CN103764665A

CN103764665A - 使用分选酶安装用于蛋白质连接的点击化学柄

Info

Publication number: CN103764665A
Application number: CN201280042272.7A
Authority: CN
Inventors: 希德·L·普莱赫; 马丁·D·威特; 尼古拉斯·C·约德
Original assignee: Whitehead Institute for Biomedical Research
Current assignee: Whitehead Institute for Biomedical Research
Priority date: 2011-06-28
Filing date: 2012-06-28
Publication date: 2014-04-30
Also published as: EP2726494A1; CA2840409A1; EP2726494B1; WO2013003555A1; JP2014525904A; US10081684B2; EP2726494A4; AU2012275390A1; US11028185B2; US20190112394A1; US20140249296A1

Abstract

本发明提供了将点击化学柄安装至靶蛋白上的方法和试剂以及包含点击化学柄的修饰蛋白。另外，本文中公开了嵌合蛋白，其包含借助点击化学结合的两种蛋白质，例如双特异性抗体，以及其产生的方法及应用。

Description

使用分选酶安装用于蛋白质连接的点击化学柄

相关申请

本发明权利根据35U.S.C.§119（e）要求2011年6月28日提交的名为“使用分选酶安装用于蛋白质连接的点击化学柄”的美国临时专利申请U.S.S.N.61/502,237和2012年4月13日提交的名为“分选酶修饰的VHH结构域及其用途”的美国临时专利申U.S.S.N.61/624,114的优先权，所述文献的每一篇通过引用的方式并入本文。

政府资助

本发明借助美国政府支持在国家健康研究所（NIH）资助的基金ROIU54AI057159、ROI AI033456和ROI AI087879下做出。美国政府享有本发明中的某些权利。

背景技术

蛋白质工程正在变成蛋白质生物化学的许多领域中广泛使用的工具。一个工程化方法是受控的蛋白质连接。天然化学的蛋白质连接依赖于合成的肽酯的有效制备，这可能在技术上难以制备多种蛋白质。重组技术可以用来产生将一种蛋白质的C末端与另一种蛋白质的N末端结合的蛋白质-蛋白质融合物。基于蛋白质内含子的蛋白质连接系统也可以用来结合蛋白质。蛋白质内含子介导的这种连接方法的前提是将靶蛋白表达为具有该内含子的正确折叠的融合物，这经常是具有挑战性。常规的天然和重组连接技术的困难明显限制蛋白质连接法的应用。

由分选酶催化的转肽反应已经显示出作为用各种形式的修饰衍生化蛋白质的通用方法。对于常规的分选酶修饰，将靶蛋白工程化以在它们的C-末端附近含有分选酶识别基序（LPXT）。与含有一个或多个N末端甘氨酸残基的合成肽和重组分选酶孵育时，这些人工分选酶底物发生转酰基反应，使得C末端残基到苏氨酸残基与合成的寡甘氨酸肽交换，使得蛋白质C末端连接至合成肽的N末端。

发明概述

本发明的一些方面涉及分选酶介导的蛋白质修饰，尤其关于在蛋白质序列上安装反应性化学基团，例如，点击化学柄。本发明提供了在蛋白质上安装反应性化学基团的方法和试剂，也提供了修饰的蛋白质，例如，包含C末端或N末端点击化学柄的蛋白质。另外，本发明提供了使根据本发明多方面修饰的两种蛋白结合的方法。这类方法可用来使单聚蛋白质二聚化并可用来产生组合有异源的单一蛋白的特征的嵌合蛋白，例如，双特异性嵌合抗体。

本发明的一些方面提供了利用分选酶转酰基反应向蛋白质N末端或C末端添加点击化学柄的方法、组合物和试剂。本发明的一些方面提供了在靠近C末端包含分选酶识别基序（例如，LPXT）的蛋白质的C末端处或与之邻近安装点击化学柄的方法。本发明的一些方面提供了在包含一个或多个N末端甘氨酸残基的蛋白质的N末端上安装点击化学柄的方法。

例如，一些实施方式提供了将靶蛋白与C末端点击化学柄结合的方法。在一些实施方式中，该方法包括为靶蛋白提供例如，作为C末端融合物的C末端分选酶识别基序（例如，LPXT）。在一些实施方式中，该方法还包括使靶蛋白与包含1-10个N末端甘氨酸残基或N末端烷基胺基团和点击化学柄的试剂（例如，肽、蛋白质或化合物）接触。在一些实施方式中，在分选酶存在的情况下，在适于分选酶使靶蛋白和包含点击化学柄的肽转酰胺化的条件下进行接触，因此使靶蛋白与点击化学柄结合。

一些实施方式提供了使靶蛋白与N末端点击化学柄结合的方法。在一些实施方式中，该方法包括为靶蛋白提供例如作为N末端融合物的1-10个N末端甘氨酸残基或N末端烷基胺基团。在一些实施方式中，该方法还包括使靶蛋白与包含分选酶识别基序（例如，LPXT）和点击化学柄的肽接触。在一些实施方式中，在分选酶存在的情况下，在适于分选酶使靶蛋白和肽转酰胺化的条件下进行接触，因此使靶蛋白与点击化学柄结合。

使用本文所述的方法，可以将任何化学配基安装至蛋白质上。根据本发明的一些方面，点击化学柄是特别有用的。点击化学柄是提供可以参与点击化学反应的反应基团的化学配基。点击化学反应和用于点击化学反应的合适化学基团是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于末端炔烃、叠氮化物、有张力的炔烃、二烯、亲二烯体、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇和烯烃。例如，在一些实施方式中，叠氮化物和炔烃用于点击化学反应中。

本发明的一些方面提供了修饰的蛋白质，例如，包含C末端或N末端点击化学柄的蛋白质。这类蛋白质可以结合于其他分子，例如，包括可以与蛋白质的点击化学柄反应的配基的蛋白质、核酸、聚合物、脂类或小分子。在一些实施方式中，修饰的蛋白质包含抗原结合结构域，例如，抗体（例如，骆驼抗体、单一结构域抗体、VHH结构域、纳米体或scFv）的抗原结合结构域或其抗原结合片段。

本发明的一些方面提供了借助点击化学使两个蛋白质分子结合或连接的方法。在一些实施方式中，将第一点击化学柄安装至第一蛋白质上，并且将第二点击化学柄安装至第二蛋白质上，其中第一点击化学柄可以与第二点击化学柄形成共价键。例如，一些实施方式提供用于翻译后结合两种蛋白质以形成嵌合蛋白的方法。在一些实施方式中，该方法包括使得与第一点击化学柄结合的第一蛋白质和与第二点击化学柄结合的第二蛋白质在适于第一点击化学柄与第二点击化学柄反应的条件下接触，因此产生了包含经共价键连接的两个蛋白质的嵌合蛋白。

本文中提供的方法允许产生不能通过重组手段（例如，表达蛋白质融合物）实现的蛋白质N末端-N末端结合物和C末端-C末端结合物。例如，在一些实施方式中，第一点击化学柄与第一蛋白质的N末端结合，并且第二点击化学柄与第二蛋白质的N末端结合，并且嵌合蛋白是两种蛋白质的N末端-N末端结合物。在其他实施方式中，第一点击化学柄与第一蛋白质的C末端结合，并且第二点击化学柄与第二蛋白质的C末端结合，并且嵌合蛋白包括两种蛋白质的C末端-C末端结合物。在一些实施方式中，点击柄用来连接第一多肽和第二多肽的C末端和N-末端，例如，作为重组地产生融合蛋白的替代。这是特别有用的，例如，如果融合蛋白非常大、有毒、难以纯化、由难以克隆的核酸序列编码或为避免克隆。

本发明的一些实施方式提供了嵌合蛋白，例如，根据本发明的多个方面已经通过翻译后将两种蛋白质结合产生嵌合蛋白。一些实施方式提供双特异性嵌合抗体，包括借助点击化学结合在一起的两个抗原结合蛋白，例如，单一结构域抗体。一些实施方式提供双特异性嵌合抗体，包括包含分选酶识别序列的第一抗体或抗原结合抗体片段和包含分选酶识别序列的第二抗体或抗原结合抗体片段；并且第一抗体和第二抗体或抗体片段借助点击化学结合在一起。

应当指出本发明不限于抗原结合蛋白的结合，反而任何蛋白质可以与包含合适点击化学柄或可以根据本文所述的方法或本领域技术人员已知的方法在其上安装这种柄的任何分子结合。因此，一些实施方式提供嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含具有分选酶识别基序（例如，LPXT）的靶蛋白和借助点击化学与该蛋白质结合的第二分子。在一些实施方式中，该嵌合蛋白通过翻译后在靶蛋白上安装点击化学柄并且使包含点击化学柄的靶蛋白与第二分子接触来产生，其中所述第二分子包含可以与靶蛋白的点击化学柄反应以形成共价键的第二点击化学柄。

一些实施方式提供修饰的蛋白质，例如，包含分选酶识别基序（例如，LPXT）和与所述分选酶识别基序结合（例如，直接与分选酶识别基序的氨基酸之一结合或经接头结合）的点击化学柄的蛋白质。在一些实施方式中，修饰的蛋白质包括抗原结合结构域，例如，抗体或抗原结合抗体片段。本文中提供的示例性修饰的蛋白质包括但不限于骆驼抗体或其抗原结合片段、VHH结构域、单一结构域抗体、纳米体、scFv、亲和体、模拟抗体Anticalin、DARPin或Adnectin。在一些实施方式中，点击化学柄位于蛋白质的C末端处，而在其他实施方式中，点击化学柄位于蛋白质的N末端处。在一些实施方式中，点击化学柄选自末端炔烃、叠氮化物、有张力的炔烃、二烯、亲二烯体、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇和烯烃。

本发明的一些实施方式提供了试剂盒，所述试剂盒包含可用于实施本文中提供的方法的一种或多种试剂。例如，在一些实施方式中，本发明提供的试剂盒包含与第一点击化学柄结合的包含1-10个甘氨酸残基或末端烷基胺的第一肽和与第二点击化学柄结合的包含分选酶识别基序的第二肽，其中第一肽和第二肽的点击化学柄可以反应。在一些实施方式中，该试剂盒包含与第一点击化学柄结合的包含1-10个甘氨酸残基或末端烷基胺的第一肽和与第二点击化学柄结合的包含1-10个甘氨酸残基或末端烷基胺的第二肽，其中第一肽和第二肽的点击化学柄可以反应。在一些实施方式中，该试剂盒包含与第一点击化学柄结合的包含分选酶识别基序的第一肽和与第二点击化学柄结合的包含分选酶识别基序的第二肽，其中第一肽和第二肽的点击化学柄能够彼此反应。在一些实施方式中，该试剂盒还包含分选酶。在一些实施方式中，试剂盒还包含使用说明书、催化剂（例如金属催化剂）和/或反应缓冲液。

以上简述意在概述本发明的一些方面，不得以任何方式解释为限制本发明。本发明的其他方面、优点和实施方式在本文中描述，并且其他实施方式将是本领域技术人员基于本公开而显而易见的。以上援引的全部参考文献的完整内容通过引用的方式并入本文。

附图简述

图1.使用分选酶和点击化学产生C-C蛋白质二聚体和N-N蛋白质二聚体。在上面的图中，术语“LEPTGG”指分选酶识别基序，例如，包含LPXT序列如LPETGG（SEQ ID NO:1）的识别基序。序列从顶部至底部分别对应于SEQ ID NOs XX-XX。

图2.A）分选酶催化的转酰基反应的示意图。B）适于产生结合的蛋白质的示例性点击化学柄和反应。C）在抗体1和2上安装C末端点击柄A和B。D）抗体1和2的二聚化。序列从顶部至底部分别对应于SEQ ID NOs XX-XX。

图3.A）可以利用点击化学并入到蛋白质上的示例性其他官能团。B）聚乙二醇化双特异性抗体和蛋白质三聚体的合成。

图4.使用N末端标记的泛素类似物优化点击化学。A）用点击柄标记C₃Ub-VME。B）确定形成的构建体的活性。将UbVME单体和二聚体与UCHL3孵育。DUB的标记导致分子量变化。序列从顶部至底部分别对应于SEQ ID NOs XX-XX。

图5.使用泛素作为模型蛋白的N末端分选标记。序列从顶部至底部分别对应于SEQ ID NOs XX-XX。

图6.叠氮化物-Ub和环辛炔-Ub的点击化学N-N二聚化的动力学。

图7.抗-p2M和抗-GFP抗体的C-C二聚化示意图。术语“LEPTGG”指分选酶识别基序，例如，包含LPXT序列如LPETGG（SEQ ID NO:1）的识别基序。序列从顶部至底部分别对应于SEQ ID NOs XX-XX。

图8.通过尺寸排阻色谱纯化。

图9.抗-GFP纳米体的分选标记。

图10.干扰素α和抗-GFP（抗-eGFP）纳米体的分选标记。37：C末端叠氮化物；57：C末端环辛炔；40：N末端环辛炔；41：N末端叠氮化物；LPETGG：SEQ ID NO:1。

图11.INFA和抗-GFP的分选标记。LPETGG：SEQ ID NO:1。

图12.方法的示意性概述。序列从顶部至底部分别对应于SEQ ID NOsXX-XX。

图13.泛素二聚化的条件。（A）示意性方法。（B）泛素用1或2分选标记3小时并用LC/MS分析。（C、D）泛素二聚化。叠氮化修饰的泛素（2nmol）与等摩尔量的装配泛素的环辛炔在13μL H₂O中孵育。在15%SDS-PAGE上解析二聚体并且通过针对泛素的考马斯（C）和（D）免疫印迹法检测蛋白质。（E）与DIBAC-泛素（0.1nmol）孵育所指示时间的叠氮基-泛素（0.1nmol）在TRIS/Tricine凝胶上解析，通过考马斯蓝染色，并且通过ImageJ将所产生的蛋白质定量。如下确定单体和二聚体的相对量/泳道：二聚体的相对量=二聚体的强度/总强度；单体的相对量=单体的强度/总强度。（F）用泛素或UbVME标记UCHL3；左小图：考马斯染色的凝胶，右小图：针对his₆标签的免疫印迹法。序列从顶部至底部分别对应于SEQ ID NOs XX-XX。

图14.合成N-N融合的蛋白质。（A）所用的N末端探针1和2的结构。（B、C）用二聚体UbVME标记具有His标签的UCHL3。（B）考马斯亮兰染色的tris-tricine凝胶。（C）使用抗His抗体的免疫印迹。Ub-UbVME*：与单一UCHL3结合的泛素-UbVME。UbVME₂*：与单一UCHL3分子结合的二聚体UbVME。UbVME₂*：与两个UCHL3分子结合的二聚体UbVME。

图15.C-C同型二聚抗体。（A）探针3和4的结构。（B）抗GFP的二聚化。（C）显示两种抗GFP均结合GFP的尺寸排阻实验。红线：抗GFP二聚体，绿线：GFP，浅蓝色线：抗-GFP二聚体+2.5μL GFP，深蓝色线：抗GFP+10μL GFP，黑线：抗-GFP二聚体+20μL GFP（过量）。

图16.（A）纯化用探针4分选标记的抗GFP。考马斯亮兰染色的凝胶（B）和纯化后的用4标记的抗-GFP的质谱（C）。（D）GFP-3和aGFP-4的二聚化。TRIS（50mM，pH7.4，150mM NaCl）中的aGFP-3（2.5μg，0.17nmol）与等摩尔量的aGFP-4在室温孵育所指示的时间。在TRIS/tricine SDS-PAGE上将二聚化产物与单体分离。蛋白质通过荧光成像（λ_ex=532，λ_em=580，左小图）和考马斯亮兰（中部小图）被可视化并且被定量（右小图）。如所述对泛素确定单体对二聚体的相对量。（E）在Superdex^TM7510/30上纯化抗-GFP二聚体。（F）在15%SDS-PAGE上分析浓缩的纯化的蛋白质。

图17.在GFP存在和不存在下孵育的单体抗GFP-3和抗GFP-4的Superdex^TM20010/30洗脱图。

图18.将以12.5mL（1）和15.5mL（2）与30μL GFP孵育的抗GFP二聚体洗脱的峰浓缩并加载于天然PAGE上。

图19.荧光抗GFP-4-VHH7-3（A）和非荧光抗GFP-4-VHH7-5（B）的二聚化和纯化。

图20.（A）用抗MHC II-抗GFP抗体对小鼠淋巴结细胞的FACS染色。上面的图：在野生型细胞中观察染色。下面的图：II类MHC缺损细胞的染色。（B）GFP的体内递送。用50μg双特异性注射小鼠，并且腹内直接接受或在静脉内注射50μg GFP1小时后。通过流式细胞术分析染色的细胞。

图21.用抗MHC II-抗GFP抗体对小鼠淋巴结细胞的FACS染色。上面的小图：在野生型细胞中观察染色。下面的小图：II类MHC缺损细胞的染色。

图22.产生aGFP与VHH7、IL2和IFN的异二聚体。

定义

下文更详细地描述特定官能团和化学术语的定义。出于本发明的目的，化学元素根据CAS版本，化学和物理学手册，第75版，封面内页元素周期表确定，并且特定官能团通常如其中所述那样定义。另外，有机化学的一般原理以及特定官能配基和反应性在有机化学（Organic Chemistry）,ThomasSorrell,大学科学书籍,索萨利托,1999；Smith和March高等有机化学（March's Advanced Organic Chemistry）,第5版,John Wiley&Sons公司,纽约,2001；Larock,有机官能团转换（Comprehensive Organic Transformations）,VCH出版社,纽约，1989；Carruthers,当代有机合成方法（Some ModernMethods of Organic Synthesis）,第3版,英国剑桥大学出版社,剑桥,1987中描述。

如本文所用，术语“脂族的”包括饱和及不饱和、非芳族的、直链（即，非支链）、支链、非环和环状（即，碳环）烃，它们任选地被一个或多个官能团取代。如本领域普通技术人员将领会，在本文中“脂族的”意在包括但不限于烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基和环炔基配基。因此，如本文所用，术语“烷基”包括直链、支链和环状烷基。类似的常规适用于其他类属术语，如“烯基”、“炔基”等。另外，如本文所用，术语“烷基”、“烯基”、“炔基”等涵盖取代和未取代的基团。在某些实施方式中，如本文所用，“脂族的”用来指示具有1-20个碳原子（C_1-20脂族）的那些（环状、非环状、取代、未取代、支链或非支链）脂族基团。在某些实施方式中，脂族基团具有1-10个碳原子（C_1-10脂族）。在某些实施方式中，脂族基团具有1-6个碳原子（C_1-6脂族）。在某些实施方式中，脂族基团具有1-5个碳原子（C_1-5脂族）。在某些实施方式中，脂族基团具有1-4个碳原子（C_1-4脂族）。在某些实施方式中，脂族基团具有1-3个碳原子（C_1-3脂族）。在某些实施方式中，脂族基团具有1-2个碳原子（C_1-2脂族）。脂族基团取代基包含但不限于本文所述的导致稳定的配基形成的任何取代基。

如本文所用，术语“烷基”指通过移除单个氢原子由烃部分衍生的含有1至20个之间碳原子的饱和直链或支链烃基。在一些实施方式中，本发明中使用的烷基含有1-20个碳原子（C_1-20烷基）。在另一个实施方式中，所用的烷基含有1-15个碳原子（C_1-15烷基）。在另一个实施方式中，所用的烷基含有1-10个碳原子（C_1-10烷基）。在另一个实施方式中，所用的烷基含有1-8碳原子（C_1-8烷基）。在另一个实施方式中，所用的烷基含有1-6个碳原子（C_1-6烷基）。在另一个实施方式中，所用的烷基含有1-5个碳原子（C_1-5烷基）。在另一个实施方式中，所用的烷基含有1-4个碳原子（C_1-4烷基）。在另一个实施方式中，所用的烷基含有1-3个碳原子（C_1-3烷基）。在另一个实施方式中，所用的烷基含有1-2个碳原子（C_1-2烷基）。烷基的例子包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、仲戊基、异戊基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基、仲己基、正庚基、正辛基、正癸基、正十一烷基、十二烷基等，它们可以带有一个或多个取代基。烷基取代基包含但不限于本文所述的导致稳定的配基形成的任何取代基。如本文所用，术语“亚烷基”指通过移除两个氢原子由如本文定义的烷基衍生的双基。亚烷基可以是环状或非环的，支链或非支链的，取代或未取代的。亚烷基取代基包含但不限于本文所述的导致稳定的配基形成的任何取代基。

如本文所用，术语“烯基”指通过移除单个氢原子由具有至少一个碳-碳双键的直链或支链烃部分衍生的单价基团。在某些实施方式中，本发明中使用的烯基含有2-20个碳原子（C_2-20烯基）。在一些实施方式中，本发明中使用的烯基含有2-15个碳原子（C_2-15烯基）。在另一个实施方式中，使用的烯基含有2-10个碳原子（C_2-10烯基）。在另外的实施方式中，烯基含有2-8个碳原子（C_2-8烯基）。在另外的其他实施方式中，烯基含有2-6个碳原子（C_2-6烯基）。在另外的其他实施方式中，烯基含有2-5个碳原子（C_2-5烯基）。在另外的其他实施方式中，烯基含有2-4个碳原子（C_2-4烯基）。在另外的其他实施方式中，烯基含有2-3个碳原子（C_2-3烯基）。在另外的其他实施方式中，烯基含有2个碳原子（C₂烯基）。烯基包括，例如，乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基等，它们可以带有一个或多个取代基。烯基取代基包含但不限于本文所述的导致稳定的配基形成的任何取代基。如本文所用，术语“亚烯基”指通过移除两个氢原子由如本文定义的烯基衍生的双基。亚烯基可以是环状或非环的，支链或非支链的，取代或未取代的。亚烯基取代基包含但不限于本文所述的导致稳定的配基形成的任何取代基。

如本文所用，术语“炔基”指通过移除单个氢原子由具有至少一个碳-碳叁键的直链或支链烃衍生的单价基团。在某些实施方式中，本发明中使用的炔基含有2-20个碳原子（C_2-20炔基）。在一些实施方式中，本发明中使用的炔基含有2-15个碳原子（C_2-15炔基）。在另一个实施方式中，使用的炔基含有2-10个碳原子（C_2-10炔基）。在另外的实施方式中，炔基含有2-8个碳原子（C_2-8炔基）。在另外的实施方式中，炔基含有2-6个碳原子（C_2-6炔基）。在另外的实施方式中，炔基含有2-5个碳原子（C_2-5炔基）。在另外的实施方式中，炔基含有2-4个碳原子（C_2-4炔基）。在另外的实施方式中，炔基含有2-3个碳原子（C_2-3炔基）。在另外的实施方式中，炔基含有2个碳原子（C₂炔基）。代表性炔基包括但不限于，乙炔基、2-丙炔基（炔丙基）、1-丙炔基等，它们可以带有一个或多个取代基。炔基取代基包含但不限于本文所述的导致稳定的配基形成的任何取代基。如本文所用，术语“亚炔基”指通过移除两个氢原子由如本文定义的炔基衍生的双基。亚炔基可以是环状或非环的，支链或非支链的，取代或未取代的。亚炔基取代基包含但不限于本文所述的导致稳定的配基形成的任何取代基。

如本文所用，术语“碳环”或“碳环基”指含有3-10个碳环原子的环状脂族基团（C_3-10碳环）。碳环基取代基包含但不限于本文所述的导致稳定的配基形成的任何取代基。

如本文所用，术语“杂脂族”指如本文定义的脂族部分，其包括饱和及不饱和、非芳族的、直链（即，非支链）、支链、非环和环状（即，杂环）或多环状烃，它们任选地被一个或多个官能团取代，并且进一步在碳原子之间含有一个或多个杂原子（例如，氧、硫、氮、磷或硅原子）。在某些实施方式中，杂脂族配基通过将其上的一个或多个氢原子独立置换成一个或多个取代基进行取代。如本领域普通技术人员将领会，“杂脂族”在本文中意在包括，但不限于杂烷基、杂烯基、杂炔基、杂环烷基、杂环烯基和杂环炔基部分。因而，术语“杂脂族”包括术语“杂烷基”、“杂烯基”、“杂炔基”等。另外，如本文所用，术语“杂烷基”、“杂烯基”、“杂炔基”等涵盖取代和未取代的基团。在某些实施方式中，如本文所用，“杂脂族的”用来指示具有1-20个碳原子和1-6个杂原子（C_1-20杂脂族）的那些（环状、非环状、取代、未取代、支链或非支链）杂脂族基团。在某些实施方式中，杂脂族基团含有1-10个碳原子和1-4个杂原子（C_1-10杂脂族）。在某些实施方式中，杂脂族基团含有1-6个碳原子和1-3个杂原子（C_1-6杂脂族）。在某些实施方式中，杂脂族基团含有1-5个碳原子和1-3个杂原子（C_1-5杂脂族）。在某些实施方式中，杂脂族基团含有1-4个碳原子和1-2个杂原子（C_1-4杂脂族）。在某些实施方式中，杂脂族基团含有1-3个碳原子和1个杂原子（C_1-3杂脂族）。在某些实施方式中，杂脂族基团含有1-2个碳原子和1个杂原子（C_1-2杂脂族）。杂脂族基团取代基包含但不限于本文所述的导致稳定的配基形成的任何取代基。

如本文所用，术语“杂烷基”指如本文定义的烷基配基，其在碳原子之间含有一个或多个杂原子（例如，氧、硫、氮、磷或硅原子）。在某些实施方式中，杂烷基含有1-20个碳原子和1-6个杂原子（C_1-20杂烷基）。在某些实施方式中，杂烷基含有1-10个碳原子和1-4个杂原子（C_1-10杂烷基）。在某些实施方式中，杂烷基含有1-6个碳原子和1-3个杂原子（C_1-6杂烷基）。在某些实施方式中，杂烷基含有1-5个碳原子和1-3个杂原子（C_1-5杂烷基）。在某些实施方式中，杂烷基含有1-4个碳原子和1-2个杂原子（C_1-4杂烷基）。在某些实施方式中，杂烷基含有1-3个碳原子和1个杂原子（C_1-3杂烷基）。在某些实施方式中，杂烷基含有1-2个碳原子和1个杂原子（C_1-2杂烷基）。如本文所用，术语“杂亚烷基”指通过移除两个氢原子由如本文定义的杂烷基衍生的双基。杂亚烷基可以是环状或非环的，支链或非支链的，取代或未取代的。杂亚烷基取代基包含但不限于本文所述的导致稳定的配基形成的任何取代基。

如本文所用，术语“杂烯基”指如本文定义的烯基部分，其在碳原子之间还含有一个或多个杂原子（例如，氧、硫、氮、磷或硅原子）。在某些实施方式中，杂烯基含有2-20个碳原子和1-6个杂原子（C_2-20杂烯基）。在某些实施方式中，杂烯基含有2-10个碳原子和1-4个杂原子（C_2-10杂烯基）。在某些实施方式中，杂烯基含有2-6个碳原子和1-3个杂原子（C_2-6杂烯基）。在某些实施方式中，杂烯基含有2-5个碳原子和1-3个杂原子（C_2-5杂烯基）。在某些实施方式中，杂烯基含有2-4个碳原子和1-2个杂原子（C_2-4杂烯基）。在某些实施方式中，杂烯基含有2-3个碳原子和1个杂原子（C_2-3杂烯基）。如本文所用，术语“杂亚烯基”指通过移除两个氢原子由如本文定义的杂烯基衍生的双基。杂亚烯基可以是环状或非环的，支链或非支链的，取代或未取代的。

如本文所用，术语“杂炔基”指如本文定义的炔基配基，其在碳原子之间还含有一个或多个杂原子（例如，氧、硫、氮、磷或硅原子）。在某些实施方式中，杂炔基含有2-20个碳原子和1-6个杂原子（C_2-20杂炔基）。在某些实施方式中，杂炔基含有2-10个碳原子和1-4个杂原子（C_2-10杂炔基）。在某些实施方式中，杂炔基含有2-6个碳原子和1-3个杂原子（C_2-6杂炔基）。在某些实施方式中，杂炔基含有2-5个碳原子和1-3个杂原子（C_2-5杂炔基）。在某些实施方式中，杂炔基含有2-4个碳原子和1-2个杂原子（C_2-4杂炔基）。在某些实施方式中，杂炔基含有2-3个碳原子和1个杂原子（C_2-3杂炔基）。如本文所用，术语“杂亚炔基”指通过移除两个氢原子由如本文定义的杂炔基衍生的双基。杂亚炔基可以是环状或非环的，支链或非支链的，取代或未取代的。

如本文所用，术语“杂环的”、“杂环”或“杂环基”指环状杂脂族基团。杂环基指非芳族、部分不饱和或完全饱和的3-10元环系统，所述环系统包括大小3至8个原子的单环和双环系统及三环系统，所述双环系统和三环系统可以包括与非芳族环稠合的芳族五元或六元芳基或杂芳基。这些杂环包括具有独立选自氧、硫和氮的1至3个杂原子的那些，其中所述氮杂原子和硫杂原子可以任选地被氧化并且氮杂原子可以任选地被季铵化。在某些实施方式中，术语“杂环的”指非芳族5元、6元或7元环或多环基团，其中至少一个环原子是选自O、S和N的杂原子（其中氮杂原子和硫杂原子可以任选地被氧化），并且剩余的环原子是碳，基团经任何环原子与分子的其余部分连接。杂环基包括但不限于双环基或三环基，包括具有1个至3个之间独立选自氧、硫和氮的杂原子的5元、6元或7元环，其中（i）每个5元环具有0至2个双键，每个6元环具有0至2个双键并且每个7元环具有0至3个双键，（ii）氮杂原子和硫杂原子可以任选地被氧化，（iii）氮杂原子可以任选地被季铵化，并且（iv）前述任一种杂环可以与芳基或杂芳基环稠合。示例性杂环包括氮杂环丙基、氮杂环丁基、1,3-二氮杂环丁基、哌啶基、哌嗪基、氮杂环辛基（azocanyl）、硫杂环丙基（thiaranyl）、硫杂环丁基（thietanyl）、四氢噻吩基、二硫杂环戊烷（dithiolanyl）、噻环己基（thiacyclohexanyl）、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基（tetrahydropuranyl）、二氧杂环己基、氧硫杂环戊基（oxathiolanyl）、吗啉基、硫氧杂环己烷基（thioxanyl）、四氢萘基等，它们可以带有一个或多个取代基取代基。取代基包含但不限于本文所述的导致稳定的配基形成的任何取代基。

如本文所用，术语“芳基”指具有3-20个环原子的芳族单环或多环系统，其中所述环系统的全部环原子均是碳并且可以是取代或未取代的。在本发明的某些实施方式中，“芳基”指具有1个、2个或3个芳环的单环、双环、三环C₄-C₂₀芳环系统，所述芳环包括但不限于苯基、联苯基、萘基等，它们可以带有一个或多个取代基。芳基取代基包含但不限于本文所述的导致稳定的配基形成的任何取代基。如本文所用，术语“亚芳基”指通过移除两个氢原子由如本文定义的芳基衍生的芳基双基。亚芳基可以是取代或未取代的。亚芳基取代基包含但不限于本文所述的导致稳定的配基形成的任何取代基。另外，可以将亚芳基作为接头基团并入如本文定义的亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基。

如本文所用，术语“杂芳基”指具有3-20个环原子的芳族单环或多环系统，所述环系统的一个环原子选自S、O和N；0、1或2个环原子是独立选自S、O和N的其他杂原子；并且剩余的环原子是碳，基团经任何环原子与分子的其余部分连接。示例性杂芳基包括但不限于吡咯基、吡唑基、咪唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基、四嗪基、吡咯嗪基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、吲唑基、喹啉基、异喹啉基、喹嗪基、噌啉基、喹唑啉基、酞嗪基、萘啶基、喹噁啉基、噻吩基、硫茚基（thianaphthenyl）、呋喃基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、噻唑啉基（thiazolynyl）、异噻唑基、噻二唑啉基（thiadiazolynyl）、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基（oxadiaziolyl）、噁二唑基（oxadiaziolyl）等，它们可以带有一个或多个取代基取代基。杂芳基取代基包含但不限于本文所述的导致稳定的配基形成的任何取代基。如本文所用，术语“杂亚芳基”指通过移除两个氢原子由如本文定义的杂芳基衍生的双基。杂亚芳基可以是取代或未取代的。另外，可以将杂亚芳基作为接头基团并入如本文定义的亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基。杂亚芳基取代基包含但不限于本文所述的导致稳定的配基形成的任何取代基。

如本文所用、术语“酰基”是取代的烷基的子集并且指具有通式-C（=O）R^A、-C（=O）OR^A、-C（=O）-O-C（=O）R^A、-C（=O）SR^a、-C（=O）N（R^a）₂、-C（=S）R^a、-C（=S）N（R^a）₂和-C（=S）S（R^A）、-C（=NR^A）R^A、-C（=NR^a）OR^a、-C（=NR^a）SR^a以及-C（=NR^A）N（R^A）₂的基团，其中R^A是氢；卤素；取代或未取代的羟基；取代或未取代的硫醇；取代或未取代的氨基；酰基；任选取代的脂族；任选取代的杂脂族；任选取代的烷基；任选取代的烯基；任选取代的炔基；任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、脂族氧基、杂脂族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂族硫氧基、杂脂族硫氧基、烷基硫氧基、杂烷基硫氧基、芳基硫氧基、杂芳基硫氧基、单脂族氨基或二脂族氨基、单杂脂族氨基或二杂脂族氨基、单烷基氨基或二烷基氨基、单杂烷基氨基或二杂烷基氨基、单芳基氨基或二芳基氨基、或单杂芳基氨基或二杂芳基氨基；或两个R^A基团共同形成5元至6元杂环。示例性酰基包括醛（-CHO）、羧酸（-CO₂H）、酮、酰卤、酯、酰胺、亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯和脲。酰基取代基包含但不限于本文所述的导致稳定的配基形成的任何取代基。

如本文所用，术语“酰亚基（acylene）”是以下基团的子集：取代的亚烷基、取代的亚烯基、取代的亚炔基、取代的杂亚烷基、取代的杂亚烯基或取代的杂亚炔基，并且指具有以下通式的酰基：-R⁰-（C=X¹）-R⁰-、-R⁰-X²（C=X¹）-R⁰-或-R⁰-X²（C=X¹）X³-R⁰-，其中X¹、X²和X³独立地是氧、硫或NRr，其中Rr是氢或任选取代的脂族基，并且R⁰是如本文定义的任选取代的亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基。其中R⁰是亚烷基的示例性酰基包括-(CH₂)_T-O(C=O)-(CH₂)_T-；-(CH₂)_T-NR^r(C=O)-(CH₂)_T-；-(CH₂)_T-O(C=NR^r)-(CH₂)_T-；-(CH₂)_T-NR^r(C=NR^r)-(CH₂)_T-；-(CH₂)_t-(C=O)-(CH₂)_T-；-(CH₂)_T-(C=NR^r)-(CH₂)_T-；-(CH₂)_T-S(C=S)-(CH₂)_T-；-(CH₂)_T-NR^r(C=S)-(CH₂)_T-；-(CH₂)_T-S(C=NR^r)-(CH₂)_T-；-(CH₂)_T-O(C=S)-(CH₂)_T-；-(CH₂)_T-(C=S)-(CH₂)_T-；或-(CH₂)_T-S(C=O)-(CH₂)_T-等，它们可以带有一个或多个取代基；并且其中T的每种例子独立地为0至20之间的整数。酰亚基取代基包含但不限于本文所述的导致稳定的配基形成的任何取代基。

如本文所用，术语“氨基”指式（-NH₂）的基团。“取代的氨基”或者指单取代的胺(-NHR^H)或双取代的胺（-NR^h ₂），其中R^h取代基是如本文所述的导致稳定的配基形成的任何取代基（例如，氨基保护基；脂族基、烷基、烯基、炔基、杂脂族基、杂环芳基、杂芳基、酰基、氨基、硝基、羟基、硫醇、卤素，脂族氨基、杂脂族氨基、烷氨基、二杂烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、烷基芳基、芳烷基、脂族氧基、杂脂族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂族硫氧基、杂脂族硫氧基、烷基硫氧基、杂烷基硫氧基、芳基硫氧基、杂芳基硫氧基、酰氧基等，每种可以经进一步取代或可以不经进一步取代）。在某些实施方式中，双取代的氨基(-NR^h ₂)的R^h取代基形成5元至6元杂环。

如本文所用，术语“羟基的”或“羟基”指式（-OH）的基团。“取代的羟基”指式（-ORⁱ）的基团，其中Rⁱ可以是产生稳定的配基的任何取代基（羟基保护基；脂族基、烷基、烯基、炔基、杂脂族基、杂环芳基、杂芳基、酰基、硝基、烷基芳基、芳烷基等，每种可以经进一步取代或可以不经进一步取代）。

如本文所用，术语“硫代”或“硫醇”指式（-SH）的基团。“取代的硫醇”指式（-SR^r）的基团，其中R^r可以是产生稳定的配基的任何取代基（硫醇保护基；脂族基、烷基、烯基、炔基、杂脂族基、杂环芳基、杂芳基、酰基、烷基芳基、芳烷基等，每种可以经进一步取代或可以不经进一步取代）。

如本文所用，术语“亚氨基”指式（=NR^r）的基团，其中R^r对应于氢或如本文所述的导致稳定的配基形成的任何取代基（例如，氨基保护基；脂族基、烷基、烯基、炔基、杂脂族基、杂环芳基、杂芳基、酰基、氨基、羟基、烷基芳基、芳烷基等，每种可以经进一步取代或可以不经进一步取代）。

如本文所用，术语“叠氮化物”或“叠氮基”指式（-N₃）的基团。

如本文所用，术语“卤代”和“卤素”指选自氟（氟，-F）、氯（氯，-Cl）、溴（溴，-Br）和碘（碘，-I）的原子。

“离去基团”是本领域理解的术语，指键断裂时伴随一对电子一起离去的分子片段，其中所述分子片段是阴离子或中性分子。见，例如，Smith，高等有机化学（March's Advanced Organic Chemistry）第6版（501-502）。示例性离去基团包括但不限于卤素（例如，氯、溴、碘）和例如以下式的活化的取代羟基：-OC（=O）SR^aa、-OC（=O）R^aa、-OCO₂R^aa、-OC（=O）N（R^bb）₂、-OC（=NR^bb）R^aa、-OC（=NR^bb）OR^aa、-OC（=NR^bb）N（R^bb）₂、-OS（=O）R^aa、-OSO₂R^aa、-OP（R^cc）₂、-OP（R^cc）3、-OP（=O）₂R^aa、-OP（=O）（R^aa）₂、-OP（=O）（OR^cc）₂、-OP（=O）₂N（R^bb）₂或-OP（=O）（NR^bb）₂其中R^aa是任选取代的脂族、任选取代的杂脂族、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；R^bb是氢、氨基保护基、任选取代的脂族基、任选取代的杂脂族基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；和R^cc是氢、任选取代的脂族基、任选取代的杂脂族基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基。

如本文所用，术语Xaa指氨基酸，例如，表A的标准氨基酸，或表B的非标准氨基酸。在一些实施方式中，术语Xaa指例如下式的化合物：

其中R和R'的每个例子独立地选自氢、任选取代的脂族基、任选取代的杂脂族基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基；并且R^d是氢或氨基保护基。由以上两式涵盖的氨基酸包括而不限于天然α-氨基酸如多肽和蛋白质中存在的20种天然存在的常见α-氨基酸（例如、A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V，如下表A中所示，在本文中也称作标准氨基酸）的D-异构体和L-异构体、非标准α-氨基酸（下表B中描述的例子）和β-氨基酸（标准或非标准氨基酸，例如，β-丙氨酸）。

表A.标准α-氨基酸	R	R'
			L-丙氨酸（A）	-CH₃	-H
L-精氨酸（R）	-CH₂CH₂CH₂-NHC（=NH）NH₂	-H
			L-天冬氨酸（N）	-CH₂C（=O）NH₂	-H
L-天冬氨酸（D）	-CH₂CO₂H	-H
			L-半胱氨酸（C）	-CH₂SH	-H
L-谷氨酸（E）	-CH₂CH₂CO₂H	-H
			L-谷氨酰胺（Q）	-CH₂CH₂C（=O）NH₂	-H
甘氨酸（G）	-H	-H
			L-组氨酸（H）	-CH₂-2-（1H-咪唑）	-H
L-异亮氨酸（I）	-仲丁基	-H
			L-亮氨酸（L）	-异丁基	-H

（K）	-CH₂CH₂CH₂CH₂NH₂	-H
			L-甲硫氨酸（M）	-CH₂CH₂SCH₃	-H
L-苯丙氨酸（F）	-CH₂Ph	-H
			L-脯氨酸（P）	-2-（吡咯烷）	-H
L-丝氨酸（S）	-CH₂OH	-H
			L-苏氨酸（T）	-CH₂CH（OH）（CH₃）	-H
L-色氨酸（W）	-CH₂-3-（1H-吲哚）	-H
			L-酪氨酸（Y）	-CH₂-（对羟苯基）	-H
L-缬氨酸（V）	-异丙基	-H

存在许多已知的非天然氨基酸，这些氨基酸中的任一种可以包含在本发明的多肽中。见，例如，S.Hunt，非蛋白质氨基酸：在氨基酸的化学和生物化学中（The Non-Protein Amino Acids:In Chemistry and Biochemistry of theAmino Acids）,编著G.C.Barrett,Chapman和Hall,1985。非天然氨基酸的一些例子是4-羟脯氨酸、锁链素、γ-氨基丁酸、β-氰基丙氨酸、正缬氨酸、4-（E）-丁烯基-4（R）-甲基-N-甲基-L-苏氨酸、N-甲基-L-亮氨酸、1-氨基-环丙烷羧酸、1-氨基-2-苯基-环丙烷羧酸、1-氨基-环丁烷羧酸、4-氨基-环戊烯羧酸、3-氨基-环己烷羧酸、4-哌啶基乙酸、4-氨基-1-甲基吡咯-2-羧酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸、2-氨基庚二酸、4-（氨基甲基）苯甲酸、4-氨基苯甲酸、邻位取代、间位取代和对位取代的苯丙氨酸（例如，用-C（=O）C₆H₅；-CF₃；-CN；-卤素；-NO₂；-CH₃取代）、双取代的苯丙氨酸、取代的酪氨酸（例如，进一步用-C（=O）C₆H₅；-CF₃；-CN；-卤素；-NO₂；-CH₃取代）和抑胃酶氨酸。

术语“点击化学”指由斯克里普斯研究所的K.Barry Sharpless引入的化学哲学，其描述为通过将包含反应基团的小单位结合在一起而迅速和可靠地产生共价键而定制的化学。点击化学并不指特定反应，而是指包括模拟自然界中存在的反应的概念。在一些实施方式中，点击化学反应是模块化的，范围广泛，给出高化学产率，产生无害的副产物，具有立体特异性，显示>84kJ/mol的巨大热动力驱动力以有利于具有单个反应产物的反应，和/或可以在生理条件下实施。不同的放热反应使得反应物“簧压（spring loaded）”。在一些实施方式中，点击化学反应显示出高原子经济性，可以在简单的反应条件下实施，使用轻易可获得的原料和试剂，使用无毒溶剂或使用温和或容易移除的溶剂（优选地是水），和/或提供通过非色谱方法（结晶或蒸馏）的简单产物分离。

如本文所用，术语“点击化学柄”指可以参与点击化学反应的反应物或反应基团。例如，有张力的炔烃，例如，环辛炔，是一种点击化学柄，因为它可以参与应变引发的环加成反应（见，例如，表1）。通常而言，点击化学反应需要至少两个包含可以彼此反应的点击化学柄的分子。有时在本文中这类彼此具有反应性的点击化学柄对被称作配偶物点击化学柄。例如，叠氮化物是环辛炔或任何其他炔的配偶物点击化学柄。本文中描述了适用于根据本发明的一些方面的示例性点击化学柄，例如，在表1和表2中以及在图2B中。其他合适的点击化学柄是本领域技术人员已知的。

在本文中术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”互换地使用，并且指由肽（酰胺）键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。该术语指具有任何尺寸、结构或功能的蛋白质、肽或多肽。一般，蛋白质、肽或多肽的长度为至少3个氨基酸。蛋白质、肽或多肽可以指单个蛋白质或蛋白质集合。蛋白质、肽或多肽中的一个或多个氨基酸可以被修饰，例如，通过添加化学实体如糖基团、羟基、磷酸酯基团、法呢基、异法呢基、脂肪酸基、用于结合、官能化或其他修饰的接头等。蛋白质、肽或多肽也可以是单个分子或可以是多分子复合体。蛋白质、肽或多肽可以仅是天然存在的蛋白质或肽的片段。蛋白质、肽或多肽可以是天然存在的、重组的或合成的或其任意组合。

术语“结合的”或“结合”指两个分子（例如，两个蛋白质）彼此以如此方式缔合，从而它们由直接或间接的共价或非共价相互作用连接。在借助点击化学结合的情况下，结合是借助于通过点击化学柄的反应所形成的共价键。在某些实施方式中，这种缔合是共价的，并且将实体称为彼此“结合”。在一些实施方式中，通过以下方式蛋白质与另一个分子（例如，第二蛋白质）翻译后结合：在蛋白质已经翻译后在该蛋白质和另一个分子之间形成共价键，并且在一些实施方式中，在蛋白质已经分离后在该蛋白质和另一个分子之间形成共价键。在一些实施方式中，通过以下方式实现蛋白质和第二分子（例如，第二蛋白质）的翻译后结合：在该蛋白质上安装点击化学柄并在第二分子上安装可以与第一点击化学柄反应的第二点击化学柄，并且实施点击化学反应，其中这些点击化学柄反应并且在蛋白质和第二分子之间形成共价键，因此产生嵌合蛋白。在一些实施方式中，两个蛋白质在它们的各自的C-末端处结合，产生C-C结合的嵌合蛋白。在一些实施方式中，两个蛋白质在它们的各自的N-末端处结合，产生N-N结合的嵌合蛋白。

如本文所用，“可检测标记物”指具有并入配基内的使得检测与该标记物连接的分子（例如，蛋白质或多肽）或其他实体成为可能的至少一种元素、同位素或官能团的配基。标记物可以是直接连接（即，经键）或可以由系链（如，例如，可以构成系链的任选取代的亚烷基；任选取代的亚烯基；任选取代的亚炔基；任选取代的杂亚烷基；任选取代的杂亚烯基；任选取代的杂亚炔基；任选地取代的芳基；任选地取代的杂芳基或任选取代的酰亚基，或其任意组合）连接。可以理解标记物可以在任何位置与分子（例如，蛋白质或多肽）或其他实体连接或并入其中。

通常而言，标记物可以属于以下5个类别中的任一个（多个）类别：a）含有同位素配基的标记物，所述同位素部分可以是放射性同位素或重同位素，包括但不限于²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸F、³¹P、³²P、³⁵S、⁶⁷Ga、⁷⁶Br、^99mTc（Tc-99m）、¹¹¹In、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁵³Gd、¹⁶⁹Yb和¹⁸⁶Re；b）含有免疫配基的标记物，所述免疫配基可以与酶（例如，辣根过氧化物酶）结合的抗体或抗原；c）作为有色、发光、磷光或荧光配基的标记物（例如，荧光标记物，异硫氰酸荧光素（FITC）；d）具有一个或多个光亲和配基的标记物；和e）作为一种或多种已知结合配偶体的标记物（例如，生物素-链霉亲和素、FK506-FKBP）。在某些实施方式中，标记物包含放射性同位素，优选地发射可检测粒子（如β粒子）的同位素。在某些实施方式中，标记物包含荧光配基。在某些实施方式中，标记物是荧光标记物异硫氰酸荧光素（FITC）。在某些实施方式中，标记物包含具有一个或多个已知结合配偶体的配体配基。在某些实施方式中，标记物包含生物素。在一些实施方式中，标记物是荧光多肽（例如，GFP或其衍生物如增强型GFP（EGFP））或萤光素酶（例如，萤火虫、海肾或长腹水蚤萤光素酶）。可以理解，在某些实施方式中，标记物可以与合适的底物（例如，萤光素）反应以产生可检测信号。荧光蛋白的非限制性例子包括GFP及它们的衍生物、包含发射不同颜色光的发色团的蛋白质，如红色、黄色和青色荧光蛋白等。示例性荧光蛋白包括例如Sirius、Azurite、EBFP2、TagBFP、mTurquoise、ECFP、Cerulean、TagCFP、mTFP1、mUkG1、mAG1、AcGFP1、TagGFP2、EGFP、mWasabi、EmGFP、TagYPF、EYFP、Topaz、SYFP2、Venus、Citrine、mKO、mKO2、mOrange、mOrange2、TagRFP、TagRFP-T、mStrawberry、mRuby、mCherry、mRaspberry、mKate2、mPlum、mNeptune、T-Sapphire、mAmetrine、mKeima。见，例如，Chalfie,M.和Kain,SR（编辑）绿色荧光蛋白：性质、应用和方案（Green fluorescent protein:properties，applications,andprotocols）,（生物化学分析方法（Methods of biochemical analysis）,第47卷），Wiley-Interscience,Hoboken,N.J.,2006，和/或Chudakov,DM,等人，Physiol Rev.90（3）:1103-63,2010，关于GFP和众多其他荧光蛋白或发光蛋白的讨论。在一些实施方式中，标记物包含暗淬灭剂，例如，吸收来自荧光团的激发能量并将该能量作为热消散的物质。

如本文所用，术语“抗体”，指属于免疫球蛋白超家族的糖蛋白。术语“抗体”和“免疫球蛋白”互换地使用。存在一些例外，哺乳动物抗体一般由各自具有两条大的重链和两条小的轻链的基本结构单元构成。存在几种不同类型的抗体重链和几种不同类型的抗体，其中基于它们拥有的重链将抗体划分成不同的同种型。在哺乳动物中已知五种不同的抗体同种型：IgG、IgA、IgE、IgD和IgM，它们发挥不同的作用并且针对它们遇到的每种不同类型的异物辅助指导适宜的免疫反应。在一些实施方式中，抗体是IgG抗体，例如，IgG1、2、3或4人亚类的抗体。来自非哺乳动物物种（例如，来自鸟、爬行类、两栖动物）的抗体也处于本术语的范围内，例如，IgY抗体。仅抗体的部分参与结合抗原，并且抗原结合抗体片段、它们的制备和用途是本领域技术人员熟知的。如本领域熟知，仅抗体分子的小部分即互补位参与抗体与其表位的结合（见，一般而言，Clark,W.R.（1986）现代免疫学实验基础（The Experimental Foundations of Modern Immunology）Wiley&Sons,Inc.,New York；Roitt,I.（1991）免疫学纲要（Essential Immunology），第7版,布莱克韦尔科学出版物，牛津）。PFc'和Fc区，例如是补体级联的效应器，但是不参与抗原结合。已经酶切去pFc'区或已经在没有pFc'区的情况下产生的抗体（命名为F（ab'）片段（或F（ab'）2片段））保留完整抗体的两个抗原结合位点。类似地，已经酶切去Fc'区或已经在没有Fc区的情况下产生的抗体（命名为Fab片段）保留完整抗体分子的一个抗原结合位点。Fab片段由共价结合的抗体轻链和称作Fd的抗体重链的一部分组成。Fd片段是抗体特异性的主要决定因子（单一Fd片段可以与至多十条不同轻链相缔合而不改变抗体特异性）并且Fd片段保留分离时的结合表位的能力。

抗体的抗原结合部分内部，如本领域熟知，存在直接与抗原的表位相互作用的互补决定区（CDR）和维持互补位的三级结构的框架区（FR）（通常见，Clark,W.R.（1986）现代免疫学实验基础（The Experimental Foundationsof Modern Immunology）Wiley&Sons公司,纽约；Roitt,I.（1991）免疫学纲要,第7版,布莱克韦尔科学出版物，牛津）。在重链Fd片段和IgG免疫球蛋白的轻链中，存在分别由三个互补决定区（CDR1至CDR3）分隔的4个框架区（FR1至FR4）。CDR，尤其CDR3区，更具体地重链CDR3主要负责抗体特异性。

本领域中已经充分建立：可以将哺乳动物抗体的非CDR区替换为非特异性或异特异性抗体的相似区域，同时保留原始抗体的表位特异性。在开发和使用非人类CDR与人FR和/或Fc/pFc'区共价连接以产生功能抗体的“人源化”抗体时，最清楚地体现这一点。见，例如，美国专利4816567，5225539，5585089，5693762和5859205。

可以通过免疫对于大部分人免疫球蛋白重链基因座和轻链基因座而言转基因的小鼠制备完全人单克隆抗体。在免疫这些小鼠（例如，XenoMouse（Abgenix）、HuMAb小鼠（Medarex/GenPharm））后，可以根据标准杂交瘤技术制备单克隆抗体。这些单克隆抗体将具有人免疫球蛋白氨基酸序列，并且因此在施用至人时不诱导人抗小鼠抗体（HAMA）反应。

因而，对本领域普通技术人员来说显而易见，本发明还提供F（ab'）、Fab、Fv和Fd片段；Fc和/或FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区已经由同源性人类序列或非人类序列替换的抗体；FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区已经由同源性人类序列或非人类序列替换的抗体；FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区已经由同源性人类序列或非人类序列替换的抗体；和FR和/或CDR1和/或CDR2区已经由同源性人类序列或非人类序列替换的抗体。在一些实施方式中，本发明提供了所谓单链抗体（例如，scFv）、（单）结构域抗体和在一些实施方式中作为胞内抗体的其他抗体。结构域抗体、骆驼抗体和骆驼化抗体及其片段（例如，VHH结构域）或纳米体，如在Ablynx NV和Domantis的专利和公开的专利申请中描述的那些，也涵盖于术语抗体中。如本文所用，术语“抗原结合抗体片段”指包含互补位的抗体片段，或具有与完整抗体相似的特异性和亲和力与抗原结合的抗体片段，其中所述抗原与该抗体结合。

抗体，例如，全人单克隆抗体，可以使用噬菌体展示（或其他展示方法如酵母展示、核糖体展示、细菌展示）鉴定。展示文库，例如，噬菌体展示文库是可获得的（和/或可以由本领域普通技术人员产生），其中可以筛选所述展示文库以鉴定与目的抗原结合的抗体，例如，使用淘洗法。见，例如，Sidhu,S.（编辑）生物技术和药物研发中的噬菌体展示（Phage Display inBiotechnology and Drug Discovery）（（药物研发系列）（Drug DiscoverySeries））;CRC出版社；第1版,2005；Aitken,R.（编著）抗体噬菌体展示：方法和方案（Antibody Phage Display:Methods and Protocols）（Methods inMolecular Biology）Humana出版社；第2版,2009。在一些实施方式中，使用重组方法在合适的宿主细胞（例如，原核或真核宿主细胞）中产生单克隆抗体。在一些实施方式中，使用微生物宿主细胞（例如，细菌、真菌）。编码抗体或其部分的核酸可以被分离并且可以测定它们的序列。可以将这类核酸序列插入合适的载体（例如，质粒）中并例如引入用于表达的宿主细胞中。在一些实施方式中，使用昆虫细胞。在一些实施方式中，使用哺乳动物细胞，例如，人细胞。在一些实施方式中，抗体由产生它的宿主细胞分泌并且可以分离，例如，从培养基分离。用于产生和纯化重组蛋白的方法是本领域普通技术人员熟知的。

如本文所用，术语“嵌合抗体”指与另一个分子结合（例如，与第二抗体或抗原结合抗体片段结合）的抗体或抗原结合抗体片段。任何抗体或抗原结合抗体片段或抗原结合蛋白结构域可以用来产生根据本发明方面的嵌合抗体。在一些实施方式中，嵌合抗体包含两个结合的抗体或抗体片段，或与抗体片段结合的一个抗体，其中结合的分子的抗原结合结构域结合不同的抗原或相同抗原的不同表位。这类嵌合抗体在本文中称作“双特异性”，因为它们结合两个不同的抗原/表位。

如本文所用，术语“接头”指与分子（例如，蛋白质）和化学基团或配基（例如，点击化学柄）共价连接的化学基团或分子。在一些实施方式中，接头位于两个基团、分子或配基之间或位于它们的侧面并且通过共价键彼此连接，因此将二者连接。在一些实施方式中，接头是氨基酸或多个氨基酸。在一些实施方式中，接头是有机分子、基团或化学配基。

如本文所用，术语“分选标记”指添加标签（例如，点击化学柄）到靶分子（例如，靶蛋白）上的过程。应当指出本术语不限于点击化学柄，还指其中添加其他标签的过程。合适标签的例子包括但不限于氨基酸、肽、蛋白质、核酸、多核苷酸、糖、糖类、聚合物、脂类、脂肪酸和小分子。其他合适的标签对本领域技术人员来说是显而易见的并且本发明不限于这个方面。在一些实施方式中，标签包含可用于纯化、表达、增溶和/或检测多肽的序列。在一些实施方式中，标签可以发挥多个功能。标签经常是相对小的，例如，长度范围从数个氨基酸直到约100氨基酸。在一些实施方式中，标签的长度多于100个氨基酸，例如，至多到约500个氨基酸或更长。在一些实施方式中，标签包括HA、TAP、Myc、6XHis、Flag或GST标签，仅列举数个例子。在一些实施方式中，标签包括增强溶解性的标签（例如，SUMO标签、NUS A标签、SNUT标签或噬菌体T7的Ocr蛋白的单聚突变体）。见，例如，Esposito D和Chatterjee DK.Curr Opin Biotechnol.；17（4）:353-8（2006）。在一些实施方式中，标签是可切除的，从而可以移除它，例如，通过蛋白酶移除。在一些实施方式中，通过在标签中包含蛋白酶切割位点（例如，相邻于或连接至标签的功能部分）实现这一点。示例性蛋白酶包括，例如，凝血酶、TEV蛋白、因子Xa、PreScission蛋白酶等。在一些实施方式中，使用“自切除”标签。见，例如，PCT/US05/05763。

某些实施方式的具体实施方式

标准遗传的方法允许通过多肽以头-尾方式融合产生蛋白质复合。然而，当剩余的游离末端对生物活性是必需的时，一些应用将受益于遗传上不可能的构建体，如通过其N-或C-末端的蛋白质的位点特异性连接。

嵌合蛋白，例如，与荧光蛋白的遗传融合广泛地用来使它们的（亚）细胞定位在原位和在体内可视化（Lippincott-Schwartz J，Patterson GH（2003）活细胞中荧光蛋白标记的开发和用途（Development and Use of FluorescentProtein Markers in Living Cells）.Science300:87-91；所述文献的完整内容是通过引用方式并入本文）。例如，两种正交标记的嵌合体的共表达允许研究蛋白质共定位和受体二聚化的动力学。另外，蛋白质融合物已经用来评价其他的短暂蛋白质复合物的生物意义。两种或更多种相互作用的蛋白质的融合或交联可以使蛋白质复合物稳定化，并且已经用来探索G-蛋白偶联受体的信号传导和（异）二聚化（Seifert R，Wenzel-Seifert K，Kobilka BK（1999）（GPCR-G融合蛋白：受体-G-蛋白偶联的分子分析）（GPCR-G fusionproteins:molecular analysis of receptor-G-protein coupling））.Trends PharmacolSci20:383-389；和Han Y,Moreira IS,Urizar E,Weinstein H,Javitch JA（2009）（在多巴胺A类GPCR二聚体的原体之间的变构通讯调节活化（Allostericcommunication between protomers of dopamine class A GPCR dimers modulatesactivation））.NatmetH5:688-695；所述文献每一篇的完整内容通过引用方式并入本文）、趋化因子和细胞因子（Leong SR等人,（1997）IL-8单链同型二聚体和异二聚体：与趋化因子受体CXCR1、CXCR2和DARC相互作用（IL-8single-chain homodimers and heterodimers:interactions with chemokinereceptors CXCR1,CXCR2,and DARC）.Protein Sci6:609-617；Nasser MW等人,（2009）通过CXCL8单体和二聚体差异性激活和调节CXCR1和CXCR2（Differential activation and regulation of CXCR1and CXCR2byCXCL8monomer and dimer）.J Immunol183:3425-3432；和Drury LJ等人,（2011）单体和二聚体CXCL12通过明显不同的CXCR4相互作用和信号传导途径抑制转移（Monomeric and dimeric CXCL12inhibit metastasis throughdistinct CXCR4interactions and signaling pathways）.P Natl Acad Sci USA108:17655-17660；所述文献每一篇的完整内容通过引用方式并入本文）。

除了作为有用的生物化学工具外，嵌合蛋白还有前景作为癌症、自身免疫疾病、溶酶体贮积疾病和脑病的治疗选项（Boado RJ等人,GeneticEngineering，（2008）用于在人类中受体介导递送生物素酰化药物的嵌合单克隆抗体-抗生物素蛋白融合蛋白的表达和活性（Expression,and Activity of aChimeric Monoclonal Antibody-Avidin Fusion Protein for Receptor-MediatedDelivery of Biotinylated Drugs in Humans）。Bioconjug Chem19:731-73；Lu JZ,Hui EK-W,Boado RJ,Pardridge WM（2010）具有艾杜糖-2-硫酸酯酶的双官能IgG融合蛋白的基因工程（Genetic Engineering of a Bifunctional IgG FusionProtein with Iduronate-2-Sulfatase）.Bioconjug Chem21:151-156;Zhou Q-H,Boado RJ,Lu JZ,Hui EK-W,Pardridge WM（2010）促红细胞生成素作为渗透小鼠中血脑屏障的IgG融合蛋白的再工程化（Re-Engineering Erythropoietinas an IgG Fusion Protein That Penetrates the Blood-Brain Barrier in the Mouse）.Mol Pharmaceutics7:2148-2155；和Pastan I,Hassan R,FitzGerald DJ,KreitmanRJ（2006）免疫毒素治疗癌症（Immunotoxin therapy of cancer）.NatureReviews Cancer6:559-565；所述文献的每一篇的完整内容通过引用方式并入本文）。毒素已经与抗体、生长因子和细胞因子结合作为递送这些有效负载至表达由这类融合蛋白识别的对应结构物的恶性细胞的手段，以便杀伤肿瘤细胞，同时使附带损伤最小化（Pastan I,Hassan R,FitzGerald DJ,Kreitman RJ（2006）免疫毒素治疗癌症（Immunotoxin therapy of cancer）。NatureReviews Cancer6:559-565；Osusky M,Teschke L,Wang X,Wong K,Buckley JT（2008）白介素2和气单胞菌溶素的结合性变体的嵌合体选择性毒害展示白介素2受体的细胞（A chimera of interleukin2and a binding variant of aerolysinis selectively toxic to cells displaying the interleukin2receptor）.J Biol Chem283:1572-1579；和Rafei M等人,（2011）具有CCR2特异性杀肿瘤活性的MCP1Fusokine（A MCP1fusokine with CCR2-specific tumoricidal activity）.Molecular Cancer10:121；所述文献每一篇的完整内容通过引用方式并入本文）。通过融合免疫球蛋白的两个单链可变片段（scFv）制备的双特异性抗体可以将肿瘤细胞特异性抗原结合结构域与T-细胞特异性CD3受体结合结构域组合（Baeuerle PA,Reinhardt C（2009）用于癌症疗法的双特异性T细胞结合抗体（Bispecific T-Cell Engaging Antibodies for Cancer Therapy）.CancerResearch69:4941-4944；所述文献的完整内容是通过引用方式并入本文）。随后这允许T-细胞产生细胞毒活性或局部地释放细胞因子并激发所需的抗肿瘤反应。最后，蛋白质融合策略已经用来制备结构上确定的生物材料（SinclairJC,Davies KM,Venien-Bryan C,Noble MEM（2011）通过与匹配性轴对称融合蛋白质产生蛋白质晶格（Generation of protein lattices by fusing proteins withmatching rotational symmetry）.Nature Nanotechnology6:558-562；所述文献的完整内容是通过引用方式并入本文）。

融合蛋白的产生和纯化仍是一项生物技术难题。为获得有活性的产物，嵌合体的两个结构域必须采取天然折叠，而活性所需要的残基和区域未经修饰。产生融合蛋白的标准方法是借助两个蛋白质或蛋白质片段的开放阅读框的遗传融合。在融合蛋白中常观察到部分折叠的蛋白质和折叠缺陷产物。

天然折叠的纯化蛋白质的翻译后结合（例如，借助连接标签）将允许规避这个问题。这类方法利用在适当修饰的蛋白质底物的C末端或N末端处的标记以产生目的加合物，与正在制备相应的遗传融合物完全一样。分选酶催化的转酰基反应允许以优异特异性和近乎定量的产率在天然条件下进行蛋白质的这类位点特异性标记以及制备头-尾蛋白质-蛋白质融合物（Popp MW,Ploegh HL（2011）制造和断裂肽键：使用分选酶的蛋白质工程（Makingand Breaking Peptide Bonds:Protein Engineering Using Sortase）.应用化学（Angew Chem Int Ed50:5024-5032）；Guimaraes CP等人,（2011）对通过使用修饰的霍乱毒素而中毒所需的宿主细胞因子的鉴定（Identification of hostcell factors required for intoxication through use of modified cholera toxin）.JCell Biol195:751-764；和Popp MW,Antos JM,Grotenbreg GM,Spooner E,Ploegh HL（2007）：用于蛋白质标记的通用方法（Sortagging:a versatilemethod for protein labeling分选标记）.Nat Chem Biol3:707-708；所述文献每一篇的完整内容通过引用方式并入本文）。

标准分选酶连接方案不允许产生遗传上不可能的蛋白质-蛋白质融合物（N末端-N末端；C末端-C末端），虽然这类非天然连接将对构建双特异性抗体或其片段具有巨大吸引力。本发明的一些方面涉及以下认识：为了实现这类融合物，必须借助于化学连接方法。早期化学结合策略依赖于经胺基或硫氢基的非特异性交联（Kim JS,Raines RT（1995）Dibromobimane作为荧光交联试剂（Dibromobimane as a fluorescent crosslinking reagent）.AnalyticalBiochemistry225:174-176；所述文献的完整内容通过引用方式并入本文）。缺少对修饰的位点和化学计量的控制导致异质产物的形成，从而限制该方案的有效性。生物正交化学与位点特异性诱变、天然化学连接、基于蛋白质内含子的连接和琥珀阻抑基因吡咯赖氨酸tRNA技术组合的兴起已经使得合成非天然蛋白质融合物成为可能，如适用于双价和多价抗体的产生（SchellingerJG等人,（2012）用于交联多价单链可变片段的通用化学合成平台（Ageneral chemical synthesis platform for crosslinking multivalent single chainvariable fragments）.Org Biomol Chem10:1521-1526；Natarajan A等人,（2007）通过三价炔-叠氮化物1,3-偶极环加成反应构建双scFv（Construction of di-scFv through a trivalent alkyne-azide1,3-dipolarcycloaddition）.Chem Commun:695-697；和Xiao J,Hamilton BS,Tolbert TJ（2010）通过天然化学连结合成N末端连接的蛋白质和肽二聚体（Synthesisof N-Terminally Linked Protein and Peptide Dimers by Native ChemicalLigation）.Bioconjug Chem21:1943-1947；所述文献每一篇的完整内容通过引用方式并入本文）。通过基于蛋白质内含子的连接、位点特异性突变和铜催化点击化学的组合制备了泛素二聚体的结构类似物（Weikart ND，Sommer S，Mootz HD（2011）点击合成泛素二聚体类似物以探查连接特异性UBA结构域结合（Click synthesis of ubiquitin dimer analogs to interrogate linkage-specificUBA domain binding）.Chem Commun48:296；Weikart ND,Mootz HD（2010）通过Cu I催化的叠氮化物-炔环加成反应产生位点特异性及酶促稳定的重组蛋白与泛素样调节物的结合物（Generation of Site-Specific andEnzymatically Stable Conjugates of Recombinant Proteins with Ubiquitin-LikeModifiers by the Cu I-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition）.生物化学11:774-777；所述文献每一篇的完整内容通过引用方式并入本文）。炔丙基氧基苯丙氨酸的位点特异性并入促进了GFP二聚体的合成（Schellinger JG等人,（2012）用于交联多价单链可变片段的通用化学合成平台（A generalchemical synthesis platform for crosslinking multivalent single chain variablefragments）.Org Biomol Chem10:1521-1526；和Bundy BC,Swartz JR（2010）在无细胞环境中对-炔丙基氧基苯丙氨酸的位点特异性并入用于蛋白质-蛋白质直接点击结合（Site-Specific Incorporation of p-Propargyloxyphenylalanine ina Cell-Free Environment for Direct Protein-Protein Click Conjugation）.Bioconjug Chem21:255-263；所述文献每一篇的完整内容通过引用方式并入本文）。

然而，双特异性的合成将收益于这样的方法，所述方法与公开的方法正交并允许容易地获得修饰的天然蛋白，以及使得蛋白质末端的有效非天然结合成为可能。另外，正交方法的可用性允许合成甚至更复杂的蛋白结构（例如，异三聚体和更高阶的复合物）。本文中公开了与允许蛋白质在其N末端或C末端处与其他实体（包括但不限于其他蛋白质）结合的通用方案相关的试剂和方法。本文所述的一些结合策略包括使用分选酶催化的转肽反应向蛋白质添加点击化学柄。随后所产生的修饰的蛋白质可以与也包含反应性点击化学柄的分子结合。

本发明的一些方面涉及如下认识：分选酶转酰基反应允许在适当修饰的蛋白质的C末端容易地安装全部类型的取代基。成功的转酰基反应的唯一要求是在靶蛋白中存在适当暴露的分选酶识别基序，例如，LPXT或LPXTG（SEQ ID NO:2）基序。可以在分选酶催化的反应中使用的亲核体的设计同样是简洁明了的：一短的连续的（例如，1-10个）甘氨酸残基，或甚至烷基胺足以允许该反应继续进行。使用分选酶转酰基作用策略来修饰靶蛋白的重要优点是易于合成和在生理条件下对天然蛋白进行反应。

本发明的一些方面涉及如下认识：可以修饰在分选酶反应中使用的亲核体以包含任何数目的修饰：生物素、可检测标记物（例如，荧光团）、脂肪酸、核酸、脂类、放射性同位素、糖类或甚至具有适当暴露的N末端甘氨酸残基段的蛋白质。另外，本发明的一些方面提供亲核体可以用于包含适于点击化学反应（例如，无铜点击化学反应）的反应性化学配基，例如配基或“柄”的分选酶反应中。这类亲核体，例如，包含1-10个甘氨酸残基（例如，GGG）的肽或包含烷基胺基团和点击化学柄的任何化合物（例如肽），可以用来在包含C末端分选酶识别基序的靶蛋白上安装C末端点击化学柄。该分选酶识别基序必须正好位于C末端处，但是它必须是酶完全可接近的以高效参与分选酶反应。

类似地，通过使用包含分选酶识别基序和所需点击化学柄的肽进行分选酶反应，可以将点击化学柄以N末端方式安装至包含短的连续的甘氨酸的蛋白质或包含烷基胺基团的蛋白质或任何化合物（例如，对蛋白质而言在它们的N末端）上。因此，包含分选酶识别基序或1-10个甘氨酸残基或末端烷基胺基团的任何蛋白质可以用根据本发明多方面的点击化学柄衍生化。在靶蛋白上安装点击化学柄为蛋白质的赋予点击化学反应性。例如，如本文所述，包含点击化学柄的蛋白质可以与包含第二点击化学柄的第二分子（例如，第二分子）反应以形成共价键，因此使两个分子结合在一起。

在一些实施方式中，通过进行相应的点击化学反应，将带有反应性点击化学柄的蛋白质结合在一起。这导致蛋白质经共价键彼此结合。由于本发明的策略允许在蛋白质的C末端或N末端上安装点击化学柄，因此如此修饰的两个蛋白质可以经共价键从第一蛋白质的C末段至第二蛋白质的N末端结合，很像常规的蛋白质融合物。然而，在两种靶蛋白上安装C末端反应性点击化学柄允许产生借助共价点击化学键在其C-末端（C-C-末端，C-C）结合的蛋白质，而在两种靶蛋白上安装N末端反应性点击化学柄允许产生借助共价点击化学键在其N-末端（N-N-末端，N-N）结合的蛋白质。通过常规的蛋白质工程技术（如重组蛋白融合物技术）既不能实现实现共价C-C结合，也不能实现共价N-N结合。

分选酶介导的点击化学柄安装

分选酶、分选酶介导的转酰基反应和它们在蛋白质工程的转酰基作用（有时也称作转肽）中的用途是本领域技术人员熟知的（见，例如，Ploegh等人，国际专利申请PCT/US2010/000274和Ploegh等人，国际专利申请PCT/US2011/033303，所述文献的每一篇的完整内容通过引用方式并入本文）。通常而言，由分选酶催化的转肽反应导致含有转酰胺基酶识别基序的种类与带有一个或多个N末端甘氨酸残基的那些种类连接。在一些实施方式中，分选酶识别基序是本文所述的分选酶识别基序。在某些实施方式中，分选酶识别基序是LPXT基序或LPXTG（SEQ ID NO:2）基序。如本领域已知的，用一旦从分选酶释放则显示低劣亲核性的配基置换识别序列的C末端残基提供了更有效的连接。

分选酶转酰基反应提供用于将酰基供体与亲核性酰基受体高效连接的手段。这种原理广泛地适用于许多酰基供体和众多不同的酰基受体。以前，将分选酶反应用于蛋白质和/或肽彼此连接、使合成肽连接至重组蛋白、使报告分子连接至蛋白质或肽、使核酸结合至蛋白质或肽、使蛋白质或肽结合至固相支持物或聚合物并且使蛋白质或肽连接至标记物。这类产物和方法节约与连接产物合成相关的成本和时间并且可用于将酰基供体至酰基受体便利地连接。

分选酶介导的转酰基反应由分选酶的转酰胺基酶活性催化。转酰胺基酶是可以在酰基供体化合物和的含有NH₂-CH₂-配基的亲核性酰基受体之间形成肽键（即，酰胺键）的酶。在一些实施方式中，分选酶是分选酶A（SrtA）。然而，应当指出催化转酰基反应的任何分选酶或转酰胺基酶可以用于本发明的一些实施方式中，因为本发明不限于使用分选酶A。分选酶是具有转酰胺基酶活性的酶并且已经从革兰氏阳性细菌分离。革兰氏阳性细菌具有作为其细胞壁结构的部分的肽聚糖以及多糖和/或磷壁酸。革兰氏阳性细菌包括以下属：放线菌属（Actinomyces）、芽孢杆菌属（Bacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、纤维单胞菌属（Cellulomonas）、梭菌属（Clostridium）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、微球菌属（Micrococcus）、分支杆菌属（Mycobacterium）、诺卡菌属（Nocardia）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、链球菌属（Streptococcus）和链霉菌属（Streptomyces）。

分选酶介导的C末端点击化学柄安装

在某些实施方式中，用于在蛋白质上安装C末端点击化学柄的分选酶介导的转酰基反应包括步骤：使包含结构如下的转酰胺基酶识别序列的蛋白质：

其中

转酰胺基酶识别序列是由转酰胺基酶识别的氨基酸序列基序；转酰胺基酶识别序列在本文中也称作分选酶识别序列或分选酶识别基序；

X是-O-、-NR-或-S-；其中R是氢、取代或未取代的脂族基或取代或未取代的杂脂族基；

A¹是或包含长度为至少3个氨基酸的氨基酸序列；

R¹是酰基、取代或未取代的脂族基、取代或未取代的杂脂族基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基；

与具下式的亲核化合物：

其中

B¹是或包含酰基、取代或未取代的脂族基、取代或未取代的杂脂族基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、氨基酸、肽、蛋白质、多核苷酸、糖类、标签、金属原子、造影剂、催化剂、非多肽聚合物、识别单元、小分子、脂质、接头和/或标记物；其中B1包含点击化学柄；并且

n是0或从1至100（包括1和100）的整数；

在转酰胺基酶（例如，分选酶）存在时在合适条件下接触以形成下式化合物：

本领域技术人员将理解点击化学柄可以按照本领域技术人员可以预期的任何方式和任何位置内并入B¹中。例如，B¹可以包含氨基酸（例如，赖氨酸），点击化学柄可以连接至例如氨基酸的中心碳、氨基酸的侧链或连接至氨基酸的羧基或任何其他位置。将点击化学柄并入B¹中的其他方式将对本领域技术人员来说是显而易见的，并且本发明不限于这个方面。

将进一步理解的是，取决于B¹的性质，点击化学柄可以正好安装至靶蛋白的C末端处，或，例如如果B¹包含了含有点击化学柄的第一氨基酸和许多额外的氨基酸，则所产生的修饰的蛋白质将包含接近C末端但是不直接在C末端处的击化学柄。如本领域技术人员将显而易见的，对于下文描述的点击化学柄的N末端安装存在相似的情况。

普通技术人员将理解，在某些实施方式中，转酰胺基酶识别序列的C末端氨基酸被省略。即，酰基

替代转酰胺基酶识别序列的C末端氨基酸。在一些实施方式中，酰基是

在一些实施方式中，酰基是

在一些实施方式中，分选酶或转酰胺基酶识别序列是LPXT，其中X是标准氨基酸或非标准氨基酸。在一些实施方式中，X选自D、E、A、N、Q、K或R。在一些实施方式中，识别序列选自LPXT、LPXT、SPXT、LAXT、LSXT、NPXT、VPXT、IPXT和YPXR。在一些实施方式中，选择X以匹配天然存在的转酰胺基酶识别序列。在一些实施方式中，转酰胺基酶识别序列选自：LPKT（SEQ ID NO:48）、LPIT（SEQ ID NO:49）、LPDT（SEQ IDNO:50）、SPKT（SEQ IDNO:51）、LAET（SEQ ID NO:52）、LAAT（SEQID NO:53）、LAET（SEQ ID NO:54）、LAST（SEQ ID NO:55）、LAET（SEQ ID NO:56）、LPLT（SEQ ID NO:57）、LSRT（SEQ ID NO:58）、LPET（SEQ ID NO:59）、VPDT（SEQ ID NO:60）、IPQT（SEQ ID NO:61）、YPRR（SEQ ID NO:62）、LPMT（SEQ ID NO:63）、LPLT（SEQ ID NO:64）、LAFT（SEQ ID NO:65）、LPQT（SEQ ID NO:66）、NSKT（SEQ IDNO:67）、NPQT（SEQ ID NO:68）、NAKT（SEQ ID NO:69）和NPQS（SEQ ID NO:70）。在一些实施方式中，例如，在其中使用分选酶A的某些实施方式中（见下文），转酰胺基酶识别基序包含氨基酸序列X₁PX₂X₃，其中X₁是亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或甲硫氨酸；X₂是任何氨基酸；X₃是苏氨酸、丝氨酸或丙氨酸；P是脯氨酸并且G是甘氨酸。在特定的实施方式中，如上文所示，X₁是亮氨酸并且X₃是苏氨酸。在某些实施方式中，X₂是天冬氨酸、谷氨酸盐、丙氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸或甲硫氨酸。在某些实施方式中，例如，其中使用分选酶B的情况下，识别序列通常包含氨基酸序列NPX₁TX₂，其中X₁是谷氨酰胺或赖氨酸；X₂是天冬酰胺或甘氨酸；N是天冬酰胺；P是脯氨酸并且T是苏氨酸。本发明涵盖如下认识：为了赋予所需的特性，X的选择可以至少部分地基于含有识别基序的化合物。在一些实施方式中，选择X以调节含有识别基序的化合物的性能，如增加或减少在特定溶剂中的溶解度。在一些实施方式中，选择X以相容于合成包含识别基序的化合物时待用的反应条件，例如，对合成中使用的反应物无反应性。

在一些实施方式中，X是-O-。在一些实施方式中，X是-NR-。在一些实施方式中，X是-NH-。在一些实施方式中，X是-S-。

在某些实施方式中，R¹是取代的脂族基。在某些实施方式中，R¹是未取代的脂族基。在一些实施方式中，R¹是取代的C_1-12脂族基。在一些实施方式中，R¹是未取代的C_1-12脂族基。在一些实施方式中，R¹是取代的C_1-6脂族基。在一些实施方式中，R¹是未取代的C_1-6脂族基。在一些实施方式中，R¹是C_1- ₃脂族基。在一些实施方式中，R¹是丁基。在一些实施方式中，R¹是正丁基。在一些实施方式中，R¹是异丁基。在一些实施方式中，R¹是丙基。在一些实施方式中，R¹是正丙基。在一些实施方式中，R¹是异丙基。在一些实施方式中，R¹是乙基。在一些实施方式中，R¹是甲基。

在某些实施方式中，R¹是取代的芳基。在某些实施方式中，R¹是未取代的芳基。在某些实施方式中，R¹是取代的苯基。在某些实施方式中，R¹是未取代的苯基。

在一些实施方式中，A¹包括蛋白质。在一些实施方式中，A¹包括肽。在一些实施方式中，A¹包含抗体、抗体链、抗体片段、抗体表位、抗原结合抗体结构域、VHH结构域、单一结构域抗体、骆驼抗体、纳米体、亲和体、模拟抗体Anticalin、DARPin或Anadnectin。在一些实施方式中，A¹包括重组蛋白、包含一个或多个D-氨基酸的蛋白质、支链肽、治疗性蛋白、酶、多亚基蛋白的多肽亚基、跨膜蛋白、细胞表面蛋白、甲基化肽或蛋白质、酰化肽或蛋白质、脂质化肽或蛋白质、磷酸化肽或蛋白质，或糖基化肽或蛋白质。在一些实施方式中，A¹是包含至少3个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方式中，A¹包括蛋白质。在一些实施方式中，A¹包括肽。在一些实施方式中，A¹包括抗体。在一些实施方式中，A¹包括抗体片段。在一些实施方式中，A¹包括抗体表位。在一些实施方式中，A¹包括绿色荧光蛋白。在一些实施方式中，A¹包括泛素。

在一些实施方式中，B¹包含点击化学柄。在一些实施方式中，B¹包含本文所述的点击化学柄。在一些实施方式中，B¹包含在表1、表2或图2B中描述的点击化学柄。在一些实施方式中，B¹包含在Kolb,Finn和Sharpless应用化学国际版（Angewandte Chemie International Edition）（2001）40:2004-2021；Evans,澳大利亚化学杂志（Australian Journal of Chemistry）（2007）60:384-395）；Joerg Lahann，生物技术和材料科学的点击化学（ClickChemistry for Biotechnology and Materials Science），2009,John Wiley&SonsLtd,ISBN978-O-470-69970-6；或者Becer,Hoogenboom和Schubert,金属催化的加成作用之外的点击化学（Click Chemistry beyond Metal-CatalyzedCycloaddition）,Angewandte Chemie International Edition（2009）48:4900-4908中描述的点击化学柄；所述文献每一篇的完整内容通过引用方式并入本文。例如，在某些实施方式中，B¹包含末端炔烃、叠氮化物、有张力的炔烃、二烯、亲二烯体、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇或烯烃配基。在一些实施方式中，B¹包含表1或表2或图2B中描述的点击化学柄。

在某些实施方式中，n是从0至50（包括0和50）的整数。在某些实施方式中，n是从0至20（包括0和20）的整数。在某些实施方式中，n是0。在某些实施方式中，n是1。在某些实施方式中，n是2。在某些实施方式中，n是3。在某些实施方式中，n是4。在某些实施方式中，n是5。在某些实施方式中，n是6。

分选酶介导的N末端点击化学柄的安装

在某些实施方式中，用于在蛋白质上安装N末端点击化学柄的分选酶介导的转酰基反应包括步骤：使具有如下结构的蛋白质：

其中

n是0或1-100之间（包括1和100）的整数；并且

B1是或包含至少三个氨基酸残基的氨基酸序列；

与结构如下的分子：

其中

A¹是或包含酰基、取代或未取代的脂族基、取代或未取代的杂脂族基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、氨基酸、肽、蛋白质、多核苷酸、糖类、标签、金属原子、造影剂、催化剂、非多肽聚合物、识别单元、小分子、脂质、接头和/或标记物；其中A¹包含点击化学柄；并且

R¹是氢、酰基、取代或未取代的脂族基、取代或未取代的杂脂族基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基；

本领域技术人员将理解点击化学柄可以按照本领域技术人员可以预期的任何方式和任何位置内并入A¹中。例如，A¹可以包含氨基酸（例如，赖氨酸）并且点击化学柄可以连接至，例如氨基酸的中心碳、氨基酸的侧链或连接至氨基酸的氨基或任何其他位置。将点击化学柄并入A¹中的其他方式对本领域技术人员来说是显而易见的，并且本发明不限于这个方面。

替代转酰胺基酶识别序列的C末端氨基酸。在一些实施方式中，酰基是在一些实施方式中，酰基是

在一些实施方式中，分选酶或转酰胺基酶识别序列是LPXT，其中X是标准氨基酸或非标准氨基酸。在一些实施方式中，X选自D、E、A、N、Q、K或R。在一些实施方式中，识别序列选自LPXT、LPXT、SPXT、LAXT、LSXT、NPXT、VPXT、IPXT和YPXR。在一些实施方式中，选择X以匹配天然存在的转酰胺基酶识别序列。在一些实施方式中，转酰胺基酶识别序列选自：LPKT（SEQ ID NO:48）、LPIT（SEQ ID NO:49）、LPDT SEQ ID NO:50）、SPKT（SEQ ID NO:51）、LAET（SEQ ID NO:52）、LAAT（SEQ IDNO:53）、LAET（SEQ ID NO:54）、LAST（SEQ ID NO:55）、LAET（SEQID NO:56）、LPLT（SEQ ID NO:57）、LSRT（SEQ ID NO:58）、LPET（SEQID NO:59）、VPDT（SEQ ID NO:60）、IPQT（SEQ ID NO:61）、YPRR（SEQ ID NO:62）、LPMT（SEQ ID NO:63）、LPLT（SEQ ID NO:64）、LAFT（SEQ ID NO:65）、LPQT（SEQ ID NO:66）、NSKT（SEQ ID NO:67）、NPQT（SEQ ID NO:68）、NAKT（SEQ ID NO:69）和NPQS（SEQ ID NO:70）。在一些实施方式中，例如，在其中使用分选酶A的某些实施方式中（见下文），转酰胺基酶识别基序包含氨基酸序列X₁PX₂X₃，其中X₁是亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或甲硫氨酸；X₂是任何氨基酸；X₃是苏氨酸、丝氨酸或丙氨酸；P是脯氨酸并且G是甘氨酸。在特定的实施方式中，如上文所示，X₁是亮氨酸并且X₃是苏氨酸。在某些实施方式中，X₂是天冬氨酸、谷氨酸盐、丙氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸或甲硫氨酸。在某些实施方式中，例如，其中使用分选酶B的情况下，识别序列经常包含氨基酸序列NPX₁TX₂，其中X₁是谷氨酰胺或赖氨酸；X₂是天冬酰胺或甘氨酸；N是天冬酰胺；P是脯氨酸并且T是苏氨酸。本发明涵盖如下认识：为了赋予所需的特性，X的选择可以至少部分地基于含有识别基序的化合物。在一些实施方式中，选择X以调节含有识别基序的化合物的性能，如增加或减少在特定溶剂中的溶解度。在一些实施方式中，选择X以相容于合成包含识别基序的化合物时待用的反应条件，例如，对合成中使用的反应物无反应性。

在一些实施方式中，B¹包括蛋白质。在一些实施方式中，B¹包括肽。在一些实施方式中，B¹包含抗体、抗体链、抗体片段、抗体表位、抗原结合抗体结构域、VHH结构域、单一结构域抗体、骆驼抗体、纳米体、亲和体、模拟抗体Anticalin、DARPin或Anadnectin。在一些实施方式中，B¹包括重组蛋白、包含一个或多个D-氨基酸的蛋白质、分支肽、治疗性蛋白、酶、多亚基蛋白的多肽亚基、跨膜蛋白、细胞表面蛋白、甲基化肽或蛋白质、酰化肽或蛋白质、脂质化肽或蛋白质、磷酸化肽或蛋白质，或糖基化肽或蛋白质。在一些实施方式中，B¹是包含至少3个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方式中，B¹包括蛋白质。在一些实施方式中，B¹包括肽。在一些实施方式中，B¹包括抗体。在一些实施方式中，B¹包括抗体片段。在一些实施方式中，B¹包括抗体表位。在一些实施方式中，B¹包括绿色荧光蛋白。在一些实施方式中，B¹包括泛素。

在一些实施方式中，A¹包含点击化学柄。在一些实施方式中，A¹包含本文所述的点击化学柄。在一些实施方式中，A¹包含在表1、表2或图2B中描述的点击化学柄。在一些实施方式中，A¹包含在Kolb,Finn和Sharpless应用化学国际版（Angewandte Chemie International Edition）（2001）40:2004-2021；Evans,澳大利亚化学杂志（Australian Journal of Chemistry）（2007）60:384-395）；Joerg Lahann,生物化学和材料科学的点击化学（ClickChemistry for Biotechnology and Materials Science）,2009,John Wiley&SonsLtd,ISBN978-O-470-69970-6；或者Becer,Hoogenboom和Schubert,金属催化环加成作用之外的点击化学（Click Chemistry beyond Metal-CatalyzedCycloaddition）,应用化学国际版（Angewandte Chemie International Edition）（2009）48:4900-4908中描述的点击化学柄；所述文献每一篇的完整内容通过引用方式并入本文。例如，在某些实施方式中，A¹包含末端炔烃、叠氮化物、有张力的炔烃、二烯、亲二烯体、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇或烯烃配基。在一些实施方式中，A¹包含在表1或表2或图2B中描述的点击化学柄。

合适的酶和识别基序

在某些实施方式中，转酰胺基酶是分选酶。来自革兰氏阳性细菌经鉴定为“分选酶”的酶切割蛋白质并将其转位至完整细胞壁中的蛋白聚糖配基上。已经从金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）分离的分选酶是分选酶A（Srt A）和分选酶B（Srt B）。因而，在某些实施方式中，根据本发明使用的转酰胺基酶是分选酶A，例如，来自金黄色葡萄球菌。因而，在某些实施方式中，转酰胺基酶是分选酶B，例如，来自金黄色葡萄球菌。

基于来自革兰氏阳性细菌基因组的61种分选酶的序列比对和系统进化分析，已经将分选酶划分成4类，命名为A、B、C和D（Dramsi S,Trieu-CuotP,Bierne H,分选酶分类：建议用于各种革兰氏阳性细菌分选酶的命名（Sorting sortases:a nomenclature proposal for the various sortases of Gram-positive bacteria）.Res Microbiol.156（3）:289-97,2005）。这些分类对应于以下亚家族，其中Comfort和Clubb也已经将分选酶也划分成所述亚家族（Comfort D,Clubb RT.比较基因组分析鉴定出革兰氏阳性细菌中的不同分选途径（A comparative genome analysis identifies distinct sorting pathways ingram-positive bacteria）.Infect Immun.,72（5）:2710-22,2004）：A类（亚家族1）、B类（亚家族2）、C类（亚家族3）、D类（亚家族4和5）。前述参考文献公开了许多分选酶和识别基序。还参见Pallen,M.J.；Lam,A.C.；Antonio,M.；Dunbar,K.微生物学发展（TRENDS in Microbiology）,2001,9（3）,97-101。本领域技术人员能够容易地基于分选酶序列和/或其他特征（如上文Drami等人中描述的那些）将分选酶分配至正确的分类。术语“分选酶A”在本文中用来指任何特定细菌物种中的A类分选酶，通常命名为SrtA，例如，来自金黄色葡萄球菌的SrtA。同样地，“分选酶B”在本文中用来指任何特定细菌物种中的B类分选酶，通常命名为SrtB，例如，来自金黄色葡萄球菌的SrtB。本发明涵盖涉及来自任何细菌物种或菌株的分选酶A的实施方式。本发明涵盖涉及来自任何细菌物种或菌株的分选酶B的实施方式。本发明涵盖涉及来自任何细菌物种或菌株的C类分选酶的实施方式。本发明涵盖涉及来自任何细菌物种或菌株的D类分选酶的实施方式。

Srt A和Srt B的氨基酸序列和编码它们的核苷酸序列是本领域技术人员已知的并且在本文援引的许多参考文献中公开，所述全部文献的完整内容通过引用方式并入本文。金黄色葡萄球菌SrtA和SrtB的氨基酸序列是同源的，共有例如22%序列同一性和37%序列相似性。来自金黄色葡萄球菌分选酶-转酰胺基酶的氨基酸序列也与来自其他革兰氏阳性细菌的酶的序列具有极大的同源性，并且可以在本文所述的连接方法中利用这类转酰胺基酶。例如，对于SrtA，在化脓性链球菌（S.pyogenes）开放阅读框的整个序列区域范围最佳比对的情况下，存在约31%的序列同一性（和约44%序列相似性）。在内氏放线菌（A.naeslundii）开放阅读框的整个序列区域范围最佳比对的情况下，存在约28%的序列同一性。可以理解，不同细菌菌株可以具有特定多肽序列的差异，并且本文的序列是示例性的。

在某些实施方式中，可以筛选出与编码分选酶的化脓性链球菌、内氏放线菌、变异链球菌（S.mutans）、粪肠球菌（E.faecalis）或枯草芽孢杆菌（B.subtilis）开放阅读框具有18%或更多序列同一性、20%或更多序列同一性，或30%或更多序列同一性的转酰胺基酶，并且可以利用具有与金黄色葡萄球菌Srt A或Srt B可比较的转酰胺基酶活性的酶（例如，可比较活性有时是SrtA或Srt B活性的10%或更多）。

因而在本发明的一些实施方式中，分选酶是分选酶A（SrtA）。SrtA识别基序LPXTG（SEQ ID NO:2）和例如是LPKTG（SEQ ID NO:71）、LPATG（SEQ ID.NO.96）、LPNTG（SEQ ID NO:97）的共同识别基序。在一些实施方式中，使用LPETG（SEQ ID NO:4）。然而，也可以识别落于这种共有序列之外的基序。例如，在一些实施方式中，基序的第4位包含'A'而非'T'，例如，LPXAG（SEQ ID NO:98），例如，LPNAG（SEQ ID NO:99）。在一些实施方式中，基序的第5位包含'A'而非'G'，例如，LPXTA（SEQ ID NO:100），例如，LPNTA（SEQ ID NO:101）。在一些实施方式中，基序的第2位包含'G'而非'P'，例如，LGXTG（SEQ ID NO:102），例如，LGATG（SEQ IDNO:102）。在一些实施方式中，基序的第1位包含'I'而非'L'，例如，IPXTG（SEQ ID NO:104）或IPETG（SEQ ID NO:106）。

将可以理解，就转酰胺基酶或分选酶识别的序列而言，术语“识别基序”和“识别序列”互换使用。有时在本文中术语“转酰胺基酶识别序列”缩写为“TRS”。

在本发明的一些实施方式中，分选酶是分选酶B（SrtB），例如，金黄色葡萄球菌、炭疽芽孢杆菌（B.anthracis）或单核增生李斯特菌（L.monocytogenes）的分选酶B。由B类分选酶（SrtB）识别的基序通常落于共有序列NPXTX范围内，例如，NP[Q/K]-[T/s]-[N/G/s]（SEQ ID NO:107），如NPQTN（SEQ ID NO:108）或NPKTG（SEQ ID NO:109）。例如，金黄色葡萄球菌或炭疽芽孢杆菌的分选酶B切割相应细菌中的IsdC的NPQTN（SEQID NO:110或NPKTG（SEQ ID NO:111）基序（例如见，Marraffini,L.和Schneewind,O.,细菌学杂志（Journal of Bacteriology,）189（17）,第6425-6436页，2007）。B类分选酶的推定性底物中存在的其他识别基序是NSKTA（SEQ ID NO:112）、NPQTG（SEQ ID NO:113）、NAKTN（SEQ ID NO:114）和NPQSS（SEQ ID NO:115）。例如，来自单核增生李斯特菌的SrtB识别在第2位置处缺少P和/或在第3位置处缺少Q或K的某些基序，如NAKTN（SEQ ID NO:116）和NPQSS（SEQ ID NO:117）（Mariscotti JF,Garcia-Del Portillo F,Pucciarelli MG.单核增生李斯特菌分选酶B识别在两种分选基序的第2位处变动的氨基酸（The listeria monocytogenes sortase-Brecognizes varied amino acids at position two of the sorting motif）.J Biol Chem.2009Jan7.[电子出版先于印刷版]）。

在一些实施方式中，分选酶是C类分选酶。C类分选酶可以利用LPXTG（SEQ ID NO:2）作为识别基序。

在一些实施方式中，分选酶是D类分选酶。据预测这个类别中的分选酶识别具有下述共有序列NA-[E/A/S/H]-TG（SEQ ID NO:118）（Comfort D,上文）的基序。D类分选酶已经例如在链霉菌属（Streptomyces spp.）、棒状杆菌属（Corynebacterium spp.）、惠普尔养障体（Tropheryma whipplei），褐色嗜热裂孢菌（Thermobifida fusca）和长双岐杆菌（Bifidobacterium longum）中找到。PXTA（SEQ ID NO:100）或LAXTG（SEQ ID NO:120）可以分别充当D类分选酶（例如，亚家族4和5）的识别序列，亚家族-4和亚家族-5酶分别加工基序LPXTA（SEQ ID NO:100）和LAXTG（SEQ ID NO:122）。例如，炭疽芽孢杆菌分选酶C，作为D类分选酶，已经显示特异性切割炭疽芽孢杆菌BasI和BasH中的LPNTA（SEQ ID NO:123）基序（Marrafini，上文）。

见Barnett和Scott对识别QVPTGV（SEQ ID NO:124）基序的分选酶的描述（Barnett,TC和Scott,JR，通过两种分选酶基因同源物差异性识别化脓性链球菌中的表面蛋白（Differential Recognition of Surface Proteins inStreptococcus pyogenes by Two Sortase Gene Homologs）.细菌学杂志（Journalof Bacteriology），第184卷，第8期，第2181-2191页，2002）。

本发明预期任何革兰氏阳性生物中存在的分选酶（如本文中和/或在本文援引的参考文献（包括数据库）中提到的那些）的用途。本发明还预期了革兰氏阴性细菌（例如，冷红科尔韦尔氏菌（Colwellia psychrerythraea）、Microbulbifer degradans、慢生型大豆根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）、奥奈达希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）和腐败希瓦氏菌（Shewanellaputrefaciens））中存在的分选酶的用途，它们识别序列基序LP[Q/K]T[A/S]T（SEQ ID NO:121）。在来自革兰氏阳性生物的分选酶的第3位保持对变异耐受的情况下，可以使用序列基序LPXT[A/S]（SEQ ID NO:119），例如，可以使用LPXTA（SEQ ID NO:100）或LPSTS（SEQ ID NO:128）。

本发明预期了使用下述分选酶识别基序，所述分选酶识别基序来自http://bamics3.cmbi.kun.nl/jos/sortase_substrates/help.html（其内容通过引用的方式并入本文）处和/或在前述任一参考文献中列出的经实验验证的或推定的任何分选酶底物。在一些实施方式中，分选酶识别基序选自：LPKTG（SEQID NO:71）、LPITG（SEQ ID NO:72）、LPDTA（SEQ ID NO:73）、SPKTG（SEQ ID NO:74）、LAETG（SEQ ID NO:75）、LAATG（SEQ ID NO:76）、LAHTG（SEQ ID NO:77）、LASTG（SEQ ID NO:78）、LAETG（SEQ IDNO:79）、LPLTG（SEQ ID NO:80）、LSRTG（SEQ ID NO:81）、LPETG（SEQ ID NO:4）、VPDTG（SEQ ID NO:82）、IPQTG（SEQ ID NO:83）、YPRRG（SEQ ID NO:84）、LPMTG（SEQ ID NO:85）、LPLTG（SEQ ID NO:86）、LAFTG（SEQ ID NO:87）、LPQTS（SEQ ID NO:89），可理解在本发明的多种实施方式中，将第5残基替换，如本文中他处描述。例如，使用的序列可以是LPXT、LAXT、LPXA、LGXT、IPXT、NPXT、NPXS、LPST（SEQ ID NO:90）、NSKT（SEQ ID NO:91）、NPQT（SEQ ID NO:92）、NAKT（SEQ ID NO:93）、LPIT（SEQ ID NO:94）、LAET（SEQ ID NO:95）或NPQS（SEQ ID NO:70）。本发明包括如下实施方式，其中本文公开或本领域已知的任何分选酶识别基序中的'X'是任何标准氨基酸或非标准氨基酸的。本发明公开了每种变异。在一些实施方式中，X选自活生物提中存在的蛋白质内最常找到的20种标准氨基酸。在一些实施方式中，例如，其中识别基序是LPXTG（SEQ ID NO:2）或LPXT的情况下，X是D、E、A、N、Q、K或R。在一些实施方式中，特定识别基序中的X选自天然存在的分选酶底物中第3位的那些氨基酸。例如，在一些实施方式中，X选自LPXTG（SEQID NO:2）或LPXT基序中的K、E、N、Q、A，其中分选酶是分选酶A。例如，在一些实施方式中，X选自LPXTG（SEQ ID NO:2）或LPXT基序中的K、S、E、L、A、N，并且使用C类分选酶。

在一些实施方式中，识别序列还包含一个或多个其他氨基酸，例如，在N或C末端处。例如，可以并入一个或多个具有与在天然存在的分选酶底物中与N末端或C末端直接发现的氨基酸至5氨基酸识别序列一致性的氨基酸（例如，至多5个氨基酸）。这类其他的氨基酸可以提供改善识别基序识别作用的环境。

术语“转酰胺基酶识别序列”可以指掩蔽或未掩蔽的转酰胺基酶识别序列。未掩蔽的转酰胺基酶识别序列可以由转酰胺基酶识别。未掩蔽的转酰胺基酶识别序列可以先前已经被掩蔽，例如，如本文所述。在一些实施方式中，“掩蔽的转酰胺基酶识别序列”是这样的序列，所述序列不被转酰胺基酶识别但是可以容易地修饰（“未掩蔽”），从而所产生的序列被转酰胺基酶识别。例如，在一些实施方式中，掩蔽的转酰胺基酶识别序列至少一个氨基酸具有侧链，所述侧链包含抑制（例如，基本上阻止）目的转酰胺基酶识别该序列的配基，其中该配基的移除允许转酰胺基酶识别该序列。在某些实施方式中，掩蔽可以例如减少识别至少80%、90%、95%或更多（例如，至不可检测水平）。以举例方式，在某些实施方式中，转酰胺基酶识别序列如LPXTG（SEQ IDNO:2）中的苏氨酸残基磷酸化，因而使得它难以由SrtA识别和切割。掩蔽的识别序列可以通过用磷酸酶处理而解除掩蔽，因此允许其用于SrtA-催化的转酰胺化反应中。

包含点击化学柄的修饰蛋白

一些实施方式提供包含C末端点击化学柄（CCH）的修饰蛋白质（PRT），其中修饰的蛋白质包含根据式（I）的结构：

PRT-LPXT-[Xaa]_y-CCH （I）。

一些实施方式提供包含N末端点击化学柄（CCH）的修饰蛋白质（PRT），其中修饰的蛋白质包含根据式（I）根据式（II）的结构：

CHH-[Xaa]_y-LPXT-PRT （II）。

其中，在式（I）和（II）中：

PRT是至少三个氨基酸的氨基酸序列；Xaa的每个例子独立地是氨基酸残基；Y是0或1-100之间的整数，LPXT是分选酶识别基序；并且CCH是点击化学柄。在一些实施方式中，提供了由根据式（I）或式（II）的结构组成的修饰蛋白质。

点击化学

各自包点击化学柄的两个蛋白质（例如，包含提供亲核（Nu）基团的点击化学柄的第一蛋白质和包含可以与第一点击化学柄的Nu基团反应的亲电子基团（E）的第二蛋白质）可以在点击化学反应条件下共价结合。点击化学是Sharpless在2001年引入的化学哲学并且描述了通过将小单位结合在一起迅速和可靠地产生物质的化学（见，例如，Kolb,Finn和Sharpless应用化学国际版（Angewandte Chemie International Edition）（2001）40:2004-2021；Evans,澳大利亚化学杂志（Australian Journal of Chemistry）（2007）60:384-395）。在Joerg Lahann,生物化学和材料科学的点击化学（Click Chemistry forBiotechnology and Materials Science）,2009,John Wiley&Sons Ltd,ISBN978-O-470-69970-6中描述了根据本发明多方面可用的其他示例性点击化学柄、反应条件和相关方法，所述文献的完整内容通过引用方式并入本文。

点击化学应当是模块化的，范围广泛，赋予高化学产率，产生无害的副产物，具有立体特异性，生理稳定，显示巨大热动力驱动力（例如>84kJ/mol，以有利于存在单个反应产物的反应），和/或具有高度原子经济性。已经鉴定了符合这种概念的几种反应：

1.Huisgen1,3-偶极环加成反应（例如，Cu（I）催化的逐级变体，经常简称为“点击反应”；见，例如，Tornoe等人,有机化学杂志（Journal ofOrganic Chemistry）（2002）67:3057-3064）。铜和钌是反应中常使用的催化剂。铜作为催化剂的应用导致1,4-结构异构体的形成，而钌导致1,5-结构异构体的形成；

2.其他环加成反应反应，如Diels-Alder反应；

3.对张力小的环如环氧化物和氮杂环丙烷的亲核加成；

4.对激活的羰基的亲核加成；和

5.对碳-碳双键或叁键的加成反应。

借助点击化学柄结合蛋白质

对于借助点击化学结合的两个蛋白质，蛋白质的点击化学柄不得不彼此具有反应性，例如，其中点击化学柄之一的反应性配基可以与第二点击化学柄的反应性配基反应以形成共价键。点击化学柄的这类反应性配偶物是本领域技术人员熟知的并且包括但不限于表I中描述的那些：

表I

表I：示例性点击化学柄和反应，其中根据式（I）和（II），R₁、R₂各自独立地是PRT-LPXT-[Xaa]_y-或-[Xaa]_y-LPXT-PRT。

在一些优选的实施方式中，使用可以在金属催化剂不存在的情况下反应以形成共价键的点击化学柄。这类点击化学柄是本领域技术人员熟知的并且包括在Becer,Hoogenboom和Schubert，金属催化的环加成反应之外的点击化学（Click Chemistry beyond Metal-Catalyzed Cycloaddition）,应用化学国际版（Angewandte Chemie International Edition）（2009）48:4900-4908中描述的点击化学柄。

^[a]RT=室温，DMF=N,N-二甲基甲酰胺，NMP=N-甲基吡咯烷酮，THF=四氢呋喃，CH₃CN=乙腈。

表2：示例性点击化学柄和反应。来自Becer,Hoogenboom和Schubert,金属催化的环加成反应之外的点击化学（Click Chemistry beyond Metal-Catalyzed Cycloaddition），应用化学国际版（Angewandte Chemie InternationalEdition）（2009）48:4900-4908。

适用于本文所述的蛋白质结合方法中的其他点击化学柄是本领域技术人员熟知的，并且这类点击化学柄包括但不限于在以下文献中描述的点击化学反应配偶物、基团和柄：[1]H.C.Kolb,M.G.Finn,K.B.Sharpless,应用化学2001,113,2056-2075；应用化学国际版2001,40,2004-2021.[2]a）C.J.Hawker,K.L.Wooley,科学2005,309,1200-1205；b）D.Fournier,R.Hoogenboom,U.S.Schubert,化学会评论2007,36,1369-1380；c）W.H.Binder,R.Sachsenhofer,Macromol.Rapid Commun.2007,28,15-54；d）H.C.Kolb,K.B.Sharpless,最新药物2003,8,1128-1137；e）V.D.Bock,H.Hiemstra,J.H.van Maarseveen,欧洲有机化学杂志2006,51-68.[3]a）V.O.Rodionov,V.V.Fokin,M.G.Finn,应用化学2005,117,2250-2255；应用化学国际版2005,44,2210-2215；b）P.L.Golas,N.V.Tsarevsky,B.S.Sumerlin,K.Matyjaszewski,大分子2006,39,6451-6457；c）C.N.Urbani,C.A.Bell,M.R.Whittaker,M.J.Monteiro,大分子2008,41,1057-1060；d）S.Chassaing,A.S.S.Sido,A.Alix,M.Kumarraja,P.Pale,J.Sommer,欧洲化学.2008,14,6713-6721；e）B.C.Boren,S.Narayan,L.K.Rasmussen,L.Zhang,H.Zhao,Z.Lin,G.Jia,V.V.Fokin,美国化学会志2008,130,8923-8930；f）B.Saba,S.Sharma,D.Sawant,B.Kundu,Synlett2007,1591-1594.[4]J.F.Lutz,应用化学2008,120,2212-2214；应用化学国际版2008,47,2182-2184.[5]a）Q.Wang,T.R.Chan,R.Hilgraf,V.V.Fokin,K.B.Sharpless,M.G.Finn,美国化学会志2003,125,3192-3193；b）J.Gierlich,G.A.Burley,P.M.E.

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例如，在一些实施方式中，提供包含C末端有张力的炔烃基团（例如，C末端环辛炔基团）作为点击化学柄的第一蛋白质和包含C末端叠氮化物基团作为点击化学柄的第二蛋白质。这两种点击化学柄彼此具有反应性，因为它们可以实施张力促进的环加成反应，这导致第一蛋白质和第二蛋白质经共价键结合。在这个例子中，蛋白质的两个C-末端结合在一起，这也称作C-C或C对C结合。

在某些实施方式中，包含亲选自-SH、-OH、-NHR^b5、-NH-NHR^b5或-N=NH的亲核性点击化学柄（Nu）的第一分子（例如，第一蛋白质）与包含亲电子的配偶物点击化学柄（E）

的第二分子（例如，第二蛋白质）结合，

以形成具有下式的结合基团的嵌合蛋白：

其中Z^b9是-S-、-O-、-N（R^b5）-、-NH-N（R^b5）-或-N=N-。在一些实施方式中，亲核性点击化学柄Nu是-SH并且Z^b9是-S-。在某些实施方式中，Nu是-OH并且Z^b9是-O-。在某些实施方式中，Nu是-NHR^b5并且Z^b9是-N（R^b5）-。在某些实施方式中，Nu是-NH-NHR^b5并且Z^b9是-NH-N（R^b5）-。在某些实施方式中，Nu是-N=NH并且Z^b9是-N=N-。在某些实施方式中，R^b5是氢。

在某些实施方式中，Nu是-SH、-OH、-NHR^b5、-NH-NHR^b5或-N=NH，并且E是

并且两个分子（例如，两个蛋白质）结合以形成嵌合分子，例如，嵌合蛋白，其中Nu和E经结合以形成如下式的结合基团：

其中Z^b9是-S-、-O-、-N（R^b5）-、-NH-N（R^b5）-或-N=N-。在某些实施方式中，Nu是-SH并且Z^b9是-S-。在某些实施方式中，Nu是-OH并且Z^b9是-O-。在某些实施方式中，Nu是-NHR^b5并且Z^b9是-N（R^b5）-。在某些实施方式中，Nu是-NH-NHR^b5并且Z^b9是-NH-N（R^b5）-。在某些实施方式中，Nu是-N=NH并且Z^b9是-N=N-。在某些实施方式中，R^b5是氢。

其中Z^b9是-S-、-O-、-N（R^b5）-、-NH-N（R^b5）-或-N=N-。在某些实施方式中，Nu是-SH并且Z^b9是-S-。在某些实施方式中，Nu是-OH并且Z^b9是-O-。在某些实施方式中，Nu是-NHR^b5并且Z^b9是-N（R^b5）-。在某些实施方式中，Nu是-NH-NHR^b5并且Z^b9是-NH-N（R^b5）-。在某些实施方式中，Nu是-N=NH并且Z^b9是-N=N-。在某些实施方式中，R^b5是氢。在某些实施方式中，R^b6是氢，任选地取代的脂族基，或任选地取代的杂脂族基。在某些实施方式中，R^b6是氢或C_1-6烷基。在某些实施方式中，R^b6是氢或-CH₃。在某些实施方式中，R^b5是氢。在某些实施方式中，R^b8是氨基保护基。

并且两个分子（例如，两个蛋白质）结合以形成嵌合分子，例如，嵌合蛋白，其中Nu和E经结合以形成下式的结合基团：

其中Z^b9是-S-、-O-、-N（R^b5）-、-NH-N（R^b5）-或-N=N-。在某些实施方式中，Nu是-SH并且Z^b9是-S-。在某些实施方式中，Nu是-OH并且Z^b9是-O-。在某些实施方式中，Nu是-NHR^b5并且Z^b9是-N（R^b5）-。在某些实施方式中，Nu是-NH-NHR^b5并且Z^b9是-NH-N（R^b5）-。在某些实施方式中，Nu是-N=NH并且Z^b9是-N=N-。在某些实施方式中，R^b5是氢。在某些实施方式中，R^b6是氢，任选地取代的脂族基，或任选地取代的杂脂族基。在某些实施方式中，R^b6是氢或C_1-6烷基。在某些实施方式中，R^b6是氢或-CH₃。在某些实施方式中，R^B11是氢。在某些实施方式中，R^B11是氧保护基。

在某些实施方式中，Nu是-SH、-OH、-NHR^b5、-NH-NHR^b5或-N=NH，并且E是-CO₂R^b6、-COX^b7，并且两个分子（例如，两个蛋白质）结合以形成嵌合分子，例如，嵌合蛋白，其中Nu和E经结合以形成下式的结合基团：

其中Z^b9是-S-、-O-、-N（R^b5）-、-NH-N（R^b5）-或-N=N-。在某些实施方式中，Nu是-SH并且Z^b9是-S-。在某些实施方式中，Nu是-OH并且Z^b9是-O-。在某些实施方式中，Nu是-NHR^b5并且Z^b9是-N（R^b5）-。在某些实施方式中，Nu是-NH-NHR^b5并且Z^b9是-NH-N（R^b5）-。在某些实施方式中，Nu是-N=NH并且Z^b9是-N=N-。在某些实施方式中，R^b5是氢。在某些实施方式中，R^b6是氢，任选地取代的脂族基，或任选地取代的杂脂族基。在某些实施方式中，R^b6是氢或C_1-6烷基。在某些实施方式中，R^b6是氢或-CH₃。

其中Z^b9是-S-、-O-、-N（R^b5）-、-NH-N（R^b5）-或-N=N-。在某些实施方式中，Nu是-SH并且Z^b9是-S-（硫醇-炔反应）。在某些实施方式中，Nu是-OH并且Z^b9是-O-。在某些实施方式中，Nu是-NHR^b5并且Z^b9是-N（R^b5）-。在某些实施方式中，Nu是-NH-NHR^b5并且Z^b9是-NH-N（R^b5）-。在某些实施方式中，Nu是-N=NH并且Z^b9是-N=N-。在某些实施方式中，R^b5是氢。在某些实施方式中，R^b6是氢，任选地取代的脂族基，或任选地取代的杂脂族基。在某些实施方式中，R^b6是氢或C_1-6烷基。在某些实施方式中，R^b6是氢或-CH₃。

其中Z^b9是-S-、-O-、-N（R^b5）-、-NH-N（R^b5）-或-N=N-。在某些实施方式中，Nu是-SH并且Z^b9是-S-（硫醇-炔反应）。在某些实施方式中，Nu是-OH并且Z^b9是-O-。在某些实施方式中，Nu是-NHR^b5并且Z^b9是-N（R^b5）-。在某些实施方式中，Nu是-NH-NHR^b5并且Z^b9是-NH-N（R^b5）-。在某些实施方式中，Nu是-N=NH并且Z^b9是-N=N-。

在某些实施方式中，Nu是-N=NH和E是-CHO，经结合以形成式III的同型二聚体或异二聚体多肽，其中Nu和E经连接以形成下式的结合基团：

在某些实施方式中，Nu是-NHR^b5，R^b5是氢，并且E是-CHO，并且两个分子（例如，两个蛋白质）结合以形成嵌合分子，例如，嵌合蛋白，其中Nu和E经结合以形成下式的结合基团：

在某些实施方式中，Nu是-NH-N（R^b5）-，R^b5是氢，并且E是-CHO，并且两个分子（例如，两个蛋白质）结合以形成嵌合分子，例如，嵌合蛋白，其中Nu和E经结合以形成下式的结合基团：

在某些实施方式中，Nu是并且E是

并且两个分子（例如，两个蛋白质）借助Diels-Alder反应结合以形成嵌合分子，例如，嵌合蛋白，其中Nu和E经结合以形成下式的结合基团：

在某些实施方式中，R^b10是氢。在某些实施方式中，R^b6是氢或任选取代的脂族基，例如，酰基。

在某些实施方式中，Nu是-N₃，并且E是并且两个分子（例如，两个蛋白质）借助Huisgen1,3-偶极环加成反应结合以形成嵌合分子，例如，嵌合蛋白，其中Nu和E经结合以形成下式的结合基团：

（1,4结构异构体）或

（1,5结构异构体）。

在某些实施方式中，R^b6是氢，任选地取代的脂族基，或任选地取代的杂脂族基。在某些实施方式中，R^b6是氢或C_1-6烷基。在某些实施方式中，R^b6是氢或-CH₃。在某些实施方式中，R^b6是氢。

在某些实施方式中，各自包含点击化学柄Nu（其中每个Nu独立地是-SH、-OH、-NHR^b5、-NH-NHR^b5或-N=NH）的两个蛋白质通过两个多肽与下式的双亲电子体发生反应来结合：

X^b7-W₃-X^b7

其中X^b7是离去基团，并且W₃选自任选取代的亚烷基；任选取代的亚烯基；任选取代的亚炔基；任选取代的杂亚烷基；任选取代的杂亚烯基；任选取代的杂亚炔基；任选取代的亚芳基；或任选取代的杂亚芳基，以提供下式的结合基团：

其中Z^b9是-O-、-S-、-N（R^b5）-、-NH-N（R^b5）-或-N=N-。在某些实施方式中，每个Nu是-SH并且每个Z^b9是-S-。在某些实施方式中，每个Nu是-OH并且每个Z^b9是-O-。在某些实施方式中，每个Nu是-NHR^b5并且每个Z^b9是-N（R^b5）-。在某些实施方式中，每个Nu是-NH-NHR^b5并且每个Z^b9是-NH-N（R^b5）-。在某些实施方式中，每个Nu是-N=NH并且每个Z^b9是-N=N-。在某些实施方式中，W₃是任选取代的亚烷基。在某些实施方式中，W₃是任选取代的亚芳基。在某些实施方式中，W₃是任选取代的杂亚芳基。预期了两个Nu基团和两个X^b7基团的多种组合。在某些实施方式中，因此两个Nu基团和两个Z^b9基团是相同的。在某些实施方式中，两个Nu基团和因此两个Z^b9基团是不同的。在某些实施方式中，两个X^b7基团是相同的。在某些实施方式中，两个X^b7基团是不同的。

在某些实施方式中，其中W3是任选取代的亚烷基，双-亲电体具有下式：

其中X^b7是-Br、-Cl或-I。

例如，当双-亲电体具有下式：

时，所产生的结合基团具有下式：

在某些实施方式中，其中W3是任选取代的杂亚芳基的，双亲电体具有下式：

其中X^b7是-Br、-Cl或-I。

例如，当双-亲电体具有下式：

时，所产生的结合基团具有下式：

在某些实施方式中，各自包含点击化学柄E的两个蛋白质通过两种多肽与双亲核体Nu-W₄-Nu反应来结合以提供结合的多肽，其中每个E独立地选自离去基团、-CHO、-CO₂R^b6、-COX^b7、

其中每个Nu是-SH、-OH、-NHR^b5、-NH-NHR^b5、-N=NH、-N=C、-N₃或

以及W₄独立地代表任选取代的亚烷基；任选取代的亚烯基；任选取代的亚炔基；任选取代的杂亚烷基；任选取代的杂亚烯基；任选取代的杂亚炔基；任选取代的亚芳基；任选取代的杂亚芳基；或其组合。列于下文的与W₄结合的两个E基团各自地对应于上述结合基团中的任一个：

预期了两个E基团的多种组合。在某些实施方式中，两个E基团是相同的。在某些实施方式中，两个E基团是不同的。在某些实施方式中，两个Nu基团和因此两个Z^b9基团是不同的。在某些实施方式中，两个X^b7基团是相同的。在某些实施方式中，两个X^b7基团是不同的。

化合物、组合物及其用途

本发明的一些实施方式提供嵌合蛋白，例如，包含分选酶识别基序的并且借助点击化学与第二分子结合的蛋白质。在一些实施方式中，嵌合蛋白包含抗体或抗体片段，例如，纳米体。在一些实施方式中抗体或抗体片段是治疗性抗体或抗体片段，例如，与治疗性靶抗原结合的抗体或抗体片段。一些实施方式包括本领域技术人员已知的任何治疗性抗体，因为本发明不限于这个方面。另外，作为已知的治疗性抗体结合至治疗性抗原（例如，结合至治疗性抗原的相同或不同表位）的任何抗体或抗体片段可以用于本发明的一些实施方式中，例如，用于产生如本文所述的嵌合抗体。一些实施方式提供嵌合抗体，所述嵌合抗体作为根据本文所述方法衍生的这类治疗性抗体或结合治疗性抗原的抗体的结果产生。

在一些实施方式中，嵌合蛋白靶向细胞群体、组织、生物体或受试者中的特定抗原、细胞类型或位点。例如，在一些实施方式中，提供了双特异性嵌合抗体，所述抗体包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域将抗体靶向靶位点（例如，器官、细胞或细胞类型（例如，患病细胞，如肿瘤细胞）、组织或疾病部位），所述第二抗原结合结构域提供功能，例如，治疗性功能。这种治疗性功能可以由毒素或由吸引特定细胞或细胞类型至靶部位的分子提供。在一些实施方式中，提供嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含靶向例如受试者中特定细胞、细胞类型、组织或部位的抗体，其中所述抗体借助点击化学结合至治疗药（例如，小分子）或治疗性多肽。在一些实施方式中，如本文中提供的治疗性蛋白与作为靶抗原的肿瘤抗原结合。在一些实施方式中，如本文中提供的治疗性蛋白与已知或潜在的病原体（例如，病毒、细菌、真菌或寄生虫）的抗原结合。

本领域技术人员将理解，如本文中提供的嵌合多肽和蛋白质可以包含任何治疗药，所述治疗药包含点击化学柄或可以与之连接。

在一些实施方式中，本文所述的方法和试剂用来靶蛋白连接至固体或半固体支持物或表面，例如，粒子（任选地，磁粒子）、微粒子、纳米粒子、珠、载玻片、滤器或（例如，多孔/微量滴定平板的）孔。

在一些实施方式中，本文所述的方法和试剂和修饰的蛋白质（例如，本文所述的嵌合蛋白或嵌合抗体）在体外、在体内用于研究、用于检测、用于诊断分析中或用于治疗性应用中。示例性，非限制的治疗性应用包括治疗传染病、治疗癌症和治疗代谢性疾病。其他治疗性用途对本领域技术人员来说是显而易见，因为本发明不限于这个方面。

选择的靶蛋白

不以任何方式限制本发明，这个章节讨论某些靶蛋白。通常而言，可以修饰任何蛋白质或多肽以携带点击化学柄和/或借助点击化学根据本文中提供的方法使蛋白质或多肽与另一个分子结合。在一些实施方式中，靶蛋白包含与天然存在的蛋白质或多肽至少80%或至少90%（例如，至少95%、86%、97%、98%、99%、99.5%或100%）一致性的多肽或由其组成。在一些实施方式中，相对于天然存在的序列，靶蛋白具有不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异。在一些实施方式中，天然存在的蛋白质是哺乳动物蛋白质，例如，人源蛋白质。在一些实施方式中，蛋白质是抗体、抗体片段或包含抗原结合结构域的蛋白质。在一些实施方式中，天然存在的蛋白质是细胞因子，例如，I型细胞因子。在特别有意义的一些实施方式中，靶蛋白是4-螺旋束蛋白，例如，4-螺旋束细胞因子。示例性4-螺旋束细胞因子包括，例如，某些干扰素（例如，I型干扰素，例如，IFN-α）、白介素（例如，IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12）和集落刺激因子（例如，G-CSF、GM-CSF、M-CSF）。IFN可以例如是干扰素α2a或干扰素α2b。关于这些细胞因子中某一些的进一步讨论，见，例如Mott HR和Campbell ID."4-螺旋束生长因子和它们的受体：蛋白质-蛋白质相互作用（Four-helix bundlegrowth factors and their receptors:protein-protein interactions）."Curr OpinStruct Biol.1995Feb;5（1）:114-21；Chaiken IM,Williams WV."鉴定4-螺旋束细胞因子中的结构-功能关系：对于从头开始的模拟设计（Identifyingstructure-function relationships in four-helix bundle cytokines:towards de novomimetics design）".Trends Biotechnol.1996Oct;14（10）:369-75；Klaus W等人,"通过异核NMR光谱法测定的溶液中人干扰素α-2a的三维高分辨率结构（The three-dimensional high resolution structure of human interferon alpha-2adetermined by heteronuclear NMR spectroscopy in solution）".J Mol Biol.,274（4）:661-75,1997。

在一些实施方式中，细胞因子具有与一种或多种前文提到的细胞因子相似的结构。例如，细胞因子可以是IL-6类细胞因子，如白血病抑制因子（LIF）或抑瘤素M。在一些实施方式中，细胞因子是在自然界中与包含GP130信号转导亚基的受体结合的一种细胞因子。其他的目的4-螺旋束蛋白包括生长激素（GH）、催乳素（PRL）和胎盘催乳激素。在一些实施方式中，靶蛋白是红细胞生成刺激物质，例如，促红细胞生成素（EPO），其也是4-螺旋束细胞因子。在一些实施方式中，红细胞生成刺激物质是EPO变体，例如，达贝泊汀α（arbepoetinα），又称作新红细胞生成刺激蛋白（NESP），其经工程化含有5个N-联糖链（比重组HuEPO多两个）。在一些实施方式中，该蛋白质包含5个螺旋。例如，该蛋白质可以是干扰素β，例如，干扰素β-1a或干扰素β-1b，所述干扰素β（如所理解的）经常被划归为4-螺旋束细胞因子。在一些实施方式中，靶蛋白是IL-9、IL-10、IL-11、IL-13或IL-15。关于某些细胞因子的讨论，见例如Hunter,CA,免疫学自然综述（Nature ReviewsImmunology）5,521-531,2005。还见Paul,WE（编著）,基础免疫学（Fundamental Immunology）,Lippincott Williams&Wilkins；第6版，2008。可以使用在本文援引的参考文献中描述的任何蛋白质（它们全部通过引用方式并入本文）作为靶蛋白。

在一些实施方式中，靶蛋白是由美国食品药品管理局（或同等管理机关如欧洲药物评审局）批准用于治疗人类中疾病或病症的蛋白质。这类蛋白质可以是或可以不是蛋白质的聚乙二醇化形式已经在临床试验中测试过和/或已经批准用于销售的蛋白质。

在一些实施方式中，靶蛋白是神经营养因子，即，促进神经谱系细胞（如本文所用的术语包括神经祖先细胞、神经元和神经胶质细胞，例如，星形细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞）存活、发育和/或功能的因子。例如，在一些实施方式中，靶蛋白是促进神经突起的因子。在一些实施方式中，蛋白质是睫状神经营养因子（CNTF；一种4-螺旋束蛋白质）或其类似物如Axokine，所述Axokine是人睫状神经营养因子的改良形式，其具有C末端15个氨基酸截短和两个氨基酸置换，其在体外和体内测定法中的效力比CNTF高3至5倍并且具有改善的稳定性特性。

在一些实施方式中，靶蛋白是形成同型二聚体或异二聚体（或包含不只两个亚基的同型寡聚体或异寡聚体，如四聚体）的一种靶蛋白。在某些实施方式中，同型二聚体、异二聚体或寡聚体结构是这样的，从而第一亚基的末端紧邻于第二亚基的末端。例如，第一亚基的N末端紧邻于第二亚基的C末端。在某些实施方式中，同型二聚体、异二聚体或寡聚体结构是这样的，从而第一亚基的末端和第二亚基的末端不参与同受体的相互作用，从而所述末端可以借助非基因方式编码的肽元件连接，而不显著地影响生物活性。在一些实施方式中，使用本文所述的方法，借助点击化学结合同型二聚体，异二聚体或寡聚体的两个亚基的末端，因而产生其中至少两个亚基共价结合的二聚体（或寡聚体）。例如，神经营养蛋白神经生长因子（NGF）、脑衍生神经营养因子（BDNF）、神经营养因子3（NT3）和神经营养因子4（NT4）是共有大约50%序列同一性并以二聚体形式存在的二聚体分子。见，例如，Robinson RC等人,"脑衍生神经营养因子/神经营养因子3异二聚体的结构（Structure of the brain-derived.neurotrophic factor/neurotrophin3heterodimer）."生物化学（Biochemistry）.34（13）:4139-46,1995；RobinsonRC等人,"神经营养因子4同型二聚体和脑衍生神经营养因子/神经营养因子4异二聚体的结构揭示出共同的Trk-结合位点（The structures of theneurotrophin4homodimer and the brain-derived neurotrophic factor/neurotrophin4heterodimer reveal a common Trk-binding site）"Protein Sci.8（12）:2589-97,1999，及其中参考文献。在一些实施方式中，二聚体蛋白是细胞因子，例如，白介素。

在一些实施方式中，靶蛋白是酶，例如，在代谢或其他生理过程中重要的酶。如本领域已知的，酶或其他蛋白质的缺乏可以导致多种疾病。这类疾病包括与糖代谢缺陷、氨基酸代谢缺陷、有机酸代谢缺陷、卟啉代谢缺陷、嘌呤或嘧啶代谢缺陷、溶酶体贮积病症、血液凝固等相关的疾病。例子包括法布里病、戈谢病、庞贝氏症、腺苷脱氨酶缺乏症、天冬酰胺酶缺乏症、卟啉病、血友病和遗传性血管性水肿。在一些实施方式中，蛋白质是凝块或凝血因子（例如，因子VII、VIIa、VIII或IX）。在其他实施方式中，蛋白质是在糖代谢、氨基酸代谢、有机酸代谢、卟啉代谢、嘌呤或嘧啶代谢和/或溶酶体贮积中发挥作用的酶，其中所述酶的外源施用至少部分地减轻该疾病。

在一些实施方式中，靶蛋白包含受体或受体片段（例如，胞外结构域）。在一些实施方式中，受体是TNFa受体。在某些实施方式中，靶蛋白包括尿酸氧化酶。

本领域技术人员将知晓本文所述的蛋白质的序列。在不限制的情况下，某些靶蛋白的序列存在于例如SSN10/773,530；11/531,531；USSN11/707,014；11/429,276；11/365,008中。在一些实施方式中，靶蛋白在表3中列出。本发明涵盖本发明方法对本文所述的任何蛋白质和本领域技术人员已知的任何蛋白质的适用性。

在一些实施方式中，本发明提供任何靶蛋白的修饰形式，其所述修饰形式包含（i）在N末端处的一个或多个亲核性残基如甘氨酸（例如，1个残基至10个残基）和，任选地，切割识别序列，例如，掩蔽亲核性残基的蛋白酶切割识别序列）；或（ii）在C末端处或其附近的分选酶识别基序。在一些实施方式中，靶蛋白包括（i）和（ii）。这类修饰的蛋白质可以用于如本文所述的蛋白质结合方法中。

本领域技术人员将是清楚，某些蛋白质，例如，分泌的真核（例如，哺乳动物）蛋白，通常经历胞内加工（例如，在分泌之前切除分泌信号和/或移除对生物活性而言不需要的其他部分）以产生成熟形式。靶蛋白的这类成熟的生物活性形式用于本发明的某些实施方式中。

表3：选择的靶蛋白序列

可以理解关于前文提到的许多蛋白质以及来自不同哺乳动物物种的序列的大量结构/功能信息是可获得的，所述信息可以用来设计保留显著生物活性的天然存在序列的变体（例如，天然存在蛋白质的至少25%、75%、90%或更多的活性）。例如，在一些情况下处于与相应受体复合的复合物中的许多蛋白质的晶体结构或NMR结构是可获得的。此外，应当理解，如果天然存在的N-末端和C-末端在天然结构中并非彼此紧邻地存在，则天然存在的序列可以在N-和/或C-末端处延长，例如，采用柔性肽间隔序列延长，从而末端可以靠近。

在多种实施方式中，抗体与目的抗原结合。目的抗原可以是或可以包含例如多肽、多糖、糖类、脂质、核酸或其组合。在多种实施方式中，抗原可以是天然存在的或合成的。在一些实施方式中，抗原天然地由病原体、感染的细胞或肿瘤细胞（例如，癌细胞）产生和/或包含由病原体、感染的细胞或肿瘤细胞（例如，癌细胞）以基因方式编码的多肽或肽。在一些实施方式中，抗原是自体抗原（“自身抗原”），或具有引发或增强自身免疫反应的能力的物质。在一些实施方式中，抗原由病毒、细菌、真菌或寄生虫产生或以基因方式编码，一些实施方式中抗原是病原体抗原。在一些实施方式中，试剂（例如，病毒、细菌、真菌、寄生体）感染至少一种哺乳动物或鸟类物种，例如，人、非人灵长类、牛、羊、马、山羊、和/或猪物种并且在一些实施方式中，在其中引起疾病。在一些实施方式中，病原体在其至少部分的生活周期期间是胞内的。在一些实施方式中，病原体是细胞外的。将可以理解在多种实施方式中，源自特定来源的抗原可以从这类来源分离，或使用任何适宜的手段（例如，重组地、合成地等）产生，例如，目的是使用该抗原例如来鉴定、产生、测试或使用针对该抗原的抗体）。可以修饰抗原，例如，通过与另一个分子或实体（例如，佐剂）的结合、化学抗原或物理变性等。在一些实施方式中、抗原是包膜蛋白、衣壳蛋白、分泌蛋白、结构蛋白、细胞壁蛋白或多糖、荚膜蛋白或多糖、或酶。在一些实施方式中，抗原是毒素，例如，细菌毒素。

示例性病毒包括例如逆转录病毒科（Retroviridae）（例如，慢病毒如人免疫缺损病毒、如HIV-I）；杯状病毒科（Caliciviridae）（例如造成胃肠炎的毒株）；披膜病毒科（Togaviridae）（例如马脑炎病毒、风疹病毒）；黄病毒科（Flaviridae）（例如登革病毒、脑炎病毒、黄热病毒、丙型肝炎病毒）；冠状病毒科（例如冠状病毒）；弹状病毒科（Rhabdoviridae）（例如水泡性口炎病毒、狂犬病病毒）；丝状病毒科（Filoviridae）（例如埃博拉病毒）；副粘病毒科（Paramyxoviridae）（例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞体病毒）；正粘病毒科（Orthomyxoviridae）（例如流感病毒）；布尼亚病毒科（Bunyaviridae）（例如汉坦病毒、布尼亚病毒病毒、白蛉热病毒和内罗毕病毒）；砂粒样病毒科（Arenaviridae）（出血的发热病毒）；呼肠孤病毒科（Reoviridae）（例如，呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒）；双RNA病毒科（Birnaviridae）；嗜肝DNA病毒科（Hepadnaviridae）（乙型肝炎病毒）；细小病毒科（Parvoviridae）（细小病毒）；乳多空病毒科（Papovaviridae）（乳头瘤病毒、多瘤病毒）；腺病毒科（Adenoviridae）；疱疹病毒科（Herpesviridae）（单纯疱疹病毒（HSV）1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒（CMV）、EBV、KSV）；痘病毒科（天花病毒、痘苗病毒、痘病毒）；和小RNA病毒科（Picornaviridae）（例如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒）。

示例性细菌例如包括幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）、伯氏疏螺旋体（Borellia burgdorferi）、嗜肺军团菌（Legionella pneumophilia）、分支杆菌属（Mycobacteria）（例如结核分支杆菌（M.tuberculosis）、鸟分支杆菌（M.avium）、胞内分支杆菌（M.intracellular）、堪萨斯分支杆菌（M.kansasii）、戈登分支杆菌（M.gordonae））、金黄色葡萄球菌、淋病奈瑟菌（Neisseriagonorrhoeae）、脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）、单核细胞增生性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）（A组链球菌）、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）（B组链球菌）、链球菌（绿色链球菌组）、粪链球菌（Streptococcus faecalis）、牛链球菌（Streptococcus bovis）、链球菌（厌氧物种）、肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）、弯曲杆菌属物种（Campylobacter sp.）、肠球菌属物种（Enterococcus sp.）、衣原体属物种（Chlamydia sp.）、流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）、炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）、白喉棒状杆菌（Corynebacterium diphtheriae）、红斑丹毒丝菌（Erysipelothrixrhusiopathiae）、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）、破伤风梭菌（Clostridium tetani）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、多杀巴氏菌（Pasturella multocida）、拟杆菌属物种（Bacteroides sp.）、具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）、念珠状链杆菌（Streptobacillus moniliformis）、苍白密螺旋体（Treponema pallidum）、细弱密螺旋（Treponema pertenue）、钩端螺旋体（Leptospira）、以色列放线菌（Actinomyces israelii）和土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）。

示例性真菌包括例如，曲霉属（Aspergillus），如黄曲霉（Aspergillusflavus）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）、黑曲霉（Aspergillus niger）；芽生菌属（Blastomyces），如皮炎芽生菌（Blastomyces dermatitidis）；假丝酵母属（Candida），如白假丝酵母（Candida albicans）、光滑假丝酵母（Candidaglabrata）、季也蒙假丝酵母（Candida guilliermondii）、克柔假丝酵母（Candida krusei）、近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）、热带假丝酵母（Candida tropicalis）；球孢子菌属（Coccidioides），如粗球孢子菌（Coccidioides immitis）；隐球酵母属（Cryptococcus），如新型隐球酵母（Cryptococcus neoformans）；表皮癣菌属（Epidermophyton）；镰刀菌属（Fusarium）；组织胞浆菌属（Histoplasma），如荚膜组织胞浆菌（Histoplasma capsulatum）；马拉色菌属（Malassezia），如糠秕马拉色菌（Malassezia furfur）；小孢子菌属（Microsporum）；毛霉属（Mucor）；副球孢子菌属（Paracoccidioides），如巴西副球孢子菌（Paracoccidioidesbrasiliensis）；青霉属（Penicillium），如马内菲青霉（Penicillium marnejfei）；毕赤酵母属（Pichia），如异常毕赤酵母（Pichia anomala）、季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）；肺囊虫（Pneumocystis），如卡氏肺囊虫（Pneumocystis carinii）；假霉样真菌属（Pseudallescheria），如波氏假霉样真菌（Pseudallescheria boydii）；根霉属（Rhizopus），如米根霉（Rhizopusoryzae）‘红酵母属（Rhodotorula），如深红酵母（Rhodotorula rubra）；丝孢菌属（Scedosporium），如尖端赛多孢子菌（Scedosporium apiospermum）；裂褶菌属（Schizophyllum），如裂褶菌（Schizophyllum commune）；孢子丝菌属（Sporothrix），如申克孢子丝菌（Sporothrix schenckii）；毛癣菌属（Trichophyton），如须癣毛癣菌（Trichophyton mentagrophytes）、红色毛癣菌（Trichophyton rubrum）、疣状毛癣菌（Trichophyton verrucosum）、紫色毛癣菌（Trichophyton violaceutn）；丝孢酵母属（Trichosporon），如阿氏丝孢酵母（Trichosporon asahii）、皮状丝孢酵母（Trichosporon cutaneum）、墨汁丝孢酵母（Trichosporon inkin）和粘性丝孢酵母属（Trichosporon mucoides）。

示例性寄生虫包括例如，疟原虫属（Plasmodium spp.）（例如，恶性疟原虫（P.falciparum）、三日疟原虫（P.malariae）、约氏疟原虫（P.yoelii）、伯氏疟原虫（P.berghei）、内阿米巴属（Entamoeba spp.）（例如，溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica））、贾弟鞭毛虫属（Giardia spp.）（例如，肠贾第鞭毛虫（G.intestinalis）、十二指肠贾第鞭毛虫（G.duodenalis）、兰氏贾第鞭毛虫（G.lamblia）、鼠贾第鞭毛虫（G.muris）、敏捷贾第鞭毛虫（G.agilis）、苍鹭贾第鞭毛虫（G.ardae）和鹦鹉贾第鞭毛虫（G.psittaci））、弓形体属（Toxoplasma spp.）（例如，岗地弓形虫（T.gondii）、隐孢子虫（Cryptosporidium spp.）（例如，微小隐孢子虫（C.parvum）、鼠隐孢子虫（C.muris）、猫隐孢子虫（C.felis）、雷利隐孢子虫（C.wrairi）、贝氏隐孢子虫（C.baileyi）、火鸡隐孢子虫（C.meleagridis）、蛇隐孢子虫（C.serpentis）和鱼隐孢子虫（C.nasorum））、环孢子虫属（Cyclospora spp.）（例如，卡晏环孢子虫属（C.cayetanensis））、耐格里属（Naegleria spp.）（例如，福氏耐格里变形虫（Naegleria fowleri））、棘阿米巴属（Acanthamoeba spp.）、利什曼属（Leishmania spp.）（例如，硕大利什曼原虫（L.major）、利什曼原虫（L.tropica）、埃塞俄比亚利什曼原虫（L.aethiopica）、墨西哥利什曼原虫（L.mexicana）、巴西利什曼原虫（L.braziliensis）、杜氏利什曼原虫（L.donovani）、婴儿利什曼原虫（L.infantum）、恰氏利什曼原虫（L.chagasi））、裂体属（Schistosoma spp.）（例如，曼氏裂体吸虫（S.mansonii））和锥虫属（Trypanosoma spp.）（例如，蝾螈锥虫（T.ambystomae）、鸟锥虫（T.avium）、布氏锥虫（T.brucei）、枯氏锥虫（T.cruzi）、刚果锥虫（T.congolense）、马锥虫（T.equinum）、路氏锥虫（T.lewisi）、泰氏锥虫（T.theileri）和活动锥虫（T.vivax）。

在一些实施方式中，抗原是肿瘤抗原（TA）。通常而言，肿瘤抗原可以是由肿瘤细胞（例如，致瘤细胞或在一些实施方式中，肿瘤间质细胞，例如，肿瘤相关细胞如癌相关的成纤维细胞）产生的任何抗原性物质。在许多实施方式中，肿瘤抗原是与非肿瘤细胞相比由肿瘤细胞差异性表达的分子（或其部分）。肿瘤抗原可以包括，例如，正常情况下以非常小的量产生并且由肿瘤细胞以较大的量表达的蛋白质、正常情况下仅在某些发育阶段中产生的蛋白质、因肿瘤细胞中的突变其结构（例如，序列或翻译后修饰））被修饰的蛋白质或与免疫系统隔绝的正常蛋白质（在正常条件下）。肿瘤抗原可以用于例如，鉴定或检测肿瘤细胞（例如，目的在于诊断和/或目的在于监测已经接受针对肿瘤治疗的受试者，例如，以便检验复发）和/或用于将各种药物（例如，治疗药）靶向至肿瘤细胞。例如，在一些实施方式中，提供嵌合抗体，所述嵌合抗体包含结合肿瘤抗原和借助点击化学结合于治疗药（例如，细胞毒药物）的抗体片段。在一些实施方式中，TA是突变的基因（例如，癌基因或突变的肿瘤抑制基因）的表达产物、过量表达的或异常表达的细胞蛋白、抗原由致瘤病毒（例如，HBV；HCV；疱疹病毒科成员如EBV，KSV；乳头瘤病毒等）编码或瘤胎抗原。瘤胎抗原在正常情况下在胚胎发育早期阶段产生并且至免疫系统充分发育的时间大多或完全消失。例子是α胎蛋白（AFP，例如存在于生殖细胞肿瘤和肝细胞癌中）和癌胚抗原（CEA，例如存在于肠癌中并偶尔存在在肺癌或乳腺癌中）。酪氨酸酶是在正常情况下产生的量十分低的但是在某些肿瘤细胞（例如，黑色素瘤细胞）中其产生的量大幅度增加的蛋白质的例子。其他示例性TAs包括，例如，CA-125（例如存在于卵巢癌中）；MUC-1（例如存在于乳腺癌中）；上皮肿瘤抗原（例如存在于乳腺癌中）；黑色素瘤相关抗原（MAGE；例如存在于恶性黑色素瘤中）；前列腺酸性磷酸酶（PAP，存在于中前列腺癌中）。在一些实施方式中，TA至少部分地暴露在肿瘤细胞的细胞表面。在一些实施方式中，肿瘤抗原包括异常修饰的多肽或脂质，例如，异常修饰的细胞表面糖脂或糖蛋白。可以理解TA可以由特定类型的肿瘤亚类和/或由肿瘤中细胞亚群表达。

根据本文提供的方法用于产生嵌合抗体或蛋白质的示例性治疗性抗体包括但不限于以下抗体（所述抗体的靶在括号中与示例性非限制的治疗适应症一起列出）：

阿昔单抗（abciximab）（糖蛋白IIb/IIIa；心血管疾病）、阿达木单抗（adalimumab）（TNF-α，各种自身免疫疾病，例如，类风湿性关节炎）、阿伦珠单抗（alemtuzumab）（CD52；慢性淋巴细胞白血病）、巴利昔单抗（basiliximab）（IL-2Rα受体（CD25）；移植排斥）、贝伐珠单抗（血管内皮生长因子A；各种癌症，例如，结直肠癌、非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、肾癌；湿性年龄相关性黄斑变性）、卡妥索单抗（catumaxomab）、西妥昔单抗（EGF受体、各种癌症，例如，结直肠癌、头颈癌）、赛妥珠单抗（certolizumab）（例如，赛妥珠单抗（certolizumab pegol））（TNFα；Crohn病、类风湿性关节炎）、达克珠单抗（IL-2Rα受体（CD25）；移植排斥）、依库珠单抗（eculizumab）（补体蛋白C5；阵发性睡眠性血红蛋白尿症）、依法珠单抗（CD11a；银屑病）、吉妥珠单抗（CD33；急性髓细胞白血病（例如，采用刺孢霉素））、替伊莫单抗（ibritumomab tiuxetan）（CD20；非霍奇金淋巴瘤（例如，采用钇-90或铟-111）、英夫单抗（infliximab）（TNFα；各种自身免疫疾病，例如，类风湿性关节炎）、莫罗单抗-CD3（T细胞CD3受体；移植排斥）、那他珠单抗（α-4（α4）整联蛋白；多发性硬化、Crohn病）、奥马珠单抗（IgE；过敏相关性哮喘）、帕利珠单抗（RSV F蛋白的表位；呼吸道合胞体病毒感染）、帕尼单抗（EGF受体；癌症，例如，结直肠癌）、来尼珠单抗（ranibizumab）（血管内皮生长因子A；湿性年龄相关性黄斑变性）、利妥昔单抗（CD20；非霍奇金淋巴瘤）、托西莫单抗（tositumomab）（CD20；非霍奇金淋巴瘤）、曲妥珠单抗（ErbB2；乳腺癌）及其任何其抗原结合片段。

在一些实施方式中，使用本文所述的本发明方法，将治疗性单克隆抗体和可用于治疗相同疾病的第二药物结合。在一些实施方式中，第二药物包括多肽、肽、小分子或第二抗体。

在一些实施方式中，使用本文所述的本发明方法，将单克隆抗体和细胞因子（例如干扰素，例如干扰素α）结合。任选地，单克隆抗体和细胞因子均可用于治疗相同的疾病。

在一些实施方式中，本文所述的本发明方法用来结合多亚基蛋白的两个（或更多个）亚基（例如，分离的多肽链）。在一些实施方式中，多亚基蛋白是受体（例如，细胞表面受体）。在一些实施方式中，多亚基蛋白是酶。在一些实施方式中，多亚基蛋白是细胞因子。在一些实施方式中，多亚基蛋白是通道或转运蛋白。在一些实施方式中，这种连接促进多亚基蛋白的正确折叠（例如，加速折叠或增加正确折叠的有功能的蛋白质的比例）。

在一些实施方式中，靶蛋白或多肽包蛋白质转导结构域。例如，本发明方法可以用来将蛋白质转导结构域连接至目的多肽。

在一些实施方式中，本文所述的本发明方法用来产生疫苗，例如，单价或多价疫苗。例如，两种或更多种抗原（例如，一种或多种病原体抗原如上文提到的那些病原体的抗原或肿瘤抗原）可以使用本发明方法连接。在一些实施方式中，所产生的物质可以施用至受试者，例如，在适宜的组合物中，任选地包含合适的载体或赋形剂。在一些实施方式中，所产生的物质离体使用，例如，刺激或被可以事先从供体获得的免疫系统细胞（例如，T细胞、抗原呈递细胞（例如，树突细胞）摄取。在一些实施方式中，供体是随后向其使用所述细胞的受试者。在一些实施方式中，疫苗用于免疫哺乳动物或鸟类受试者对抗病原体或肿瘤，例如，以便诱导或增进指向该病原体（或由病原体感染的细胞）或肿瘤的免疫反应。

在一些实施方式中，使用本文所述的本发明方法将抗原和细胞因子结合，其中所述细胞因子任选地调节，例如，刺激、增殖、分化和/或至少一种免疫系统细胞（例如，T细胞（例如，属于某亚类的T细胞，如细胞毒素、辅助物、调控子或天然杀伤细胞）、B细胞、巨噬细胞等）活性。

应当理解在一些方面，本发明涵盖根据本文所述的方法产生的物质和包含这类物质的组合物。应当理解，在一些方面，本发明涵盖使用这类物质的方法，例如，用于本文所述的一个或多个目的或其他目的。

药物组合物

在一些实施方式中，本发明提供药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的任一种修饰的蛋白质，例如，已经被修饰以携带点击化学柄的蛋白质或借助点击化学与第二分子（例如，另一个蛋白质）结合的嵌合蛋白。在一些实施方式中，蛋白质借助点击化学与聚合物（例如，PEG）结合。

药物组合物可以包含多种可药用载体。可药用载体是本领域熟知的，并且例如包括水溶液，如水、5%右旋糖或生理缓冲盐水；或其他溶剂或载体，如二醇、甘油、油如橄榄油或合适施用至人类或非人类受试者的可注射用有机酯。见，例如，药学科学和实践（Remington:The Science and Practice ofPharmacy）,第21版；Lippincott Williams&Wilkins,2005。在一些实施方式中，可药用载体或组合物是无菌的。除有效药物之外，药物组合物可以包含充当例如填充剂、填料、增溶剂、稳定剂、渗透剂、摄取增进剂等的生理可接受化合物。生理可接受的化合物包括，例如，糖类，如葡萄糖、蔗糖、乳糖；葡聚糖；多元醇如甘露醇；抗氧化剂，如抗坏血酸或谷胱甘肽；防腐剂；络合剂；缓冲剂；或其他稳定剂或赋形剂。可药用载体和/或生理可接受化合物的选择可以例如取决于有效药物的性质，例如，溶解度，相容性（指该物质可以在组合物中一起存在，而不以常规使用情况下将实质降低该药物组合物的药物功效的方式相互作用）和/或组合物的施用途径。该药物组合物可以处于液体、凝胶、洗剂、片剂、胶囊、油膏剂、乳膏剂、透皮贴剂等形式。药物组合物可以通过各种途径（包括例如，肠胃外施用）施用至受试者。示例性施用途径包括静脉内施用；呼吸道施用（例如，通过吸入）、肌内施用、经鼻施用、腹膜内施用、口服施用、皮下施用和局部施用。对于口服施用，化合物可以用可药用载体配制为片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、悬浮液、混悬剂等。在一些实施方式中，化合物可以直接施用至靶组织。直接施用可以通过例如注射或通过在组织内部植入持续释放植入物实现。当然，持续释放植入物可以在任何合适的位点处植入。在一些实施方式中，持续释放植入物可以特别适于预防性治疗面临形成复发性癌症的风险的受试者。在一些实施方式中，持续释放植入物递送治疗性水平的活性物质持续至少30日，例如，至少60日，例如，多达3个月、6个月或更长时间。本领域技术人员将考虑多种因素如患者的重量和总体健康、正在治疗的具体病状等选择有效剂量和施用方案。示例性剂量可以使用体外研究进行选择，在动物模型中和/或在作为本领域的标准的人临床试验中测试。

可以以有效量递送包含根据本发明多方面的修饰蛋白质的药物组合物，所述有效量指足以实现目的生物学反应（例如，减少一种或多种疾病或病症的症状或表现）的量。确切的所需量将在受试者之间不同，这取决于多种因素，如受试者的物种、年龄、重量、性别和总体状况、疾病或病症的严重性、特定化合物及其活性、其施用模式、共存疗法等。在一些实施方式中，为了易于施用和剂量均匀性，化合物（例如，蛋白质）以单位剂型配制，如本文所用的所述术语指适用于待治疗患者的药物的物理分立单元。尽管如此，将理解的是，每日总剂量将由主治医生在可靠的医学判断范围内决定。在一些实施方式中，例如，当施用PEG-结合的蛋白质时，关于未PEG化形式合适剂量的可获得的信息，任选地连同体外活性数据一起，可以用作选择适宜剂量用于临床前试验和/或用于临床用途时的指导原则。

药物组合物可以用来治疗类型广泛的不同疾病和病症。在一些实施方式中，使用药物组合物来治疗例如对其使用未修饰蛋白的任何疾病或病状。因而，本发明提供包括施用本发明的蛋白质至有需求的受试者的治疗方法。受试者一般是哺乳动物受试者，例如，人类。在一些实施方式中，受试者是充当影响人类的疾病或病症的模型的非人类动物。动物模型可以用于例如临床前研究中，例如，以评估功效和/或确定合适的剂量。

在一些实施方式中，将本发明的蛋白质预防地施用至，例如不显示疾病或病症的体征或症状的受试者（但是可能面临形成该病症的风险增加或预期形成该疾病或病症）。在一些实施方式中，将本发明的蛋白质施用至已经出现一种或多种疾病或病症的体征或症状的受试者，例如，已经诊断为患有该疾病或病症的受试者。任选地，该方法包括诊断该受试者为患有该蛋白质作为适宜治疗剂的疾病或病症。例如，干扰素具有多种用途，例如，用于治疗自身免疫疾病（例如，多发性硬化）和传染病（例如，病毒性感染，如由属于黄病毒科的病毒（例如，HBV、HCV）引起的那些感染；细菌性感染；真菌性感染；寄生虫）。示例性病毒包括但不限于黄病毒科的病毒，例如，丙型肝炎病毒、黄热病毒、西尼罗河病毒、乙型脑炎病毒、登革病毒和牛病毒腹泻病毒；嗜肝DNA病毒科的病毒，例如，乙型肝炎病毒；小RNA病毒科的病毒，例如，脑心肌炎病毒、人鼻病毒和甲型肝炎病毒；逆转录病毒科的病毒，例如，人免疫缺损病毒、猴免疫缺陷病毒、人T淋巴细胞病毒和罗氏肉瘤病毒；冠状病毒科的病毒，例如，SARS冠状病毒；弹状病毒科的病毒，例如，狂犬病病毒和水泡性口炎病毒；副粘病毒科的病毒，例如，呼吸道合胞体病毒和副流感病毒；乳多空病毒科（Papillomaviridae）的病毒，例如，人乳头瘤病毒；以及疱疹病毒科的病毒，例如，单纯疱疹病毒。

干扰素疗法（通常与化疗和辐射组合）用作针对许多癌症的疗法，本文中所用的术语癌症涵盖实体瘤（癌、肉瘤）和白血病。在一些实施方式中，肿瘤是腺癌。在一些实施方式中，肿瘤是肉瘤。在一些实施方式中、肿瘤影响选自以下的器官或器官系统：乳腺、淋巴结、前列腺、肾、膀胱、肺、肝脏、胃肠道、结肠、睾丸、胃、胰、甲状腺、皮肤、卵巢、子宫、子宫颈、皮肤、神经、骨和神经系统（例如，脑）。在一些实施方式中，干扰素用于治疗血液恶性肿瘤，例如，白血病或淋巴瘤，例如，毛细胞白血病、慢性髓样白血病、结节性淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤。在一些实施方式中，IFN（例如，IFN-α2b）用来治疗黑色素瘤。

红细胞生成刺激物质如EPO用于治疗可能因多种原因造成的贫血。例如，贫血可以是慢性疾病的贫血、与医学相关的贫血（例如，癌症化疗）、辐射、肾病（例如，糖尿病）、传染病或失血。集落刺激因子如G-CSF、GM-CSF和/或M-CSF可以用来治疗可能因例如药物（例如，癌症化疗）、辐射、传染病或失血所致的白细胞减少症，例如，中性粒细胞减少症和/或淋巴细胞减少症。

神经营养因子蛋白质可以例如用来治疗神经变性病（例如，肌萎缩侧索硬化、亨廷顿病、阿尔茨海默病、帕金森病），中枢或外周神经系统损伤。

生长激素可以例如用来治疗儿童的生长病症和成人生长激素缺乏症。

白介素可用于调节为了各种各样的目的免疫反应，例如，以刺激针对感染物质或癌症的免疫反应。在一些实施方式中，白介素刺激免疫系统细胞和/或增加天然和/或适应性免疫反应的强度和/或持续时间。如本领域已知，某些白介素有助于限制天然和/或适应性免疫反应的强度和/或持续时间。这类白介素的施用可以用于治疗自身免疫疾病、败血症或其他病状，所述其他病状中异常或过度激活的免疫反应可能是有害的。

自身免疫疾病包括I型糖尿病（例如，幼发型糖尿病）、多发性硬化、硬皮病、强直性脊柱炎、结节病、寻常天疱疮、重症肌无力、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、青少年关节炎、Behcets综合征、莱特尔病、Berger病、皮肌炎、韦格纳肉芽肿病、自身免疫性心肌炎、抗肾小球基底膜病（包括肺出血肾炎综合征）、扩张型心肌病、甲状腺炎（例如，桥本氏甲状腺炎（Hashimoto's thyroiditis）、格氏病）和Guillane-Barre综合征。

在某些实施方式中，由革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌、分支杆菌、真菌如假丝酵母或曲霉、蠕虫等引起的疾病是感兴趣的疾病。示例性细菌和真菌包括落入以下组内的那些：放线菌目（Actinomycetales）（例如，棒状杆菌属（Corynebacterium）、分支杆菌属（Mycobacterium）、诺卡氏菌属（Norcardia））、曲霉菌病（Aspergillosis）、芽孢杆菌科（Bacillaceae）（例如，炭疽（Anhrax）、梭菌属（Clostridium））、拟杆菌科（Bacteroidaceae）、芽生菌病（Blastomycosis）、博德特氏菌属（Bordetella）、包柔氏螺旋体属（Borrelia）、布氏杆菌（Brucellosis）、念珠菌病（candidiasis）、弯曲杆菌属（Campylobacter）、球孢子菌（coccidioidomycosis）、隐球菌（cryptococcosis）、皮肤真菌（Dermatocycoses）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）（克雷伯氏菌属（Klebsiella）、沙门氏菌属（Salmonella）、沙雷菌属（Serratia）、耶尔森菌属（Yersinia））、丹毒丝菌属（Erysipelothrix）、螺杆菌属（Helicobacter）、军团菌属（legionella）、钩端螺旋体（Leptospires）、李斯特氏菌属（Listeria）、支原体目（Mycoplasmatales）、奈瑟氏菌科（Neisseriaceae）（例如，不动杆菌属（Acinetobacter）、奈瑟球菌属（Meningococci））、巴斯德菌科（Pasteurellaceae）（例如，放线杆菌属（Actinobacillus）、嗜血杆菌属（Heamophilus）、巴氏杆菌属（Pasteurella））、假单胞菌属（Pseudomonas）、立克次体科（Rickettsiaceae）、衣原体科（Chlamydiaceae）、密螺旋体属（Treponema）和葡萄球菌属（Staphylococci）。

在一些实施方式中，修饰的（例如，聚乙二醇化的）蛋白质相对于未修饰的形式显示增加的功效和/或实现等同的功效需要较低剂量或施用频率更少（更大的给药时间间隔）和/或显示降低的毒性（降低的副作用、更大的可耐受性、更大的安全性）和/或可以通过更便利或优选的施用途径施用。

应当指出本发明不限于前述的示例性点击化学柄，并且额外的点击化学柄、反应性点击化学柄配偶物和用于这类点击化学柄对子的反应条件将是本领域技术人员显而易见的。

以下工作实施例意在描述本文提供的实施方法、试剂和组合物的示例性归纳并且不限制本发明的范围。

实施例

实施例1：通过点击化学与分选酶催化的转酰基作用产生N-N和C-C蛋白质融合物。

蛋白质融合物是生物化学中的有用工具。使用基因构建体，已经表达种类繁多的与GFP融合的蛋白质。然而，蛋白质融合技术的一个主要缺点是仅可以实现C-N连接的蛋白质融合物，其中一个蛋白质的C末端与另一个蛋白质的N末端融合。这使这类蛋白质融合物限于不需要未占据或未融合的N末端或C末端的那些融合物。例如，需要用于抗原识别的抗体的N末端，因此不能使用常规重组技术（包括蛋白质融合技术）产生双特异性抗体。其他蛋白质，如泛素，需要用于正常活性的未修饰的C末端。

本发明的一些方面提供了利用分选酶反应和点击化学的组合制备N-N和C-C蛋白质融合物的方法和试剂。分选酶催化的转酰基作用允许在适当修饰的蛋白质的C末端容易地安装全部形式的取代基。成功的转酰基反应的唯一要求是在靶蛋白中存在适当暴露的LPXTG（SEQ ID NO:2）。可以在分选酶催化的反应中使用的亲核体的设计同样是简洁明了的：一短的连续的甘氨酸残基，或甚至烷基胺足以使得该反应继续进行。对于借助分选酶介导的点击化学柄安装和后续点击化学反应产生C-C和N-N结合的蛋白质的示例性方案，见图1。点击柄叠氮化物和环辛炔分别由N₃和八角形代表。

借助分选酶反应在蛋白质上安装击化学柄的重要优点是易于合成分选酶反应所需要的亲核体和在生理条件下在天然蛋白上进行该反应（图2A）。先前已经用于分选酶反应中的亲核体含有以下任何修饰：生物素、荧光团、脂肪酸、核酸、脂类、放射性同位素、糖类或甚至具有适当暴露的N末端甘氨酸残基段（例如，1-10个G残基）的蛋白质。

本发明的一些方面通过合成提供点击反应柄的亲核体，提供了扩展的范围的蛋白质修饰。这允许产生在蛋白质的C-末端融合的蛋白质。任何类型的生物正交点击反应可以用于这个目的并且可以应用的一些实例，但不限于铜催化的点击反应、（无痕迹）施陶丁格连接反应、张力促进的点击反应、硫醇-烯反应、（反电子需求）Diels-Alder反应、肟连接和天然化学连接（见表I和图2B）。在一些实施方式中，在天然氨基酸的侧链上或通过并入非天然氨基酸引入这些官能团。

本发明的一些方面提供用于产生双特异性嵌合抗体的方法和试剂。在一些实施方式中，两个抗体是借助点击化学在它们的C末端结合以形成嵌合抗体。C-C末端结合允许结合的抗体的结合抗原的N-末端保留它们的抗原结合特性。如果如此结合的两个抗体结合不同的抗原，则所产生的嵌合抗体是双特异性的。

本发明的一些方面提供用于制备根据本发明的一些实施方式的双特异性抗体的策略。在一些实施方式中，提供了含有C末端分选酶识别序列（例如，C末端LPXTGG（SEQ ID NO:3）序列）的抗体。在一些实施方式中，抗体还包含C末端标签，例如，六组氨酸（His6）标签。这类抗体可以借助重组方法并使用本领域技术人员熟知的试剂获得。

在一些实施方式中，使用标准固相肽合成法合成包含点击化学柄的用于分选酶反应的亲核体，例如，GGG-肽。

在一些实施方式中，在包含第一点击化学柄（例如，柄A，见图2B）的亲核体存在的情况下，通过分选酶催化的反应修饰包含C末端分选酶识别基序的第一抗体。在包含第二点击化学柄（例如，柄B，见图2B）的亲核体存在的情况下，通过分选酶催化的反应修饰包含分选酶识别基序的第二抗体，例如，结合与第一抗体不同的抗原的抗体。两个点击化学柄（例如，柄A和B）一般是点击“配偶物”，意味着它们可以在点击化学反应中反应以形成共价键。在表1和图2B中描述一些示例性点击反应和配偶物点击柄。作为分选酶反应的结果，获得了在其上安装C末端点击化学柄的抗体（图2C）。

在一些实施方式中，例如，使用His标签纯化法、尺寸排阻色谱法和/或离子交换层析分离或纯化分选酶修饰的抗体。在一些实施方式中，分选酶修饰的第一和第二抗体在适于相应点击反应发生的生理条件下混合。例如，如果在生理条件下为了该点击反应的发生需要催化剂，适于该反应发生的条件将包括以有效催化点击反应的量提供铜催化剂。在一些实施方式中，在点击反应后，例如使用LC/MS和凝胶色谱法以确定反应结束。在一些实施方式中，当反应结束时，分离或纯化C-C-融合蛋白质，例如，采用上述方法进行（图2D）。

实施例2：借助分选酶反应安装非点击官能团

可以并入用于分选酶反应的亲核体中的官能团不限于点击化学柄。分选酶亲核体可以配备先前已经用于分选酶反应中的任何官能团（图3A）。例如，在一些实施方式中，并入生物素，其允许使用链霉亲和素而使得修饰的蛋白质例如分选酶修饰的抗体可视化、纯化和四聚化。在一些实施方式中，并入允许蛋白质二聚体可视化的荧光团，例如，荧光蛋白或荧光配基。尤其对于双特异性抗体，这是允许它们用于FACS和显微术实验中的有用特征。另外，相容性点击柄的组合可以用于合成甚至更复杂的结构物，如蛋白质三聚体，和聚乙二醇化的蛋白质二聚体（图3B）。

考虑固相合成所提供的灵活性，在缝合部位纳入另外其他的官能团可以用来进一步扩展这种嵌合蛋白所赋予的特性的范围。例如，分选酶介导的合成的聚合物的安装（例如，PEG配基）可以延长肽和蛋白质的半寿期，例如，这种修饰延长细胞因子的循环半寿期。并入可检测标记物，如荧光团、荧光蛋白、染料、生物发光酶和探针或放射性同位素使得能够使用全部常用的成像方式。

实施例3：产生双特异性嵌合抗体

分选酶介导的点击化学柄安装的示例性策略用来基于使用骆驼抗体的常见的VHH结构域产生双特异性抗体片段。不同于其他哺乳动物物种，骆驼拥有结合位点仅由VH结构域构成的其他类别的抗体。可以将这些结构域在细菌中表达成所谓纳米体。它们小的尺寸和易于操作性使得它们成为构建治疗药的有吸引力的靶。尤其，在单一试剂中能够将两种不同的识别特异性组合为构建所谓的双特异性抗体提供了希望。

VHH片段在大肠杆菌中表达为纳米体。VHH片段以小羊驼中针对GFP产生的抗体和大羊驼中针对2-微球蛋白产生的抗体为基础。两种纳米体均配备LPXTG（SEQ ID NO:2）基序以便使它们为分选标记反应做准备。亲核体的设计分别涉及将有张力的环辛炔安装到一个纳米体上，将叠氮化物安装到另一个纳米体上以允许无铜的点击反应继续进行。

使用对适当修饰的泛素（Ub，图4，示意图），泛素乙烯基甲基酯（UbVME）（一种共价修饰泛素特异性蛋白酶的亲电Ub衍生物），进行的N末端标记反应，建立了该点击反应的最佳条件。对于这种反应，选择（Gly）₃延长形式的UbVME。该点击反应的进行产生UbVME二聚体，其功能通过修饰泛素C末端水解酶UCHL3来评估（图4，凝胶图像）。所用化学的一个重要方面是避免可能对这种反应中作为底物的蛋白质造成损伤的恶劣条件。全部转化均在含水环境、中性pH下进行。

观察到，N末端和C末端分选标记反应以可比较的效率继续进行（图5），从而在此所用的方案不仅允许C-C融合，还允许N-N融合，二者均不可能由常规重组技术完成。在一些实施方式中，其中分选酶反应的反应物（例如，输入纳米体）以及反应中使用的分选酶配备有吸附到适宜的结合剂（例如，NiNTA琼脂糖）上有效地去除这些反应物的标签，例如His6标签，从而允许单个步骤纯化所需的“分选标记”的产物。

研究了叠氮化物修饰的Ub和环辛炔修饰的Ub的二聚化反应的动力学（图6）。在仅包含N3-Ub或环辛炔-Ub的样品中未观察到二聚化。然而，当一起孵育时，在30分钟孵育后二聚化是可检测的，并且在孵育1小时时达到平台期。在N3-Ub和环辛炔-Ub的不同混合比下该反应都是有效的。

两种纳米体均经过在针对Ub确定的优化反应条件下分选酶介导的点击化学柄（分别是叠氮化物和环辛炔）的安装（对于反应条件见实施例4，图7）。通过尺寸排阻色谱纯化所产生的各自包含合适点击柄的纳米体以移去任何未并入的分选酶反应亲核体（图8）。纯化的纳米体可以借助类似于泛素二聚化的点击化学反应结合。可以在S75柱上通过尺寸排阻色谱纯化结合产物，并且所需的产物可以通过SDS-PAGE和MS/MS表征以证实C-C纳米体融合产物的身份。

可以制备粗制的反应混合物并与饱和量的均在大肠杆菌中表达的靶抗原β-2微球蛋白和eGFP孵育。各个级分的尺寸排阻色谱、随后的SDS-PAGE和银染法允许对处于其预期的斯托克斯半径的未结合的抗原进行鉴定，以及对每个与其同族抗原复合的分离的纳米体进行鉴定。N-N和C-C蛋白质结合的例子显示通过标准遗传方法不可获得的嵌合蛋白，可以使用本文提供的方法和试剂以良好产率获得。

图9显示抗-GFP纳米体的分选标记。图10显示干扰素α（INFA）纳米体和抗-GFP（抗-eGFP）纳米体的分选标记。37：C末端叠氮化物；57：C末端环辛炔；40：N末端环辛炔；41：N末端叠氮化物。图11显示INFA和抗-GFP的分选标记。

实施例4：材料与方法

分选酶反应肽的固相肽合成

将Rink-酰胺树脂在NMP中溶剂化并在用含有20%哌啶的NMP处理树脂移除Fmoc基后，使用连续步骤加载并延长树脂。（I）将树脂用NMP（3×）、CH₂Cl₂（3×）和NMP洗涤。（II）Fmoc-保护的氨基酸（市售或自制）在HOBt（3当量）、PyBOP（3当量）和DiPEA（6当量）的作用下被缩合。（III）使用如步骤（I）中相同的条件再次洗涤树脂。（IV）使用Kaiser试验监测偶联，如果结束，（V）使用含有20%哌啶的NMP移除Fmoc-保护基。

最后，在95%TFA，2.5%TIS，2.5%H₂O存在下搅动树脂3小时，将肽从树脂上裂解下来。将冰冷的Et₂O添加至裂解溶液，并且通过在4℃离心该溶液30分钟形成的沉淀物被制成小球。通过反相HPLC纯化法纯化粗制的肽（使用的缓冲剂：A：H₂O，B：ACN，C：H₂O中的10%TFA）。

C末端肽

H₂N-GGGK（叠氮己酸）-CONH₂

如一般方法中所述，用Fmoc-Lys（Mtt）-OH加载并且用Fmoc-GGG-OH延长Rink酰胺树脂（100mg，50μmol）。用CH₂Cl₂洗涤树脂后，通过用CH₂Cl₂中的1%TFA和1%TIS处理树脂2次持续30分钟（或直至黄颜色完全消失）移除Mtt保护基。将树脂用CH₂Cl₂（5×）、NMP（5×）和含有5当量DiPEA的NMP洗涤。使用PyBOP（104mg，200μmol）和DiPEA（70μL，400μmol）使叠氮己酸（31mg，200μmol）缩合。在2小时振荡后，Kaiser试验显示转化完全。如一般方法中所述，移除N末端Fmoc基团并将肽从树脂裂解下来。反相HPLC纯化（在12分钟（3CV）内15-24%B，Rt=8min）产生作为米白色固体的题述化合物（15.4mg，33μmol，67%）。

H₂N-GGGC（DBCO）-CONH₂

如一般方法中所述，用Fmoc-Cys（Trt）-OH加载并且用Fmoc-GGG-OH延长Rink酰胺树脂（167mg，100μmol），并从树脂上裂解下来，以定量产率产生粗制H₂N-GGGC-CONH₂（SEQ ID NO:129）。将这种肽（38mg，83μmol）溶解于PBS（0.25mL）中，并向这种溶液中添加含有DBCO-马来酰亚胺（17mg，40μmol）的DMF（0.25mL）。反应体系搅拌过夜，用TFA酸化并通过RP-HPLC（在20分钟（5CV）内20-35%B）纯化产生作为白色固体的题述化合物（15.3mg，22μmol，27%）。

N末端肽

叠氮己酸-LPETGG-CONH₂

如一般方法中所述，用Fmoc-Glyc-OH加载Rink酰胺树脂（60μmol），用合适的保护的氨基酸延长，并且从树脂切下。为了最终的偶联，使用叠氮己酸。RP-HPLC（在12分钟（3CV）内26-35%B）产生作为白色固体的题述化合物（9.5mg，13μmol，13%）。

DBCO-LPETGG-CONH₂

如一般方法中所述，用Fmoc-Glyc-OH加载Rink酰胺树脂，用适当保护的氨基酸延长，并且从树脂裂解下来。来自Et₂O的沉淀提供粗制H₂N-LPETGG-CONH₂（SEQ ID NO:132）（17.9mg，31.3μmol），其溶解于DMF（0.5mL）中。添加DBCO-OSu（14mg，20μmol）并反应体系搅拌过夜。将溶液稀释，之后通过RP-HPLC（12分钟（3CV）内25-34%B）纯化产生作为米白色固体的题述化合物。

泛素的分选标记

将分选酶（7.2μL，700μM）和探针（10μL，5mM）添加至含有泛素（58μM）的100μL分选酶缓冲液（50mM Tris，pH7.4，150mM NaCl，10mM CaCl₂）中。将所产生的混合物在37℃孵育2小时。接着，将溶液酸化并且通过反相HPLC纯化。将所产生的纯化蛋白质在真空下浓缩，重溶于H₂O中并通过凝胶电泳定量。

纳米体的分选标记

将分选酶（7.2μL，700μM）和探针（10μL，5mM）添加至含有纳米体（15μM）的100μL分选酶缓冲液（50mM Tris，pH7.4，150mM NaCl，10mM CaCl₂）中。将所产生的混合物在37℃孵育过夜。接着，将溶液用Et₃N HOAc（pH5）稀释并且通过尺寸排阻HPLC纯化。将所产生的纯化蛋白质在真空下浓缩，重溶于H₂O中并通过凝胶电泳定量。

泛素的二聚化

将叠氮基修饰的泛素和DBCO修饰的泛素按1：1的比例混合并且在37℃孵育0.5-7小时。使用凝胶电泳分析向二聚化产物的转化。

活性测定法

将叠氮基修饰的UbVME和DBCO修饰的UbVME按1：1比例混合并且在37℃孵育过夜。在二聚化后，样品用Tris缓冲液（7μL）稀释并且添加UCHL3（2μL，5倍过量于UbVME）。将所产生的混合物孵育2小时，用样品缓冲剂（4×）变性并加载于15%凝胶上。将蛋白质转移至PVDF-膜。该膜用含有4%牛奶的PBS/Tween（0.1%）封闭。添加兔多克隆抗-泛素（1:100）并且将该膜在室温搅拌30分钟。该膜用含有0.1%Tween的PBS洗涤4次，之后添加二抗（HRP-山羊抗兔，1:25000）。在室温振荡30分钟后，该膜用含有0.1%Tween的PBS（4×）洗涤，并且用ECL plus使蛋白质可视化。

实施例5：非天然N-N和C-C蛋白质融合物的制备

此处所述的策略用来产生完整保留融合配偶物的生物活性并且对结合的蛋白质不造成化学损伤的N-N和C-C蛋白质融合物。分选酶A用来在目的蛋白的N末端或C末端上安装必要修饰以执行张力促进的无铜Huisgen环加成反应。此处适用于蛋白质-蛋白质融合物，所述方法可以用来使任何蛋白质与任何目的实体结合。

材料与方法

一般实验全部化学品均是商业来源的并如收到时那样使用。Fmoc-Lys（Mtt）-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Glu-OH、Fmoc-Leu-OH、O-苯并三唑-N,N,N',N'-四甲基-脲鎓六氟磷酸盐（HBTU），苯并三唑-1-基氧三吡咯烷膦鎓六氟磷酸盐（PyBOP）从EMDBiosciences/Novabiochem购买。Rink酰胺树脂从Advanced Chemtech购买。环辛炔试剂从Click Chemistry Tools购买。使用MilliQ纯化系统（Millipore）纯化在生物流程中使用的或作为反应溶剂的水。

无水CH2Cl2、

无水MeOH、

无水DMF从EMD Chemicals购买。重蒸馏的无水N,N'-二异丙基乙胺（DiPEA）、三氟乙酸（TFA）、三异丙基硅烷（TIS）N-甲基吡咯烷酮（NMP）从Sigma-Aldrich获得。

质谱法使用Micromass LCT质谱仪（

MS Technologies，USA）和配备有HTC PAL自动进样器的Paradigm MG4HPLC系统（Michrom BioResources，USA）和Waters Symmetry5μm C8柱（2.1x50mm，MeCN:H₂O（0.1%甲酸）梯度流动相（150μL/分钟）进行LC-ESI-MS分析。

HPLC/FPLC使用配备有Waters Delta Pak15μm，

C18柱（7.8×300mm，MeCN:H₂O梯度流动相3ml/min）的Agilent1100系列HPLC系统实现HPLC纯化。尺寸排阻和阳离子交换色谱分别在配备有HiLoad16/60Superdex75柱（Amersham）或Mono S5/50GL柱（Amersham）的PharmaciaAKTA Purifier系统上进行。

紫外-可见光光谱法在Nanodrop ND-1000分光光度计（Thermo Scientific,USA）上进行紫外-可见光谱法。

凝胶内荧光使用Typhoon9200Variable Mode成像仪（GE Healthcare），获得荧光凝胶图像。

用于固相肽合成探针的一般方法将Rink-酰胺树脂在NMP中溶剂化并且在用含有20%哌啶的NMP处理树脂移除Fmoc基后，加载并使用连续步骤延长树脂。（I）将树脂用NMP（3×）、CH₂Cl₂（3×）和NMP洗涤。（II）Fmoc-保护的氨基酸在HOBt（3当量）、PyBOP（3当量）和DiPEA（6当量）的作用下缩合。（III）使用如步骤（I）中相同的条件再次洗涤树脂。（IV）使用Kaiser试验监测偶联，如果结束，（V）使用含有20%哌啶的NMP移除Fmoc-保护基。在最终的步骤中，在95%TFA，2.5%TIS，2.5%H₂O存在下搅动树脂3小时，将肽从树脂上裂解下来。将冰冷的Et₂O添加至裂解溶液，并且通过在4℃离心该溶液30分钟收集形成的沉淀物。通过反相HPLC纯化法纯化粗制的小球（使用的缓冲剂：A：H₂O，B：ACN，C：含有10%TFA的H₂O）。

N末端探针

叠氮己酸-LPETGG-CONH₂（1）如一般方法中所述，用Fmoc-Glyc-OH加载Rink酰胺树脂（60μmol），用适当保护的氨基酸延长，并且从树脂上裂解下来。为了最终的偶联，使用叠氮己酸。RP-HPLC（在12分钟（3CV）内26-35%B）产生作为白色固体的题述化合物（9.5mg，13μmol，13%）。LC/MS：R_t6.34分钟；线性梯度在10分钟内5→45%B；ESI/MS:m/z=711.1[M+H]⁺。¹H NMR（400MHz,CDC1₃）δppm4.65（dd,J=10.0,4.4Hz,1H）,4.42（dd,J=8.4,6.0Hz,1H）,4.35（dd,J=9.2,5.2Hz,1H）,4.30-4.24（m,2H）,4.00（s,2H）,3.96（s,2H）,3.91-3.84（m,4H）,3.70-3.64（m,1H）,2.48（t,J=7.2Hz,2H）,2.26（t,J=7.6）,2.24-1.96（m,6H）,1.78-1.70（m,1H）,1.69-1.56（m,7H）,1.44-1.38（m,3H）,1.21（d,J6.4Hz,3H）,0.97（t,6.4Hz,6H）。

DIBAC-LPETGG-CONH₂（2）如一般方法中所述用Fmoc-Glyc-OH加载Rink酰胺树脂，用适当保护的氨基酸延长，并且从树脂裂解下来。来自Et₂O的沉淀提供粗制H₂N-LPETGG-CONH₂（SEQ ID NO:132）（17.9mg，31.3μmol），其溶解于DMF（0.5mL）中。添加DIBAC-OSu（14mg，20μmol）并将反应体系搅拌过夜。将溶液稀释，之后通过RP-HPLC（12分钟内（3CV）25-34%B）纯化产生作为米白色固体的题述化合物（13.1mg，12.3μmol，39%）。LC/MS：R_t9.42分钟；线性梯度在10分钟内5→45%B；ESI/MS:m/z=1066.14[M+H]⁺.¹H NMR（400MHz,CDCl3）δppm7.65（dd,J=13.2,7.2Hz,1H）,7.46-7.28（m,7H）,5.05（d,J=14.4Hz,1H）,4.72-4.65（m,1H）,4.60-4.50（m,1H）,4.48-4.38（m,2H）,4.36（d,J=4Hz,1H）,4.26-4.23（m,1H）,4.04-3.87（m,5H）,3.73-3.62（m,2H）,3.52-3.38（m,1H）,3.10-2.92（m,1H）,2.82-2.67（m,1H）,2.56-2.39（m,5H）,2.34-2.09（m,6H）,2.07-1.98（m,4H）,1.94-1.85（m,2H）,1.72-1.52（m,6H）,1.50-1.40（m,1H）,1.20（d,J=6.0Hz,3H）,0.98-0.90（m,6H）。

C末端探针

H₂N-GGGK（N₃）K（TAMRA）-CONH₂（3）如一般方法中所述用Fmoc-Lys（Mtt）-OH加载Rink酰胺树脂（60μmol）并且用Fmoc-叠氮基赖氨酸-OH和Fmoc-GGG-OH延长。用CH₂Cl₂洗涤树脂后，用含有1%TFA，1%TIS的CH₂Cl₂处理树脂2次持续30分钟（或直至黄颜色完全消失）移除Mtt保护基。将树脂用CH₂Cl₂（5×）、NMP（5×）和含有DiPEA（43.5μL，250μmol，5当量）的NMP洗涤。使用PyBOP（94mg，180μmol，3当量）和DiPEA（65μL，370μmol，6当量）使5（6）-羧基四甲基罗丹明（77mg，180μmol，3当量）缩合。在16小时振荡后，Kaiser试验显示转化完全。如一般方法中所述，移除N末端Fmoc基团并将肽从树脂裂解下来。反相HPLC纯化（在12分钟内（3CV）25-34%B）产生了作为紫色固体的题述化合物（41.4mg，50.5μmol，81%）。LC/MS：R_t5.50和6.10分钟；线性梯度在10分钟内5→45%B；ESI/MS:m/z=883.3[M+H]⁺.¹HNMR（400MHz,CDC1₃）δppm8.78（d,J=1.6Hz,1H）,8.28（dd,J=7.6,1.6Hz,1H）,7.53（d,J=8.0Hz）,7.14（d,J=9.6Hz,2H）,7.06（dd,J=9.6,2.4Hz,2H）,6.98（d,J=2.4Hz,2H）,4.34（dd,J=9.2,5.2Hz,2H）,3.98（d,14.8Hz,1H）,3.96（s,2H）,3.82（d,18.4Hz,1H）,3.80（s,2H）,3.54-3.46（m,2H）,3.32-3.28（m,14H）,1.94-1.45（m,12H）。

H₂N-GGGC（DIBAC）-CONH₂（4）如一般方法中所述用Fmoc-Cys（Trt）-OH加载Rink酰胺树脂（167mg，100μmol）并且从树脂上裂解下来，以定量产率产生粗制四肽H₂N-GGGC-CONH₂（SEQ ID NO:129）。将这种肽（38mg，83μmol，2当量）溶解于PBS（0.25mL）中，并向这种溶液中添加含有DIBAC-马来酰亚胺（17mg，40μmol，1当量）的DMF（0.25mL）。将反应体系搅拌过夜，用TFA酸化并通过RP-HPLC（在20分钟内（5CV）20-35%B）纯化，产生作为白色固体的题述化合物（15.3mg，22μmol，27%）。LC/MS：R_t6.90分钟；线性梯度在10分钟内5-45%B；ESI/MS：m/z=719.3[M+H]⁺。¹H NMR（400MHz,M）δppm7.66（d,J=7.2Hz,1H）,7.55-7.51（m,1H）,7.48-7.45（m,3H）,7.38（dt,J=7.6,1.4Hz,1H）,7.37-7.33（m,1H）,7.28（d,J=7.2Hz,1H）,5.14（d,7=14Hz,1H）,4.69-4.64（m,1H）,4.01-3.85（m,6H）,3.77（d,J=4.8Hz,1H）3.73（s,1H）,3.70（s,1H）,3.67-3.63（m,2H）,3.39（ddd,J=14.0,5.2,2.8Hz,1H）,3.27-3.05（m,5H）,2.97（ddd,J=14,8.4,5.2Hz,1H）,2.48-2.41（m,3H）,2.33-2.87（m,2H）2.08-1.99（m,1H）。

H₂N-GGGK（叠氮己酸）-CONH₂（5）如一般方法中所述，用Fmoc-Lys（Mtt）-OH加载并且用Fmoc-GGG-OH延长Rink酰胺树脂（100mg，50μmol）。用CH₂Cl₂洗涤树脂后，通过用含有1%TFA，1%TIS的CH₂Cl₂处理树脂2次持续30分钟（或直至黄颜色完全消失）移除Mtt保护基。将树脂用CH₂Cl₂（5×）、NMP（5×）和含有DiPEA（43.5μL，250μmol，5当量）的NMP洗涤。使用PyBOP（104mg，200μmol，4当量）和DiPEA（70μL，400μmol，8当量）使叠氮己酸（31mg，200μmol，4当量）缩合。在2小时振荡后，Kaiser试验显示转化完全。如一般方法中所述，移除N末端Fmoc基团并将肽从树脂上裂解下来。反相HPLC纯化（在12分钟（3CV）内15-24%B）产生作为米白色固体的题述化合物（15.4mg，33μmol，67%）。LC/MS：R_t2.77min；线性梯度在10分钟内5→45%B；ESI/MS:m/z=456.3[M+H]⁺.¹H NMR（400MHz,CDCl₃）δppm4.35（dd,J=9.2,4.8Hz,1H）,3.98（d,J=16.8Hz,1H）,3.97（s,2H）,3.86（d,J=16.8Hz,1H）,3.78（s,2H）,3.29（t,J=6.8Hz,2H）,3.17（dt,J=6.8,2.0Hz,2H）,2.20（t,J=7.2Hz,2H）,1.86-1.81（m,1H）,1.73（ddd,J=18.4,9.4,5.0Hz,1H）,1.67-1.57（m,4H）,1.55-1.47（m,2H）,1.43-1.38（m,4H）。

蛋白质的克隆和表达N末端融合有N末端his标签，随后融合有凝血酶切割位点（MGSSHHHHHHSSGLVPRGGGSH,SEQ ID NO:130）的泛素克隆至pET28载体中。将该载体转化至LB中所培养的BL21（DE3）pLysS A起子培养物中。在0.2的OD₆₀₀启动表达培养。当培养物达到OD₆₀₀0.6-0.8时，将细菌用1mM IPTG诱导并且在37℃培养6。将细菌通过以6000×g离心15分钟收集沉淀物并且重悬于裂解缓冲液（20mM Tris pH8.0，150mMNaCl，10mM咪唑，50μg/ml DNA酶I（Roche）和1片/25mL完全蛋白酶抑制剂（Roche））中并超声处理。通过离心澄清裂解物。通过Ni-NTA（Qiagen）纯化可溶性蛋白。使用凝血酶CleanCleave试剂盒（Sigma Aldrich）移除凝血酶序列。

随后将N末端融合有凝血酶切割位点GGG（MGSSHHHHHHSSGLVPRGGG,SEQ ID NO:131）并且C末端融合有蛋白质内含子的泛素（1-75）克隆至pTYB2中。该载体转化至BL21（DE3）pLysS中。构建的泛素-蛋白质内含子被表达，纯化并转化成如先前对HA标签的UbVME所描述的UbVME加合物。凝血酶CleanCleave试剂盒用来暴露N末端甘氨酸残基。

合成形式的含有C末端LPETGG（SEQ ID NO:1）的抗GFP被亚克隆盗pET28A+载体中。该载体转化至大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中。起子培养物（250mL，LB培养基）在37℃过夜生长至饱和状态。在OD₆₀₀0.2时启动的表达培养（2L，酵母/胰蛋白胨（2YT）培养基）在37℃培养直至OD₆₀₀=0.6。将细菌用IPTG（1mM）诱导并在25℃培养16小时。将细菌通过以6000×g离心15分钟并收集，并且通过在裂解缓冲液（20mM Tris pH8.0，150mM NaCl，10mM咪唑，50μg/ml DNA酶I（Roche）和1片/25mL完全蛋白酶抑制剂（Roche））中超声处理裂解这些细菌。通过离心澄清裂解物。通过Ni-NTA（Qiagen），随后通过在Superdex^TM75上尺寸排阻色谱纯化可溶性蛋白。

将含有C末端LPETGGHHHHHH（SEQ ID NO:45）的VHH7克隆至N末端前置有pelB前导序列的pHEN载体中。该载体转化至大肠杆菌WK6中。将起子培养物（250mL）在2YT中于37℃过夜培养至饱和。在OD₆₀₀=0.2时启动表达培养。当培养物达到OD₆₀₀0.7时，通过添加1mM IPTG诱导蛋白质的表达。将细菌在37℃培养过夜。通过在4℃在1体积1×TES缓冲液（Tris0.2M，EDTA0.65mM，蔗糖0.5M）中孵育细菌小球1小时并且随后添加2体积的0.25x TES缓冲液来分离细胞周质级分。将所得到的悬液在4℃搅拌过夜。将溶液通过离心澄清，使用Amicon ultra3K离心浓缩器浓缩，并且将蛋白质进行Ni-NTA。进一步通过尺寸排阻色谱纯化蛋白质。

将缺少前导序列并在C末端与序列GGLPETGGHHHHHH（SEQ ID NO:46）融合的人白介素-2克隆至pET28a⁺载体（Novagen）中。将该载体转化至大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中并且将起子培养物在37℃培养过夜。将起子培养物添加至表达培养物（3L，2YT）并培养直至OD₆₀₀达到0.6。为诱导表达，添加1mM IPTG（终浓度）并且将细菌在37℃培养4小时。通过在4℃以6000×g离心15分钟收集细菌。在裂解缓冲液（50mM Tris pH7.4，150mM NaCl，50μg/ml DNA酶I（Roche）和1片/25mL完全蛋白酶抑制剂（Roche））中通过超声处理裂解细菌。通过离心（在4℃12000×g持续15分钟）收集包涵体。在50mM Tris，pH7.4，150mM NaCl，6M胍中溶解于前，通过将沉淀物重悬于裂解缓冲剂（1×）、正丁醇（1×）和50mM Tris pH7.4，150mM NaCl，1M胍HCl（2×）并接着离心，首先洗涤包涵体。

将未折叠的蛋白质（6mg/ml，0.7mL）用TCEP（1mM）预处理并随后在25℃添加（0.1mL/h）至再折叠缓冲液（200mL，50mM Tris pH7.4，150mM NaCl，10%甘油，5mM谷胱甘肽，0.5mM氧化型谷胱甘肽）中。将反应体系搅拌2日，在Ni-NTA柱上浓缩并随后通过尺寸排阻色谱纯化。

如先前所描述的，表达和纯化金黄色葡萄球菌的分选酶A和人IFNα2a（Popp,M.W.；Dougan,S.K.；Chuang,T.-Y.；Spooner,E.；Ploegh,H.L.PNatl Acad Sci Usa2011,108,3169-3174；and Popp,M.W.；Antos,J.M.；Ploegh,H.L.蛋白科学实验指南（Current Protocols in Protein Science）；Coligan,J.E.；Dunn,B.M.；Speicher,D.W.；Wingfield,P.T.编著,John Wiley&Sons,Inc.:Hoboken,NJ,USA,2001；所述文献每一篇的完整内容通过引用方式并入本文）。

用N₃-LPETGG（1）和DIBAC-LPETGG（2）修饰泛素

如对UbYME所述那样，用1和2修饰泛素。N3-Ub：R_t7.17分钟；线性梯度在10分钟内5→45%B；ESI/MS:m/z=9542（M+H）⁺.DIBAC-Ub：R_t7.37分钟；线性梯度在10分钟内5→45%B；ESI/MS:m/z=9898（M+H）⁺。

泛素的二聚化将叠氮基修饰的泛素（5μL，4μg/μL）和DIBAC修饰的泛素（8μL，2.5μg/μL）混合（蛋白质的终浓度170μM）并在37℃孵育0.5-7小时。使用凝胶电泳分析向二聚化产物的转化。

N末端分选标记将金黄色葡萄球菌的分选酶A（150μM终浓度，4.5×母液：50mM Tris，pH7.4，150mM NaCl）和探针1或2（0.5mM终浓度，10x母液）添加至含有UbVME（58μM终浓度）的分选酶缓冲液（50mMTris，pH7.4，150mM NaCl，10mM CaCl₂）中。将所产生的混合物在37℃孵育3小时。接着，将溶液用含有1%TFA的H₂O酸化并且通过反相HPLC（20分钟内30→45%B，3ml/分钟）纯化。将所产生的纯化蛋白质，用饱和NaHCO₃水溶液中和，在真空下浓缩，重溶于H₂O中并通过凝胶电泳定量。蛋白质由LC/MS分析。N₃-UbVME：R_t7.70分钟；线性梯度在20分钟内5→45%B；ESI/MS:m/z=9714（M+H）⁺。DIBAC-UbVME：R_t7.54分钟；线性梯度在20分钟内5→45%B；ESI/MS:m/z=9360（M+H）⁺。

C末端分选标记将金黄色葡萄球菌的分选酶A（150μM终浓度，4.5×母液：50mM Tris，pH7.4，150mM NaCl）和探针（0.5mM终浓度，10×母液）添加至含有VHH（15μM终浓度）的分选酶缓冲液（50mM Tris，pH7.4，150mM NaCl，10mM CaCl₂）中。将所产生的混合物在25℃孵育过夜。通过在Superdex^TM75尺寸排阻色谱上纯化蛋白质。将所产生的纯化蛋白质在离心过滤装置中浓缩，并通过凝胶电泳和LC/MS分析。抗GFP-3：R_t6.02分钟；线性梯度在20分钟内5→45%B；ESI/MS:m/z=14330（M+H）⁺。抗GFP-4：R_t7.90分钟；线性梯度在20分钟内5→45%B；ESI/MS:m/z=14170（M+H）⁺。VHH7-3：R_t7.20分钟；线性梯度在20分钟内5→45%B；ESI/MS:m/z=15549（M+H）⁺。VHH7-5：R_t7.00分钟；线性梯度在20分钟内5→45%B；ESI/MS:m/z=15139（M+H）⁺。

二聚体UbVME构建体的合成将叠氮基修饰的UbVME（42.5（IL，80μM）和环辛炔修饰的UbVME（42.5μL，70μM）的混合物孵育过夜并随后通过反相HPLC纯化（在20分钟中30→45%B，3ml/分钟）。在纯化后，溶液用饱和NaHCO₃水溶液中和并且在真空下浓缩。通过以下方式获得仅含有一个反应性乙烯基甲基酯的二聚泛素构建体：将叠氮基修饰的泛素（42.5μL，80μM）与环辛炔修饰的UbVME（42.5μL，70μM）孵育或将叠氮基修饰的UbVMe（42.5μL，80μM）与环辛炔修饰的泛素（42.5μL，70μM）孵育。在二聚化后，如上文所述蛋白质被纯化并被安装柄。

用二聚UbVME构建体标记UCHL3将纯化的二聚构建体（0.5μg，24.5pmol）在UCHL3（94pmol）存在或不存在下稀释于20μL Tris缓冲液（20mM，pH8，100mM NaCl，0.1mM TCEP）中。将所产生的混合物孵育2小时，用Laemmli样品缓冲剂（4×）变性并加载于TRIS-tricine凝胶上。通过考马斯亮兰染色直接分析蛋白质或将它们转移至PVDF膜上。该膜用含有4%BSA的PBS/Tween（0.1%v/v）封闭。添加5-His HRP（1:12500）并且将该膜在室温搅拌30分钟。用含有0.1%体积/体积Tween的PBS洗涤该膜4次，之后用ECL plus使蛋白质可视化。

纳米体的二聚化在室温过夜孵育抗GFP-3（100μL，80μM）和抗GFP-4（100μL，85μM）制备同型二聚抗GFP纳米体。使VHH7-3（200μL20μM溶液）或VHH7-5（200μL60μM溶液）与抗GFP-4（100μL120μM溶液）在25℃反应过夜获得异二聚VHH7-3-抗GFP-4和VHH7-5-抗GFP-4。通过在Superdex^TM75尺寸排阻色谱上纯化二聚纳米体。收集并在离心过滤装置中浓缩级分。在15%SDS-PAGE上分析纯化的二聚体。（抗GFP）₂：R_t10.07分钟；线性梯度在20分钟内5→45%B；ESI/MS:m/z=28526（M+H₂O+H）⁺。VHH7-3-抗GFP-4：R_t10.91分钟；线性梯度在20分钟内5→45%B；ESI/MS:m/z=29755（M+H₂O+H）⁺。VHH7-5-抗GFP-4：R_t10.87分钟；线性梯度在20分钟内5→45%B；ESI/MS:m/z=29329（M+H₂O+H）⁺。

同型二聚纳米体的功能性测定同型二聚抗GFP纳米体（20μL，25μM）与GFP（2.5μL，10μL和30μL80μM溶液）孵育。形成的纳米体-GFP复合物在Superdex^TM200上经过尺寸排阻处理。

异二聚纳米体的功能性测定从C57BL/6（Jackson labs）或MHCII缺陷小鼠（Jackson labs）收获淋巴结细胞，洗涤并且在4℃与VHH7-抗GFP、GFP和VHH7-抗GFP+GFP孵育10分钟。细胞通过离心收集，用PBS洗涤并且通过流式细胞术分析。

体内递送测定对于递送测定，用双特异性抗体或GFP（50μg/小鼠）注射BALB/c小鼠（Jackson labs）的尾静脉。1小时后接受双特异性抗体的小鼠直接腹内接受GFP（50μg）或静脉接受GFP（50μg）。在5.5小时后，收获血液，处死小鼠并且从淋巴结、胸腺和脾中分离细胞。将细胞用PBS洗涤并且在4℃与抗CD19-APC（BD Pharmingen）和7-AAD（Viaprobe，BD）孵育10分钟。将细胞用PBS洗涤并且通过流式细胞术分析。

结果

为了构建N-N蛋白质二聚体，合成LPXTGG（SEQ ID NO:3）肽1和2，其N末端配备有叠氮己酸或二苯并氮杂环辛炔（DIBAC）（25）（图12A）。使用来自金黄色葡萄球菌的分选酶A，将这些肽连接至底物G₃-泛素（G₃-Ub）的N末端，其具有适当暴露的短的连续的Gly残基以充当引入亲核体。肽1和2被高效地转酰到G₃-泛素上（图13）。在修饰的蛋白质随时可用的情况下，建立二聚化的条件。将叠氮基修饰的泛素（80μM）与化学计量的配备有环辛炔的泛素混合并在37℃孵育。在30分钟后，观察到与泛素二聚体相对应的约18kDa多肽，如通过考马斯亮兰染色法和在抗-泛素免疫印迹中所示（图13）。延长孵育时间至7小时，如使用ImageJ通过SDS-PAGE定量，二聚泛素的转化率达到约70%。在较低的浓度（15μM）下，该反应仍继续进行，尽管以稍微较低的速率（16小时后约70%转化率）。

为评价结合的蛋白质是否保留它们的生物活性，将构建双价形式（N-对-N融合物）的泛素乙烯基甲基酯（UbVME）。UbVME是指向活性部位的探针，所述探针共价地修饰众多泛素特异性蛋白酶（USP）（26）。通过SDS-PAGE分析时通过迁移率变动，使得这些加合物的形成轻易地可视化。用双价形式的UbVME修饰USP应当产生含有两个UbVME单位和两个拷贝的USP的复合物，同时形成的加合物的分子量相应增加。因此二聚UbVME构建体的合成利用以下两个生物正交反应的联合作用：基于蛋白质内含子的天然连接以获得C末端修饰形式的携带乙烯基甲基酯配基的泛素（26）和N末端分选标记反应（27）。以如所述制备的G₃-UbVME起始，获得叠氮基修饰的和有张力的环辛炔修饰的形式。通过使等摩尔量的叠氮基修饰的UbVME和环辛炔修饰的UbVME反应并随后通过反相HPLC纯化除去任何未反应的UbVME单体，获得双价加合物。使用泛素羧基端水解酶同工酶L3（UCHL3）评价这种双价加合物的反应性，对于所述同工酶L3，与UbVME复合状态下的晶体结构是已知的（28）。作为对照，产生一个C-末端配备反应性乙烯基甲基酯并且另一个C末端配备非反应性羧酸的二聚构建体。因此所产生的UbVME-泛素能够结合单个UCHL3分子。双价UbVME与过量的N末端加His标签的UCHL3（2当量/乙烯基甲基酯）孵育（图14B）产生与两个UCHL3分子结合的双价加合物（约67kDa）。当UCHL3与对照UbVME-泛素构建体孵育或与UbVME孵育时，观察到预期的分子量变动，即分别是经UbVME-泛素二聚体修饰的UCHL3（约47kDa）和经UbVME单体修饰的UCHL3（约37kDa，见图13）。针对His6的免疫印迹法（图14C）证实，新形成的加合物实际上含有UCHL3投入材料中包括的His6标签。因此由点击反应产生的双价加合物中的两个UbVME单元保留完整活性，明显地形成它们的能力以共价修饰预期的靶。

研究了第二实施例。骆驼产生仅由重链组成的不寻常抗体（29）。当作为单结构域构建体重组表达时，它们的可变区（也称作VHH）保留完整的抗原结合能力（30）。通过以下方式合成双价单结构域VHH蛋白质：利用组合的分选点击策略，借助它们的C-末端将这些蛋白质结合。合成含有叠氮化物3或环辛炔4的三甘氨酸肽（图15A）并且重组产生合成形式的对绿色荧光蛋白（GFP）特异的骆驼抗体VHH（31）。这种VHH经修饰以含有分选酶底物基序和随其后的（His）₆标签以促利于纯化。通过SDS-PAGE和LC/MS判定，向点击柄标记的抗GFP VHH的优异转化在25℃过夜孵育后实现。通过尺寸排阻色谱去除多余的三甘氨酸亲核体以避免干扰后续的二聚化反应（图16）。使用这些修饰的VHH，产生相应的C--C融合的同型二聚体（图15B），所述同型二聚体通过尺寸排阻色谱纯化至均一性（图16）。

VHH单体和二聚体与它们的靶抗原（GFP）孵育以评估复合物的形成。与GFP孵育时，修饰的VHH单体显示在尺寸排阻色谱实验中斯托克斯半径的预期增加（图17）。随后将C-C VHH二聚体与渐增浓度的GFP孵育，并且通过尺寸排阻色谱分析在二聚体和GFP之间形成的复合物（图15C）。在添加的GFP浓度低时，游离的VHH二聚体容易与被单个GFP占据的二聚体分离，转而在较高的GFP浓度时容易与被两个GFP部分占据的二聚体分离（图18）。

该数据显示使用根据本发明多方面的点击化学与分选酶的组合容易地实现抗体片段（在单个VHH结构域情况下）的C-C融合。不仅转化率优异的（～90%）而且所产生的产物保留它们的完整功能。因为分选酶反应中使用的大多数亲核体是水溶性的并且在亲核体的合成期间引入需要严苛和/或非选择性反应条件的全部必需官能团，所以这种方案使可能影响生物活性的不想要的副反应（如可用性氨基（18）的酰化、蛋白质的变性）最小化。

以上实验被扩展以产生对小鼠II类MHC分子产物特异的VHH（VHH7）（驼羊衍生的VHH），所述VHH借助其C末端与抗GFP VHH连接以产生异双特异性产物。如上文所述制备两种加合物，一种在交界处含有四甲基罗丹明（TAMRA）荧光团的加合物（使用肽3）和一种非荧光结合物（使用肽5）。这两种加合物被纯化以获得荧光和非荧光双特异性VHH制备物（图19），并将它们添加至小鼠淋巴结细胞，B细胞中，这两种加合物对II类MHC分子产物一致地呈阳性。当细胞暴露于这种双特异性荧光VHH时，在TAMRA通道中观察到B细胞的特异性染色（图20A）。对非荧光双特异性抗体未检测到染色（图20）。随后添加GFP至暴露于双特异性VHH的细胞中。这导致在GFP通道中对两种双特异性VHH的染色。这个结果显示在这种情况下每种融合配偶物还保留其活性和特异性。II类MHC敲除小鼠的淋巴结细胞未能用双特异性VHH染色从而显示特异性。

为展示这类双特异性抗体衍生物用于产生深组织储库的用途（32），静脉内注射抗GFP-VHH7双特异性构建体，目的在于首先用这种试剂靶向相关的细胞群体（B细胞）。将单个大丸剂的重组GFP（50μg）直接腹内施用或1小时后静脉内施用，5.5小时后处死动物。收获脾细胞并通过流式细胞术分析（图20B）。大部分CD19⁺细胞（B细胞）为GFP⁺，表明在体内成功捕获GFP。施用GFP至未曾接受双特异性构建体的对照动物中显示在CD19⁺或CD19-细胞上无GFP染色。因此这个实验表明双特异性构建体可以用来首先靶向目的细胞群体，随后其剩余的游离的第二结合位点可以被配体靶向。这个类型的双特异性试剂的构建使得以可能避免急性毒性的方式定向递送生物制品，如施用全身性白介素-2（IL2）所观察到。

采用本文提供的方法和试剂，现在可以连接经证明在分选酶反应中和在全部拓扑结构中作为底物的任何实体。例如，使用这种方法，C末端结合的人IL2和干扰素-α成功地与抗GFP和VHH-7结合（图22），因此显示这些工具的一般适用性。

讨论

N-或C-末端融合蛋白质的能力创造出产生通过标准遗传方法不可获得的分子直接的机会。以这种方式连接的蛋白质保留N-N和C-C融合物的功能。作为示范性实施例，已经显示了能产生具有完全保留融合配偶物的结合能力的C末端融合的双特异性骆驼衍生的VHH构建体。可能的应用也扩展至其他融合物。对于那些所需组合需要两个C末端或两个N-末端均对正常功能而言可用的情况，标准遗传方法是不适用的。点击化学已经发展到这样的程度，其中适于固相肽合成的市售试剂使得容易地获得能够实现这些类型融合物的肽。虽然在此显示了针对蛋白质-蛋白质融合物，但是用来连接两个蛋白质的点击柄的进一步修饰允许安装其他官能团（如荧光团）或药理活性小分子。目的蛋白修饰的容易性、不同来源的重组分选酶的可得性和在亲核体设计中通过使用标准肽合成方法所提供的灵活性增加了分选酶介导的转酰基作用的通用性。

使用本文所述的技术，使得通过其他手段不易获得的蛋白质融合物触手可及。要指出的是，Hudak等人描述了与张力促进的点击化学组合使用的醛标签以实现相似目的并且产生融合有hlgG的人生长激素和麦芽糖结合蛋白（33）。这种方法与我们的分选标记策略正交并且直接暗示显示将如Hudak等人开发的醛标签-点击化学方法与本文开发的化学酶促方法组合以获得甚至更具挑战性的蛋白质-蛋白质融合物的可能性。

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在发明简述、发明详述和实施例部分中列出的全部参考文献的完整内容通过引用方式并入本文，如同每份参考文献单独地通过引用的方式并入。在并入的参考资料和本说明书之间存在冲突的情况下，应当以本说明书规范为主。

认为前面的书面说明书足以使本领域技术人员能实施本发明。本发明在范围方面不受提供的实施例限制，因为这些实施例意在作为本发明一个方面的单一说明并且功能上等同的其他实施方式处于本发明的范围内。除了本文显示和描述的那些修改之外，本发明的各种修改将因前面的描述而对本领域技术人员是显而易见的并且落于所附权利要求书的范围内。本发明的优点和目的并不必然地由本发明的每个实施方式涵盖。

等同物和范围

利用不超出常规的实验，本领域那些普通技术人员会认识到，或将能够确定与本文中所述的本发明具体实施例的许多等同物。本发明的范围不意在限于以上描述，而是如所附权利要求书所述。

权利要求书中，除非根据上下文有相反或其他的证据，所述“一个”、“一种”和“该”可以表示一个或多于一个。除非相反地指示，否则从上下文显而易见，否则如果某群组的一个、多于一个或全部成员均包含于、存在于给定的产物、公式或过程中、用于其中或否则与之相关，则将该群组的一个或多个成员之间包含“或”或者“和/或”的权利要求或说明视为满足。本发明包括其中该群组的一个成员完全存在于给定的产物或过程中、用于其中或否则与之相关的实施方式。本发明还包括其中该群组的一个、多于一个或全部成员均存在于给定的产物或过程中、用于其中或否则与之相关的实施方式。

另外，应当理解本发明将源自一项或多项权利要求或源自说明书相关部分的一个或多个限定、要素、从句、描述性术语等引入另一项权利要求的全部变例、组合和排列。例如，可以修改依赖于另一项权利要求的任何权利要求以包含在依赖于同一项基础权利要求的任何其他权利要求中存在的一个或多个限定。另外，除非另外说明或除非本领域普通技术人员显而易见将出现矛盾或不一致性，否则在权利要求提到一种组合物的情况下，应当理解包括为本文中公开的任何目的使用该组合物的方法，并且包括根据本文公开或本领域已知的其他制造方法制造该组合物的方法。

在将要素作为清单（例如，以马库什基团形式）提出的情况下，应当理解还公开了该要素的每个亚群，并且任何要素都可以从该基团中移除。还应当注意到，术语“包含”是开放式的并且允许包含额外的组成成分或步骤。应当理解，通常，在本发明或本发明的各方面称作包含特定要素、特征、步骤等时，本发明或本发明各方面的某些实施方式由所述特定要素、特征、步骤等组成或基本上由其组成。出于简明性目的，这些实施方式在本文中并没有从字词上具体阐述。因此对于本发明的包含一个或多个要素、特征、步骤等的每个实施方式，本发明还提供由这些些要素、特征、步骤等组成或基本上由其组成的实施方式。

在给出范围的情况下，包括端值。另外，应当理解，除非另外说明或另外从上下文和/或本领域普通技术人员的理解中显而易见，否则在提供范围的情况下，也在一些实施方式中提供该范围内部的全部特定值至该范围下限的十分之一单位，除非上下文另外清楚地说明。还可理解，除非另外说明或另外从上下文和/或本领域普通技术人员的理解中显而易见，否则表述为范围的值可以取得在给定的范围内部的任何子范围，其中将该子范围的端值表述至与该范围下限的十分之一单位相同的准确度。

此外，应当理解，可以从任一项或多项权利要求中明确地排除本发明的任何具体实施方式。在给出范围的情况下，可以从任一项或多项权利要求明确排除在该范围内的任何值或值集合。可以从任一项或多项权利要求排除本发明的任何实施方式、要素、特征、应用或方面。为简便目的，在此不明确地阐述其中一个或多个要素、特征、目的或方面被排除的全部实施方式。

Claims

1.一种将点击化学柄安装至靶蛋白的C末端的方法，所述方法包括步骤：

（a）为靶蛋白提供C末端分选酶识别序列；

（b）在分选酶存在时，在适合于所述分选酶的条件下，使所述靶蛋白与包含1-10个N末端甘氨酸残基或N末端烷基胺基团以及所述点击化学柄的肽或试剂接触，以使所述靶蛋白和包含所述点击化学柄的肽转酰胺化，从而使所述靶蛋白与所述点击化学柄结合。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶蛋白与所述分选酶识别序列在蛋白质的C末端处融合。

3.一种将点击化学柄安装至靶蛋白的N末端的方法，所述方法包括：

（a）为靶蛋白提供1-10个N末端甘氨酸残基或N末端烷基胺基团；

（b）在分选酶酶存在时，在适合于所述分选酶的条件下，使所述靶蛋白与包含分选酶识别基序的肽接触，以使所述靶蛋白和所述肽转酰胺化，从而使所述靶蛋白与所述点击化学柄结合。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述靶蛋白与所述1-10个N末端甘氨酸残基或N末端烷基胺基团在蛋白质的N末端处融合。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述分选酶识别基序是分选酶A识别基序。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述分选酶识别基序包含序列LPXT。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述1-10个N末端G甘氨酸残基是3个N末端甘氨酸残基。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述肽包含位于所述点击化学基团和所述1-10个甘氨酸残基或N末端烷基胺基团之间，或位于所述点击化学基团和所述分选酶识别序列之间的接头。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述接头包含具有1-100个氨基酸残基的氨基酸序列。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述点击化学柄选自由如下所组成的组：末端炔烃、叠氮化物、有张力的炔烃、二烯、亲二烯体、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇、四嗪和烯烃。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述点击化学柄选自环辛炔和叠氮化物。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述分选酶识别序列是LPETG（SEQ ID NO:4）。

13.一种翻译后使两个蛋白结合以形成嵌合蛋白的方法，所述方法包括：

在适于第一点击化学柄与第二点击化学柄反应的条件下，使与所述第一点击化学柄结合的第一蛋白质和与所述第二点击化学柄结合的第二蛋白质接触，从而产生嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含经共价键连接的两个蛋白质。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第一点击化学柄与所述第一蛋白质的N末端结合，所述第二点击化学柄与所述第二蛋白质的N末端结合，并且所述嵌合蛋白是所述第一蛋白质和所述第二蛋白质的N末端-N末端的结合物。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述第一点击化学柄与所述第一蛋白质的C末端结合，所述第二点击化学柄与所述第二蛋白质的C末端结合，并且所述嵌合蛋白包括两个蛋白质的C末端-C末端的结合物。

16.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述第一蛋白质的所述点击化学柄选自由如下所组成的组：末端炔烃、有张力的炔烃、二烯、烷氧基胺、膦、酰肼、四嗪和硫醇。

17.根据权利要求13-16中任一项所述的方法，其中所述第二蛋白质的所述点击化学柄选自由如下所组成的组：叠氮化物、亲二烯体、羰基和烯烃。

18.根据权利要求13-17中任一项所述的方法，其中

（i）所述第一蛋白质的所述点击化学柄是末端炔烃，所述第二蛋白质的所述点击化学柄是叠氮化物；

（ii）所述第一蛋白质的所述点击化学柄是具有张力的炔烃，所述第二蛋白质的所述点击化学柄是叠氮化物；

（iii）所述第一蛋白质的所述点击化学柄是二烯，所述第二蛋白质的所述点击化学柄是亲二烯体；

（iv）所述第一蛋白质的所述点击化学柄是烷氧基胺，所述第二蛋白质的所述点击化学柄是羰基；

（v）所述第一蛋白质的所述点击化学柄是膦，所述第二蛋白质的所述点击化学柄是叠氮化物；

（vi）所述第一蛋白质的所述点击化学柄是酰肼，所述第二蛋白质的所述点击化学柄是羰基；或

（vii）所述第一蛋白质的所述点击化学柄是硫醇，所述第二蛋白质的所述点击化学柄是烯烃；

（viii）所述第一蛋白质的所述点击化学柄是环辛炔，所述第二蛋白质的所述点击化学柄是叠氮化物。

19.一种双特异性嵌合抗体，包括：

包含分选酶识别序列的第一抗体或抗原结合抗体片段；和

包含分选酶识别序列的第二抗体或抗原结合抗体片段；

其中所述第一抗体和所述第二抗体或抗体片段借助点击化学结合在一起。

20.根据权利要求19所述的嵌合抗体，其中所述第一抗体和所述第二抗体或抗体片段在它们的C-末端（C-C）或在它们的N-末端（N-N）经共价键结合在一起。

21.根据权利要求19或20所述的嵌合抗体，其中所述第一抗体和/或所述第二抗体包括单一结构域抗体或其抗原结合片段。

22.根据权利要求19-21中任一项所述的嵌合抗体，其中所述第一抗体和/或所述第二抗体包括骆驼抗体或其抗原结合片段。

23.根据权利要求19-22任一项所述的嵌合抗体，其中所述第一抗体和/或所述第二抗体包括VHH结构域或其抗原结合片段。

24.根据权利要求19-23一项所述的嵌合抗体，其中所述第一抗体和/或所述第二抗体包括scFv或其抗原结合片段。

25.根据权利要求19-24一项所述的嵌合抗体，其中所述第一抗体和/或所述第二抗体包括纳米体或其抗原结合片段。

26.根据权利要求19-25中任一项所述的嵌合抗体，其中所述第一抗体和所述第二抗体或其抗原结合片段结合不同的抗原。

27.根据权利要求19-25中任一项所述的嵌合抗体，其中所述第一抗体和所述第二抗体或其抗原结合片段结合相同的抗原。

28.根据权利要求27所述的嵌合抗体，其中所述第一抗体和第二抗体或其抗原结合片段结合相同抗原的不同表位。

29.一种蛋白质，包含具有分选酶识别基序的靶蛋白和借助点击化学与蛋白质结合的第二分子。

30.根据权利要求29所述的蛋白质，其中所述分选酶识别基序包含序列LPXT。

31.根据权利要求29或30所述的蛋白质，其中所述蛋白质通过翻译后在所述靶蛋白上安装点击化学柄并且使所述靶蛋白与所述第二分子接触来产生，其中所述第二分子包含在合适条件下可以与所述靶蛋白的所述点击化学柄反应以形成共价键的第二点击化学柄。

32.根据权利要求27-31中任一项所述的蛋白质，其中所述第二分子是第二蛋白质、小分子化学化合物、核酸或脂质。

33.根据权利要求32所述的蛋白质，其中所述第二蛋白质包含分选酶识别基序。

34.根据权利要求32或33所述的蛋白质，其中所述靶蛋白和所述第二蛋白在质翻译后在它们的N-末端（N-N）或在它们的C-末端（C-C）借助点击化学结合。

35.根据权利要求29-34中任一项所述的蛋白质，其中所述靶蛋白包含抗原结合结构域。

36.根据权利要求29-35中任一项所述的蛋白质，其中所述第二分子包含抗原结合结构域。

37.根据权利要求32-36中任一项所述的蛋白质，其中所述靶蛋白和所述第二分子各自包含抗原结合结构域，并且其中所述靶蛋白的抗原结合结构域和所述第二分子的抗原结合结构域是不同的。

38.根据权利要求37所述的蛋白质，其中所述蛋白质的抗原结合结构域和所述第二分子的抗原结合结构域结合不同的抗原。

39.根据权利要求37或38所述的蛋白质，其中所述蛋白质的抗原结合结构域和/或所述第二分子的抗原结合结构域包括抗体、抗原结合抗体片段、Adnectin、亲和体、模拟抗体Anticalin、DARPin或适体。

40.根据权利要求37-39中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质的抗原结合结构域和/或所述第二分子的抗原结合结构域包括骆驼抗体、VHH结构域、单一结构域抗体、scFv、纳米体或其抗原结合片段。

41.根据权利要求29所述的蛋白质，其中所述第二分子包括合成的聚合物。

42.根据权利要求41所述的蛋白质，其中所述合成的聚合物包含PEG配基。

43.根据权利要求29所述的蛋白质，其中其他的分子包含可检测标记物。

44.根据权利要求43所述的蛋白质，其中所述可检测标记物包括荧光团、酶或放射性同位素。

45.根据权利要求44所述的蛋白质，其中所述可检测标记物选自荧光蛋白、荧光染料、萤光素酶和过氧化物酶。

46.一种蛋白质，包含

分选酶识别基序；和

与所述分选酶识别基序结合的点击化学柄。

47.根据权利要求46所述的蛋白质，其中所述分选酶识别基序包含序列LPXT。

48.根据权利要求46或47所述的蛋白质，其中所述蛋白质包含抗原结合结构域。

49.根据权利要求46-48中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质包括抗体或抗原结合抗体片段。

50.根据权利要求49所述的蛋白质，其中所述蛋白质包括骆驼抗体或其抗原结合片段、VHH结构域、单一结构域抗体、纳米体、scFv、亲和体、模拟抗体Anticalin、DARPin或Adnectin。

51.根据权利要求29-50中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质包含位于所述点击化学基团和所述分选酶识别序列之间的接头。

52.根据权利要求51所述的蛋白质，其中所述接头包含具有1-100个氨基酸残基的氨基酸序列。

53.根据权利要求46-50中任一项所述的蛋白质，其中所述点击化学柄在所述蛋白质的C末端。

54.根据权利要求46-50中任一项所述的蛋白质，其中所述点击化学柄在所述蛋白质的N末端。

55.根据权利要求46-50中任一项所述的蛋白质，其中所述点击化学柄选自由如下所组成的组：末端炔烃、叠氮化物、有张力的炔烃、二烯、亲二烯体、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇和烯烃。

56.一种试剂盒，包含：

（a）与第一点击化学柄结合的包含1-10个甘氨酸残基或末端烷基胺的第一肽；和

（b）与第二点击化学柄结合的包含分选酶识别基序的第二肽；其中所述第一肽的点击化学柄和所述第二肽的点击化学柄可以在合适条件下反应；以及，任选地，

（c）分选酶。

57.一种试剂盒，包含：

（b）与第二点击化学柄结合的包含1-10个甘氨酸残基或末端烷基胺的的第二肽；其中所述第一肽的点击化学柄和所述第二肽的点击化学柄可以在合适条件下反应；以及，任选地，

（c）分选酶。

58.一种试剂盒，包含：

（a）与第一点击化学柄结合的包含分选酶A识别基序的第一肽；和

（c）分选酶。

59.根据权利要求56-58中任一项所述的试剂盒，其中所述第一点击化学柄选自由如下所组成的组：末端炔烃、有张力的炔烃、二烯、烷氧基胺、膦、酰肼和硫醇。

60.根据权利要求56-59中任一项所述的试剂盒，其中所述第二点击化学柄选自由如下所组成的组：叠氮化物、亲二烯体、羰基和烯烃。

61.根据权利要求56-60中任一项所述的试剂盒，其中

（i）所述第一点击化学柄是末端炔烃，所述第二点击化学柄是叠氮化物；

（ii）所述第一点击化学柄是有张力的炔烃，所述第二点击化学柄是叠氮化物；

（iii）所述第一点击化学柄是二烯，所述第二点击化学柄是亲二烯体；

（iv）所述第一点击化学柄是烷氧基胺，所述第二点击化学柄是羰基；

（v）所述第一点击化学柄是膦，所述第二点击化学柄是叠氮化物；

（vi）所述第一点击化学柄是酰肼，所述第二点击化学柄是羰基；或

（vii）所述第一点击化学柄是硫醇，所述第二点击化学柄是烯；

（viii）所述第一点击化学柄是环辛炔，所述第二点击化学柄是叠氮化物。

62.根据权利要求56-61中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含催化剂、反应缓冲液和/或所述试剂盒的使用说明书。