそれに続くビオチンタグ（基質２）のコンジュゲート化／カップリング反応を行う。ソルターゼを、第一および第二の基質を含有する溶液に添加すると、第一および第二の基質のソルターゼ仲介性コンジュゲート化によって、Ｃ末端ビオチン化Ｆ（ａｂ’）２断片が形成される（図２を参照されたい）。

標準法にしたがって、ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖中のソルターゼ・コンジュゲート化ループのアミノ酸配列を設計する。マウス免疫グロブリンＧ１重鎖の例示的な配列は以下の通りであった：
（ＶＨドメイン）−（ＣＨ１ドメイン）−（挿入されたソルターゼ・コンジュゲート化ループを含むヒンジ領域＝ＶＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＧＳＧＳＧＧＶＬＰＥＴＧＶＧＳＧＳＧＧＡＧＳＧＳＳ）（配列番号１９）−（ＣＨ２ドメイン）−（ＣＨ３ドメイン）
式中、配列１９（配列番号１９）は以下の部分を含む：
ＶＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴ（配列番号２０）＝上部および中央ヒンジ領域ならびにソルターゼ・コンジュゲート化ループＧＳＧＳＧＧＶＬＰＥＴＧＶＧＳＧＳＧＧＡＧＳＧＳＳ（配列番号２１）。

連結モチーフ（ＧＧＧＧ）およびタグ（ビオチン）を含むソルターゼ求核剤の構造は、必要に応じて設計可能である（こうした構造の例を図３に提供する）。
１５０ｍＭ ＫＣｌおよび５ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝剤ｐＨ８．０中、精製ソルターゼ（２０μＭ）を、その基質、すなわちソルターゼ・コンジュゲート化ループを含む組換え免疫グロブリン（３０μＭ）およびＮ末端ＧＧＧＧ求核剤モチーフを含有するビオチン誘導体（１５００μＭ）と混合した。反応混合物を３７℃で１７時間（一晩）インキュベーションした。０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５を、反応混合物中、５ｍＭまで添加することによって、反応を停止した。

ＧＰＣクロマトグラフィ（ＧＦＣ３００ Ｔｏｓｏｈ； １００ｍＭリン酸緩衝剤、ｐＨ７．０； １ｍｌ／分； ２８０ｎｍで検出）ならびにＳＤＳ ＰＡＧＥによって、切断反応の進行を監視した。全長ＩｇＧの残量は、反応混合物にソルターゼを添加した後、それぞれ、６時間以内に５％未満に減少し、そして１５時間以内に３．６％未満に減少した（（エラー！ 参考文献は見出されない）を参照されたい）。

わずかに塩基性の条件（例えばｐＨ８．０）で、プロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィベッド材料（例えばＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、切断され、そしてビオチン・コンジュゲート化されたＦ（ａｂ’）２断片を精製した。残存するＩｇＧならびにＦｃ部分は、ベッドマテリアル上に捕捉されている。ビオチン化Ｆ（ａｂ’）２のフロースルー分画は、限外濾過膜（１５ＭＷＣＯ、Ａｍｉｃｏｎ−Ｕｌｔｒａ）によって濃縮され、そして最終的に、適切なクロマトグラフィ条件（例えば５０ｍＭリン酸緩衝剤、１５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）下、ＧＰＣカラム（例えばＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上の精錬工程で精製した。

ソルターゼ・コンジュゲート化ループを含む組換え免疫グロブリンの切断／ビオチン化Ｆ（ａｂ’）２へのコンジュゲート化の同一性を、理論的および実験的に決定した分子量の比較に関して、ＥＳＩ ＴＯＦ ＭＳによって確認した。ビオチン取り込み率は正確に２である（各重鎖は、切断され、そしてＣ末端ビオチン化された型である）。切断／コンジュゲート化／精製法の収率は、およそ３３％（最大理論収率はおよそ６０％）であるのに比較して、ＮＨＳコンジュゲート化モノビオチン化Ｆ（ａｂ’）２断片の収率はおよそ１０〜１５％である。機能試験を、それぞれ実施例７および８に記載する。

実施例６
ソルターゼ・コンジュゲート化ループを含む組換えウサギ免疫グロブリンのソルターゼ仲介性融合
実施例５に概説する方法を用いて、ウサギ／マウスＩｇＧキメラ、ソルターゼ・コンジュゲート化ループを含むクローンＢ（基質１）の酵素切断およびそれに続くビオチンタグ（基質２）のコンジュゲート化／カップリング反応を試験した。

ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖中のソルターゼ・コンジュゲート化ループのアミノ酸配列を、本質的に実施例５に記載するように、設計する。
１５０ｍＭ ＫＣｌおよび５ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝剤ｐＨ８．０中、精製ソルターゼ（４０μＭ）を、その基質、すなわちソルターゼ・コンジュゲート化ループを含む組換え免疫グロブリン（６０μＭ）およびＮ末端ＧＧＧＧ求核剤モチーフを含有するビオチン誘導体（３０００μＭ）と混合した。反応混合物を３７℃で１７時間（一晩）インキュベーションした。０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５を、反応混合物中、５ｍＭまで添加することによって、反応を停止した。

ＧＰＣクロマトグラフィ（ＧＦＣ３００ Ｔｏｓｏｈ； １００ｍＭリン酸緩衝剤、ｐＨ７．０； １ｍｌ／分； ２８０ｎｍで検出）ならびにＳＤＳ ＰＡＧＥによって、切断反応の進行を監視した。全長、すなわち非ソルターゼ切断ＩｇＧの残量は、１５時間以内に１０％未満に減少した。Ｆ（ａｂ’）２産物は、２のビオチン取り込み率で、完全にビオチン化された（データ未提示）。

実施例７
慣用的なＦ（ａｂ’）２断片および実施例５において産生されるようなＦ（ａｂ’）２様断片を用いたイムノアッセイデータ
提示されるソルターゼ仲介プロトコル（実施例５を参照されたい）にしたがって調製されたビオチン化Ｆ（ａｂ’）２コンジュゲートを、同じモノクローナル抗体のＮＨＳコンジュゲート化モノビオチン化ペプシン調製Ｆ（ａｂ’）２断片と比較した。

第一の場合、ビオチンは、ソルターゼ・コンジュゲート化ループからなる重鎖のＣ末端に部位特異的に結合され、コンジュゲート化断片の定義される均質な集団を提供する（実施例５を参照されたい）。

第二の場合、ビオチンは、標準的なプロトコルにしたがってＦ（ａｂ’）２断片の異なるリジン上に、化学量論的に付着する。モノビオチン化抗体コンジュゲートを得るため、０．５〜１Ｍの硫酸アンモニウムをコンジュゲート溶液に添加した。５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．５〜１Ｍ硫酸アンモニウムで平衡化したストレプトアビジン・ムテイン吸着剤（ＤＥ１９６３７７１８を参照されたい）に溶液を通過させた。いかなるビオチンもカップリング／結合していない抗体は、吸着剤に結合不能であり、そして洗い流された。モノビオチン化抗体コンジュゲートは、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＫＣｌおよび２％ＤＭＳＯで溶出された。抗体あたり１より多いビオチンを含む抗体コンジュゲートは、その後、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＫＣｌおよび２ｍＭビオチンで溶出された。得られるモノビオチン化分画は、異なるモノビオチン化Ｆ（ａｂ’）２断片の異種集団を含む。

実験ＴＳＨ電気化学発光アッセイを用いて、比較評価を行った。Ｒｏｃｈｅのｃｏｂａｓ（登録商標）ｅ４１１分析装置上で、サンドイッチアッセイ形式で測定を行った。ｃｏｂａｓ（登録商標）ｅ４１１分析装置におけるシグナル検出は、電気化学発光に基づく。このサンドイッチアッセイにおいて、ビオチン−コンジュゲート（すなわち捕捉抗体）は、ストレプトアビジン・コーティング磁気ビーズ表面上に固定される。検出抗体は、シグナル伝達部分として、錯体化ルテニウム陽イオンを所持する。分析物の存在下で、色素原ルテニウム複合体は固相に架橋され、そしてｃｏｂａｓ（登録商標）ｅ６０１分析装置の測定セル中に含まれる白金電極での励起後、６２０ｎｍで光を放出する。シグナル出力は、恣意的光単位である。ＴＳＨをスパイク処理された標準物質、ならびにいくつかの供給源から購入したヒト血清試料で測定を行った。

実験ＴＳＨアッセイを以下のように行った。５０μｌのヒト血清試料またはスパイク処理した標準物質、３５μｌの２μｇ／ｍｌ捕捉抗体−ビオチン・コンジュゲートおよび５０μｌの１μｇ／ｍｌ検出抗体ルテニウム標識コンジュゲートを、９分間一緒にインキュベーションした後、４０μｌのストレプトアビジン・コーティング常磁性微粒子を添加した。混合物をさらに９分間インキュベーションした。その後、（これらの実験において生じる電気化学発光シグナルを通じて）ＴＳＨを検出した。

実験ＴＳＨ Ｅｌｅｃｓｙｓで得た結果または標準物質を以下の表に要約する。結果は、Ｆ（ａｂ’）２断片のＣ末端部位特異的ビオチン化が、未結合リジンを通じて化学量論的にコンジュゲート化されたモノビオチン化Ｆ（ａｂ’）２断片よりも有益であることを立証する。アッセイ動力学は、それぞれ、標準物質６に関しては９２から１４５に、そして標準物質２に関しては６．８から１０．２に増加した（図５を参照されたい）。ブランク値は影響を受けないままであった。

実施例８
実施例５で産生されるようなＦ（ａｂ’）２断片および慣用的ＩｇＧコンジュゲートを用いたイムノアッセイデータ
提示するソルターゼ仲介プロトコル（実施例５を参照されたい）にしたがって調製したビオチン化Ｆ（ａｂ’）２コンジュゲートを、同じモノクローナル抗体のＮＨＳコンジュゲート化モノビオチン化ＩｇＧと比較した。

第一の場合、ビオチンは、ソルターゼ・コンジュゲート化ループからなる重鎖のＣ末端に部位特異的に結合され、コンジュゲート化断片の定義される均質な集団を提供する（実施例５を参照されたい）。

第二の場合、ビオチンは、標準的なプロトコルにしたがってＩｇＧの異なるリジン上に、化学量論的に付着する。モノビオチン化抗体を得るため、実施例６に記載する慣用的コンジュゲートの調製法を適用している。

実験ｐＴａｕ電気化学発光アッセイを用いて、比較評価を実行した。Ｒｏｃｈｅのｃｏｂａｓ（登録商標）ｅ６０１分析装置上で、サンドイッチアッセイ形式で測定を行った。ｃｏｂａｓ（登録商標）ｅ６０１分析装置におけるシグナル検出は、電気化学発光に基づく。サンドイッチアッセイの技術的実現を、実施例６に記載する。

実験ホスホ−Ｔａｕ（１８１Ｐ）アッセイを以下のように実行した。５５μｌのヒト血清試料またはスパイク処理した標準物質、５０μｌの１μｇ／ｍｌ捕捉抗体−ビオチン・コンジュゲート、および６０μｌの２μｇ／ｍｌ検出抗体ルテニウム標識コンジュゲートを、９分間一緒にインキュベーションした後、３５μｌのストレプトアビジン・コーティング常磁性微粒子を添加した。混合物をさらに９分間インキュベーションした。その後、（これらの実験において生じる電気化学発光シグナルを通じて）ホスホ−Ｔａｕを検出した。

実験ホスホ−Ｔａｕ Ｅｌｅｃｓｙｓで得た標準物質に関する結果を以下の表に要約する。結果は、Ｆ（ａｂ’）２断片のＣ末端部位特異的ビオチン化が、未結合リジンを通じて化学量論的にコンジュゲート化されたモノビオチン化ＩｇＧよりも有益であることを立証する。アッセイ動力学は、それぞれ、標準物質７に関しては５７から８６に、そして標準物質３に関しては３．０から４．１に増加した（図６を参照されたい）。ブランク値は影響を受けないままであった。

Claims (15)

1. 組換え免疫グロブリン重鎖であって、
   ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、中央ヒンジ領域の最もＣ末端のシステインまでのヒンジ領域、ソルターゼ・コンジュゲート化ループ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む、
   ここで、該ソルターゼ・コンジュゲート化ループが
   ａ）中央ヒンジ領域の最もＣ末端のシステインおよび免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインのＮ末端のＶＦＸ１ＦＰＰ（配列番号２；式中、Ｘ１はＬまたはＩである）コンセンサス配列の間に位置する、少なくとも１６アミノ酸からなり、
   ｂ）アミノ酸配列ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１）からなるソルターゼ認識モチーフを含み、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである、
   ｃ）（ｂ）の配列のＮ末端に少なくとも２つのアミノ酸を含み、
   ｄ）（ｂ）の配列のＣ末端に少なくとも６つのアミノ酸を含み、そして
   ｅ）ここで（ｂ）の配列のＣおよびＮ末端のアミノ酸はシステインではない
   前記組換え免疫グロブリン重鎖。
2. 前記ソルターゼ・コンジュゲート化ループが、配列ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである）のＣ末端に少なくとも９アミノ酸を含む、請求項１の組換え免疫グロブリン重鎖。
3. 前記ソルターゼ・コンジュゲート化ループが、配列ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである）のＮ末端に少なくとも５アミノ酸を含む、請求項１または２の組換え免疫グロブリン重鎖。
4. 前記ソルターゼ・コンジュゲート化ループが、配列ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである）のＮ末端に少なくとも８アミノ酸を含む、請求項１または２の組換え免疫グロブリン重鎖。
5. 前記ソルターゼ・コンジュゲート化ループが、配列ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである）のＮ末端に少なくとも５アミノ酸を、そして該配列のＣ末端に少なくとも９アミノ酸を含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の組換え免疫グロブリン重鎖。
6. 前記ソルターゼ・コンジュゲート化ループが、配列ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである）のＮ末端に少なくとも８アミノ酸を、そして該配列のＣ末端に少なくとも９アミノ酸を含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の組換え免疫グロブリン重鎖。
7. 前記ソルターゼ・コンジュゲート化ループが、最長５０アミノ酸である、請求項１〜６のいずれか一項記載の組換え免疫グロブリン重鎖。
8. 請求項１〜７のいずれか一項記載の組換え免疫グロブリン重鎖を少なくとも２つ含む、抗体。
9. 請求項１〜７のいずれか一項記載の組換え免疫グロブリン重鎖を２つ有する、ＩｇＧクラス抗体。
10. 組換え免疫グロブリン重鎖のソルターゼ切断断片およびソルターゼ求核剤のコンジュゲートを産生するための方法であって
    ｉ）請求項７または８記載の抗体、
    ｉｉ）ソルターゼ求核剤を含む化合物、
    ｉｉｉ）ソルターゼ活性を持つポリペプチド
    をインキュベーションし、それによって、ＬＰＸ１ＴＸ２（配列番号０１、式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸残基であってもよく、そしてＸ２はＧまたはＡである）中のスレオニンの後ろで組換え抗体重鎖を切断し、そして該スレオニンにソルターゼ求核剤のＮ末端をコンジュゲート化する
    工程を含む、前記方法。
11. 前記ソルターゼ求核剤が、関心対象のタグを含み、そして式（Ｇｌｙ）_ｎ−タグを有する、式中、ｎは少なくとも２である、請求項１０記載の方法。
12. 前記ソルターゼ求核剤が、関心対象のタグを含み、そして式（Ｇｌｙ）_ｎ−タグを有し、そして式中、ｎは２、３、４、５または６より選択される、請求項１０記載の方法。
13. 前記ソルターゼ求核剤が、関心対象のタグを含み、そして式（Ｇｌｙ）_ｎ−タグを有する、式中、ｎは最大３０である、請求項１０記載の方法。
14. 請求項１０〜１３の方法のいずれか１つにしたがって産生されるコンジュゲート。
15. ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、中央ヒンジ領域の最後のシステインまでのヒンジ領域、中央ヒンジ領域の最もＣ末端のシステイン、配列ＬＰＸＴ（配列番号０３、式中、Ｘはいずれのアミノ酸残基であってもよい）の間の２またはそれより多いアミノ酸、および少なくとも２つのグリシン残基を含む、組換え免疫グロブリン重鎖断片を含む、コンジュゲート。

Images