KR20170098821A

KR20170098821A - 소르타아제를 사용한 １ 단계로의 이중 폴리펩티드 컨쥬게이션을 위한 효소 원-포트 반응

Info

Publication number: KR20170098821A
Application number: KR1020177015798A
Authority: KR
Inventors: 디터 하인들; 에르하르트 코페츠키; 게오르크 티펜트할러
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2014-12-17
Filing date: 2015-12-15
Publication date: 2017-08-30
Also published as: JP6605606B2; RU2711364C2; EP3233906B1; CA2966289A1; RU2017122041A3; MX2017007204A; US11162127B2; WO2016096787A1; BR112017010888A2; SG11201704627XA; JP2018505661A; CN107001446A; US20170314055A1; RU2017122041A; EP3233906A1

Abstract

본원에는, 3 종의 폴리펩티드의 효소 컨쥬게이션 생성물의 제조 방법으로서, i) 아미노산 서열 LPXTG (SEQ ID NO: 20, 여기서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함하는 제 1 폴리펩티드, 아미노산 서열 LPXTA (SEQ ID NO: 31, 여기서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함하는 제 2 폴리펩티드, 2 개의 N-말단을 가지며, 이의 제 1 N-말단에 올리고-글리신 G_m (m = 2 (SEQ ID NO: 22), 또는 3 (SEQ ID NO: 23), 또는 4 (SEQ ID NO: 24), 또는 5 (SEQ ID NO: 25)) 아미노산 서열 및 이의 제 2 N-말단에 올리고-알라닌 A_m (m = 2 (SEQ ID NO: 26), 또는 3 (SEQ ID NO: 27), 또는 4 (SEQ ID NO: 28), 또는 5 (SEQ ID NO: 29)) 아미노산 서열을 갖는 제 3 폴리펩티드, 스타필로코쿠스 아우레우스 소르타아제 A 에서 유래된 소르타아제 활성을 갖는 제 4 폴리펩티드, 및 스트렙토코쿠스 피오게네스 소르타아제 A 에서 유래된 소르타아제 활성을 갖는 제 5 폴리펩티드를 동시에 인큐베이션하고, 반응 혼합물로부터 컨쥬게이트를 회수하는 것을 포함하는 방법이 보고되어 있다.

Description

소르타아제를 사용한 １ 단계로의 이중 폴리펩티드 컨쥬게이션을 위한 효소 원-포트 반응 {ENZYMATIC ONE-POT REACTION FOR DOUBLE POLYPEPTIDE CONJUGATION IN A SINGLE STEP USING SORTASE}

본원에는, 펩티드 결합을 통한 3 종의 화합물의 동시적 효소 컨쥬게이션 (conjugation) 방법이 보고되어 있다.

소르타아제 (sortase A (SrtA)) 는, 단백질을 박테리아 세포 벽에 공유 결합시키는 멤브레인 결합성 효소이다. SrtA 기질 상의 특이적 인식 모티프는 LPXTG 이며, 이에 의해 효소는 잔기인 트레오닌과 글리신 사이를 절단한다. 펩티도글리칸 상의 인식 모티프는 펜타글리신 모티프이다. 유리 N-말단 상의 트리글리신 및 심지어 디글리신 모티프가 SrtA 반응을 지지하는데 충분하다고 밝혀졌다 (Clancy, K.W., et al., Peptide science 94 (2010) 385-396). 반응은, 올리고글리신으로부터 아민 친핵체의 공격에 의해 분해되어, 단백질 기질을 펩티도글리칸과 공유 결합시키고, SrtA 를 재생시키는, 티오에스테르 아실-효소 중간체를 통해 진행된다. SrtA 는 화학적으로 합성된 펩티드를 재조합적으로 발현된 단백질에 공유 결합적으로 접합시키는데 사용될 수 있다.

스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 로부터의 소르타아제 A 는, 다수의 구조적으로 관련이 없는 기질에서 LPXTG 모티프를 인식하고, 올리고글리신 친핵체의 C-말단 확장을 허용하여, 다양한 관능화된 친핵체를 LPXTG 모티프가 구비된 단백질 상에 위치 특이적으로 장착시키는 것을 가능하게 하는, 티올 함유 트랜스펩티다아제이다 (Popp, W.M., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108 (2011) 3169-3174). 관련 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) 소르타아제는, S. 아우레우스 (S. aureus) 효소는 수용하지 않는, 디-알라닌계 친핵체를 수용한다. 이러한 소르타아제는 트레오닌과 알라닌 사이의 LPXTA 모티프를 절단하고, 개질된 알라닌계 친핵체의 장착을 가능하게 한다. SrtA_Strep 는 또한, 감소된 효율에도 불구하고, LPXTG 모티프를 인식하고 절단하지만, LPXTA 모티프는 SrtA_Staph 에 의한 절단에 대하여 반응성이 없다 (Popp et al. 상기 문헌).

WO 2010/087994 에는, 라이게이션 (ligation) 방법 및 그 용도가 보고되어 있다. IgG-유사 이중특이적 항체에 대한 재조합 접근법은, Marvin, J.S. 등에 의해 보고되었다 (Acta Pharmacol. Sinica 26 (2005) 649-658). Levary, D.A. 등은 (PLoS one, 6 (2011) e18342.1-e18342.6), 소르타아제 A 에 의해 촉매화된 단백질-단백질 융합을 보고하였다. WO 2013/003555 에는, 단백질 라이게이션을 위한 클릭 화학 핸들을 장착하기 위한 소르타아제의 용도가 보고되어 있다.

Strijbis, K 등 (Traffic 13 (2012) 780-789) 은, 소르타아제를 사용한 살아있는 세포에서의 단백질 라이게이션을 보고하였다. Ca²⁺-의존성 S. 아우레우스 소르타아제 A 는 세포내에서 기능적이지 않지만, Ca²⁺-비의존성 S. 피오게네스 (S. pyogenes) 소르타아제 A 는 사카로마이세스 세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae) 및 포유류 HEK293T 세포 둘 모두의 시토졸 및 소포체 (ER) 루멘에서 기능적인 것으로 명시되어 있다.

Levary, D.A. 등은, 소르타아제 A 에 의해 촉매화된 단백질-단백질 융합을 보고하였다 (PLOS ONE 6 (2011)). 항-표피 성장 인자 수용체 항체의 단일 사슬 형태로의 엔지니어링 및 소르타아제 A-매개 단백질 라이게이션에 의한 라벨링은, Madej, M.P. 등에 의해 보고되어 있다 (Biotechnol. Bioeng. 109 (2012) 1461-1470). Ta, H.T. 등은, 심혈관 질환에서의 표적 분자 이미징 및 세포 귀환에 대한 보편적인 접근법으로서의 효소적 단일 사슬 항체 태깅을 보고하였다 (Cir. Res. 109 (2011) 365-373). Popp, M. 등은, 소르타아제를 사용한 펩티드 결합 - 단백질 엔지니어링의 제조 및 파괴를 보고하였다 (Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 50 (2011) 5024-5032). WO 2010/087994 에는, 라이게이션 방법 및 그 용도가 보고되어 있다. DOTA 킬레이트에 대하여 높은 친화성을 갖는 엔지니어링된 단백질은 WO 2010/099536 에 보고되어 있다.

N-말단 멤브레인-앵커링 (anchoring) 모티프가 결여된, 절단된 SrtA 는, 세포-표면 단백질 라벨링, 공유 결합 단백질 고정화 및 단백질에의 신규한 기능성의 혼입을 위해 사용되어 왔다. 하지만, 반응이 가역적이기 때문에, 등몰량의 기질을 사용하는 경우, SrtA-매개 라이게이션의 수율은 항상 70 % 미만이다. 또 다른 단점은, 의도하지 않은 LPXT 생성물을 유도하는 반응 중간체의 가수분해이다. 이는 특히 SrtA 와 함께 장기간 인큐베이션하는 것에 의해 문제가 된다. 이는, 또한 최종 생성물 중 남아있는 심지어 소량의 SrtA 라도 시간이 지남에 따라 파괴될 수 있으며; 이는 품질 기준이 매우 높은 생물학적 제제에 있어서 큰 문제가 된다는 것을 의미한다.

소르타아제의 역 반응을 방지하기 위한 다양한 노력이 보고되어 있다. Yamamura, Y. 등 (Chem. Commun. 47 (2011) 4742-4744) 은, 기질의 인식 부위 주변에 β-헤어핀을 도입하여, 라이게이션 부위 주위에 베타-헤어핀 구조를 유도함으로써, 소르타아제 A-매개 단백질 라이게이션의 증강을 보고하였다.

전형적인 소르타아제 A 에 의한 LPXTG 펩티드의 분류, 생산적 기질의 형태적 특징 및 효소 동력학의 조절에서의 불변 기질 잔기의 역할은, Biswas, T. 등에 의해 보고되었다 (Biochem. 53 (2014) 2515-2524).

Li, Y.M. 등은, 소르타아제의 사용에 의한 단백질의 비가역적 부위-특이적 히드라진분해에 대하여 보고하였다 (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53 (2014) 2198-2202).

WO 2014/001324 에는, 둘 이상의 상이한 결합 엔티티를 함유하는 맞춤형의 고도로 선택적인 다중-특이적 표적화 엔티티의 선택 및 제조 방법, 및 이의 용도가 보고되어 있다. Marraffini, L.A. 등 (J. Biol. Chem. 279 (2004) 37763-37770) 은, 표면 단백질의 스타필로코쿠스 아우레우스의 세포 벽에의 앵커링을 위하여, 보존된 아르기닌 잔기가 소르타아제 A 의 효율적인 촉매작용을 위해 요구된다고 보고하였다.

발명의 요약

스타필로코쿠스 아우레우스 유래의 제 1 소르타아제 및 스트렙토코쿠스 피오게네스 유래의 제 2 소르타아제와의 동시 인큐베이션에 의한, 효소 원-포트 (one-pot) 반응에서, 2 개의 펩티드 결합이 형성될 수 있다는 것을 발견하였다. 제 1 소르타아제는, i) 소르타아제 아미노산 모티프 LPXTG (SEQ ID NO: 20, 여기서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 및 ii) 친핵체로서의 올리고-글리신 (SEQ ID NO: 22 내지 25) 의 조합에 대하여 특이적이지만, 제 2 소르타아제는, i) 소르타아제 아미노산 모티프 LPXTA (SEQ ID NO: 31, 여기서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 및 ii) 친핵체로서의 올리고-알라닌 (SEQ ID NO: 26 내지 29) 의 조합에 대하여 특이적이다. 이러한 2 종의 소르타아제는 직교적 특이성을 갖기 때문에, 2 가지 펩티드전이 (transpeptidation) 반응은 효소 원-포트 반응으로서 동시에 수행될 수 있다.

따라서, 본원에 보고된 바와 같은 하나의 양태는,

3 종의 폴리펩티드의 효소 컨쥬게이션 생성물의 제조 방법으로서,

- 하기를 동시에 인큐베이션하는 단계:

a) i) 아미노산 서열 LPXTG (SEQ ID NO: 20, 여기서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함하는, 제 1 폴리펩티드,

ii) 아미노산 서열 LPXTA (SEQ ID NO: 31, 여기서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함하는, 제 2 폴리펩티드,

iii) 2 개의 N-말단을 가지며, 이의 제 1 N-말단에 올리고-글리신 G_m (m = 2 (SEQ ID NO: 22), 또는 3 (SEQ ID NO: 23), 또는 4 (SEQ ID NO: 24), 또는 5 (SEQ ID NO: 25)) 아미노산 서열 및 이의 제 2 N-말단에 올리고-알라닌 A_m (m = 2 (SEQ ID NO: 26), 또는 3 (SEQ ID NO: 27), 또는 4 (SEQ ID NO: 28), 또는 5 (SEQ ID NO: 29)) 아미노산 서열을 갖는, 제 3 폴리펩티드,

iv) 스타필로코쿠스 아우레우스 소르타아제 A 에서 유래된, 소르타아제 활성을 갖는, 제 4 폴리펩티드, 및

v) 스트렙토코쿠스 피오게네스 소르타아제 A 에서 유래된, 소르타아제 활성을 갖는, 제 5 폴리펩티드,

또는

b) i) 아미노산 서열 LPXTG (SEQ ID NO: 20, 여기서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함하는, 제 1 폴리펩티드,

ii) N-말단에 올리고-글리신 G_m (m = 2 (SEQ ID NO: 22), 또는 3 (SEQ ID NO: 23), 또는 4 (SEQ ID NO: 24), 또는 5 (SEQ ID NO: 25)) 아미노산 서열을 갖고, 아미노산 서열 LPXTA (SEQ ID NO: 31, 여기서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함하는, 제 2 폴리펩티드,

iii) N-말단에 올리고-알라닌 A_m (m = 2 (SEQ ID NO: 26), 또는 3 (SEQ ID NO: 27), 또는 4 (SEQ ID NO: 28), 또는 5 (SEQ ID NO: 29)) 아미노산 서열을 갖는, 제 3 폴리펩티드,

또는

c) i) 아미노산 서열 LPXTA (SEQ ID NO: 31, 여기서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함하는, 제 1 폴리펩티드,

ii) N-말단에 올리고-알라닌 A_m (m = 2 (SEQ ID NO: 26), 또는 3 (SEQ ID NO: 27), 또는 4 (SEQ ID NO: 28), 또는 5 (SEQ ID NO: 29)) 아미노산 서열을 갖고, 아미노산 서열 LPXTG (SEQ ID NO: 20, 여기서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함하는, 제 2 폴리펩티드,

iii) N-말단에 올리고-글리신 G_m (m = 2 (SEQ ID NO: 22), 또는 3 (SEQ ID NO: 23), 또는 4 (SEQ ID NO: 24), 또는 5 (SEQ ID NO: 25)) 아미노산 서열을 갖는, 제 3 폴리펩티드,

및

- 반응 혼합물로부터 컨쥬게이트를 회수하여, 3 종의 폴리펩티드의 효소 컨쥬게이션 생성물을 생성하는 단계

를 포함하는 방법이다.

하나의 구현예에서, 제 1, 제 2 및 제 3 폴리펩티드는 대략 등몰 농도로 존재한다.

하나의 구현예에서, 올리고-알라닌은 디-알라닌 (SEQ ID NO: 26) 또는 트리-알라닌 (SEQ ID NO: 27) 이다.

하나의 구현예에서, 올리고-글리신은 디-글리신 (SEQ ID NO: 22) 또는 트리-글리신 (SEQ ID NO: 23) 이다.

하나의 구현예에서, 제 4 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 21 의 아미노산 서열을 갖는다.

하나의 구현예에서, 제 5 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 34 의 아미노산 서열을 갖는다.

하나의 구현예에서, 제 1 폴리펩티드, 제 2 폴리펩티드 및 제 3 폴리펩티드는, 서로 독립적으로, 항체 가변 도메인, 항체 중쇄 Fab-단편, 항체 Fc-영역, 및 태그 (tag) 로부터 선택된다.

하나의 구현예에서, 상기 방법은 3 종의 폴리펩티드의 효소 컨쥬게이션 생성물의 정제 단계를 추가로 포함한다.

하나의 구현예에서, 아미노산 서열 LPXTG (SEQ ID NO: 20, 여기서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 및/또는 아미노산 서열 LPXTA (SEQ ID NO: 31, 여기서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 다음에, 하나 이상의 아미노산 잔기가 이어진다.

I. 정의

본 명세서 및 청구범위에서, 면역글로불린 중쇄 Fc-영역에서의 잔기의 번호지정은, Kabat 의 EU 인덱스에 따른 것이다 (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242, 분명하게 본원에 참조로서 인용됨).

용어 "변경" 은, 변종 항체 또는 융합 폴리펩티드를 수득하기 위한, 모체 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어 Fc-영역의 적어도 FcRn 결합 부분을 포함하는 항체 또는 융합 폴리펩티드의, 돌연변이, 부가, 또는 결실을 나타낸다.

용어 "아미노산 돌연변이" 는, 모체 아미노산 서열의 아미노산 서열에서의 변형을 나타낸다. 예시적인 변형에는, 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실이 포함된다. 하나의 구현예에서, 아미노산 돌연변이는 치환이다. 용어 "해당위치에서의 아미노산 돌연변이" 는, 특정 잔기의 치환 또는 결실, 또는 특정 잔기에 인접한 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입을 나타낸다. 용어 "특정 잔기에 인접한 삽입" 은, 이의 1 내지 2 개의 잔기 내의 삽입을 나타낸다. 삽입은 특정 잔기에 대하여 N-말단 또는 C-말단일 수 있다.

용어 "아미노산 치환" 은, 소정의 모체 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산 잔기를 상이한 "대체" 아미노산 잔기로 대체하는 것을 나타낸다. 대체 잔기 또는 잔기들은, "자연 발생 아미노산 잔기" (즉 유전자 코드에 의해 인코딩된 것) 일 수 있으며, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 수 있다: 알라닌 (Ala); 아르기닌 (Arg); 아스파라긴 (Asn); 아스파르트산 (Asp); 시스테인 (Cys); 글루타민 (Gln); 글루탐산 (Glu); 글리신 (Gly); 히스티딘 (His); 이소류신 (Ile): 류신 (Leu); 리신 (Lys); 메티오닌 (Met); 페닐알라닌 (Phe); 프롤린 (Pro); 세린 (Ser); 트레오닌 (Thr); 트립토판 (Trp); 티로신 (Tyr); 및 발린 (Val). 하나의 구현예에서, 대체 잔기는 시스테인이 아니다. 하나 이상의 비(非)-자연 발생 또는 비-단백질성 아미노산 잔기로의 치환 또한 본원의 아미노산 치환의 정의에 포함된다. "비-자연 발생 아미노산 잔기" 는, 폴리펩티드 사슬 내 인접한 아미노산 잔기(들)과 공유 결합할 수 있는, 상기 열거된 자연 발생 아미노산 잔기 이외의 잔기를 나타낸다. 비-자연 발생 아미노산 잔기의 예에는, 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린, 에이브 (aib) 및 [Ellman, et al., Meth. Enzym. 202 (1991) 301-336] 에 기재된 바와 같은 기타 아미노산 잔기 유사체가 포함된다. 이러한 비-자연 발생 아미노산 잔기를 생성하기 위하여, Noren 등 (Science 244 (1989) 182) 및/또는 Ellman 등 (상기 문헌) 의 절차가 사용될 수 있다. 간략하게, 이러한 절차에는, 비-자연 발생 아미노산 잔기를 이용한 억제유전자 tRNA 의 화학적 활성화, 이어서 RNA 의 시험관내 전사 및 번역이 포함된다. 비-자연 발생 아미노산은 또한 화학적 펩티드 합성 및 이러한 펩티드와 재조합적으로 생산된 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 항체 단편과의 후속 융합을 통해, 펩티드 내에 혼입될 수 있다.

용어 "아미노산 삽입" 은 하나 이상의 부가적인 아미노산 잔기가 소정의 모체 아미노산 서열 내에 혼입되는 것을 나타낸다. 삽입은 통상적으로 1 또는 2 개의 아미노산 잔기의 삽입으로 이루어지지만, 본 출원에서는 보다 큰 "펩티드 삽입", 예를 들어 약 3 개 내지 약 5 개 또는 심지어 약 10 개 이하의 아미노산 잔기의 삽입이 고려된다. 삽입된 잔기(들)은 상기 정의된 바와 같이 자연 발생 또는 비-자연 발생일 수 있다.

용어 "아미노산 결실" 은, 아미노산 서열 중 소정의 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기의 제거를 나타낸다.

본 출원에서, 아미노산 변경이 언급되는 경우, 이는 고의적인 아미노산 변경이며, 무작위적인 아미노산 변형이 아니다.

용어 "태그" 는, 특이적 결합 특성을 갖는 펩티드 결합을 통해 서로 연결된 아미노산 잔기의 서열을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 태그는 친화성 또는 정제 태그이다. 하나의 구현예에서, 태그는 Arg-태그, His-태그, Flag-태그, 3xFlag-태그, Strep-태그, Nano-태그, SBP-태그, c-myc-태그, S-태그, 카모둘린-결합-펩티드, 셀룰로오스-결합-도메인, 키틴-결합-도메인, GST-태그, 또는 MBP-태그로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 태그는 SEQ ID NO: 01 (RRRRR), 또는 SEQ ID NO: 02 (RRRRRR), 또는 SEQ ID NO: 03 (HHHHHH), 또는 SEQ ID NO: 04 (KDHLIHNVHKEFHAHAHNK), 또는 SEQ ID NO: 05 (DYKDDDDK), 또는 SEQ ID NO: 06 (DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK), 또는 SEQ ID NO: 07 (AWRHPQFGG), 또는 SEQ ID NO: 08 (WSHPQFEK), 또는 SEQ ID NO: 09 (MDVEAWLGAR), 또는 SEQ ID NO: 10 (MDVEAWLGARVPLVET), 또는 SEQ ID NO: 11 (MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP), 또는 SEQ ID NO: 12 (EQKLISEEDL), 또는 SEQ ID NO: 13 (KETAAAKFERQHMDS), 또는 SEQ ID NO: 14 (KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL), 또는 SEQ ID NO: 15 (셀룰로오스 결합 도메인), 또는 SEQ ID NO: 16 (셀룰로오스 결합 도메인), 또는 SEQ ID NO: 17 (TNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQ), 또는 SEQ ID NO: 18 (GST-태그), 또는 SEQ ID NO: 19 (MBP-태그), 또는 SEQ ID NO: 35 (C-태그) 로부터 선택된다.

제제, 예를 들어, 약학적 제형의 "유효량" 은, 목적하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하기 위하여, 필요한 기간 동안 및 투여량으로, 효과적인 양을 의미한다.

용어 "개체" 또는 "대상" 은, 포유류를 나타낸다. 포유류에는, 비제한적으로, 가축 (예를 들어, 암소, 양, 고양이, 개, 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예를 들어, 마우스, 래트, 및 햄스터) 가 포함된다. 특정 구현예에서, 개체 또는 대상은 인간이다.

용어 "약학적 제형" 은, 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태이며, 제형이 투여될 수 있는 대상에게 허용가능하지 않을 정도로 독성인 부가적인 구성성분을 함유하지 않는 제제를 나타낸다.

"약학적으로 허용가능한 담체" 는, 대상에게 비독성인, 약학적 제형 중 활성 성분 이외의 성분을 나타낸다. 약학적으로 허용가능한 담체에는, 비제한적으로, 완충제, 부형제, 안정화제, 또는 보존제가 포함된다.

용어 "위치" 는, 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 아미노산 잔기의 위치를 나타낸다. 위치는 순차적으로, 또는 확립된 형식, 예를 들어 항체 번호지정을 위한 Kabat 의 EU 인덱스에 따라 번호가 지정될 수 있다.

본원에 사용된 바, "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료하는" 과 같은 이의 문법적 변형) 는, 치료하고자 하는 개체의 자연적인 경과를 변경하고자 하는 임상적 개입을 나타내며, 이는 예방을 위해 또는 임상 병리학의 과정 중 수행될 수 있다. 치료의 목적하는 효과에는, 비제한적으로, 질환 발병 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접 병리학적 결과의 축소, 전이 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 관해 또는 개선된 예후가 포함된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는, 질환의 발달을 지연시키거나 질환의 진행 속도를 늦추는데 사용된다.

II. 소르타아제 A 를 사용하는 효소 컨쥬게이션

공유 결합되지 않은 2 개의 생체내 엔티티를 포함하는 공유 결합 컨쥬게이트는, 효소 소르타아제, 특히 소르타아제 A 를 사용하여 시험관내에서 수득될 수 있다.

소르타아제 A (SrtA) 는, 단백질을 박테리아 세포 벽에 공유 결합시키는 멤브레인 결합성 효소이다. SrtA 기질 상의 특이적 인식 모티프는 LPXTG 이며, 이에 의해 효소는 잔기인 트레오닌과 글리신 사이를 절단한다. 펩티도글리칸 상의 인식 모티프는 펜타글리신 모티프이다. N-말단 상의 트리글리신 및 심지어 디글리신 모티프가 SrtA 반응을 지지하는데 충분하다고 밝혀졌다 (Clancy, K.W., et al., Peptide science 94 (2010) 385-396). 반응은, 올리고글리신으로부터 아민 친핵체의 공격에 의해 분해되어, 단백질 기질을 펩티도글리칸과 공유 결합시키고, SrtA 를 재생시키는, 티오에스테르 아실-효소 중간체를 통해 진행된다. SrtA 는 화학적으로 합성된 펩티드를 재조합적으로 발현된 단백질에 공유 결합시키는데 사용될 수 있다.

다수의 그람-양성 박테리아는 소르타아제를 사용하여, 독성 인자를 포함하는 각종 표면 단백질을 이의 세포 벽 (펩티도글리칸) 에 공유 결합적으로 고정시킨다. 소르타아제는 멤브레인 관련 효소이다. 야생형 스타필로코쿠스 아우레우스 소르타아제 A (SrtA) 는, N-말단 멤브레인-스패닝 영역을 갖는 206 개 아미노산의 폴리펩티드이다. 제 1 단계에서, 소르타아제 A 는, LPXTG (SEQ ID NO: 20) 아미노산 서열 모티프를 함유하는 기질 단백질을 인식하고, 활성-부위 Cys 을 이용하여 Thr 과 Gly 사이의 아미드 결합을 절단한다. 이러한 펩티드 절단 반응은 소르타아제 A-기질 티오에스테르 중간체를 유도한다. 제 2 단계에서, 티오에스테르 아실-효소 중간체는 제 2 기질 폴리펩티드 (S. 아우레우스에서 펩티도글리칸의 펜타글리신 유닛에 해당함) 를 함유하는 올리고글리신의 (N-말단) 아미노기의 친핵성 공격에 의해 분해되어, 공유 결합된 세포 벽 단백질 및 소르타아제 A 의 재생을 유도한다. 올리고글리신 친핵체의 부재 하에서, 아실-효소 중간체는 물 분자에 의해 가수분해될 수 있다.

소르타아제-매개 라이게이션/컨쥬게이션은, 각종 단백질 엔지니어링 및 바이오컨쥬게이션 목적을 위해 적용되기 시작했다. 이러한 기술은, LPXTG-태그된 재조합 또는 화학적으로 합성된 폴리펩티드에의 천연 또는 합성 관능기의 도입을 가능하게 한다. 이의 예에는, 올리고글리신 유도체화 중합체 (예를 들어, PEG), 형광단, 비타민 (예를 들어, 비오틴 및 엽산), 지질, 탄수화물, 핵산, 합성 펩티드 및 단백질 (예를 들어, GFP) 의 공유 결합 부착이 포함된다 (예를 들어, [Tsukiji, S. and Nagamune, T., ChemBioChem 10 (2009) 787-798]; [Popp, M.W.L. and Ploegh, H.L., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 50 (2011) 5024-5032] 참조).

효소 컨쥬게이션을 위하여, 멤브레인-스패닝 영역이 결핍된 가용성의 절단된 소르타아제 A (SrtA; 스타필로코쿠스 아우레우스 SrtA 의 아미노산 잔기 60-206) 가, 사용될 수 있다 (SEQ ID NO: 21; 또한 [Ton-That, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 12424-12429]; [Ilangovan, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001) 6056-6061] 참조).

III. 재조합 방법

N-말단에 올리고글리신 모티프를 포함하는 (GG (SEQ ID NO: 22), GGG (SEQ ID NO: 23), GGGG (SEQ ID NO: 24), GGGGG (SEQ ID NO: 25)) 임의의 폴리펩티드 도메인 (예를 들어, 단일 사슬 항원 결합 폴리펩티드, 예컨대 scFv, scFab, 또는 다르핀 (darpin), 또는 다중 사슬 항원 결합 폴리펩티드, 예컨대 dsFv 또는 Fab) 는, 진핵 세포 (예를 들어, HEK293 세포, CHO 세포) 의 상청액에서 발현 및 정제될 수 있다. 폴리펩티드가 단리된 폴리펩티드인지, 다중체 또는 이종체 엔티티에 포함되는지는 중요하지 않다.

폴리펩티드-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현/분비에 적합한 숙주 세포에는, 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포가 포함된다. 예를 들어, 폴리펩티드는, 특히 글리코실화가 요구되지 않는 경우, 박테리아에서 생성될 수 있다 (예를 들어, US 5,648,237, US 5,789,199 및 US 5,840,523, Charlton, Methods in Molecular Biology 248 (2003) 245-254 (B.K.C. Lo, (ed.), Humana Press, Totowa, NJ), 대장균 (E. coli.) 내 항체 단편의 발현에 대하여 기술됨, 참조). 발현 후, 폴리펩티드는 가용성 분획 중 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있거나, 가용화되고 생활성 형태로 리폴딩될 수 있는 불용성 분획 소위 봉입체로부터 단리될 수 있다. 그 후, 폴리펩티드는 추가로 정제될 수 있다.

원핵 생물 이외에, 진핵 미생물, 예컨대 사상균 또는 이스트가 폴리펩티드-인코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이며, 이에는 이의 글리코실화 경로가 "인간화" 되어, 부분적으로 또는 전부 인간 글리코실화 패턴을 갖는 폴리펩티드의 생성을 유도하는, 진균 및 이스트 균주가 포함된다 (예를 들어, [Gerngross, Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414], 및 [Li, et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215] 참조).

글리코실화된 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 생물 (무척추동물 및 척추동물) 에서 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는, 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 트랜스펙션 (transfection) 을 위하여, 곤충 세포와의 콘쥬게이션으로 사용될 수 있는, 다수의 바큘로바이러스 균주가 확인되었다.

식물 세포 배양물은 또한 숙주로서 이용될 수 있다 (예를 들어, US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978 및 US 6,417,429 (형질전환 식물에서 항체를 생성하기 위한 PLANTIBODIES^TM 기술이 기재되어 있음) 참조).

척추동물 세포 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 성장하도록 적응된 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 예는, COS-7 세포주 (SV40 에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포); HEK293 세포주 (인간 배아 신장); BHK 세포주 (아기 햄스터 신장); TM4 마우스 세르톨리 세포주 (예를 들어, [Mather, Biol. Reprod. 23 (1980) 243-251] 에 기재된 바와 같은, TM4 세포); CV1 세포주 (원숭이 신장 세포); VERO-76 세포주 (아프리카 녹색 원숭이 신장 세포); HELA 세포주 (인간 경부 암종 세포); MDCK 세포주 (개 신장 세포); BRL-3A 세포주 (버팔로 래트 간 세포); W138 세포주 (인간 폐 세포); HepG2 세포주 (인간 간 세포); MMT 060562 세포주 (마우스 유방 종양 세포); TRI 세포주 (예를 들어, [Mather, et al., Anal. N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68] 에 기재됨); MRC5 세포주; 및 FS4 세포주이다. 기타 유용한 포유류 숙주 세포주에는, DHFR 음성 CHO 세포주를 포함하는 CHO 세포주 (중국 햄스터 난소 세포) (예를 들어, [Urlaub, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216] 참조), 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0 세포주가 포함된다. 폴리펩티드 생성에 적합한 특정 포유류 숙주 세포주의 검토를 위하여, 예를 들어 하기를 참조한다 (Yazaki, and Wu, Methods in Molecular Biology, Antibody Engineering 248 (2004) 255-268 (B.K.C. Lo, (ed.), Humana Press, Totowa, NJ).

IV. 본원에 보고된 바와 같은 방법

스타필로코쿠스 아우레우스 유래의 제 1 소르타아제 및 스트렙토코쿠스 피오게네스 유래의 제 2 소르타아제와의 동시 인큐베이션에 의한, 효소 원-포트 반응에서, 2 개의 펩티드 결합이 형성될 수 있다는 것을 발견하였다. 제 1 소르타아제는, i) 소르타아제 아미노산 모티프 LPXTG (SEQ ID NO: 20, 여기서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 및 ii) 친핵체로서의 올리고-글리신 (SEQ ID NO: 22 내지 25) 의 조합에 대하여 특이적이지만, 제 2 소르타아제는, i) 소르타아제 아미노산 모티프 LPXTA (SEQ ID NO: 31, 여기서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 및 ii) 친핵체로서의 올리고-알라닌 (SEQ ID NO: 26 내지 29) 의 조합에 대하여 특이적이다. 이러한 2 종의 소르타아제는 직교적 특이성을 갖기 때문에, 2 가지 펩티드전이 반응은 효소 원-포트 반응으로서 동시에 수행될 수 있다.

따라서, 본원에 보고된 바와 같은 하나의 양태는,

- 하기를 동시에 인큐베이션하는 단계:

또는

및

를 포함하는 방법이다.

제 1, 제 2 및 제 3 폴리펩티드는, 서로 독립적으로, 하나 이상의 비-소르타아제 모티프 모이어티를 포함할 수 있다. 이는 서로 직접 또는 소르타아제 아미노산 서열 모티프를 갖는 링커를 통해 연결될 수 있다.

비-소르타아제 모티프 모이어티

소르타아제 모티프 아미노산 서열 LPXTG 는, 이들 분자 중 하나에 직접 포함되지 않는 경우, 치료제 (약물), 세포 독성제 (예를 들어, 독소, 예컨대 독소루비신 또는 백일해 독소), 형광단, 예컨대 플루오레세인 또는 로다민과 같은 형광 염료, 이미징 또는 방사선치료 금속용 킬레이트제, 펩티딜 또는 비-펩티딜 라벨, 태그, 또는 클리어런스 개질제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜의 각종 이성질체, 제 3 구성성분에 결합하는 펩티드, 또는 또 다른 탄수화물 또는 친유성 제제에 컨쥬게이션될 수 있다. 컨쥬게이션은 직접 또는 매개 링커를 통해 이루어질 수 있다.

a) 치료적 모이어티

약물 모이어티는, 치료 효과를 갖는 임의의 화합물, 모이어티 또는 기, 예컨대 항체, 세포독성 또는 세포증식억제 화합물일 수 있다.

세포 표면 분자 및 이의 리간드에 대한 다수의 치료적 항체가 공지되어 있다: 예컨대 리툭산/맙테라/리툭시맙 (Rituxan/MabThera/Rituximab), 2H7/오크렐리주맙 (Ocrelizumab), 제발린/이브리주모맙 (Zevalin/Ibrizumomab), 아르제라/오파투무맙 (Arzerra/Ofatumumab) (CD20), HLL2/에프라투주맙 (Epratuzumab), 이노투조맙 (Inotuzomab) (CD22), 제나팍스/다클리주맙 (Zenapax/Daclizumab), 시물렉트/바실릭시맙 (Simulect/Basiliximab) (CD25), 헤르셉틴/트라스투주맙 (Herceptin/Trastuzumab), 페르투주맙 (Pertuzumab) (Her2/ERBB2), 밀로타르그/겜투주맙 (Mylotarg/Gemtuzumab) (CD33), 랍티바/에팔리주맙 (Raptiva/Efalizumab) (Cd11a), 에르비툭스/세툭시맙 (Erbitux/Cetuximab) (EGFR, 표피 성장 인자 수용체), IMC-1121B (VEGF 수용체 2), 티사브리/나탈리주맙 (Tysabri/Natalizumab) (α4β1 및 α4β7 인테그린의 α4-서브유닛), 레오프로/아브식시맙 (ReoPro/Abciximab) (gpIIb-gpIIa 및 ανβ3-인테그린), 오르토글론 OKT3/무로모납-CD3 (Orthoclone OKT3/Muromonab-CD3) (CD3), 벤리스타/벨리무맙 (Benlysta/Belimumab) (BAFF), 토렉스/오텔릭시맙 (Tolerx/Oteliximab) (CD3), 솔리리스/에쿨리주맙 (Soliris/Eculizumab) (C5 보체 단백질), 악템라/토클리주맙 (Actemra/Tocilizumab) (IL-6R), 파노렉스/에드레콜로맙 (Panorex/Edrecolomab) (EpCAM, 상피 세포 접착 분자), CEA-CAM5/라베투주맙 (Labetuzumab) (CD66/CEA, 암배 항원), CT-11 (PD-1, 예정된 사멸-1 T-세포 억제 수용체, CD-d279), H224G11 (c-Met 수용체), SAR3419 (CD19), IMC-A12/식수투무맙 (Cixutumumab) (IGF-1R, 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체), MEDI-575 (PDGF-R, 혈소판-유래 성장 인자 수용체), CP-675, 206/트레멜리무맙 (Tremelimumab) (세포독성 T 림프구 항원 4), RO5323441 (태반 성장 인자 또는 PGF), HGS1012/마파투무맙 (Mapatumumab) (TRAIL-R1), SGN-70 (CD70), 베도틴(SGN-35)/브렌툭시맙 (Vedotin(SGN-35)/Brentuximab) (CD30), 및 ARH460-16-2 (CD44).

본원에 보고된 바와 같은 방법으로 수득되는 컨쥬게이트는, 예를 들어 하기의 치료를 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다: 종양성 질환, 심혈관 질환, 감염성 질환, 염증성 질환, 자가면역 질환, 대사성 (예를 들어, 내분비) 질환, 또는 신경학적 (예를 들어, 신경퇴행성) 질환. 이러한 질환의 예시적인 비-제한적인 예는, 알츠하이머 질환, 비-호지킨 (Hodgkin) 림프종, B-세포 급성 및 만성 림프구 백혈병, 버킷 (Burkitt) 림프종, 호지킨 림프종, 모발세포 백혈병, 급성 및 만성 골수성 백혈병, T-세포 림프종 및 백혈병, 다발성 골수종, 신경교종, 발덴스트롬 (Waldenstrom) 마크로글로불린혈증, 암종 (예컨대 구강, 위장관, 결장, 위, 폐관, 폐, 유방, 난소, 전립선, 자궁, 자궁내막, 자궁경부, 방광, 췌장, 뼈, 간, 담낭, 신장, 피부 및 고환의 암종), 흑색종, 육종, 신경교종, 및 피부 암, 급성 특발성 혈소판 감소성 자반증, 만성 특발성 혈소판 감소성 자반증, 피부근염, 시드남 (Sydenham) 무도병, 중증 근무력증, 전신 홍반 루푸스, 루푸스 신염, 류마티스열, 다선성 증후군, 수포성 유천포창, 당뇨병, 에노흐-쉔라인 (Henoch-Schonlein) 자반증, 후-연쇄상구균 신염, 결절성 홍반, 타카야수 (Takayasu) 동맥염, 애디슨 (Addison) 질환, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 유육종증, 궤양성 대장염, 다형 홍반, IgA 신장병증, 결절다발 동맥염, 강직성 척추염, 굿패스츄어 (Goodpasture) 증후군, 폐색성혈전혈관염, 쇼그렌 (Sjogren) 증후군, 원발성 담즙성 간경화증, 하시모토 (Hashimoto) 갑상선염, 갑상선중독증, 경피증, 만성 활성 간염, 다발성근염/피부근염, 다발연골염, 심상성천포창, 베게너 (Wegener) 육아종증, 막성 신장병증, 근위축성 측삭 경화증, 척수매독, 거대세포 동맥염/다발성근육통, 악성 빈혈, 급속진행성 사구체신염, 건선, 또는 섬유성 폐렴이다.

다수의 세포 표면 마커 및 이의 리간드가 공지되어 있다. 예를 들어 암 세포는, 비제한적으로, 하기 세포 표면 마커 및 또는 리간드 중 하나 이상을 발현하는 것으로 보고되어 있다: 탄산무수화효소 IX, 알파-태아단백질, 알파-악티닌-4, A3 (A33 항체에 대하여 특이적인 항원), ART-4, B7, Ba-733, BAGE, BrE3-항원, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8/m, CCCL19, CCCL21, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CDS, CD8, CD1-1A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-e, CD67, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD133, CD138, CD147, CD154, CDC27, CDK-4/m, CDKN2A, CXCR4, CXCR7, CXCL12, HIF-l-알파, 결장-특이적 항원-p (CSAp), CEA (CEACAM5), CEACAM6, c-met, DAM, EGFR, EGFRvIII, EGP-1, EGP-2, ELF2-M, Ep-CAM, Flt-1, Flt-3, 엽산 수용체, G250 항원, GAGE, GROB, HLA-DR, HM1.24, 인간 융모생식샘 자극호르몬 (human chorionic gonadotropin) (HCG) 및 이의 서브유닛, HER2/neu, HMGB-1, 저산소증 유도 인자 (HIF-1), HSP70-2M, HST-2 또는 la, IGF-1R, IFN-감마, IFN-알파, IFN-베타, IL-2, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-25, 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1), KC4-항원, KS-1-항원, KS1-4, Le-Y, LDR/FUT, 대식세포 이동 억제 인자 (MIF), MAGE, MAGE-3, MART-1, MART-2, NY-ESO-1, TRAG-3, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUM-1/2, MUM-3, NCA66, NCA95, NCA90, 췌장암 뮤신, 태반 성장 인자, p53, PLAGL2, 전립선 산성 인산화효소, PSA, PRAME, PSMA, P1GF, ILGF, ILGF-1R, IL-6, IL-25, RS5, RANTES, T101, SAGE, S100, 서비빈 (survivin), 서비빈-2B, TAC, TAG-72, 테나신 (tenascin), TRAIL 수용체, TNF-알파, Tn-항원, 톰슨-프리덴리히 (Thomson-Friedenreich) 항원, 종양 괴사 항원, VEGFR, ED-B 피브로넥틴 (fibronectin), WT-1, 17-1A-항원, 보체 인자 C3, C3a, C3b, C5a, C5, 혈관형성 마커, bcl-2, bcl-6, Kras, cMET, 종양형성 유전자 마커 및 종양형성 유전자 생성물 (예를 들어, [Sensi, et al., Clin. Cancer Res. 12 (2006) 5023-5032]; [Parmiani, et al, J. Immunol. 178 (2007) 1975-1979]; [Novellino, et al., Cancer Immunol. Immunother. 54 (2005) 187-207] 참조).

따라서, 특이적 세포 표면 수용체 (이의 리간드 포함) 를 인식하는 항체는, 특이적 및 선택적 표적화, 및 질환과 관련된 다수의/수 많은 세포 표면 마커에 대한 결합에 사용될 수 있다. 세포 표면 마커는, 예를 들어 신호전달 사건 또는 리간드 결합과 관련이 있는 세포 (예를 들어, 질환-관련 세포) 의 표면 상에 위치된 폴리펩티드이다.

하나의 구현예에서, 암/종양의 치료를 위하여, 종양-관련 항원을 표적화하는 다중특이적 결합 분자/이중특이적 항체가 제조되었으며, [Herberman, "Immunodiagnosis of Cancer", in Fleisher (ed.), "The Clinical Biochemistry of Cancer", page 347 (American Association of Clinical Chemists (1979))] 및 US 4,150,149; US 4,361,544; 및 US 4,444,744 에 보고되어 있다.

종양 관련 항원 (TAA) 에 대한 보고서에는, [Mizukami, et al., (Nature Med. 11 (2005) 992-997)]; [Hatfield, et al., (Curr. Cancer Drug Targets 5 (2005) 229-248)]; [Vallbohmer, et al., (J Clin. Oncol. 23 (2005) 3536-3544)]; 및 [Ren, et al., (Ann. Surg. 242 (2005) 55-63)] 이 포함되며, 이는 각각 확인된 TAA 와 관련하여 본원에 참조로서 인용된다.

질환이 림프종, 백혈병 또는 자가면역 질환과 관련되는 경우, 표적화 항원은 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD54, CD67, CD74, CD79a, CD80, CD126, CD138, CD154, CXCR4, B7, MUC1 또는 la, HM1.24, HLA-DR, 테나신, VEGF, P1GF, ED-B 피브로넥틴, 종양형성 유전자, 종양형성 유전자 생성물 (예를 들어, c-met 또는 PLAGL2), CD66a-d, 괴사 항원, IL-2, T101, TAG, IL-6, MIF, TRAIL-R1 (DR4) 및 TRAIL-R2 (DR5).

2 종의 상이한 표적에 대한 다수의 이중특이적 항체가 공지되어 있다: 예컨대 BCMA/CD3, 조합으로의 HER 패밀리의 상이한 항원 (EGFR, HER2, HER3), CD19/CD3, IL17RA/IL7R, IL-6/IL-23, IL-1-베타/IL-8, IL-6 또는 IL-6R/ IL-21 또는 IL-21R (제 1 특이성은 Lewis x-, Lewis b- 및 Lewis y-구조, Globo H-구조, KH1, Tn-항원, TF-항원 및 뮤신의 탄수화물 구조, CD44, 글리코리피드 및 글리코스핑고리피드, 예컨대 Gg3, Gb3, GD3, GD2, Gb5, Gm1, Gm2, 시알릴테트라오실세라미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원의 글리코에피토프 (glycoepitope) 에 대한 것이고, 제 2 특이성은 EGFR, HER2, HER3 및 HER4 로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB 수용체 티로신 키나아제에 대한 것임), T-림프구 NK 세포, B-림프구, 수지상 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구, 간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 세포와 관련이 있는 제 2 항원 결합 부위와 조합으로의 GD2, ANG2/VEGF, VEGF/PDGFR-베타, 혈관 내피 성장 인자 (Vascular Endothelial Growth Factor) (VEGF) 수용체 2/CD3, PSMA/CD3, EPCAM/CD3, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, FLT3, c-FMS/CSF1R, RET, c-Met, EGFR, Her2/neu, HER3, HER4, IGFR, PDGFR, c-KIT, BCR, 인테그린 및 MMP 로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원과 VEGF, EGF, PIGF, PDGF, HGF, 및 안지오포이에틴 (angiopoietin) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 수용성 리간드의 조합, ERBB-3/C-MET, ERBB-2/C-MET, EGF 수용체 1/CD3, EGFR/HER3, PSCA/CD3, C-MET/CD3, ENDOSIALIN/CD3, EPCAM/CD3, IGF-1R/CD3, FAPALPHA/CD3, EGFR/IGF-1R, IL 17A/F, EGF 수용체 1/CD3, 및 CD19/CD16.

독성 약물 모이어티에는 하기가 포함된다: (i) 미세소관 억제제, 유사분열 억제제, 토포이소머라아제 억제제, 또는 DNA 삽입제로서 기능할 수 있는, 화학요법제; (ii) 효소적으로 기능할 수 있는, 단백질 독소; 및 (iii) 방사성 동위원소.

예시적인 독성 약물 모이어티에는, 비제한적으로, 매이탄시노이드 (maytansinoid), 아우리스타틴 (auristatin), 돌라스타틴 (dolastatin), 트리코테센 (trichothecene), CC1065, 칼리케아미신 (calicheamicin) 및 기타 엔디인 (enediyne) 항생제, 탁산 (taxane), 안트라시클린 (anthracycline), 및 이의 입체이성질체, 동배체 (isoster), 유사체 또는 유도체가 포함된다.

단백질 독소에는, 디프테리아-A 사슬, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (녹농균 (Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 (ricin) A 사슬 (Vitetta et al (1987) Science, 238:1098), 아브린 (abrin) A 사슬, 모데신 (modeccin) A 사슬, 알파-사르신 (sarcin), 유동 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 (dianthin) 단백질, 미국자리콩 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-5), 여주 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신 (curcin), 크로틴 (crotin), 비누풀 (saponaria officinalis) 억제제, 겔로닌 (gelonin), 미토겔린 (mitogellin), 레스트릭토신 (restrictocin), 페노마이신 (phenomycin), 에노마이신 (enomycin), 및 트리코테센 (tricothecene) (WO 93/21232) 이 포함된다.

치료용 방사성 동위원소에는, 32P, 33P, 90Y, 125I, 131I, 131In, 153Sm, 186Re, 188Re, 211At, 212B, 212Pb, 및 Lu 의 방사성 동위원소가 포함된다.

방사성 동위원소 또는 기타 라벨은 공지된 방식으로 혼입될 수 있다 ([Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57]; ["Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" Chatal, CRC Press 1989]). 탄소-14-라벨된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민 펜타아세트산 (MX-DTPA) 은, 방사성핵종의 복합체로의 컨쥬게이션을 위한 예시적인 킬레이트제이다 (WO 94/11026).

b) 라벨

비-소르타아제 모티프 모이어티는 라벨이 될 수 있다. 소르타아제 아미노산 서열에 공유 결합될 수 있는 임의의 라벨 모이어티가 사용될 수 있다 (예를 들어, [Singh et al (2002) Anal. Biochem. 304:147-15]; [Harlow E. and Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]; [Lundblad R. L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, Fla.] 참조). 라벨은 하기와 같은 기능을 할 수 있다: (i) 검출가능한 신호를 제공함; (ii) 제 2 라벨과 상호작용하여, 제 1 또는 제 2 라벨에 의해 제공된 검출가능한 신호를 변경시킴, 예를 들어 FRET (형광 공명 에너지 전이 (fluorescence resonance energy transfer)) 를 제공함; (iii) 전하, 소수성, 모양, 또는 기타 물리적 파라미터에 의해, 이동도, 예를 들어 전기영동 이동도 또는 세포-투과성에 영향을 미침, 또는 (iv) 포획 모이어티를 제공하여, 예를 들어 이온성 복합체화를 조절함.

본원에 보고된 바와 같은 합테닐화 (haptenylated) 라벨을 포함하는 컨쥬게이트는, 예를 들어, 특이적 세포, 조직, 또는 혈청에서 관심 대상인 항원의 발현을 검출하기 위한 진단용 검정에서 유용할 수 있다. 진단용 적용의 경우, 제 1 결합 특이성이 표적에 결합하고, 제 2 결합 특이성이 합테닐화 라벨에 결합하는, 이중특이적 항체가 사용될 수 있다. 합텐은 전형적으로 검출가능한 모이어티로 라벨될 수 있다. 일반적으로 하기 카테고리로 그룹화될 수 있는 다수의 라벨이 이용가능하다:

(a) 방사성 동위원소 (방사성핵종), 예컨대 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Gn, 86Y, 89Zr, 99TC, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At, 또는 131Bi. 방사성 동위원소 라벨된 컨쥬게이트는 수용체 표적화 이미징 실험에서 유용하다. 항원 (합텐) 은 [Current Protocols in Immunology, (1991) Volumes 1 and 2, Coligen et al, Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs] 에 기재된 기술을 사용하여, 방사성 동위원소 금속에 결합, 킬레이트 또는 다르게는 이를 복합체화하는 리간드 시약으로 라벨될 수 있다. 금속 이온을 복합체화할 수 있는 킬레이팅 리간드에는, DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA 및 TETA (Macrocyclics, Dallas, Tex.) 가 포함된다. 방사성핵종은 본원에 보고된 바와 같은 복합체와의 복합체화를 통해 표적화될 수 있다 (Wu et al, Nature Biotechnology 23(9) (2005) 1137-1146). 방사성핵종 라벨된 복합체를 이용한 수용체 표적 이미징은, 종양 조직에서 복합체 또는 해당 치료적 항체의 점진적인 축적의 검출 및 정량화에 의해 경로 활성화의 마커를 제공할 수 있다 (Albert et al (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:1207-1210).

이미징 실험용 라벨로서 적합한 금속-킬레이트 복합체 (US 2010/0111856; US 5,342,606; US 5,428,155; US 5,316,757; US 5,480,990; US 5,462,725; US 5,428,139; US 5,385,893; US 5,739,294; US 5,750,660; US 5,834,456; [Hnatowich et al, J. Immunol. Methods 65 (1983) 147-157]; [Meares et al, Anal. Biochem. 142 (1984) 68-78]; [Mirzadeh et al, Bioconjugate Chem. 1 (1990) 59-65]; [Meares et al, J. Cancer (1990), Suppl. 10:21-26]; [Izard et al, Bioconjugate Chem. 3 (1992) 346-350]; [Nikula et al, Nucl. Med. Biol. 22 (1995) 387-90]; [Camera et al, Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 955-62]; [Kukis et al, J. Nucl. Med. 39 (1998) 2105-2110]; [Verel et al., J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670]; [Camera et al, J. Nucl. Med. 21 (1994) 640-646]; [Ruegg et al, Cancer Res. 50 (1990) 4221-4226]; [Verel et al, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670]; [Lee et al, Cancer Res. 61 (2001) 4474-4482]; [Mitchell, et al, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1105-1112]; [Kobayashi et al Bioconjugate Chem. 10 (1999) 103-111]; [Miederer et al, J. Nucl. Med. 45 (2004) 129-137]; [DeNardo et al, Clinical Cancer Research 4 (1998) 2483-90]; [Blend et al, Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18 (2003) 355-363]; [Nikula et al J. Nucl. Med. 40 (1999) 166-76]; [Kobayashi et al, J. Nucl. Med. 39 (1998) 829-36]; [Mardirossian et al, Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 65-74]; [Roselli et al, Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14 (1999) 209-20)].

(b) 형광 라벨, 예컨대 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트), FITC, 5-카르복시플루오레세인, 6-카르복시 플루오레세인을 포함하는 플루오레세인 유형; TAMRA 를 포함하는 로다민 유형; 단실 (dansyl); 리사민 (Lissamine); 시아닌 (cyanine); 피코에리트린 (phycoerythrin); 텍사스 레드 (Texas Red); 및 이의 유사체. 형광 라벨은 예를 들어 [Current Protocols in Immunology, (상기 문헌)] 에 개시된 기술을 사용하여 항원 (합텐) 에 컨쥬게이션될 수 있다. 형광 염료 및 형광 라벨 시약에는, Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, Oregon, USA) 및 Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, Ill.) 사에서 시판되는 것들이 포함된다.

검출 라벨, 예컨대 형광 염료 및 화학발광 염료 ([Briggs et al "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids," J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1 (1997) 1051-1058]) 는, 검출가능한 신호를 제공하며, 일반적으로 특히 하기 특성을 갖는 라벨링에 적용가능하다: (i) 라벨된 컨쥬게이트는, 소량의 컨쥬게이트가 무세포 (cell-free) 및 세포-기반 검정 둘 모두에서 민감하게 검출될 수 있도록, 배경이 적으면서 매우 높은 신호를 생성해야 함; 및 (ii) 라벨된 컨쥬게이트는, 형광 신호가 유의한 광표백 없이 관찰, 모니터링 및 기록될 수 있도록, 광안정성이 있어야 함. 특히 살아있는 세포의 멤브레인 또는 세포 표면에의 라벨된 컨쥬게이트의 세포 표면 결합을 포함하는 적용에 있어서, 라벨은 (iii) 유효한 컨쥬게이트 농도 및 검출 민감도를 달성하기 위하여 양호한 수용해성을 가져야 하고, (iv) 세포의 정상적인 대사 과정을 방해하지 않거나 세포 조기 사멸을 야기하지 않도록 살아있는 세포에 대하여 비-독성임.

(c) 각종 효소-기질 라벨이 이용가능하거나 개시되어 있다 (예를 들어, US 4,275,149 참조). 효소는 일반적으로 각종 기술을 사용하여 측정될 수 있는 발색 기질의 화학적 변경을 촉매화한다. 예를 들어, 효소는 기질의 색상 변화를 촉매화할 수 있으며, 이는 분광광도법적으로 측정될 수 있다. 대안적으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경시킬 수 있다. 화학발광 기질은 화학적 반응에 의해 전자적으로 여기되어, 측정될 수 있는 (예를 들어, 화학발광측정계 (chemiluminometer) 를 사용하여) 광을 방출하거나, 또는 형광 수용체에 에너지를 제공할 수 있다. 효소 라벨의 예에는, 루시퍼라아제 (luciferase) (예를 들어, 반딧불이 루시퍼라아제 및 박테리아 루시퍼라아제; US 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나아제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 예컨대 홀스래디쉬 퍼옥시다아제 (HRP), 알칼리 포스페이트 (AP), (3-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 리소자임, 당류 옥시다아제 (예를 들어, 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제, 및 글루코오스-6-포스페이트 데히드로게나아제), 헤테로시클릭 옥시다아제 (예컨대 우리카아제 및 잔틴 옥시다아제), 락토퍼옥시다아제, 마이크로퍼옥시다아제 등이 포함된다. 효소를 폴리펩티드에 컨쥬게이션하는 기술은 [O'Sullivan et al "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay", in Methods in Enzym. (ed. by J. Langone & IT Van Vunakis), Academic Press, New York, 73 (1981) 147-166] 에 기재되어 있다.

효소-기질 조합 (US 4,275,149; US 4,318,980) 의 예에는, 예를 들어 하기가 포함된다:

(i) 기질로서 히드로겐 퍼옥시다아제를 갖는 홀스래디쉬 퍼옥시다아제 (HRP), 여기서 히드로겐 퍼옥시다아제는 염료 전구체 (예를 들어, 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 히드로클로라이드 (TMB)) 를 산화시킴;

(ii) 발색 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트를 갖는 알칼리 포스페이트 (AP); 및

(iii) 발색 기질 (예를 들어, p-니트로 페닐-(3-D-갈락토시다아제) 또는 형광발생 기질 4-메틸움벨리페릴-(3-D-갈락토시다아제) 를 갖는 (3-D-갈락토시다아제 (3-D-Gal)).

본원에 보고된 바와 같은 라벨된 컨쥬게이트는 임의의 공지된 검정법, 예컨대 ELISA, 경쟁 결합 검정, 직접 및 간접 샌드위치 검정, 및 면역침강 검정에 이용될 수 있다 ([Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (1987) pp. 147-158, CRC Press, Inc.]).

본원에 보고된 바와 같은 라벨된 컨쥬게이트는, 하기와 같은 생체의학 및 분자 이미징의 각종 방법 및 기술에 의한 이미징 바이오마커 및 프로브로서 유용하다: (i) MRI (자기 공명 영상); (ii) MicroCT (전산화 단층 촬영); (iii) SPECT (단일 광자 방출 단층 촬영); (iv) PET (양전자 방출 단층 촬영) [Tinianow, J. et al Nuclear Medicine and Biology, 37(3) (2010) 289-297]; [Chen et al, Bioconjugate Chem. 15 (2004) 41-49]; US 2010/0111856; (v) 생물발광; (vi) 형광; 및 (vii) 초음파. 면역섬광조영술 (immunoscintigraphy) 은, 방사성 물질로 라벨된 컨쥬게이트를 동물 또는 인간 환자에게 투여하고, 컨쥬게이트가 국부적으로 위치하는 신체 내 부위의 사진을 촬영하는 이미징 절차이다 (US 6,528,624). 이미징 바이오마커는 정상적인 생물학적 과정, 병원성 과정, 또는 치료적 개입에 대한 약리학적 반응의 지표로서, 객관적으로 측정 및 평가될 수 있다. 바이오마커에는 몇몇의 유형이 존재할 수 있다: 유형 0 마커는 질환의 자연자 마커이며, 공지된 임상 지표, 예를 들어 류마티스 관절염의 활액성 염증의 MRI 평가와 종적인 상관관계가 있음; 유형 I 마커는 작용 기전에 따른 개입의 효과를 포착함 (기전이 임상적 결과와 관련되지 않을 지라도); 유형 II 마커는, 바이오마커의 변화, 또는 이로부터의 신호가, 류마티스 관절염에서 CT 에 의한 측정된 골 침식과 같은 표적화 반응을 "검증" 하기 위한 임상적 이점을 예측하는, 대리결과 변수 (surrogate endpoints) 로서 기능함. 따라서, 이미징 바이오마커는 하기에 대한 약력학적 (PD) 치료 정보를 제공할 수 있다: (i) 표적 단백질의 발현, (ii) 표적 단백질에의 치료제의 결합, 즉 선택성, 및 (iii) 클리어런스 및 반감기 약동학적 데이터. 실험실 기반 바이오마커와 비교하여 생체내 이미징 바이오마커의 이점에는 하기가 포함된다: 비-침습적 치료, 정량화가능, 전신 평가, 반복 투여 및 평가, 즉 여러 시간 지점, 및 전임상 (작은 동물) 에서 임상 (인간) 결과로의 잠재적으로 이동가능한 효과. 일부 적용에 있어서, 바이오이미징은 전임상 연구에서의 동물 실험을 대체하거나 그 수를 최소화한다.

펩티드 라벨링 방법은 널리 공지되어 있다. 하기 참조: [Haugland (2003) Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.]; [Brinkley (1992) Bioconjugate Chem. 3:2]; [Garman, (1997) Non-Radioactive Labeling: A Practical Approach, Academic Press, London]; [Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2]; [Glazer et al Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work and E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., New York]; [Lundblad, R. L. and Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and II, CRC Press, New York]; [Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGruyter, Berlin and New York]; 및 [Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.)]; [DeLeon-Rodriguez et al, Chem. Eur. J. 10 (2004) 1149-1155]; [Lewis et al, Bioconjugate Chem. 12 (2001) 320-324]; [Li et al, Bioconjugate Chem. 13 (2002) 110-115]; [Mier et al Bioconjugate Chem. 16 (2005) 240-237].

링커

용어 "링커" 는, 제 1 모이어티와 제 2 모이어티를 컨쥬게이션 (링크 (link)) 하는데 사용될 수 있는 이관능성 또는 다관능성 모이어티를 나타낸다. 링크된 컨쥬게이트는 2 개의 반응성 관능기를 갖는 링커를 사용하여 편리하게 제조될 수 있다.

하나의 구현예에서, 링커는 소르타아제 아미노산 서열 중에 존재하는 친핵성 기에 대하여 반응성이 있는 친전자성 기를 갖는 반응성 부위를 갖는다. 유용한 친전자성 기에는, 비제한적으로, 또 다른 티올, 말레이미드 및 할로아세트아미드 기가 포함된다 (예를 들어, [Klussman et al, Bioconjugate Chemistry 15(4) (2004) 765-773] 의 766 페이지의 컨쥬게이션 방법 참조).

티올-반응 관능기의 예에는, 비제한적으로, 티올, 말레이미드, 알파-할로아세틸, 활성화 에스테르, 예컨대 숙신이미드 에스테르, 4-니트로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르, 무수물, 산 클로라이드, 술포닐 클로라이드, 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트가 포함된다.

링커는 소르타아제 아미노산 서열을 비-소르타아제 모티프 모이어티에 링크하는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 아미노산 잔기는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드, 헥사펩티드, 헵타펩티드, 옥타펩티드, 노나펩티드, 데카펩티드, 운데카펩티드 또는 도데카펩티드 유닛를 형성할 수 있다. 아미노산 잔기에는, 자연 발생의 것 뿐 아니라, 비-자연 발생 아미노산 유사체, 예를 들어 시트룰린 (citrulline) 또는 β-아미노산, 예컨대 β-알라닌, 또는 ω-아미노산, 예컨대 4-아미노-부티르산이 포함된다.

또 다른 구현예에서, 링커는 소르타아제 아미노산 서열 중에 존재하는 친전자성 기에 대하여 반응성이 있는 친핵성 기를 갖는 반응성 관능기를 갖는다. 유용한 친전자성 기에는, 비제한적으로, 알데히드 및 케톤 카르보닐기가 포함된다. 링커의 친핵성 기 중 헤테로원자는 소르타아제 아미노산 서열 중 친전자성 기와 반응하여, 소르타아제 아미노산 서열과 공유 결합을 형성할 수 있다. 링커 상의 유용한 친핵성 기에는, 비제한적으로, 히드라지드, 옥심, 아미노, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드가 포함된다. 항원 (합텐) 상의 친전자성 기는 링커에의 부착에 편리한 부위를 제공한다.

전형적으로, 펩티드-유형 링커는 둘 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이에 펩티드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은, 예를 들어, 펩티드 화학 분야에 널리 공지되어 있는 액체상 합성 방법에 따라 (E. Schroder and K. Lubke "The Peptides", volume 1 (1965) 76-136, Academic Press) 제조될 수 있다.

또 다른 구현예에서, 링커는 용해도 또는 반응성이 조절된 기로 치환될 수 있다. 예를 들어, 하전된 치환기, 예컨대 술포네이트 (SO₃ ^-) 또는 암모늄 또는 PEG 와 같은 중합체는,시약의 수용해도를 증가시키고, 링커 시약과 항원 (합텐) 또는 약물 모이어티의 커플링 반응을 용이하게 하거나, 이용되는 합성 경로에 따라 커플링 반응을 용이하게 할 수 있다.

본원에 명시적으로 보고된 바와 같은 비-소르타아제 모티프 모이어티를 포함하는 컨쥬게이트로는, 비제한적으로, 하기와 같은 링커 시약으로 제조된 복합체가 고려된다: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰) 벤조에이트), 및 비스-말레이미드 시약: DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BM(PEO)₃, 및 BM(PEO)₄ (이는 Pierce Biotechnology, Inc 사에서 시판됨) 포함. 비스-말레이미드 시약은, 예를 들어 티올기의 티올-함유 약물 모이어티, 라벨, 또는 링커 중간체에의, 순차적 또는 동시적으로 방식으로의, 부착을 가능하게 한다. 예를 들어 티올기와 반응성이 있는 말레이미드 이외의 기타 관능기에는, 요오도아세트아미드, 브로모아세트아미드, 비닐 피리딘, 디술피드, 피리딜 디술피드, 이소시아네이트, 및 이소티오시아네이트가 포함된다.

예시적인 링커에는, 말레이미드 스트레처 (stretcher) 및 파라-아미노벤질카르바모일 (PAB) 자기-희생 스페이서 (self-immolative spacer) 를 갖는 발린-시트룰린 (val-cit 또는 vc) 디펩티드 링커 시약, 및 말레이미드 스트레처 유닛 및 p-아미노 벤질 자기-희생 스페이서를 갖는 phe-lys(Mtr) 디펩티드 링커 시약이 포함된다.

시스테인 티올기는 친핵성이고, 하기를 포함하는 링커 시약 및 비-소르타아제 모티프 모이어티 또는 소르타아제 아미노산 서열 상의 친전자성 기와 공유 결합을 형성하도록 반응할 수 있다: (i) 활성 에스테르, 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실, 및 말레이미드기; 및 (iv) 술피드 교환을 통한, 피리딜 디술피드를 포함하는 디술피드. 합테닐화 화합물 상의 친핵성기에는, 비제한적으로: 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 기와 공유 결합을 형성하도록 반응할 수 있는 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드기가 포함된다.

도면의 간단한 설명

도 1 (a) 내지 (h): 실시예 3 의 실험 1 내지 8 의 SDS-PAGE 분석.

도 2 실시예 1 의 실험 1, 7 및 8 의, 3 종의 폴리펩티드를 포함하는 컨쥬게이트 형성의 시간 경과; 다이아몬드: 실험 1, 정사각형: 실험 7, 삼각형: 실험 8; y-축: 소르타아제 양을 기준으로 정규화된 2 배 컨쥬게이션된 생성물의 양.

하기 실시예, 도면 및 서열은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제공되는 것으로, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 청구범위에 설정된 바와 같다. 본 발명의 의미를 벗어나지 않으면서, 설정된 절차 내 변경이 이루어질 수 있다고 이해된다.

전술된 본 발명이 이해의 명확성을 위하여 예시 및 실시예로서 보다 상세하게 기재되었지만, 상세한 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예

재조합 DNA 기술

[Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 에 기재된 바와 같은 표준 방법을 사용하여 DNA 를 조작하였다. 분자 생물학적 시약은 제조업자의 지침에 따라 사용하였다.

유전자 및 올리고뉴클레오티드 합성

목적하는 유전자 단편을 Geneart GmbH (Regensburg, Germany) 사에서 화학적 합성에 의해 제조하였다. 합성된 유전자 단편을 번식/증폭을 위해 대장균 (E. coli) 플라스미드 내에 클로닝하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 시퀀싱 (sequencing) 으로 확인하였다. 대안적으로, 짧은 합성 DNA 단편을 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드의 어닐링에 의해 또는 PCR 을 통해 어셈블링하였다. 각각의 올리고뉴클레오티드를 metabion GmbH (Planegg-Martinsried, Germany) 에서 제조하였다.

기본/표준 포유류 발현 플라스미드의 설명

목적하는 유전자/단백질 (예를 들어, 전장 (full length) 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄, 또는 N-말단에 올리고글리신을 함유하는 Fc-사슬) 의 발현을 위하여, 하기 기능성 요소를 포함하는 전사 유닛를 사용한다:

- 인트론 A 를 포함하는 인간 시토메갈로바이러스 (P-CMV) 로부터의 전초기 인핸서 (enhancer) 및 프로모터 (promoter),

- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비(非)번역 영역 (5'UTR),

- 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열,

- 발현시키고자 하는 유전자/단백질 (예를 들어, 전장 항체 중쇄), 및

- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH pA).

발현시키고자 하는 목적하는 유전자를 포함하는 발현 유닛/카세트 이외에, 기본/표준 포유류 발현 플라스미드는 하기를 함유한다:

- 대장균에서 이러한 플라스미드의 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18 로부터의 복제 기점 (origin of replication), 및

- 대장균에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자.

단백질 측정

정제된 폴리펩티드의 단백질 농도는, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기준으로 산출된 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 nm 에서 광학 밀도 (OD) 를 측정함으로써 측정하였다.

실시예 1

가용성 S. 아우레우스 소르타아제 A 를 위한 발현 플라스미드의 생성

소르타아제 유전자는 N-말단 절단된 스타필로코쿠스 아우레우스 소르타아제 A 분자 (SEQ ID NO: 21 의 아미노산 서열) 를 인코딩한다.

대장균 세포에서 가용성 소르타아제의 발현을 위한 발현 플라스미드는, 가용성 소르타아제 발현 카세트 이외에, 대장균에서 이러한 플라스미드의 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18 로부터의 복제 기점, 및 선택가능한 마커로서의 URA3 유전자, 및 IPTG 를 사용하여 전사를 유도할 수 있는 LacI 유전자를 포함한다.

가용성 소르타아제의 전사 유닛은 하기 기능성 요소를 포함한다:

- T5 프로모터,

- 정제 태그,

- N-말단 절단된 S. 아우레우스 소르타아제 A 인코딩 핵산, 및

- To 및 fd 종결 서열.

스타필로코쿠스 아우레우스 유래의 성숙한 가용성 소르타아제 A 의 아미노산 서열은 하기와 같다:

QAKPQIPKDKSKVAGYIEIPDADIKEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEENESLDDQNISIAGHTFIDRPNYQFTNLKAAKKGSMVYFKVGNETRKYKMTSIRDVKPTDVGVLDEQKGKDKQLTLITCDDYNEKTGVWEKRKIFVATEVK

(SEQ ID NO: 21).

스트렙토코쿠스 피오게네스 유래의 성숙한 가용성 소르타아제 A 의 아미노산 서열은 하기와 같다:

VLQAQMAAQQLPVIGGIAIPELGINLPIFKGLGNTELIYGAGTMKEEQVMGGENNYSLASHHIFGITGSSQMLFSPLERAQNGMSIYLTDKEKIYEYIIKDVFTVAPERVDVIDDTAGLKEVTLVTCTDIEATERIIVKGELKTEYDFDKAPADVLKAFNHSYNQVST

(SEQ ID NO: 34).

정제 태그는 아미노산 서열 MRGSHHHHHHGS (SEQ ID NO: 36) 를 갖는다.

실시예 2

소르타아제의 발현 및 분석적 특징분석

가용성 소르타아제의 재조합 생산을, 각각의 소르타아제 발현 플라스미드로 형질전환된 대장균 세포를 약 0.9 의 OD578 로 37 ℃ 에서 성장시킴으로써 (사전-배양) 수행하였다. 이러한 약 0.9 의 OD578 에서, 2 mM IPTG 를 첨가하고, 세포를 28 ℃ 에서 부가적인 24 시간 동안 성장시킴으로써 단백질 발현을 유도하였다. 그 후, 세포를 원심분리로 수확하고, 균질화기를 사용하여 고압으로 용해시켰다. 세포 용해물을 원심분리하여 세포 잔여물 (cell debris) 을 제거하고, 이어서 세포 용해물을 정제할 때까지 저온에서 (예를 들어, -80℃) 보관하였다. 가용성 소르타아제를, Ni-NTA 크로마토그래피 및 이어서 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 내독소의 고갈을 위하여, 음이온 교환 크로마토그래피를 유동식 모드 (flow through mode) 로 수행하였다. 소르타아제 제제의 단백질 농도를, 아미노산 서열을 기준으로 산출된 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 nm 에서 광학 밀도 (OD) 를 측정함으로써 측정하였다. 소르타아제의 순도 및 완전성을, 환원제 (5 mM 1,4-디티오트레이톨) 의 존재 및 부재 하에서, 및 쿠마시 브릴리언트 블루 (Coomassie brilliant blue) 로 염색하여 SDS-PAGE 에 의해 측정하였다.

단백질 농도를, 아미노산 서열을 기준으로 산출된 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 nm 에서 광학 밀도 (OD) 를 측정함으로써 측정하였다. 순도를, 환원제 (5 mM 1,4-디티오트레이톨) 의 존재 및 부재 하에서, 및 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하여 SDS-PAGE 에 의해 분석하였다.

실시예 3

C-말단 개질된 Fc-영역 폴리펩티드를 위한 발현 플라스미드의 생성

HEK293 세포에서 C-말단 개질된 Fc-영역 폴리펩티드 (LPXTG 또는 LPXTA) 의 일과성 발현을 위한 발현 플라스미드는, Fc-영역 발현 카세트 이외에, 대장균에서 이러한 플라스미드의 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18 로부터의 복제 기점, 및 대장균에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자를 포함한다.

Fc 영역 폴리펩티드의 전사 유닛은 하기 기능성 요소를 포함한다:

- 인트론 A 를 포함하는 인간 시토메갈로바이러스 (P-CMV) 로부터의 전초기 인핸서 및 프로모터,

- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역 (5'UTR),

- 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열,

- N-말단 절단된 S. 아우레우스 소르타아제 A 인코딩 핵산, 및

- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH pA).

실시예 4

Fc-영역 폴리펩티드의 일과성 발현

재조합 생산을, F17 Medium (Invitrogen Corp.) 에서 배양된 HEK293 세포 (인간 배아 신장 세포주 293-유래) 의 일과성 트랜스펙션에 의해 수행하였다. 트랜스펙션을 위하여, "293-Fectin" 트랜스펙션 시약 (Invitrogen) 을 사용하였다. 트랜스펙션을 제조업자의 지침에 명시된 바와 같이 수행하였다. 세포 배양 상청액을 트랜스펙션 후 삼 내지 칠 (3-7) 일에 수확하였다. 상청액을 저온에서 (예를 들어, -80℃) 보관하였다.

예를 들어, HEK293 세포에서 인간 면역글로불린의 재조합 발현에 대한 일반적인 정보는, 하기에 제시되어 있다: [Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203].

실시예 5

소르타아제 매개 동시 컨쥬게이션

소르타아제-매개 펩티드전이 반응을 위하여, N-말단 절단된 스타필로코쿠스 아우레우스 소르타아제 A (Δ_1-59SrtA_Staph) 및 N-말단 절단된 스트렙토코쿠스 피오게네스 소르타아제 A (Δ_1-59SrtA_Step) 를 사용하였다.

반응을, 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5 (소르타아제-완충제) 를 함유하는 완충제 중에서 수행하였다.

이용된 폴리펩티드는 하기와 같았다:

(1) C-말단에 아미노산 서열 LPETG (SEQ ID NO: 30) 를 갖는 Fc-영역 폴리펩티드,

(2) C-말단에 아미노산 서열 LPETA (SEQ ID NO: 32) 를 갖는 Fc-영역 폴리펩티드,

(3) 아미노산 서열 H2N-GGG-GSGSK(GSGS-AAA-NH2)-COOH (SEQ ID NO: 33) 을 갖는 2 개의 N-말단을 갖는 폴리펩티드.

하기의 폴리펩티드/효소 조합, 농도 및 서열을 시험하였다:

-: 이러한 화합물은 반응 혼합물에 첨가되지 않음.

(24h): 이러한 화합물은 반응이 개시되고 24 시간 후에 첨가됨.

(*): 디-N-말단 폴리펩티드의 농도가 제 2 SrtA/제 2 Fc-영역 폴리펩티드의 부피 변화로 인해 및 샘플링에 의한 총 부피의 감소로 인해 감소되기 때문에, (초기에 모든 구성성분이 혼합된 반응과 비교하여) 농도가 감소됨.

각각의 실험으로부터의 샘플을 0, 4, 8, 24, 32, 48, 56 및 72 시간 후 취하고, SDS-페이지 겔 전기영동 (2 μL 샘플, 1 μL DTT, 2.5 μL LDS, 4.5 μL H₂O, 70 ℃ 10 min.) 을 통해 분석하였다. 예상된 분자량은 SrtA 의 경우 약 22 kDa, Fc-영역 폴리펩티드 및 단일 컨쥬게이션된 생성물 (+1106 Da) 의 경우 약 30 kDa 및 3 가지 모든 모이어티를 포함하는 컨쥬게이션된 것의 경우 약 60 kDa 이었다. 결과는 도 1 에 제시되어 있다.

디-N-말단 폴리펩티드에의 2 개의 Fc-영역 폴리펩티드의 동시 컨쥬게이션이 이루어질 수 있다고 볼 수 있다. 모든 화합물 (폴리펩티드 및 효소) 이 반응 초기에 혼합되는 경우, 최상의 결과가 수득될 수 있다. 또한, 반응 완충제 중 칼슘의 존재 또는 부재의 효과는 무시할 정도라고 볼 수 있다. 나아가, 모든 3 종의 폴리펩티드를 등몰량으로 사용하면 보다 높은 수율의 2 배 컨쥬게이션된 생성물이 산출되고, 동시에 단일-컨쥬게이트 생성물의 양이 감소되는 것으로 볼 수 있다. 나아가, 폴리펩티드가 등몰 농도로 이용되는 경우, 농도가 높을수록 수율이 높아진다고 볼 수 있다. 실험 8 에서, 수율은 반응 시간이 72 시간이 될 때까지 선형으로 증가하고, 약 100 시간에서 정체기 (plateau) 에 도달하는 것으로 보인다.

실시예 6

이중 컨쥬게이트의 정제

이중 컨쥬게이트를, HiLoad 16/600 Superdex 200 prep 등급 컬럼 (GE Healthcare, Cat. No. 28-9893-35) 및 0.15 M NaCl, pH 7.2 를 포함하는 0.05 M NaPO₄ 완충제를 사용하여, 크기 배제 크로마토그래피를 통해 반응 혼합물로부터 정제하였다. 샘플 부피는 0.3 mL 였고, 루프 (loop)-부피는 2.0 mL 였다. 20 % 의 컬럼 부피 후, 0.5 μL 분획의 수집을 시작하였다.

<110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Enzymatic one-pot reaction for double polypeptide conjugation in a single step <130> P32477-WO <150> EP14198534 <151> 2014-12-17 <160> 36 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Arg-tag <400> 1 Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Arg-tag 2 <400> 2 Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His-tag <400> 3 His His His His His His 1 5 <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 4 Lys Asp His Leu Ile His Asn Val His Lys Glu Phe His Ala His Ala 1 5 10 15 His Asn Lys <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 5 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 6 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 6 Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr 1 5 10 15 Lys Asp Asp Asp Asp Lys 20 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag# <400> 7 Ala Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 8 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 9 Met Asp Val Glu Ala Trp Leu Gly Ala Arg 1 5 10 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 10 Met Asp Val Glu Ala Trp Leu Gly Ala Arg Val Pro Leu Val Glu Thr 1 5 10 15 <210> 11 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 11 Met Asp Glu Lys Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly His Val Val Glu Gly 1 5 10 15 Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro 20 25 30 Gln Gly Gln Arg Glu Pro 35 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 12 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 13 Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser 1 5 10 15 <210> 14 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 14 Lys Arg Arg Trp Lys Lys Asn Phe Ile Ala Val Ser Ala Ala Asn Arg 1 5 10 15 Phe Lys Lys Ile Ser Ser Ser Gly Ala Leu 20 25 <210> 15 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 15 Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr 1 5 10 15 Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val Cys Ala Ser 20 25 30 Gly Thr Thr Cys Gln Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu 35 40 45 <210> 16 <211> 32 <212> PRT <213> Butyrivibrio fibrisolvens <400> 16 Met Asp Trp Asn Ala Asn Ile Ala Pro Gly Asn Ser Val Glu Phe Gly 1 5 10 15 Ile Gln Gly Ala Gly Ser Val Gly Asn Val Ile Asp Ile Thr Val Glu 20 25 30 <210> 17 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chitin-binding-domain <400> 17 Thr Asn Pro Gly Val Ser Ala Trp Gln Val Asn Thr Ala Tyr Thr Ala 1 5 10 15 Gly Gln Leu Val Thr Tyr Asn Gly Lys Thr Tyr Lys Cys Leu Gln Pro 20 25 30 His Thr Ser Leu Ala Gly Trp Glu Pro Ser Asn Val Pro Ala Leu Trp 35 40 45 Gln Leu Gln 50 <210> 18 <211> 209 <212> PRT <213> Chondrus crispus <400> 18 Met Pro Glu Ile Lys Leu Thr Tyr Phe Asp Met Arg Gly Arg Ala Glu 1 5 10 15 Ala Ser Arg Leu Ala Leu Val Val Gly Glu Ile Pro Phe Glu Asp Glu 20 25 30 Arg Val Val Phe Asp His Trp Lys Glu Ala Lys Pro Lys Thr Pro Tyr 35 40 45 Ala Ala Leu Pro Met Leu Thr Val Asp Gly Met Gln Val Ala Gln Ser 50 55 60 Asp Ala Ile Leu Arg Tyr Cys Gly Lys Leu Ala Gly Leu Tyr Pro Ser 65 70 75 80 Asp Pro Leu Glu Ala Ala Lys Val Asp Glu Val Gly Gly Val Ile Asp 85 90 95 Asp Val Thr His Ala Met Tyr Arg Tyr Arg Gly Asp Asp Lys Asp Lys 100 105 110 Leu Arg Glu Glu Arg Asp Lys Phe Ser Lys Val Asp Val Pro Arg Tyr 115 120 125 Val Gly Ala Leu Glu Lys Arg Leu Glu Ala Phe Gly Asp Gly Pro Trp 130 135 140 Ala Val Gly Gly Asn Met Thr Ile Ala Asp Leu His Ile Cys His Leu 145 150 155 160 Val Thr Asn Ile Arg Cys Gly Met Leu Asp Phe Val Asp Lys Asp Leu 165 170 175 Leu Glu Gly Tyr Val Arg Ile Val Lys Ser Tyr Ser Ala Val Met Glu 180 185 190 His Pro Lys Val Thr Glu Trp Tyr Glu Lys Lys Pro Val Lys Met Phe 195 200 205 Ser <210> 19 <211> 396 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 19 Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr 1 5 10 15 Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Gly Lys 20 25 30 Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu 35 40 45 Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu 50 55 60 His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly 65 70 75 80 Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr 85 90 95 Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln 100 105 110 Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys 115 120 125 Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn 130 135 140 Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala 145 150 155 160 Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn 165 170 175 Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly 180 185 190 Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly 195 200 205 Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu 210 215 220 Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu 225 230 235 240 Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp 245 250 255 Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val Thr Val 260 265 270 Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu 275 280 285 Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu 290 295 300 Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn 305 310 315 320 Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu 325 330 335 Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys 340 345 350 Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala 355 360 365 Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp 370 375 380 Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Arg Ile Thr Lys 385 390 395 <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> sortase amino acid motif of Staphylococcus aureus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> Xaa = can be any of the 20 proteinogenic amino acids <400> 20 Leu Pro Xaa Thr Gly 1 5 <210> 21 <211> 147 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mature soluble sortase <400> 21 Gln Ala Lys Pro Gln Ile Pro Lys Asp Lys Ser Lys Val Ala Gly Tyr 1 5 10 15 Ile Glu Ile Pro Asp Ala Asp Ile Lys Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro 20 25 30 Ala Thr Pro Glu Gln Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Ala Glu Glu Asn 35 40 45 Glu Ser Leu Asp Asp Gln Asn Ile Ser Ile Ala Gly His Thr Phe Ile 50 55 60 Asp Arg Pro Asn Tyr Gln Phe Thr Asn Leu Lys Ala Ala Lys Lys Gly 65 70 75 80 Ser Met Val Tyr Phe Lys Val Gly Asn Glu Thr Arg Lys Tyr Lys Met 85 90 95 Thr Ser Ile Arg Asp Val Lys Pro Thr Asp Val Gly Val Leu Asp Glu 100 105 110 Gln Lys Gly Lys Asp Lys Gln Leu Thr Leu Ile Thr Cys Asp Asp Tyr 115 120 125 Asn Glu Lys Thr Gly Val Trp Glu Lys Arg Lys Ile Phe Val Ala Thr 130 135 140 Glu Val Lys 145 <210> 22 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligoglycine motif <400> 22 Gly Gly 1 <210> 23 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligoglycine motif <400> 23 Gly Gly Gly 1 <210> 24 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligoglycine motif <400> 24 Gly Gly Gly Gly 1 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligoglycine motif <400> 25 Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 26 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligoalanine motif <400> 26 Ala Ala 1 <210> 27 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligoalanine motif <400> 27 Ala Ala Ala 1 <210> 28 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligoalanine motif <400> 28 Ala Ala Ala Ala 1 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligoalanine motif <400> 29 Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> sortase motif <400> 30 Leu Pro Glu Thr Gly 1 5 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> sortase amino acid motif of sortase from Streptococcus pyogenes <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> Xaa can be any one of the 20 protenaceous amino acid residues <400> 31 Leu Pro Xaa Thr Ala 1 5 <210> 32 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> sortase motif LPETA <400> 32 Leu Pro Glu Thr Ala 1 5 <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bi-N-terminal polypeptide <220> <221> PEPTIDE <222> (8) <223> conjugated via the epsilon amino group - GSGSAAA <400> 33 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Lys 1 5 <210> 34 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> soluble Streptococcus pyogenes Sortase A <400> 34 Val Leu Gln Ala Gln Met Ala Ala Gln Gln Leu Pro Val Ile Gly Gly 1 5 10 15 Ile Ala Ile Pro Glu Leu Gly Ile Asn Leu Pro Ile Phe Lys Gly Leu 20 25 30 Gly Asn Thr Glu Leu Ile Tyr Gly Ala Gly Thr Met Lys Glu Glu Gln 35 40 45 Val Met Gly Gly Glu Asn Asn Tyr Ser Leu Ala Ser His His Ile Phe 50 55 60 Gly Ile Thr Gly Ser Ser Gln Met Leu Phe Ser Pro Leu Glu Arg Ala 65 70 75 80 Gln Asn Gly Met Ser Ile Tyr Leu Thr Asp Lys Glu Lys Ile Tyr Glu 85 90 95 Tyr Ile Ile Lys Asp Val Phe Thr Val Ala Pro Glu Arg Val Asp Val 100 105 110 Ile Asp Asp Thr Ala Gly Leu Lys Glu Val Thr Leu Val Thr Cys Thr 115 120 125 Asp Ile Glu Ala Thr Glu Arg Ile Ile Val Lys Gly Glu Leu Lys Thr 130 135 140 Glu Tyr Asp Phe Asp Lys Ala Pro Ala Asp Val Leu Lys Ala Phe Asn 145 150 155 160 His Ser Tyr Asn Gln Val Ser Thr 165 <210> 35 <400> 35 000 <210> 36 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> purification tag <400> 36 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser 1 5 10

Claims

3 종의 폴리펩티드의 효소 컨쥬게이션 생성물의 제조 방법으로서,
- 하기를 동시에 인큐베이션하는 단계:
a) i) 아미노산 서열 LPXTG (SEQ ID NO: 20, 여기서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함하는, 제 1 폴리펩티드,
ii) 아미노산 서열 LPXTA (SEQ ID NO: 31, 여기서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함하는, 제 2 폴리펩티드,
iii) 2 개의 N-말단을 가지며, 이의 제 1 N-말단에 올리고-글리신 G_m (m = 2 (SEQ ID NO: 22), 또는 3 (SEQ ID NO: 23), 또는 4 (SEQ ID NO: 24), 또는 5 (SEQ ID NO: 25)) 아미노산 서열 및 이의 제 2 N-말단에 올리고-알라닌 A_m (m = 2 (SEQ ID NO: 26), 또는 3 (SEQ ID NO: 27), 또는 4 (SEQ ID NO: 28), 또는 5 (SEQ ID NO: 29)) 아미노산 서열을 갖는, 제 3 폴리펩티드,
iv) 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 소르타아제 (sortase) A 에서 유래된, 소르타아제 활성을 갖는, 제 4 폴리펩티드, 및
v) 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) 소르타아제 A 에서 유래된, 소르타아제 활성을 갖는, 제 5 폴리펩티드,
또는
b) i) 아미노산 서열 LPXTG (SEQ ID NO: 20, 여기서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함하는, 제 1 폴리펩티드,
ii) N-말단에 올리고-글리신 G_m (m = 2 (SEQ ID NO: 22), 또는 3 (SEQ ID NO: 23), 또는 4 (SEQ ID NO: 24), 또는 5 (SEQ ID NO: 25)) 아미노산 서열을 갖고, 아미노산 서열 LPXTA (SEQ ID NO: 31, 여기서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함하는, 제 2 폴리펩티드,
iii) N-말단에 올리고-알라닌 A_m (m = 2 (SEQ ID NO: 26), 또는 3 (SEQ ID NO: 27), 또는 4 (SEQ ID NO: 28), 또는 5 (SEQ ID NO: 29)) 아미노산 서열을 갖는, 제 3 폴리펩티드,
iv) 스타필로코쿠스 아우레우스 소르타아제 A 에서 유래된, 소르타아제 활성을 갖는, 제 4 폴리펩티드, 및
v) 스트렙토코쿠스 피오게네스 소르타아제 A 에서 유래된, 소르타아제 활성을 갖는, 제 5 폴리펩티드,
또는
c) i) 아미노산 서열 LPXTA (SEQ ID NO: 31, 여기서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함하는, 제 1 폴리펩티드,
ii) N-말단에 올리고-알라닌 A_m (m = 2 (SEQ ID NO: 26), 또는 3 (SEQ ID NO: 27), 또는 4 (SEQ ID NO: 28), 또는 5 (SEQ ID NO: 29)) 아미노산 서열을 갖고, 아미노산 서열 LPXTG (SEQ ID NO: 20, 여기서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함하는, 제 2 폴리펩티드,
iii) N-말단에 올리고-글리신 G_m (m = 2 (SEQ ID NO: 22), 또는 3 (SEQ ID NO: 23), 또는 4 (SEQ ID NO: 24), 또는 5 (SEQ ID NO: 25)) 아미노산 서열을 갖는, 제 3 폴리펩티드,
iv) 스타필로코쿠스 아우레우스 소르타아제 A 에서 유래된, 소르타아제 활성을 갖는, 제 4 폴리펩티드, 및
v) 스트렙토코쿠스 피오게네스 소르타아제 A 에서 유래된, 소르타아제 활성을 갖는, 제 5 폴리펩티드,
및
- 반응 혼합물로부터 컨쥬게이트를 회수하여, 3 종의 폴리펩티드의 효소 컨쥬게이션 생성물을 생성하는 단계
를 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 제 1, 제 2 및 제 3 폴리펩티드가 대략 등몰 농도로 존재하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 올리고-알라닌이 디-알라닌 (SEQ ID NO: 26) 또는 트리-알라닌 (SEQ ID NO: 27) 인 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고-글리신이 디-글리신 (SEQ ID NO: 22) 또는 트리-글리신 (SEQ ID NO: 23) 인 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 4 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 21 의 아미노산 서열을 갖는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 5 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 34 의 아미노산 서열을 갖는 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 폴리펩티드, 제 2 폴리펩티드 및 제 3 폴리펩티드가, 서로 독립적으로, 항체 가변 도메인, 항체 중쇄 Fab-단편, 항체 Fc-영역, 및 태그로부터 선택되는 방법.