CN108271375A - 包含分选酶缀合环的重组免疫球蛋白重链及其缀合物 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及重组免疫球蛋白重链，其包含VH‑结构域、CH1结构域、向下至中间铰链区的最C‑末端半胱氨酸的铰链区、分选酶缀合环、CH2结构域和CH3结构域，其中所述分选酶缀合环a)由位于中间铰链区的最C‑末端半胱氨酸和免疫球蛋白重链CH2‑结构域的N‑末端处的VFX1FPP (SEQ ID NO:2；其中X1是L或I)共有序列之间的至少16个氨基酸组成，b)包含由氨基酸序列LPX1TX2 (SEQ ID NO:01)组成的分选酶识别基序，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A，c)在(b)的序列的N‑末端包含至少两个氨基酸，d)在(b)的序列的C‑末端包含至少6个氨基酸，且e) 其中在(b)的序列的C‑和N‑末端的氨基酸不是半胱氨酸，以及涉及其在基于酶分选酶的定点缀合中的用途。

Description

包含分选酶缀合环的重组免疫球蛋白重链及其缀合物
本发明涉及包含分选酶缀合环的重组免疫球蛋白重链，通过使用酶分选酶缀合和/或标记此类重组免疫球蛋白重链的方法，以及经由所述方法获得的缀合物/标记的产物。
发明背景
蛋白的位点特异性修饰是有挑战性的问题，特别是对于用于诊断或治疗应用的抗体。在工业规模上经济且适用的位点特异性多肽修饰的可靠方法是非常重要的。
蛋白官能化的早期方法通过使蛋白与过量的硫醇或胺反应性试剂诸如马来酰亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺酯分别反应来利用半胱氨酸或赖氨酸残基的反应性。它们丰富，分布广泛，并且由于适当偶联化学的可用性而容易修饰。
然而，“赖氨酸-标记”策略，当例如用于标记抗体或其抗原结合片段时具有几个缺点：a)其经常导致抗原结合活性(在抗原结合位点中或其附近的赖氨酸)的显著降低；b)单标记的缀合物，甚至在相同的1：1化学计量下，也由包含经由多肽内的赖氨酸中的不同赖氨酸附接的标记物的混合物组成，以及c)期望的1:1产物的产率相当低。
近期最重要的位点特异性蛋白标记方法之一是经由酶促反应将生物正交官能团并入蛋白。对于关于“蛋白的酶促标记”的最近综述，参见M. Rashidian等人,Bioconjugate Chemistry 24 (2013) 1277-1294。该综述中涵盖的用于位点特异性缀合的酶包括甲酰甘氨酸生成酶、唾液酸转移酶、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶、O-GlcNAc翻译后修饰、分选(sortagging)、谷氨酰胺转移酶、法尼基转移酶、生物素连接酶、硫辛酸连接酶和N-肉豆蔻酰基转移酶。
分选酶A (SrtA)是将蛋白共价附接至细菌细胞壁的膜结合酶。SrtA底物上的具体分选酶识别基序是LPX1TX2 (SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基，且X2是G或A)。分选酶在残基苏氨酸(T)和X2 (G或A)之间切割。分选酶亲核体(也称为分选酶底物)上的连接基序，即变得附接至细菌细胞壁上的底物的肽聚糖的多肽部分，天然地是五甘氨酸基序。已经显示，在肽聚糖的N-末端的三甘氨酸和甚至二甘氨酸基序足以支持SrtA反应(Clancy,K.W., 等人, Peptide Science 94 (2010) 385-396)。该反应通过硫酯酰基-酶中间体进行，所述硫酯酰基-酶中间体通过来自寡聚甘氨酸的胺亲核体的攻击而分解，由此将肽聚糖共价连接至蛋白底物并再生SrtA。
在现代生物化学实验室中，SrtA可以例如用于将化学合成的肽共价缀合至重组表达的蛋白。
在WO 2010/087994中，报道了SrtA介导的连接的方法及其用途。Marvin, J.S.,等人 (Acta Pharmacol.Sinica 26 (2005) 649-658)报道了针对IgG-样双特异性抗体的重组方法。Levary, D.A., 等人 (PLoS one, 6 (2011) e18342.1-e18342.6)显示由分选酶A催化的蛋白-蛋白融合。在WO 2013/003555中，报道了使用分选酶来安装用于蛋白连接的点击化学把手。
抗表皮生长因子受体抗体至单链形式的工程改造和通过分选酶A介导的蛋白连接的标记由Madej, M.P.,等人 (Biotechnol. Bioeng. 109 (2012) 1461-1470)报道。Ta,H.T.,等人报道了酶促单链抗体标记作为心血管疾病中靶向分子成像和细胞归巢的通用方法(Cir. Res. 109 (2011) 365-373)。Popp, M., 等人报道了制备和破坏肽键 - 使用分选酶的蛋白工程改造(Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 50 (2011) 5024-5032)。
缺乏N-末端膜-锚定基序(例如，金黄色葡萄球菌SrtA的氨基酸残基60-206)的截短的SrtA已被用于蛋白标记、共价蛋白固定以及将新型官能团并入蛋白中(Ton-That, H.,等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 12424-12429; Ilangovan, H., 等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001) 6056-6061)。
高度期望位点特异性标记的多肽的最重要类别之一是免疫球蛋白或抗体。尽管完整抗体(通常是IgG、IgA或IgM)对于大多数应用是理想的，但通过使用抗体片段(诸如Fab、Fab’和F(ab')2)来增强某些程序的性能。
主要目标抗体片段是抗原结合片段。几种类型的抗原结合片段是可能的，但各自至少含有抗原结合所需的免疫球蛋白重链和轻链(分别为VH和VL)两者的可变区的那些部分，其(通常通过二硫键)保持在一起以保存抗体结合位点。
通常使用例如消化或切割免疫球蛋白结构的某些部分的蛋白酶，以及，如果必要，使用分裂在F(ab')2片段的铰链区中的二硫键的还原剂，来完成抗体片段化。酶促片段化有点费力，需要蛋白的酶介导的消化的优化，需要充足的抗体供应(例如10mg或更多)以使其合理有效并且此外通常需要复杂的纯化步骤。抗体的及时和昂贵的片段化通常仅当目标抗体大量可用并且特定应用需要其时才进行。
抗体片段可以例如使用现有技术程序进行化学标记，其具有例如关于上面提及的产率和再现性的所有缺点。
定点缀合，例如通过酶促进的定点缀合，最近已受到高度关注。
分选酶标记 - 至少理论上 - 可以用于生成抗体片段并同时“标记”那些片段。在理论上，抗体应当允许并入分选酶标签，例如，在基因工程改造的重组抗体的Fc-区中，并使用该分选酶标签用于同时切割和缀合。在理论上且取决于分选酶标签的位置，因此应当可能例如分别获得F(ab)或F(ab’)2片段的缀合物。
然而，当用另外天然抗体尝试分选酶标记(即仅插入识别序列LPETG)(如在由杂交瘤产生的小鼠单克隆抗体中)时，该方法完全不起作用或产率低/令人失望。
然而，存在极大的需求，以经济上和工业上适用规模经由同时切割和位点特异性多肽缀合来实现最相关抗体片段如F(ab)或F(ab’)2分别的分选酶介导的“标记”。
令人惊讶地，现在已发现，分选酶可用于在具有如下文所公开的特性的重组抗体重链的分选酶介导的切割后缀合抗体-片段(例如在抗体-片段标记中)。
发明概述
已经发现，如果在免疫球蛋白重链的中间铰链区的最C-末端半胱氨酸和CH2-结构域之间重组引入特殊的分选酶缀合环，则分选酶介导的重组抗体的切割和连接是可能的。
在一个实施方案中，本发明公开了重组免疫球蛋白重链，其包含VH-结构域、CH1结构域、向下至中间铰链区的最C-末端半胱氨酸的铰链区、分选酶缀合环、CH2结构域和CH3结构域，其中所述分选酶缀合环：a)由位于中间铰链区的最C-末端半胱氨酸和免疫球蛋白重链CH2-结构域的N-末端处的VFX1FPP (SEQ ID NO:2；其中X1是L或I)共有序列之间的至少16个氨基酸组成，b)包含由氨基酸序列LPX1TX2 (SEQ ID NO:01)组成的分选酶识别基序，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A，在(b)的序列的N-末端包含至少两个氨基酸，在(b)的序列的C-末端包含至少6个氨基酸，且其中在(b)的序列的C-和N-末端的氨基酸不是半胱氨酸。
进一步公开了包含至少两条如下文所公开的重组免疫球蛋白重链的抗体。在一个实施方案中，这些抗体是IgG类的并且具有两条如下文所公开的重组免疫球蛋白重链。
如文报道的一个方面是用于产生重组免疫球蛋白重链的分选酶切割片段和分选酶亲核体之间的缀合物的方法，其包括：孵育i)包含至少一条、例如两条如本发明中所公开的重组免疫球蛋白重链的IgG类抗体，ii)包含分选酶亲核体的化合物，和iii)具有分选酶活性的多肽，由此在LPX1TX2 (SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基，且X2是G或A)中的苏氨酸之后切割重组抗体重链，且将分选酶亲核体的N-末端缀合至所述苏氨酸。
在一个实施方案中，本申请涉及根据如本文公开的方法产生的缀合物，例如，这样的缀合物，其包含重组免疫球蛋白重链片段，所述重组免疫球蛋白重链片段包含VH-结构域、CH1结构域、向下至中间铰链区的最后半胱氨酸的铰链区，中间铰链区的最C-末端半胱氨酸之间的两个或更多个氨基酸，序列LPXT (SEQ ID NO:03，其中X可以是任何氨基酸残基)和至少两个甘氨酸残基。
发明详述
I.定义
在本说明书和权利要求中，免疫球蛋白重链Fc-区中的残基的编号是Kabat (Kabat,E.A.,等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIHPublication 91-3242，其通过引用清楚地并入本文)的EU索引的编号。
术语“位置”表示多肽的氨基酸序列中氨基酸残基的位置。位置可以依次编号，或根据确立的格式(例如抗体编号的Kabat的EU索引)编号。
术语“全长抗体”表示具有与天然抗体基本上相同的结构和氨基酸序列的抗体。
术语“全长抗体重链”表示在N-末端至C-末端方向包含抗体可变结构域、第一恒定结构域(= CH1-结构域)、抗体重链铰链区、第二恒定结构域(= CH2-结构域)和第三恒定结构域(= CH3-结构域)的多肽。
术语“全长抗体轻链”表示在N-末端至C-末端方向包含抗体可变结构域和恒定结构域的多肽。
术语“铰链区”表示在野生型抗体重链中连接CH1结构域和CH2结构域的抗体重链多肽的部分，例如对于人IgG1，根据EU编号系统(http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html)从约位置216至约位置238，或从Kabat编号的约位置226至约位置243。根据Kabat的位置226对应于人IgG1重链恒定区的位置99。其他IgG亚类的铰链区可以通过与人IgG1亚类序列的铰链区半胱氨酸残基比对来确定。
铰链区通常是二聚的，其由两个具有相同氨基酸序列的多肽组成。铰链区通常包含约25个氨基酸残基并且是柔性的，允许抗原结合区独立移动。铰链区可以细分成三个结构域：上铰链结构域、中间铰链结构域和下铰链结构域(参见例如Roux, 等人, J.Immunol. 161 (1998) 4083)。
术语Fc区的“上铰链区”例如对于人IgG1，表示中间铰链区的N-末端的氨基酸残基的片段，即根据EU编号的Fc-区的残基216至225。
术语“中间铰链区”，例如对于人IgG1，即根据EU编号的Fc区的残基226至230，表示包含交联半胱氨酸残基的氨基酸残基的片段，富含脯氨酸和半胱氨酸，并且其位于上铰链区和下铰链区之间。
术语Fc区的“下铰链区”例如对于人IgG1，表示紧挨中间铰链区的C-末端的氨基酸残基的片段，即根据EU编号的Fc-区的残基231至238。
术语“野生型Fc-区”表示与自然界中发现的典型同种异型/异同种异型(isoallotypes)的Fc-区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。野生型人Fc-区包括天然人IgG1Fc-区(非A和A同种异型)、天然人IgG2 Fc-区、天然人IgG3 Fc-区和天然人IgG4 Fc-区以及其天然存在的变体。
术语“改变”表示例如重组抗体的亲本氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基的突变、添加或缺失。
术语“氨基酸突变”表示亲本氨基酸序列的氨基酸序列中的修饰。示例性修饰包括氨基酸取代、插入和/或缺失。
术语“在位置…的氨基酸突变”表示指定残基的取代或缺失，或者在指定残基附近的至少一个氨基酸残基的插入。术语“在指定残基附近的插入”表示在其一个至两个残基内的插入。插入可以在指定残基的N-末端或C-末端。
术语“氨基酸取代”表示用不同的“替代”氨基酸残基替代预定亲本氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基。一个或多个替代残基可以是“天然存在的氨基酸残基”(即由遗传密码编码)并且选自：丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)：亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)。在一个实施方案中，所述氨基酸取代是被天然存在的氨基酸替代。在一个实施方案中，所述替代残基不是半胱氨酸。
本文中氨基酸取代的定义也涵盖用一个或多个非天然存在的氨基酸残基取代。“非天然存在的氨基酸残基”表示除了上面列出的那些天然存在的氨基酸残基之外的残基，其能够共价结合多肽链中的相邻氨基酸残基。非天然存在的氨基酸残基的实例包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸、α-氨基异丁酸(Aib)和其他氨基酸残基类似物，诸如Ellman,等人, Meth. Enzym. 202 (1991) 301-336中所述的那些。为了生成此类非天然存在的氨基酸残基，可以使用Noren,等人(Science 244 (1989) 182)和/或Ellman等人(同上)的程序。简言之，这些程序涉及用非天然存在的氨基酸残基化学活化抑制子tRNA，随后体外转录和翻译RNA。
术语“氨基酸插入”表示将一个或多个额外氨基酸残基并入预定亲本氨基酸序列中。根据本发明的“插入的氨基酸序列”通常由至少五个氨基酸组成。插入的氨基酸残基可以是如上定义的天然存在的或非天然存在的。在一个实施方案中，插入的氨基酸残基是天然存在的氨基酸残基。在一个实施方案中，插入的氨基酸残基是天然存在的氨基酸残基，但不是半胱氨酸。在一个实施方案中，插入的氨基酸残基是天然存在的氨基酸残基，并且既不是半胱氨酸也不是脯氨酸。
术语“氨基酸缺失”表示除去氨基酸序列中预定位置处的至少一个氨基酸残基。
在本申请内，无论何时提及氨基酸改变，其都是有意的氨基酸改变，而不是随机的氨基酸修饰。
II.重组方法
编码重组免疫球蛋白重链(其包含VH-结构域、CH1结构域、向下至中间铰链区的最C-末端半胱氨酸的铰链区、分选酶缀合环、CH2结构域和CH3结构域，其中所述分选酶缀合环：a)由位于中间铰链区的最C-末端半胱氨酸和免疫球蛋白重链CH2-结构域的N-末端处的VFX1FPP (SEQ ID NO:2；其中X1是L或I)共有序列之间的至少16个氨基酸组成，b)包含由氨基酸序列LPX1TX2 (SEQ ID NO:01)组成的分选酶识别基序，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A，c)在(b)的序列的N-末端包含至少两个氨基酸，d)在(b)的序列的C-末端包含至少6个氨基酸，且e)其中在(b)的序列的C-和N-末端的氨基酸不是半胱氨酸)的表达载体可以根据现有技术程序制造(参见例如Sambrook, J.等人, Molecular cloning: Alaboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,New York, 1989.)。
尽管可能使用体外翻译来产生如本文所公开的重组免疫球蛋白重链，但细胞表达系统将用于常规中。用于克隆或表达/分泌编码多肽的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生多肽，特别是当不需要糖基化时(参见例如，US5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523, Charlton, Methods in Molecular Biology248 (2003) 245-254 (B.K.C. Lo, (编), Humana Press, Totowa, NJ)，其描述了在大肠杆菌中表达抗体片段)。在表达之后，多肽可以在可溶性级分中从细菌细胞浆中分离，或者可以从不溶性级分（所谓的包涵体）中分离，所述包涵体可以被溶解并重折叠成生物活性形式。其后，可以进一步纯化多肽。
除了原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是编码多肽的载体的合适的克隆或表达宿主，包括真菌和酵母菌株，其糖基化途径已被“人源化”，导致产生具有部分或完全人类糖基化模式的多肽(参见例如Gerngross, Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414和Li,等人, Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215)。
用于表达糖基化多肽的合适的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定许多杆状病毒毒株，其可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
植物细胞培养物也可以用作宿主(参见例如，US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978和US 6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术))。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适合悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是COS-7细胞系(由SV40转化的猴肾CV1细胞)；HEK293细胞系(人胚肾)；BHK细胞系(幼仓鼠肾)；TM4小鼠塞尔托利细胞系(TM4细胞，如例如在Mather, Biol. Reprod. 23 (1980) 243-251中所述)；CV1细胞系(猴肾细胞)；VERO-76细胞系(非洲绿猴肾细胞)；HELA细胞系(人宫颈癌细胞)；MDCK细胞系(犬肾细胞)；BRL-3A细胞系(布法罗大鼠肝细胞)；W138细胞系(人肺细胞)；HepG2细胞系(人肝细胞)；MMT060562细胞系(小鼠乳腺肿瘤细胞)；TRI细胞系(例如在Mather,等人, Anal. N.Y. Acad.Sci. 383 (1982) 44-68中描述)；MRC5细胞系；和FS4细胞系。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括CHO细胞系(中国仓鼠卵巢细胞)，包括DHFR阴性CHO细胞系(参见例如Urlaub,等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216)和骨髓瘤细胞系诸如Y0、NS0和Sp2/0细胞系。对于适合于多肽生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki,和Wu,Methods in Molecular Biology, Antibody Engineering 248 (2004) 255-268 (B.K.C.Lo, (编), Humana Press, Totowa, NJ)。
抗体重链和抗体轻链的共表达代表根据本公开的一个实施方案。使用此共表达，可以获得包含重链和轻链两者的抗体，例如，由两条根据本发明的重组重链和两条轻链组成的IgG类抗体。
III.如本文报道的重组抗体重链及其用途
根据本发明的重组免疫球蛋白重链的特征在于有目的地插入分选酶缀合环。
根据本发明的分选酶缀合环是位于中间铰链区的最C-末端半胱氨酸和免疫球蛋白重链CH2-结构域的N-末端处的VFX1FPP (SEQ ID NO:2；其中X1是L或I)共有序列之间的人工氨基酸序列。根据本发明的分选酶缀合环额外具有以下基本特征：a)其由至少16个氨基酸组成，b)其包含由氨基酸序列LPX1TX2 (SEQ ID NO:01)组成的分选酶识别基序，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A，c)其在(b)的序列的N-末端包含至少两个氨基酸，d)其在(b)的序列的C-末端包含至少6个氨基酸，且e)在(b)的序列的C-和N-末端的氨基酸不是半胱氨酸。
如表1中所示，各种免疫球蛋白重链的中间铰链区可以经由适当的序列比对容易地鉴定。中间铰链区中最C-末端半胱氨酸在表1中以粗体表示。在表1中，给出来自各种物种的免疫球蛋白重链的共有序列的典型序列比对。
表 1：各种免疫球蛋白重链的示例性共有序列
表1中所示的序列部分分别在以下序列标识符下给出：H-IgG1 (SEQ ID NO:4)；H-IgG2 (SEQ ID NO:5)；H-IgG4 (SEQ ID NO:6)；M-IgG1 (SEQ ID NO:7)；M-IgG2a(a) (SEQID NO:8)；M-IgG2a(b) (SEQ ID NO:9)；M-IgG2b (SEQ ID NO:10)；M-IgG3 (SEQ ID NO:11)；Rb-IgG (SEQ ID NO:12)；和S-IgG (SEQ ID NO:13)。
特殊情况是H-IgG3，其中上/中间铰链区包含相同序列的3个重复和一个额外的高度同源的序列。CH1的C-末端是；TKVDKRV (SEQ ID NO:14)；上铰链和中间铰链是ELKTPLGDTTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRPC)3 (SEQ ID NO:15)；且下铰链与CH2-结构域的N-末端氨基酸是APELLGGPSVFLF(SEQ ID NO:16)。
抗体的铰链区跨越CH1-结构域(G链)中最C-末端β-折叠的最后一个氨基酸和CH2-结构域(A-链)中的第一β-折叠的第一个氨基酸之间的重链序列的部分。
上铰链区的序列(无论天然的还是修饰的)对于实施本发明并不重要。
所述中间铰链区包含在两条免疫球蛋白重链之间形成分子间胱氨酸桥所需的半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，根据本公开的重组免疫球蛋白重链具有分选酶缀合环，其在序列LPX1TX2 (SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A)的C-末端包含至少7个氨基酸。
在一个实施方案中，根据本公开的重组免疫球蛋白重链具有分选酶缀合环，其在序列LPX1TX2 (SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A)的C-末端包含至少8个氨基酸。
在一个实施方案中，根据本公开的重组免疫球蛋白重链具有分选酶缀合环，其在序列LPX1TX2 (SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A)的C-末端包含至少9个氨基酸。
在一个实施方案中，根据本公开的重组免疫球蛋白重链具有分选酶缀合环，其在序列LPX1TX2 (SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A)的N-末端包含至少3个氨基酸。
在一个实施方案中，根据本公开的重组免疫球蛋白重链具有分选酶缀合环，其在序列LPX1TX2 (SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A)的N-末端包含至少4个氨基酸。
在一个实施方案中，根据本公开的重组免疫球蛋白重链具有分选酶缀合环，其在序列LPX1TX2 (SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A)的N-末端包含至少5个氨基酸。
在一个实施方案中，根据本公开的重组免疫球蛋白重链具有分选酶缀合环，其在序列LPX1TX2 (SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A)的N-末端包含至少6个氨基酸。
在一个实施方案中，根据本公开的重组免疫球蛋白重链具有分选酶缀合环，其在序列LPX1TX2 (SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A)的N-末端包含至少7个氨基酸。
在一个实施方案中，根据本公开的重组免疫球蛋白重链具有分选酶缀合环，其在序列LPX1TX2 (SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A)的N-末端包含至少8个氨基酸。
在一个实施方案中，根据本公开的重组免疫球蛋白重链具有分选酶缀合环，其在序列LPX1TX2 (SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A)的N-末端包含至少5个氨基酸且在所述序列的C-末端包含至少9个氨基酸。
在一个实施方案中，根据本公开的重组免疫球蛋白重链具有分选酶缀合环，其在序列LPX1TX2 (SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A)的N-末端包含至少8个氨基酸且在所述序列的C-末端包含至少9个氨基酸。
只要遵守根据本公开的16个氨基酸的最小长度，分选酶缀合环的总长度看起来不是关键的。尽管如此，在一个实施方案中，根据本公开的重组免疫球蛋白重链中的分选酶缀合环为至多50个氨基酸长。在进一步实施方案中，根据本公开的重组免疫球蛋白重链中的分选酶缀合环为至多45、40、35或30个氨基酸长。
在进一步实施方案中，分选酶缀合环的总长度分别为至少17、18、19、20、21或22个氨基酸。
免疫球蛋白重链通常包含VH-结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。如技术人员所认识到，在根据本发明的重组免疫球蛋白重链中，除了分选酶缀合环之外，还可以包含如上文定义的进一步改变。如名称所示，可变序列可以以任何方式变化，只要给出对目标靶标的期望的结合特异性。在一个实施方案中，包含根据本发明的分选酶缀合环的重组抗体重链将与相应的天然存在的免疫球蛋白重链具有至少90％同一性(其中下铰链区和分选酶缀合环分别不用于此同一性评价中)。换言之，在使用GCG PileUp程序进行适当比对且一方面除了可变区和分选酶缀合环之外以及另一方面除了下铰链区之外，重组免疫球蛋白重链与所述免疫球蛋白重链的(相应的)共有序列具有至少90%同一性。在其他实施方案中，与相应的共有序列相比，重组免疫球蛋白重链的同一性各自为至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。在一个实施方案中，根据本发明的重组免疫球蛋白重链的CH1-结构域、CH2-结构域和CH3-结构域序列各自将与相应的天然存在的免疫球蛋白重链具有至少90％同一性。换言之，在使用GCG PileUp程序进行适当比对之后，例如重组小鼠IgG1重链的此改变的CH1-结构域的氨基酸的至少90％与小鼠IgG1重链CH1-结构域的共有序列的(相应的)氨基酸相同。在其他实施方案中，与相应的共有序列相比，各个修饰的CH1-结构域、CH2-结构域和CH3-结构域的同一性将各自为至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。
如上所提及，抗体重链和抗体轻链的共表达代表根据本公开的一个实施方案。使用此共表达，特别是与细胞表达系统相关，可以获得包含重链和轻链两者的抗体。(重组)免疫球蛋白重链和其相应的轻链的共表达导致期望抗体的形成以及高产率。
存在人抗体的各种同种型，例如称为α免疫球蛋白(= IgA)、γ-免疫球蛋白(=IgG)、δ免疫球蛋白(IgD)、ε免疫球蛋白(IgE)和μ免疫球蛋白(IgM)。在一个实施方案中，本公开涉及抗体(任何这些同种型或来自其他物种的相应同种型的抗体，或其相应的亚类)，其包含至少两条如本申请中公开的重组免疫球蛋白重链。
在一个实施方案中，描述并请求保护IgG类抗体，其具有两条如本申请中公开的重组免疫球蛋白重链。
如名称已经表明，包含根据本发明的分选酶缀合环的重组抗体重链可用于基于分选酶连接的方法中。
在一个实施方案中，本公开涉及用于产生重组免疫球蛋白重链的分选酶切割片段和分选酶亲核体的缀合物的方法，所述方法包括孵育i)包含至少两条各自包含分选酶缀合环的重组免疫球蛋白重链的抗体，ii)包含分选酶亲核体的化合物，和iii)具有分选酶活性的多肽，由此在LPX1TX2 (SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基，且X2是G或A)中的苏氨酸之后切割重组抗体重链且将分选酶亲核体的N-末端缀合至所述苏氨酸，其中所述分选酶缀合环a)由位于中间铰链区的最C-末端半胱氨酸和免疫球蛋白重链CH2-结构域的N-末端处的VFX1FPP (SEQ ID NO:2；其中X1是L或I)共有序列之间的至少16个氨基酸组成，b)包含由氨基酸序列LPX1TX2 (SEQ ID NO:01)组成的分选酶识别基序，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A，c)在(b)的序列的N-末端包含至少两个氨基酸，d)在(b)的序列的C-末端包含至少6个氨基酸，且e)其中在(b)的序列的C-和N-末端的氨基酸不是半胱氨酸。
如技术人员将容易地认识到，此孵育将使用适合实现期望结果(即期望的缀合物)的缓冲液条件来进行。此类适当条件从文献中众所周知，且标准分选酶连接缓冲液例如包含MgCl2。
分选酶A (SrtA)是将蛋白共价附接至细菌细胞壁的膜结合酶。具体的“分选酶识别基序”或“分选酶基序”是LPX1TX2 (SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基，且X2是G或A)。在一个实施方案中，所述分选酶识别基序是LPX1TX2，其中X2是G。在一个实施方案中，X1是天然存在的氨基酸。在一个实施方案中，X1不是半胱氨酸残基。在一个实施方案中，X1是天然存在的氨基酸且不是半胱氨酸残基。
许多革兰氏阳性细菌使用分选酶来将各种表面蛋白(包括毒力因子)共价锚定至它们的细胞壁(肽聚糖)。分选酶是膜相关的酶。野生型金黄色葡萄球菌分选酶A (SrtA)是具有N-末端跨膜区的206个氨基酸的多肽。在第一步中，分选酶A识别含有分选酶识别基序(LPX1TX2 (SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A))的底物蛋白。分选酶在残基苏氨酸(T)和X2 (G或A)之间切割。Thr之后的酰胺键的酶促切割借助活性位点Cys。该肽切割反应产生分选酶A-底物硫酯中间体。在第二步中，硫酯酰基-酶中间体通过包含分选酶连接基序的分选酶底物(分选酶亲核体)中的氨基的亲核攻击来分解。本质上，分选酶底物多肽对应于金黄色葡萄球菌中肽聚糖的五甘氨酸单元，并且亲核攻击导致共价连接的细胞壁蛋白和分选酶A的再生。在寡聚甘氨酸亲核体不存在的情况下，酰基-酶中间体可以被水分子水解。
“分选酶亲核体”包含“分选酶连接基序”或简称“连接基序”和“目标标签”或简称“标签”。分选酶亲核体具有N-末端寡聚甘氨酸并且由作为其连接基序的至少两个甘氨酸残基组成。换言之，分选酶连接基序由至少两个连续的甘氨酸残基组成。
在一个实施方案中，根据本申请的方法使用包含具有式(Gly)n-标签(其中n至少为2)的目标标签的分选酶亲核体实施。分选酶连接基序(Gly)n可以更长并且可以由3、4、5或6个甘氨酸残基组成，即(Gly)n-标签中的n为3、4、5或6。在进一步实施方案中，根据本申请的方法使用包含具有式(Gly)n-标签(其中n分别为3、4、5或6)的目标标签的分选酶亲核体实施。
本质上，肽聚糖上的分选酶连接基序是五甘氨酸基序。已经显示，在N-末端的三甘氨酸和甚至二甘氨酸基序足以支持SrtA反应(Clancy, K.W., 等人, Peptide Science 94(2010) 385-396)。该反应通过硫酯酰基-酶中间体进行，所述硫酯酰基-酶中间体通过来自寡聚甘氨酸的胺亲核体的攻击而分解，将肽聚糖共价连接至蛋白底物并再生SrtA。SrtA可以例如用于将包含连接基序的化学合成的肽或含有底物的肽共价缀合至重组表达的包含分选酶识别基序的蛋白。
分选酶介导的连接/缀合已经开始应用于各种蛋白工程改造和生物缀合目的。该技术使得能够将天然和合成官能团引入LPX1TX2标记的重组或化学合成的多肽中。实例包括寡聚甘氨酸衍生化聚合物(例如PEG)、荧光团、维生素(例如生物素和叶酸)、脂质、碳水化合物、核酸、合成肽和蛋白(例如GFP)的共价连接(参见例如Tsukiji, S.和Nagamune, T.,ChemBioChem 10 (2009) 787-798; Popp, M.W.L.和Ploegh, H.L., Angew. Chem. Int.Ed. Engl. 50 (2011) 5024-5032)。
对于体外酶促缀合，在一个实施方案中，使用缺乏膜跨越区(SrtA；金黄色葡萄球菌SrtA的氨基酸残基60-206)的可溶性截短分选酶A (SEQ ID NO:17; 还参见Ton-That,H.,等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 12424-12429; Ilangovan, H.,等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001) 6056-6061)。
分选酶亲核体中包含的“目标标签”或简称“标签”可以是结合对的配偶体，官能团，治疗剂(药物)，细胞毒性剂(例如，毒素诸如多柔比星或百日咳毒素)和标记物(例如，荧光团诸如荧光染料如荧光素或罗丹明，化学发光或电化学发光标记物，放射性标记物，用于成像或放射治疗目的的金属螯合物络合物，酶或荧光蛋白如GFP)。
在一个实施方案中，所述标签是结合对的配偶体。如本文所用的结合对由以高亲和力(即以一纳摩尔或更好的亲和力)彼此结合的两种配偶体组成。结合对的实施方案是例如由受体和配体、半抗原和抗半抗原抗体组成的结合对，以及基于天然存在的高亲和力结合对的结合对。
受体-配体结合对的一个实例是由类固醇激素受体和相应的类固醇激素组成的对。
适合于根据本发明的方法的一种类型的结合对是半抗原和抗半抗原抗体结合对。半抗原是分子量为100-2000道尔顿、优选150-1000道尔顿的有机分子。此小分子可以通过将其与载体分子偶联而赋予免疫原性，并且可以根据标准程序产生抗半抗原抗体。所述半抗原可以选自甾醇类、胆汁酸类、性激素类、皮质激素类、强心苷类、强心苷-糖苷类、蟾蜍二烯羟酸内酯类、甾类-皂角苷元类(steroid-sapogenines)和类固醇生物碱类、强心苷类和强心苷-糖苷类。这些物质类别的代表是洋地黄毒苷(digoxigenin)、洋地黄毒苷元(digitoxigenin)、羟基洋地黄毒苷元(gitoxigenin)、毒毛旋花苷配基(strophanthidin)、异羟基洋地黄毒苷原(digoxin)、洋地黄毒苷(digitoxin)、ditoxin、毒毛旋花苷(strophanthin)。另一种合适的半抗原是例如荧光素。
基于天然存在的高亲和力结合对的结合对的实例是生物素或生物素类似物，诸如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白以及FimG和DsF结合对。生物素-(链霉)抗生物素蛋白结合对是本领域众所周知的。FimG-DsF结合对的基本原理例如描述于WO2012/028697中。
在一个实施方案中，结合对选自半抗原和抗半抗原抗体、生物素或生物素类似物诸如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白、FimG和DsF以及受体和配体。
在一个实施方案中，结合对选自半抗原和抗半抗原抗体和生物素或生物素类似物诸如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素/抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白、FimG和DsF。
在一个实施方案中，所述结合对是生物素(或生物素类似物，诸如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素)和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。
在一个实施方案中，所述结合对由生物素和链霉抗生物素蛋白组成。
在一个实施方案中，所述标签是选自醛、羧酸、羧酸酯、环氧化物、N-羟基琥珀酰亚胺酯、氨基基团、卤素、肼、羟基、巯基、马来酰亚胺基、炔基、叠氮化物、异氰酸酯、异硫氰酸酯和亚磷酰胺、反式-环辛烯、四嗪的官能团。
在一个实施方案中，所述标签是选自羧酸、N-羟基琥珀酰亚胺酯、氨基基团、卤素、巯基、马来酰亚胺基、炔基、叠氮化物、异氰酸酯、异硫氰酸酯和亚磷酰胺的官能团。
所述标签可以是治疗剂(药物)并且可以例如是抗体或其抗原结合片段。许多针对细胞表面分子及其配体的治疗性抗体是已知的，诸如Rituxan/MabThera/Rituximab、2H7/Ocrelizumab、Zevalin/Ibrizumomab、Arzerra/奥法木单抗(CD20)、HLL2/依帕珠单抗、Inotuzomab (CD22)、Zenapax/达利珠单抗、Simulect/巴利昔单抗(CD25)、赫赛汀/曲妥珠单抗、帕妥珠单抗(Her2/ERBB2)、Mylotarg/吉妥珠单抗(CD33)、Raptiva/依法利珠单抗(Cd11a)、爱必妥/西妥昔单抗(EGFR，表皮生长因子受体)、IMC-1121B (VEGF受体2)、Tysabri/那他珠单抗(α4ß1和α4ß7整联蛋白的α4亚基)、ReoPro/阿昔单抗(gpIIb-gpIIa和αvß3-整联蛋白)、Orthoclone OKT3/莫罗单抗-CD3 (CD3)、Benlysta/贝利木单抗(BAFF)、Tolerx/Oteliximab (CD3)、Soliris/依库丽单抗(C5补体蛋白)、Actemra/托珠单抗(IL-6R)、Panorex/依决洛单抗(EpCAM，上皮细胞粘附分子)、CEA-CAM5/Labetuzumab (CD66/CEA，癌胚抗原)、CT-11 (PD-1，程序性死亡-1T细胞抑制性受体，CD-d279)、H224G11 (c-Met受体)、SAR3419 (CD19)、IMC-A12/西妥木单抗(IGF-1R，胰岛素样生长因子1受体)、MEDI-575 (PDGF-R，血小板衍生生长因子受体)、CP-675、206/曲美木单抗(细胞毒性T淋巴细胞抗原4)、RO5323441 (胎盘生长因子或PGF)、HGS1012/Mapatumumab (TRAIL-R1)、SGN-70(CD70)、Vedotin(SGN-35)/Brentuximab (CD30)和ARH460-16-2 (CD44)。
所述标签还可以是选自以下的细胞毒剂：(i)化学治疗剂，其可以作为微管抑制剂、有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA嵌入剂发挥功能；(ii)蛋白毒素，其可以酶促发挥功能；和(iii)治疗性放射性同位素。
示例性化学治疗剂包括但不限于美登木素生物碱、澳瑞他汀、多拉司他汀、单端孢菌烯、CC1065、卡里奇霉素和其他烯二炔抗生素、紫杉烷、蒽环霉素及其立体异构体、等排物、类似物或衍生物。
蛋白毒素包括白喉-A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓假单胞菌)、蓖麻毒素A链(Vitetta等人(1987) Science, 238:1098)、相思豆毒素A链、蒴莲素A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香竹素(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-5)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、米托洁林(mitogellin)、局限曲霉素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯(tricothecenes) (WO 93/21232)。
治疗性放射性同位素包括32P、33P、90Y、125I、131I、131In、153Sm、186Re、188Re、211At、212B、212Pb和Lu的放射性同位素。
放射性同位素可以以已知方式并入(Fraker等人(1978) Biochem. Biophys.Res. Commun. 80: 49-57; "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" Chatal,CRC Press 1989)。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核素缀合至复合物的示例性螯合剂(WO 94/11026)。
在一个实施方案中，所述标签是标记物。可以使用可以共价附接至分选酶连接基序氨基酸序列的任何标记部分(参见例如Singh等人(2002) Anal. Biochem. 304:147-15;Harlow E.和Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, ColdSprings Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Lundblad R. L.(1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 第2版 CRC Press, BocaRaton, Fla.)。所述标记物可以发挥功能以：(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记物相互作用以修改由第一或第二标记物提供的可检测信号，例如，以给予FRET(荧光共振能量转移)；(iii)影响移动性，例如电泳迁移率或细胞渗透性，其通过电荷、疏水性、形状或其他物理参数实现，或(iv)提供捕获部分，例如，以调节离子络合。
许多标记物可用，其通常可以分为以下几类：
(a) 荧光染料、化学发光染料(Briggs等人 "Synthesis of FunctionalizedFluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids," J. Chem.Soc., Perkin-Trans. 1 (1997) 1051-1058)和电化学发光标记物提供可检测信号并且通常适用于标记。
荧光标记物或荧光团包括稀土螯合物(铕螯合物)、荧光素型标记物，包括FITC、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素；罗丹明型标记物，包括TAMRA；丹磺酰基；丽丝胺；花菁类；藻红蛋白类；德克萨斯红；及其类似物。例如，荧光标记物可以使用例如Current Protocols inImmunology(同上)中公开的技术缀合至分选酶连接基序。荧光染料和荧光标记试剂包括由Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, Oregon, USA)和Pierce Biotechnology, Inc.(Rockford, Ill.)市售的那些。
不同类别的化学发光标记物包括鲁米诺、吖啶鎓化合物、腔肠素和类似物、二氧杂环丁烷类、基于过氧草酸及其衍生物的系统。对于免疫诊断程序，主要使用基于吖啶鎓的标记物(详细概述于Dodeigne C.等人, Talanta 51 (2000) 415-439中给出)。
作为电化学发光标记物的主要相关的标签分别是基于钌和铱的电化学发光复合物。电化学发光(ECL)证明作为高度灵敏和选择性的方法在分析应用中非常有用。其组合化学发光分析的分析优势(无背景光学信号)与易于通过施加电极电位进行反应控制。通常使用以液相或液-固界面中的TPA(三丙胺)再生的钌络合物，特别是[Ru (Bpy)3]2+ (其在~620 nm处释放光子)作为ECL-标记物。最近还描述了基于铱的ECL标记物(WO2012107419(A1))。
(b)放射性标记物利用放射性同位素(放射性核素)，诸如3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Gn、86Y、89Zr、99TC、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At或131Bi。
(c)适合作为用于成像和治疗目的的标记物的金属-螯合物络合物是本领域众所周知的(US 2010/0111856; US 5,342,606; US 5,428,155; US 5,316,757; US 5,480,990; US 5,462,725; US 5,428,139; US 5,385,893; US 5,739,294; US 5,750,660; US5,834,456; Hnatowich等人, J. Immunol. Methods 65 (1983) 147-157; Meares等人,Anal. Biochem. 142 (1984) 68-78; Mirzadeh等人, Bioconjugate Chem. 1 (1990)59-65; Meares等人, J. Cancer (1990), Suppl. 10:21-26; Izard等人, BioconjugateChem. 3 (1992) 346-350; Nikula等人, Nucl. Med. Biol. 22 (1995) 387-90; Camera等人, Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 955-62; Kukis等人, J. Nucl. Med. 39 (1998)2105-2110; Verel等人, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670; Camera等人, J. Nucl.Med. 21 (1994) 640-646; Ruegg等人, Cancer Res. 50 (1990) 4221-4226; Verel等人, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670; Lee等人, Cancer Res. 61 (2001) 4474-4482; Mitchell,等人, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1105-1112; Kobayashi等人Bioconjugate Chem. 10 (1999) 103-111; Miederer等人, J. Nucl. Med. 45 (2004)129-137; DeNardo等人, Clinical Cancer Research 4 (1998) 2483-90; Blend等人,Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18 (2003) 355-363; Nikula等人 J.Nucl. Med. 40 (1999) 166-76; Kobayashi等人, J. Nucl. Med. 39 (1998) 829-36;Mardirossian等人, Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 65-74; Roselli等人, CancerBiotherapy & Radiopharmaceuticals, 14 (1999) 209-20)。
(d)酶也可以用作分选酶亲核体中的标签/标记物。各种酶-底物标记系统是可用的。该酶通常催化生色底物的化学改变，其可以使用各种技术进行测量。例如，该酶可以催化底物的颜色变化，其可以分光光度测量。或者，该酶可以改变底物的荧光或化学发光。化学发光底物因化学反应变得被电子激发并且然后可以发射可测量(例如，使用化学发光计)的光或将能量递送至荧光受体。酶促标记物的实例包括萤光素酶(例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；US 4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮类、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶诸如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶((3-galactosidase)、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。
酶-底物组合的实例(还参见US 4,275,149；US 4,318,980)包括，例如：
(i) 辣根过氧化物酶(HRP)与作为底物的过氧化氢酶，其中所述过氧化氢酶氧化染料前体(例如，邻苯二胺(OPD)或3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；
(ii) 碱性磷酸酶(AP)与作为生色底物的磷酸对硝基苯酯；和
(iii) β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与生色底物(例如，对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷酶。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本文公开的任何方法产生的缀合物。
在一个实施方案中，根据如本文所述的方法产生的缀合物将包含重组免疫球蛋白重链片段，其包含VH-结构域、CH1结构域、向下至中间铰链区的最后半胱氨酸的铰链区，中间铰链区的最C-末端半胱氨酸之间的两个或更多个氨基酸，序列LPXT (SEQ ID NO:03，其中X可以是任何氨基酸残基)和至少两个甘氨酸残基。
如上所提及，产生完全抗体、即具有如本文公开的重组免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链两者的抗体是有利的。在根据本公开的方法中(在“分选(sortagging)”中)使用此抗体的情况下，获得F(ab’)2-样片段。这些F(ab’)2-样片段与经由标准程序获得的F(ab’)2-片段非常相似。如果包含如本文公开的重组重链的相同抗体将用于标准程序或分选程序中，则序列将是相同的，向下至最后半胱氨酸，但关于中间铰链区的最后半胱氨酸的C-末端的氨基酸是显著不同的，即一种程序产生标准F(ab’)2-片段，另一种程序(分选)产生非常相似、但不同的F(ab’)2-样片段。在分选后，这些F(ab’)2-样片段显然也将至少含有最小基本分选酶连接基序，即两个甘氨酸残基。
在一个实施方案中，如本文公开的缀合物包含经由胱氨酸键彼此结合的两个重组免疫球蛋白重链片段，其包含VH-结构域、CH1结构域、向下至中间铰链区的最后半胱氨酸的铰链区，中间铰链区的最C-末端半胱氨酸之间的两个或更多个氨基酸，序列LPXT (SEQ IDNO:03，其中X可以是任何氨基酸残基)和至少两个甘氨酸残基。
在一个实施方案中，如本文公开的缀合物将包含经由胱氨酸键彼此结合的两个重组免疫球蛋白重链片段和两条免疫球蛋白轻链，所述重链片段包含VH-结构域、CH1结构域、向下至中间铰链区的最后半胱氨酸的铰链区，中间铰链区的最C-末端半胱氨酸之间的两个或更多个氨基酸，序列LPXT (SEQ ID NO:03，其中X可以是任何氨基酸残基)和至少两个甘氨酸残基。
包含如本文报道的标记物的缀合物可用于诊断测定法，例如用于检测全血、血浆或血清样品中的目标抗原。如本文报道的标记的缀合物可用于任何已知的测定方法，诸如ELISA、竞争结合测定法、直接和间接夹心测定法和免疫沉淀测定法(Zola, MonoclonalAntibodies: A Manual of Techniques (1987) pp. 147-158, CRC Press, Inc.)。
如本文报道经标记的缀合物可替代地还将通过生物医学和分子成像的各种方法和技术用作成像生物标记物和探针，所述方法和技术诸如：(i) MRI(磁共振成像)；(ii)MicroCT (计算机断层摄影)；(iii) SPECT (单光子发射计算机断层摄影)；(iv) PET(正电子发射断层摄影) Tinianow, J.等人, Nuclear Medicine and Biology, 37(3) (2010)289-297; Chen等人, Bioconjugate Chem. 15 (2004) 41-49; US 2010/0111856 (v)生物发光；(vi)荧光；和(vii)超声波。免疫闪烁扫描是这样的成像程序，其中将用放射性物质标记的缀合物施用于动物或人类患者，并拍摄缀合物定位于身体内的部位的图像(US 6,528,624)。成像生物标记物可以被客观测量和评估为正常生物学过程、致病过程或对治疗干预的药理学反应的指标。
一个实施方案中，分选酶亲核体由分选酶连接基序和标签组成。在一个进一步实施方案中，分选酶亲核体由分选酶连接基序、接头和标签组成。本文的术语“接头”表示可用于将第一部分与第二部分缀合(连接)的双官能或多官能部分。包含接头的分选酶亲核体可以使用具有两个反应性官能团的接头方便地制备。
所述接头可以包含将分选酶连接基序连接至标签的氨基酸残基。所述氨基酸残基可以形成二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元。氨基酸残基包括那些天然存在的氨基酸残基，以及非天然存在的氨基酸类似物，诸如例如瓜氨酸或β-氨基酸，诸如例如，β-丙氨酸或ω-氨基酸诸如4-氨基-丁酸。
典型地，可以通过在两个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备肽型接头。此类肽键可以例如根据肽化学领域中众所周知的液相合成方法(E. Schroder和K.Lubke "The Peptides", volume 1 (1965) 76-136, Academic Press)来制备。
在另一个实施方案中，所述接头可以包含调节溶解度或反应性的基团，由其组成，或被其取代。例如，接头中的带电取代基诸如磺酸根(SO3 -)或铵可以增加分选酶亲核体的水溶性。由聚合物诸如PEG组成的接头也可以表现出积极作用，例如，可以导致非特异性结合的减少。
如以下实施例中所示，与通过现有技术程序获得的F(ab’)2-缀合物相比，用根据本发明的方法产生的F(ab’)2-样缀合物表现出显著的优点。
附图说明
图1分选酶反应方案；(A)含有LPXTG识别基序的多肽；(B)分选酶亲核体
图2分选酶介导的一步切割和缀合方案的方案图。所示符号如下：
VL、VH、CL、CH1、CH2、CH3 = IgG的共同结构域
G =糖基化
SCL = 分选酶缀合环
标签 = 具有亲核体的分选酶标签
图3包含GGGG连接基序和生物素标签的分选酶亲核体的结构。
图4分选酶介导的切割的监测；
通过在反应开始后分别在1小时、3小时、10小时和15小时进行的切割反应的GPC监测获得的选择的色谱图。
(A) IgG；(B) C-末端生物素化的F(ab’)2片段；
(C) Fcγ片段
图5现有技术缀合物和根据本公开的缀合物的比较评估的结果；显示了生物素-NHS标记的酶促(木瓜蛋白酶)切割的F(ab’)2片段(A)和分选酶切割/生物素缀合的F(ab’)2片段(B)的ECL-信号。
图6现有技术缀合物和根据本公开的缀合物的比较评估的结果；显示了生物素-NHS标记的IgG (A)和分选酶切割/生物素缀合的F(ab’)2片段(B)的ECL-信号。
提供以下实施例、附图和序列以帮助理解本发明，其真正范围在随附权利要求中记载。应理解的是，在不偏离本发明的精神的情况下可以对所述的程序进行修改。
尽管为了清楚理解的目的已经通过举例说明和实施例的方式较详细地描述了前述发明，但说明书和实施例不应被解释为限制本发明的范围。
实施例
重组DNA技术
使用标准方法来操作DNA，如Sambrook, J.等人, Molecular cloning: A laboratorymanual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York,1989中所述。根据制造商的说明使用分子生物学试剂。
基因和寡核苷酸合成
通过Geneart GmbH (Regensburg，德国)的化学合成来制备期望的基因片段。将合成的基因片段克隆至大肠杆菌质粒中用于繁殖/扩增。通过DNA测序验证亚克隆的基因片段的DNA序列。或者，通过退火化学合成的寡核苷酸或通过PCR来装配短的合成DNA片段。相应的寡核苷酸由metabion GmbH (Planegg-Martinsried，德国)制备。
基本/标准哺乳动物表达质粒的描述
为了表达期望的基因/蛋白(例如全长抗体重链、全长抗体轻链或在其N-末端含有寡聚甘氨酸的Fc链)，使用包含以下功能元件的转录单元：
- 来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子(P-CMV)，其包括内含子A，
- 人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(5’UTR)，
- 鼠免疫球蛋白重链信号序列，
- 待表达的基因/蛋白(例如全长抗体重链)，和
- 牛生长激素多聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
除了包括待表达的期望基因的表达单元/盒之外，基本/标准哺乳动物表达质粒含有
- 来自载体pUC18的复制起点，其允许该质粒在大肠杆菌中复制，和
- 在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
蛋白测定
使用基于多肽的氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测定280 nm处的光密度(OD)来测定纯化的多肽的蛋白浓度。
实施例1
可溶性金黄色葡萄球菌分选酶A的表达质粒的生成
分选酶基因编码N-末端截短的金黄色葡萄球菌分选酶A (60-206)分子(SEQ ID NO:17的氨基酸序列)。
用于在HEK293细胞中瞬时表达可溶性分选酶的表达质粒除了可溶性分选酶表达盒外还包含允许该质粒在大肠杆菌中复制的载体pUC18的复制起点和在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
可溶性分选酶的转录单位包含以下功能元件：
- 来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子(P-CMV)，其包括内含子A，
- 人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(5’UTR)，
- 鼠免疫球蛋白重链信号序列，
- 编码纯化标签的核酸，
- 编码N-末端截短的金黄色葡萄球菌分选酶A的核酸，和
- 牛生长激素多聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
成熟可溶性分选酶的氨基酸序列是
。
所述纯化标签具有氨基酸序列MRGSHHHHHHGS (SEQ ID NO:18)。
实施例2
包含分选酶缀合环的重组免疫球蛋白重链的瞬时表达和分析表征
通过瞬时转染在F17培养基(Invitrogen Corp.)中培养的HEK293细胞(人胚胎肾细胞系293衍生的)来进行重组生产。为了转染，使用"293-Fectin"转染试剂(Invitrogen)。转染如制造商的说明中所指定来进行。在转染之后三至七(3-7)天收获细胞培养物上清液。将上清液储存在降低的温度(例如-80℃)。
关于在例如HEK293细胞中重组表达人类免疫球蛋白的一般信息在以下文献中给出：Meissner, P.等人, Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203。
包含分选酶缀合环的M-IgG1亚类的重组免疫球蛋白重链已通过在弱碱性条件(例如pH 8,0)下在蛋白A琼脂糖色谱床材料(例如MabSelect Sure, GE Healtcare)上进行捕获而纯化。IgG已使用柠檬酸缓冲液(100 mM, pH 4.0)从床材料洗脱，并最终在抛光步骤中在GPC柱(例如Superdex 200 Increase, GE Healtcare)上在适当的色谱条件(例如100mM磷酸盐缓冲液，pH7.4)下进行纯化。
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280 nm处的光密度(OD)来测定纯化的多肽的蛋白浓度。通过GPC色谱法以及在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)存在和不存在的情况下的SDS-PAGE且用考马斯亮蓝染色来分析纯度。
在理论和实验测定的重组免疫球蛋白的轻链和重链两者的分子量的比较的方面，通过ESI TOF MS证实表达的包含分选酶缀合环的重组免疫球蛋白重链的身份。
实施例3
重组免疫球蛋白的载体的合成和产生
使用标准方法来操作DNA，如Sambrook, J.等人, Molecular cloning: A laboratorymanual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York,1989中所述。根据制造商的说明使用分子生物学试剂。
详言之，通过常规的基于PCR的克隆技术生成包含编码分选酶缀合环的序列的重组免疫球蛋白的轻链和重链两者的期望基因区段。因此，用含有用于分子克隆的限制性位点的基因特异性寡核苷酸/引物扩增编码期望抗体的轻链和重链的基因的cDNA。使用含有分选酶缀合环的引物与基因特异性引物的组合在两步PCR-策略中引入编码分选酶缀合环的序列。相应的寡核苷酸由metabion GmbH (Planegg-Martinsried，德国)或ThermoFisher制备。
或者，通过在GeneArt® ThermoFisher处的化学合成来制备包含编码分选酶缀合环的序列的重组免疫球蛋白的轻链和重链两者的期望基因区段。
将合成的基因片段克隆至大肠杆菌穿梭载体中用于在大肠杆菌中繁殖/扩增且在HEK293细胞中瞬时表达。通过DNA测序验证亚克隆的基因片段的DNA序列。
为了表达期望的基因/蛋白(例如，包含分选酶缀合环的全长抗体重链，全长抗体轻链)，使用包含以下功能元件的转录单元：
- 来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子(P-CMV)，
- 包括内含子的免疫球蛋白重链信号序列
- 待表达的基因/蛋白(包含分选酶缀合环，全长抗体轻链)，和
- 牛生长激素多聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
除了包括待表达的期望基因的表达单元/盒之外，基本/标准哺乳动物表达质粒含有
- 来自载体pUC18的复制起点，其允许该质粒在大肠杆菌中复制，和
- 在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
实施例4
分选酶介导的葡萄糖脱氢酶和生物素化的寡甘氨酸的融合
用如下所概述的方法，可以通过将作为报道酶的葡萄糖脱氢酶与分选酶氨基酸基序(LPETG或LPETA)融合并将其用作第一底物来光度测定分选酶介导的酶促缀合/偶联反应的活性。作为第二底物，使用生物素化的寡甘氨酸或寡丙氨酸(亲核体)。当将分选酶添加至含有第一和第二底物的溶液中时，通过分选酶介导的第一和第二底物(其为生物素化报道酶)的缀合而形成缀合物。生物素化报道酶可以使用链霉抗生物素蛋白包被的磁珠回收。当添加报道酶的底物时，可以通过光密度的变化来检测产物。
将纯化的分选酶与其底物(即含有LPETG或LPETA基序的葡萄糖脱氢酶(20μM)和含有N-末端甘氨酸或丙氨酸的生物素衍生物(330μM))在含有200 mM NaCl的50 mM Tris缓冲液pH 7.5中混合。将反应混合物在37℃下孵育2小时。通过添加10至20倍过量的抑制缓冲液(50 mM Tris, pH 7.5, 200 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 5 mM碘乙酰胺)来终止反应。将终止的反应混合物以5000 x g离心10分钟。将上清液(50μL)添加至100μL包含200 mM NaCl、10mM CaCl2的50mM Tris缓冲液(pH 7.5)中，并添加链霉抗生物素蛋白包被的磁珠，并在30℃下以200 rpm孵育30分钟。其后，将磁珠各自用300μL洗涤缓冲液(50 mM Tris, pH 7.5,200 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 5 mg/mL BSA, 0.1 % Triton X-100)在V底多孔板中使用磁铁和真空泵洗涤五次。其后，将珠粒重悬浮于100μL柠檬酸盐测试缓冲液中，并将其10-80μL转移至新的孔中。向其中添加150μL测试缓冲液(0.2M柠檬酸钠, pH 5.8, 0.3 g/L 4-亚硝基苯胺, 1 mM CaCl2, 30 mM葡萄糖)。
经5分钟的时间段在620 nm处测量报道酶的动力学。报道酶的活性与固定化酶的量成正比，所述固定化酶的量与生物素化酶的量成正比，并且这与分选酶的活性成正比。
实施例5
分选酶介导的包含分选酶缀合环的重组免疫球蛋白的融合
用如下所概述的方法，测试包含分选酶缀合环的IgG(底物1)的酶促切割和随后的生物素标签(底物2)的缀合/偶联反应。当将分选酶添加至含有第一和第二底物的溶液中时，通过分选酶介导的第一和第二底物的缀合而形成C-末端生物素化的F(ab’)2片段(参见图2)。
根据标准程序设计IgG免疫球蛋白的重链中分选酶缀合环的氨基酸序列。小鼠免疫球蛋白G1重链的示例性序列如下：
(VH结构域)-(CH1结构域)-(具有插入的分选酶缀合环的铰链区 = VPRDCGCKPCICTGSGSGGVLPETGVGSGSGGAGSGSS) (SEQ ID NO:19) -(CH2结构域)-(CH3结构域)
其中序列19 (SEQ ID NO:19)包含以下部分：
VPRDCGCKPCICT (SEQ ID NO:20) = 上铰链区和中间铰链区以及分选酶缀合环GSGSGGVLPETGVGSGSGGAGSGSS (SEQ ID NO:21)。
可以根据需要设计包含连接基序(GGGG)和标签(生物素)的分选酶亲核体的结构。(此类结构的一个实例在图3中给出)。
将纯化的分选酶(20μM)与其底物(即包含分选酶缀合环的重组免疫球蛋白(30μM)和含有N-末端GGGG亲核体基序的生物素衍生物(1500μM))在含有150 mM KCl和5mM CaCl2的50 mM Tris缓冲液pH 8.0中混合。将反应混合物在37℃下孵育17小时(过夜)。通过在反应混合物中添加0.5 M EDTA, pH 7.5至(ad)5 mM来终止反应。
通过GPC色谱(GFC300 Tosoh; 100 mM磷酸盐缓冲液，pH7.0；1 ml/min；在280 nm处检测)以及SDS PAGE监测切割反应的进展。分别地，全IgG的残余量在将分选酶添加至反应混合物中后6小时内降至5％以下，且在15小时内降至3.6％下(参见错误！参考文献来源未找到)。
在微碱性条件(例如pH 8,0)下，使用蛋白A琼脂糖色谱床材料(例如MabSelectSure, GE Healtcare)纯化切割和生物素缀合的F(ab’)2片段。残余的IgG以及Fc部分已被捕获在床材料上。生物素化的F(ab’)2的流通级分已通过超滤膜(15 MWCO, Amicon-Ultra)浓缩，并最终在抛光步骤中在GPC柱(例如Superdex 200 Increase, GE Healtcare)上在适当的色谱条件(例如50 mM磷酸盐缓冲液, 150 mM KCl, pH 7.4)下进行纯化。
在理论和实验测定的分子量的比较的方面，通过ESI TOF MS证实包含至生物素化的F(ab’)2的分选酶缀合环的切割/缀合的重组免疫球蛋白的身份。生物素并入率恰好为2(每条重链呈切割和C-末端生物素化形式)。切割/缀合/纯化程序的产率为近似33％(最大理论产率为近似60％) – 相比之下，NHS-缀合的单生物素化的F(ab’)2片段的产率为近似10-15％。功能测试分别描述于实施例7和8中。
实施例6
分选酶介导的包含分选酶缀合环的重组兔免疫球蛋白的融合
用实施例5中所概述的方法，测试包含分选酶缀合环的兔/小鼠IgG嵌合体，克隆B(底物1)的酶促切割和随后的生物素标签(底物2)的缀合/偶联反应。
基本上如实施例5中所述设计IgG免疫球蛋白的重链中分选酶缀合环的氨基酸序列。
将纯化的分选酶(40μM)与其底物(即包含分选酶缀合环的重组免疫球蛋白(60μM)和含有N-末端GGGG亲核体基序的生物素衍生物(3000μM))在含有150 mM KCl和5mM CaCl2的50 mM Tris缓冲液pH 8.0中混合。将反应混合物在37℃下孵育17小时(过夜)。通过在反应混合物中添加0.5 M EDTA, pH 7.5至5 mM来终止反应。
通过GPC色谱(GFC300 Tosoh; 100 mM磷酸盐缓冲液，pH7.0；1 ml/min；在280 nm处检测)以及通过SDS PAGE监测切割反应的进展。全长、即非分选酶切割的IgG的残余量在15小时内降至10％以下。F(ab’)2产物被完全生物素化，其中生物素并入率为2(数据未显示)。
实施例7
使用如实施例5中产生的常规F(ab’)2-片段和F(ab’)2-样片段的免疫测定数据
将根据呈现的分选酶介导的方案(参见实施例5)制备的缀合的生物素化的F(ab’)2与相同单克隆抗体的NHS-缀合的单生物素化胃蛋白酶制备的F(ab’)2片段进行比较。
在第一种情况下，生物素被定点附接至由分选酶缀合环组成的重链的C-末端，提供限定的缀合片段的均匀群体(参见实施例5)。
在第二种情况下，根据标准方案将生物素随机附接在F(ab’)2片段的不同赖氨酸上。为了获得单生物素化的抗体缀合物，将0.5-1 M硫酸铵添加至缀合物溶液。使溶液通过用50mM磷酸钾(pH7.5)、150 mM KCl、0.5-1 M硫酸铵平衡的链霉抗生物素蛋白突变蛋白吸附剂(参见DE19637718)。没有任何生物素与之偶联/结合的抗体不能结合吸附剂并被洗掉。单生物素化的抗体缀合物用50mM磷酸钾(pH7.5)、150 mM KCl和2% DMSO洗脱。其后用50 mM磷酸钾(pH7.5)、150 mM KCl和2 mM生物素洗脱每个抗体具有多于一个生物素的抗体缀合物。获得的单生物素化级分包含不同的单生物素化F(ab’)2片段的异质群体。
使用实验TSH电化学发光测定进行比较评估。在来自Roche的cobas® e411分析仪上以夹心测定形式进行测量。cobas® e411分析仪中的信号检测基于电化学发光。在该夹心测定中，将生物素-缀合物(即捕获抗体)固定在链霉抗生物素蛋白包被的磁珠的表面上。检测-抗体携带络合的钌阳离子作为信号传导部分。在分析物存在的情况下，将显色钌络合物桥接至固相，并在cobas® e601分析仪的测量室中包含的铂电极处激发后发射620 nm处的光。信号输出为任意光单位。用购自几个来源的掺入TSH的校准物以及人血清样品进行测量。
实验性TSH测定如下进行。将50μl人血清样品或掺入的校准物、35μl 2μg/ml捕获抗体-生物素缀合物和50μl 1μg/ml检测抗体钌标记缀合物一起孵育9分钟，随后添加40μl链霉抗生物素蛋白包被的顺磁微粒。将混合物再孵育9分钟。之后，检测TSH (经由在这些实验中产生的电化学发光信号)。
在实验TSH Elecsys中获得的校准物的结果概述于下表中。结果证明，F(ab’)2片段的C-末端定点生物素化相对于通过游离赖氨酸随机缀合的单生物素化F(ab’)2片段是有利的。分别地，测定动力学对于校准物6从92增加至145，并且对于校准物2从6.8增加至10.2(参见图5)。空白值保持未受影响。
实施例8
使用如实施例5中产生的F(ab’)2-片段和常规IgG缀合物的免疫测定数据
将根据呈现的分选酶介导的方案(参见实施例5)制备的缀合的生物素化的F(ab’)2与相同单克隆抗体的NHS-缀合的单生物素化IgG进行比较。
在第一种情况下，生物素被定点附接至由分选酶缀合环组成的重链的C-末端，提供限定的缀合片段的均匀群体(参见实施例5)。
在第二种情况下，根据标准方案将生物素随机附接在IgG的不同赖氨酸上。为了获得单生物素化抗体，已经应用实施例6中描述的用于制备常规缀合物的程序。
使用实验pTau电化学发光测定进行比较评估。在来自Roche的cobas® e601分析仪上以夹心测定形式实施测量。cobas® e601分析仪中的信号检测基于电化学发光。夹心测定的技术实现描述于实施例6中。
实验磷酸化-Tau(181P)测定如下进行。将55μl人血清样品或掺入的校准物、50μl1μg/ml捕获抗体-生物素缀合物和60μl 2μg/ml检测抗体钌标记缀合物一起孵育9分钟，随后添加35μl链霉抗生物素蛋白包被的顺磁微粒。将混合物再孵育9分钟。其后，检测磷酸化-Tau(经由在这些实验中产生的电化学发光信号)。
在实验磷酸化-Tau Elecsys中获得的校准物的结果概述于下表中。结果证明，F(ab’)2片段的C-末端定点生物素化相对于通过游离赖氨酸随机缀合的单生物素化IgG是有利的。分别地，测定动力学对于校准物7从57增加至86，并且对于校准物3从3.0增加至4.1(参见图6)。空白值保持未受影响。
序列表
<110> Roche Diagnostics GmbH
F. Hoffmann-La Roche AG
<120> 包含分选酶缀合环的重组免疫球蛋白重链及其缀合物
<130> P33076-WO
<150> EP15186821.3
<151> 2015-09-25
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> 任何氨基酸，其独立地选自在位置5的X
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 选自A和G的氨基酸，其独立地选自在位置3的X
<400> 1
Leu Pro Xaa Thr Xaa
1 5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工的
<220>
<221> 位置
<222> (3)..(3)
<223> 在位置3的X是L或I
<400> 2
Val Phe Xaa Phe Pro Pro
1 5
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工的
<220>
<221> 位置
<222> (3)..(3)
<223> 在位置3的X可以是任何氨基酸
<400> 3
Leu Pro Xaa Thr
1
<210> 4
<211> 35
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
1 5 10 15
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
20 25 30
Phe Leu Phe
35
<210> 5
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
20 25 30
<210> 6
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
20 25 30
<210> 7
<211> 30
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 7
Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro
1 5 10 15
Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe
20 25 30
<210> 8
<211> 36
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 8
Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro
1 5 10 15
Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Val Phe Ile Phe
35
<210> 9
<211> 41
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 9
Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Val Pro Ile Thr Gln Asn
1 5 10 15
Pro Cys Pro Pro Leu Lys Glu Cys Pro Pro Cys Ala Ala Pro Asp Leu
20 25 30
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe
35 40
<210> 10
<211> 42
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 10
Thr Thr Val Asp Lys Lys Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile
1 5 10 15
Asn Pro Cys Pro Pro Cys Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn
20 25 30
Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe
35 40
<210> 11
<211> 36
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 11
Thr Glu Leu Ile Lys Arg Ile Glu Pro Arg Ile Pro Lys Pro Ser Thr
1 5 10 15
Pro Pro Gly Ser Ser Cys Pro Ala Gly Asn Ile Leu Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Val Phe Ile Phe
35
<210> 12
<211> 31
<212> PRT
<213> 家兔
<400> 12
Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe
20 25 30
<210> 13
<211> 34
<212> PRT
<213> 绵羊
<400> 13
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Gly Cys Pro Asp Pro Cys Lys
1 5 10 15
His Cys Arg Cys Pro Pro Pro Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe
20 25 30
Ile Phe
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
1 5
<210> 15
<211> 62
<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys
1 5 10 15
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Pro Cys
20 25 30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Pro Cys Glu
35 40 45
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Pro Cys
50 55 60
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10
<210> 17
<211> 147
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 17
Gln Ala Lys Pro Gln Ile Pro Lys Asp Lys Ser Lys Val Ala Gly Tyr
1 5 10 15
Ile Glu Ile Pro Asp Ala Asp Ile Lys Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro
20 25 30
Ala Thr Pro Glu Gln Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Ala Glu Glu Asn
35 40 45
Glu Ser Leu Asp Asp Gln Asn Ile Ser Ile Ala Gly His Thr Phe Ile
50 55 60
Asp Arg Pro Asn Tyr Gln Phe Thr Asn Leu Lys Ala Ala Lys Lys Gly
65 70 75 80
Ser Met Val Tyr Phe Lys Val Gly Asn Glu Thr Arg Lys Tyr Lys Met
85 90 95
Thr Ser Ile Arg Asp Val Lys Pro Thr Asp Val Gly Val Leu Asp Glu
100 105 110
Gln Lys Gly Lys Asp Lys Gln Leu Thr Leu Ile Thr Cys Asp Asp Tyr
115 120 125
Asn Glu Lys Thr Gly Val Trp Glu Lys Arg Lys Ile Phe Val Ala Thr
130 135 140
Glu Val Lys
145
<210> 18
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工的
<400> 18
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser
1 5 10
<210> 19
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工的
<400> 19
Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Val Leu Pro Glu Thr Gly Val Gly Ser Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Ala Gly Ser Gly Ser Ser
35
<210> 20
<211> 13
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 20
Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr
1 5 10
<210> 21
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工的
<400> 21
Gly Ser Gly Ser Gly Gly Val Leu Pro Glu Thr Gly Val Gly Ser Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ala Gly Ser Gly Ser Ser
20 25

Claims (15)

1.重组免疫球蛋白重链，其包含VH-结构域、CH1结构域、向下至中间铰链区的最C-末端半胱氨酸的铰链区、分选酶缀合环、CH2结构域和CH3结构域，
其中所述分选酶缀合环
a) 由位于中间铰链区的最C-末端半胱氨酸和免疫球蛋白重链CH2-结构域的N-末端处的VFX1FPP (SEQ ID NO:2；其中X1是L或I)共有序列之间的至少16个氨基酸组成，
b) 包含由氨基酸序列LPX1TX2 (SEQ ID NO:01)组成的分选酶识别基序，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A，
c) 在(b)的序列的N-末端包含至少两个氨基酸，
d) 在(b)的序列的C-末端包含至少6个氨基酸，且
e) 其中在(b)的序列的C-和N-末端的氨基酸不是半胱氨酸。
2.权利要求1的重组免疫球蛋白重链，其中所述分选酶缀合环在序列LPX1TX2 (SEQ IDNO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A)的C-末端包含至少9个氨基酸。
3.权利要求1或2的重组免疫球蛋白重链，其中所述分选酶缀合环在序列LPX1TX2 (SEQID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A)的N-末端包含至少5个氨基酸。
4.权利要求1或2的重组免疫球蛋白重链，其中所述分选酶缀合环在序列LPX1TX2 (SEQID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A)的N-末端包含至少8个氨基酸。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的重组免疫球蛋白重链，其中所述分选酶缀合环在序列LPX1TX2 (SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A)的N-末端包含至少5个氨基酸，且在所述序列的C-末端包含至少9个氨基酸。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的重组免疫球蛋白重链，其中所述分选酶缀合环在序列LPX1TX2 (SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A)的N-末端包含至少8个氨基酸，且在所述序列的C-末端包含至少9个氨基酸。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的重组免疫球蛋白重链，其中所述分选酶缀合环为至多50个氨基酸长。
8.抗体，其包含至少两条根据权利要求1至7中任一项所述的重组免疫球蛋白重链。
9.IgG类抗体，其具有两条根据权利要求1至7中任一项所述的重组免疫球蛋白重链。
10.用于产生重组免疫球蛋白重链的分选酶切割片段和分选酶亲核体的缀合物的方法，其包括：孵育
i) 根据权利要求7或8所述的抗体，
ii) 包含分选酶亲核体的化合物，
iii) 具有分选酶活性的多肽，
由此在LPX1TX2 (SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基，且X2是G或A)中的苏氨酸之后切割所述重组抗体重链，和将所述分选酶亲核体的N-末端缀合至所述苏氨酸。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述分选酶亲核体包含目标标签且具有式(Gly)n-标签，其中n为至少2。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述分选酶亲核体包含目标标签且具有式(Gly)n-标签，且其中n选自2、3、4、5或6。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述分选酶亲核体包含目标标签且具有式(Gly)n-标签，其中n为至多30。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法生产的缀合物。
15.缀合物，其包含重组免疫球蛋白重链片段，所述重组免疫球蛋白重链片段包含VH-结构域，CH1结构域，向下至中间铰链区的最后半胱氨酸的铰链区，中间铰链区的最C-末端半胱氨酸之间的两个或更多个氨基酸，序列LPXT (SEQ ID NO:03，其中X可以是任何氨基酸残基)和至少两个甘氨酸残基。
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