KR101637010B1 - 위치 특이적으로 알부민이 연결된 요산 산화효소 및 단백질에 위치 특이적으로 알부민을 연결하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 위치 특이적으로 알부민이 연결된 요산 산화효소 및 단백질에 위치 특이적으로 알부민을 연결하는 방법에 관한 것에 관한 것이다. 본 발명에서는 요산 산화효소의 트립토판 잔기를 비천연 아미노산으로 대체하고 여기에 위치 특이적으로 알부민을 연결하는 하는 경우, 요산 산화효소의 생체 내 활성은 유지되면서 반감기가 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 치료용 단백질에 알부민을 연결하는 방법을 이용하면 알부민을 연결하기 어려웠던 치료용 단백질의 반감기를 효과적으로 향상시킬 수 있다.
Description
본 발명은 위치 특이적으로 알부민이 연결된 요산 산화효소 및 단백질에 위치 특이적으로 알부민을 연결하는 방법에 관한 것이다.
지난 30년 동안 치료용 단백질은 다양한 질병의 치료에서 임상적인 성공을 거두어 왔으며, 이는 계속해서 제약분야의 중요한 성장 동기로 작용하고 있다. 치료용 단백질의 개발에서 중요한 고려사항 중 하나는 반복적인 주사를 피하기 위하여 약효의 지속시간을 연장시키는 것이다. 환자에 투여된 치료용 단백질은 환자의 체내에서 계속해서 제거되기 때문에, 치료용 단백질을 사구체의 여과(glomerular filtration), 세포흡수작용(pinocytosis) 및 면역반응으로부터 보호하기 위한 다양한 방법들이 시도되고 있다.
약물전달체로 인간 혈청 알부민(Human serum albumin, HSA)을 이용하는 것은 생체 내에서 약물의 반감기를 증가시킬 수 있는 효율적인 방법 중 하나이다. HSA는 특이하게도 2주 이상의 긴 혈청에서의 반감기를 가지고 있는데, 이는 신장에서의 정전기적 반발력(electrostatic repulsion) 및 내피세표(endothelium)에서 FcRn에 의해 매개되는 재순환 작용으로 인한 것으로 보인다[2-5]. HSA를 유전적 결합이나 화학적인 결합에 의해 다른 단백질에 연결시킴으로써, 치료용 단백질의 반감기를 증가시킬 수 있는데, 이러한 기술을 알부미내이션(albumination)이라고 한다. 펩타이드 또는 작은 사이즈의 단백질의 경우, 알부미내이션(albumination)에 의해 성공적으로 반감기가 증가하고 약물학적 효과(PD, pharmacodynamics)가 향상되는 효과를 나타내었다[6-11]. 하지만 멀티-서브유닛과 복잡한 3차 구조를 가지고 있는 치료용 단백질의 경우, 알부민에 의한 효과를 얻기가 쉽지 않은데, 이는 충분하지 못한 단백질 발현량과 잘못된 폴딩(misfolding)으로 인한 단백질 활성의 손실이 현저하기 때문이다[12-14]. 이와 같은 일반적인 알부미내이션(albumination) 방법의 문제점을 위치 특이적인 단백질 연결(site-specific protein conjugation)에 의해 해결하고자 하는 시도가 이루어지고 있다. 연결 위치의 유연한 선택 및 특정 위치의 결합은 단백질 폴딩 문제, 멀티-서브유닛의 문제 등에 관계없이 어떤 치료용 단백질도 HSA에 연결되어 사용될 수 있는 가능성을 보여준다.
한편, 확장된 유전자코드는 단백질 연결에 있어 획기적인 전환점을 가져 왔는데, 이로 인해 비천연 아미노산(non-natural amino acids, NNAAs)을 타겟 단백질에 위치 특이적으로, 어떠한 위치에든지 포함시키는 것이 가능해졌으며, 이는 E. coli, yeast 또는 CHO 세포주 등 다양한 발현균주에서 모두 가능하다[15-21]. 반응적인 비천연 아미노산은 화학적인 핸들로서 작용하는데, 이는 기원이 같은 작용기(functional group)를 가진 분자가 다른 천연 아미노산과의 교차반응 없이 연결되는 것을 가능하게 해준다[22,23]. 가장 주목할 점은 이와 같은 기술을 위치 특이적인 PEGylation 및 항체-약물 컨쥬게이트(antibody-drug conjugate) 등의 다양한 단백질 치료제에 응용하는 것이 가능하다는 것이다[24-28]. 비천연 아미노산 및 위치 특이적인 단백질 연결방법을 함께 사용하는 경우, 단백질의 본래 기능의 손실 없이 목표로 하는 치료 단백질을 만드는 것이 가능하며, 제작과정을 효율화하는 것이 가능하므로 치료용 단백질을 임상학적으로 더 유용하게 사용할 수 있다.
비록 클릭 화학(click chemistry)이 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 변형시키는 강력한 도구라는 것이 증명되었지만, 아직까지 비천연 아미노산과 클릭 화학을 함께 사용하여 치료용 단백질에 위치 특이적으로 알부민을 연결시킨 연구는 보고된 바가 없었다.
본 발명자들은 치료용 단백질의 반감기를 증가시키기 위하여 단백질에 알부민을 위치 특이적으로 연결하는 방법을 발굴하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 요산 산화효소의 특정한 아미노산 잔기를 위치 특이적으로 비천연 아미노산으로 대체하고 여기에 알부민을 연결하는 경우, 요산 산화효소의 생체 내 활성은 유지되면서 반감기가 증가한다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 위치 특이적으로 링커를 통하여 알부민이 컨쥬게이션(conjugation)된 요산 산화효소를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 단백질에 위치 특이적으로 링커를 통하여 알부민을 컨쥬게이션(conjugation)하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 다음을 포함하는 요산 산화효소의 융합 단백질을 제공한다:
(a) 요산 산화효소; 및
(b) 상기 요산 산화요소에 위치 특이적으로 링커를 통하여 컨쥬게이션(conjugation)된 알부민.
요산산화효소(urate oxidase)는 요산을 산화하여 알란토인(allantoin)과 과산화수소를 생성하는 효소로서 영장류 외의 모든 포유류의 간, 신장 등에 다량 존재한다. 사람의 경우, 요산 산화효소의 유전자는 가지고 있으나, 활성화되지 않아서 요산 산화효소를 가지고 있지 않으므로 요산의 최종 대사산물이 퓨린이 된다. 혈액 속에 요산의 농도가 과도하게 높아질 경우 통풍의 원인이 되기도 한다. 요산 산화효소는 동일한 서브유닛으로 구성된 4합체(tetramer)의 형태를 가지며, 4개 서브유닛 사이의 인터페이스에 동일한 4개의 활성부위가 위치하고 있다. 본 발명의 구체적인 예에 따르면, 요산 산화효소는 Aspergillus flavus로부터 얻은 것으로서 각각의 서브 유닛은 301개의 아미노산으로 구성되며 분자량은 약 34 kDa이다.
라스부리카제(Rasburicase)는 재조합 요산 효소로서 화학요법 치료를 받는 환자들에 대한 종양용해증후근(tumor lysis syndrome, TLS)의 예방 또는 치료제로서 미국 FDA의 승인을 받았으며, 통풍과 같은 심각한 고뇨산혈증에 대한 치료제로도 연구 중에 있다. 라스부리카제는 Aspergillus flavus의 요산 산화효소의 재조합 단백질로서 301개의 아미노산으로 구성되며 분자량은 약 34 kDa이다.
본 발명의 요산 산화효소의 융합 단백질은 요산 산화요소에 위치 특이적으로 링커를 통하여 알부민이 컨쥬게이션(conjugation)되어 있다. 위치 특이적으로 컨쥬게이션이 되어있다는 것은 요산 산화효소의 특정한 아미노산 잔기 위치에 알부민이 컨쥬게이션되어있다는 것을 의미한다. 이를 위해 요산 산화효소의 특정한 위치의 아미노산 잔기를 비천연 아미노산으로 대체한 후, 대체한 비천연 아미노산에 링커를 통하여 알부민을 컨쥬게이션하는 방법을 사용한다. 비천연 아미노산으로 대체할 아미노산 잔기를 선택하기 위해서는 다음의 사항을 고려해야 한다. 첫째, 천연형 요산 산화효소의 활성 및 구조에 있어 중요한 역할을 하는 아미노산 잔기는 제외한다. 즉, 비천연 아미노산으로 대체를 하더라도 천연형의 활성 및 구조에 최소한의 영향을 미칠 수 있는 아미노산 잔기를 선택해야 한다. 둘째, 대체하고자 하는 아미노산과 비천연 아미노산이 구조적으로 유사해야 한다. 구체적으로 방향족 아미노산을 대체하는 경우 p-Azido-L-phenylalanine, p-ethynyl-phenylalanine, 또는 p-propargyloxyphenylalanine과 같은 비천연 아미노산이 적합하다. 셋째, 상대적 용매 접근성이 높을수록 유리하다. 용매 접근성이 높을수록 링커와 연결된 알부민이 컨쥬게이션될 가능성이 높기 때문이다. 본 발명의 구체적인 예에 따르면, 요산 산화효소를 구성하고 있는 방향족 아미노산 중 상대적 용매접근성이 높은 두 개의 트립토판을 p-Azido-L-phenylalanine(AzF)로 대체한 경우, 효율적으로 알부민을 컨쥬게이션 할 수 있었다.
본 발명에서 알부민은 링커를 통하여 상기 대체된 비천연 아미노산에 연결이 되며, 대체된 비천연 아미노산의 종류 및 비천연 아미노산과 링커를 연결하는 화학반응의 종류에 따라 사용하는 링커의 종류가 달라질 수 있다. 예를 들어, 비천연 아미노산으로서 p-Azido-L-phenylalanine을 사용하고 strain-promoted alkyne-azide cycloaddition(SPAAC)을 통해 링커를 연결하는 경우, cycloalkyne이 포함되어 있는 링커를 사용할 수 있으며, 비천연 아미노산으로서 p-ethynyl-phenylalanine이나 p-propargyloxyphenylalanine을 사용하고 copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) 반응을 통해 링커를 연결하는 경우, azide그룹을 가지고 있는 링커를 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 예에 따르면, 비천연 아미노산으로서 p-Azido-L-phenylalanine을 사용하고 strain-promoted alkyne-azide cycloaddition(SPAAC) 반응을 통해 연결하는 경우, cyclooctyne이 포함되어 있는 DBCO-PEG4-MAL을 링커로 사용하였다.
본 발명의 알부민과 링커의 연결에 있어서, 링커는 알부민의 FcRn-결합 도메인에서 이격된 아미노산 잔기에 결합하는 것을 특징으로 한다. 알부민의 FcRn-결합 도메인은 알부민으로 인한 단백질의 반감기를 증가시키는 FcRn-매개 리싸이클링(FcRn-mediated recycling)에서 중요한 역할을 하는 부위이기 때문에 링커는 가능한 FcRn-결합 도메인에서 이격된 아미노산 잔기에 결합하는 것이 유리하다. 알부민과 링커는 다양한 결합방법에 의해 연결될 수 있다. 본 발명의 구체적인 예에 따르면, FcRn-결합 도메인에서 이격된 위치에 있는 시스테인 잔기에 링커를 연결하였다.
본 발명의 알부민에는 천연형 알부민 및 알부민 변이체가 포함되며, 본 발명의 구체적인 예에 따르면, 인간 혈청 알부민(Human serum albumin, HSA)을 요산 산화 효소에 컨쥬게이션하는 경우 요산 산화 효소의 혈청 내 반감기가 현저하게 증가하는 효과를 나타내었다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 알부민을 단백질에 위치 특이적으로 링커를 통하여 컨쥬게이션(conjugation)하는 방법을 제공한다:
(a) 단백질을 구성하는 아미노산 가운데 최소 하나 이상의 아미노산 잔기를 위치 특이적으로 비천연 아미노산으로 대체하는 단계; 및
(b) 링커를 통하여 알부민을 상기 비천연 아미노산에 컨쥬게이션하는 단계.
본 발명에서 이용되는 각 단계에 대해서는 요산 산화효소에 알부민을 위치 특이적으로 링커를 컨쥬게이션하는 방법에서 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 위치 특이적으로 링커를 통하여 알부민이 컨쥬게이션(conjugation)된 요산 산화효소를 제공한다.
(b) 본 발명은 단백질에 위치 특이적으로 링커를 통하여 알부민을 컨쥬게이션(conjugation)하는 방법을 제공한다.
(c) 본 발명의 방법은 치료용 단백질에 알부민을 연결할 수 있는 효율적인 방법을 제공하므로 알부민을 연결하기 어려웠던 치료용 단백질의 반감기를 향상시키는데 효과적으로 이용될 수 있다.
도 1은 알부민이 위치 특이적으로 컨쥬게이션된 Uox-HSA를 보여주는 그림이다. DBCO-PEG4-MAL를 링커로 하여 Uox-W160.174AzF와 HSA를 연결하였다.
도 2는 천연형 Uox의 페닐알라닌, 트립토판, 타이로신 잔기에서 용매접근성을 ASA-View 온라인 서버를 이용하여 분석한 도표이다.
도 3은 AzF가 Uox에 위치 특이적으로 편입 되었는지를 확인하기 위하여 트립신으로 자른 Uox-WT와 Uox-W160.174AzF를 MALDI-TOF M/S로 분석한 결과이다. 펩타이드 Y(residues 172-176; ETWDR)는 174번 위치에서 트립토판이 AzF로 대체된 것을 포함하며, 펩타이드 X(residues 154-164, STNSQFWGFLR)는 160번 위치에서 트립토판이 AzF로 대체된 것을 포함한다.
도 4는 AzF가 Uox에 위치 특이적으로 편입 되었는지를 확인하기 위하여 형광염료인 DBCO-PEG4-carboxyrhodamine를 처리한 Uox-W160.174AzF 및 Uox-WT의 단백질 젤 이미지이다.
도 5는 Uox에 AzF가 위치 특이적으로 편입되어 이차구조에 변화가 있는지를 확인하기 위하여 Uox-WT 및 Uox-W160.174AzF의 CD spectra를 분석한 도표이다.
도 6는 Uox-HSA를 SDS-PAGE 젤로 분석한 사진이다(레인 1: Uox-W160.174AzF, 레인 2: HSA-PEG4-DBCO, 레인 3: reaction mixture, 레인 4: column-purified Uox-HSA).
도 7는 Uox-HSA의 효소활성을 분석하기 위해 Uox-HSA와 Uox-WT의 반응속도(reaction rate)를 비교 분석한 도표이다.
도 8는 생체 내에서 Uox-HSA와 Uox-WT의 반감기를 비교하기 위하여 , Uox-WT 또는 Uox-HSA를 각각 마우스에 정맥 주사한 다음, 요산 분해활성 분석(uric acid-degradation assay)방법으로 Uox 효소의 활성을 분석한 도표이다.
도 2는 천연형 Uox의 페닐알라닌, 트립토판, 타이로신 잔기에서 용매접근성을 ASA-View 온라인 서버를 이용하여 분석한 도표이다.
도 3은 AzF가 Uox에 위치 특이적으로 편입 되었는지를 확인하기 위하여 트립신으로 자른 Uox-WT와 Uox-W160.174AzF를 MALDI-TOF M/S로 분석한 결과이다. 펩타이드 Y(residues 172-176; ETWDR)는 174번 위치에서 트립토판이 AzF로 대체된 것을 포함하며, 펩타이드 X(residues 154-164, STNSQFWGFLR)는 160번 위치에서 트립토판이 AzF로 대체된 것을 포함한다.
도 4는 AzF가 Uox에 위치 특이적으로 편입 되었는지를 확인하기 위하여 형광염료인 DBCO-PEG4-carboxyrhodamine를 처리한 Uox-W160.174AzF 및 Uox-WT의 단백질 젤 이미지이다.
도 5는 Uox에 AzF가 위치 특이적으로 편입되어 이차구조에 변화가 있는지를 확인하기 위하여 Uox-WT 및 Uox-W160.174AzF의 CD spectra를 분석한 도표이다.
도 6는 Uox-HSA를 SDS-PAGE 젤로 분석한 사진이다(레인 1: Uox-W160.174AzF, 레인 2: HSA-PEG4-DBCO, 레인 3: reaction mixture, 레인 4: column-purified Uox-HSA).
도 7는 Uox-HSA의 효소활성을 분석하기 위해 Uox-HSA와 Uox-WT의 반응속도(reaction rate)를 비교 분석한 도표이다.
도 8는 생체 내에서 Uox-HSA와 Uox-WT의 반감기를 비교하기 위하여 , Uox-WT 또는 Uox-HSA를 각각 마우스에 정맥 주사한 다음, 요산 분해활성 분석(uric acid-degradation assay)방법으로 Uox 효소의 활성을 분석한 도표이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 방법
실험재료
p-Azido-L-phenylalanine(AzF)는 Chem-Impex International(Wood Dale, IL)로부터 구입하였으며, 0.2 M NaOH에 용해하여 100 mM 스톡(stock solution)을 만들어 사용하였다. Ni-NTA 아가로즈 및 pQE80 플라스미드는 Qiagen(Valencia, CA)으로부터 구입하였다. Vivaspin centrifugal concentrators는 Sartorius Corporation(Bohemia, NY)로부터, ZipTip(w/ C18 resin)은 Millipore Corporation(Billerica, MA)로부터, 시퀀싱 등급의 변형된 트립신(modified trypsin)은 Promega Corporation(Madison, WI)로부터, DBCO-PEG4-carboxyrhodamine, DBCO-PEG4-MAL 및 DBCO-PEG4-DBCO은 Bioconjugate Technology Company(Scottsdale, AZ)로부터, 15-azidopentadecanoic acid는 Life Technologies(Gaithersburg, MD)로부터, PD-10 desalting columns, HiTrap SP HP cation exchange column 및Superdex 200 10/300 GL size exclusion column은 GE Health care (Piscataway, NJ)로부터, UNO Q1 anion exchange column 및 Biologic DuoFlow chromatography system은 Bio-Rad(Hercules, CA)로부터 구입하였다. 그 외 모든 화학 시약은 Sigma-Aldrich Corporation(St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다.
위치 특이적으로 AzF가 포함된 Uox 제작을 위한 발현벡터의 제작
Methanococcus jannaschii로부터 기원한 tyrosyl-tRNA synthetase와 amber suppressor tRNA로 이루어진 AzF 특이적인 engineered pair를 포함하고 있는 pEVOL-pAzF 플라스미드(Plasmid ID: 31186)를 Addgene(Cambridge, MA)로부터 구입하여 추가적인 수정 없이 사용하였다. C-말단에 His(× 6) tag이 연결되어 있으면서 Aspergillus flavus로부터 기원한 재조합 요소산화효소(urate oxidase, Uox)를 발현하기 위한 박테리아용 발현벡터를 제작하기 위하여, pCG62-Uox(Geraths, C. et al., J. Control. Release, A biohybrid hydrogel for the urate-responsive release of urate oxidase, 2013, 171, 57-62)로부터 Uox의 코딩서열(서열목록 제1서열)을 PCR로 얻어낸 다음, pQE80에 클로닝하여 pQE80-Uox를 만들었다. 사용한 프라이머는 다음과 같다:
F: 5-CACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGTCTGCTGTGAAGGCCG-3
R: 5-CAGGAGTCCAAGCTCAGCTAATTAAGCTTAATGGTGATGGTGATGGTGC-3
Uox의 160번 및 174번 위치의 트립토판을 amber 코돈(UAG)으로 대체하기 위하여 상기 pQE80-Uox를 템플레이트로 Site-directed mutagenic PCR을 수행하였다. 160번 위치에 amber 코돈을 도입하기 위해 5-CAATTCACAGTTTTAGGGGTTTCTGAG-3 및 5-CTCAGAAACCCCTAAAACTGTGAATTG-3 프라이머를 사용하였으며, 174번 위치에 amber 코돈을 도입하기 위해 5-CACTGAAGGAGACTTAGGATAGAATCCTG-3및 5-CAGGATTCTATCCTAAGTCTCCTTCAGTG-3프라이머를 사용하였다.
모든 DNA 클로닝은 제한효소를 사용하지 않는 클로닝기술을 이용하였다[48].
UoxW160
.174
AzF
,
Uox
-
WT
의 발현 및 정제
천연형 Uox(Uox-WT)의 발현을 위해 E. coli TOP10을 pQE80-Uox로 형질전환 하였으며, TOP10[Uox]로 명명하여 사용하였다. AzF가 포함된 Uox(Uox-W160.174AzF)를 발현하기 위하여 E. coli C321.ΔA.exp(Addgene, ID: 49018)를 사용하였으며, pEVOL-pAzF와 pQE80-UoxW160.174amb로 동시에 형질전환시켜 C321.ΔA.exp [Uox-W160.174amb]로 명명하여 사용하였다.
미리 배양한 C321.ΔA.exp[Uox-W160.174amb]를 2× YT 배지(100 /mL ampicillin, 35 /mL chloramphenicol)에 접종하여 37°C, 220 rpm 조건에서 배양하였다. OD600 값이 0.5에 도달하였을 때, AzF 용액을 최종 종도가 1 mM이 되도록 첨가하였다. 10분 후, 1 mM IPTG와 0.2%(w/v) L-(+)-arabinose을 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 5시간 후, 세포를 수거하였고, 5,000 rpm으로 10분 동안 원심분리를 하여 펠렛(pellet)을 얻은 다음 -20°C에서 보관하였다.
펠렛으로부터 UoxW160.174AzF를 추출하고 정제하기 위하여, 펠렛을 용해용 버퍼(50 mM sodium phosphate pH 7.5, 0.3 M NaCl, 10 mM imidazole, 1 mg/mL lysozyme, DNase, RNase 및 protease inhibitor cocktail)에 풀어주고 37°C에 1시간 동안 놓아둔 다음, 4°C에 2시간 동안 놓아두었다. 11,000 rpm으로 30분 동안 원심분리를 하여 깨끗한 상층액을 얻어낸 다음, Ni-NTA 아가로즈와 1시간 동안 섞어주었다. 불순물을 제거하기 위하여, 세척버퍼(50 mM sodium phosphate pH 7.5, 0.3 M NaCl, 20 mM imidazol)를 컬럼에 중력을 이용하여 흘려 내려주면서 세척하였다. 단백질을 용출버퍼(50 mM sodium phosphate pH 7.5, 0.3 M NaCl, 250 mM imidazole)로 용출한 다음, PD-10 컬럼을 이용하여 저장용 버퍼(50 mM HEPES pH 8.2, 0.2 M NaCl)로 바꾸어 주었다.
Uox-WT의 경우, AzF와 L-(+)-arabinose를 첨가하지 않은 점과 발현 균주로 TOP10[Uox]을 사용한 점을 제외하고는 동일한 방법으로 발현, 정제하였다.
분광계를 이용한
Uox
-
WT
및
Uox
-
W160
.174
AzF
의 정량방법
280 nm에서 AzF의 몰 흡광계수를 측정한 결과 2,620 M-1cm-1이었으며, Uox-WT와 Uox-W160.174AzF의 분자흡광계수(molar absorption coefficient), ε280 (M-1cm-1)는 다음의 식을 이용하여 계산하였다[50].
ε280 = (5500 x nTrp) + (1490 x nTyr) + (2620 x nAZF)
Uox-WT 및 Uox-W160.174AzF의 ε280는 각각 53,400 M-1cm-1 및 47,640 M-1cm-1이었으며, 농도는 Beer-Lambert Law를 사용하여 측정하였다[51].
MALDI
-
TOF
를 이용한 질량 분석방법
단백질을 저장용 버퍼에 0.5 mg/mL 농도로 맞추어 넣은 후, 트립신으로 37°C에서 하룻밤 동안 분해한 다음, 제작자의 매뉴얼에 따라 ZipTip C18을 이용하여 염(salt)를 제거하였다. 이를 다시 DHB 매트릭스(20 mg/mL 2,5-dihydroxybenzoic acid와 2 mg/mL L-()-fucose를 10% ethanol에 용해하여 제작)와 1:1로 혼합한 다음, Microflex MALDI-TOF M/S(Bruker Corporation, Billerica, MA)을 이용하여 질량분석을 수행하였다.
SPAAC
를 사용한
Uox
-
W160
.174
AzF
표지방법
저장용 버퍼에 30 농도로 맞춘 Uox-WT 및 Uox-W160.174AzF를 각각 100 의 DBCO-PEG4-carboxyrhodamine와 실온에서 2시간 동안 반응시킨 다음, SDS-PAGE 젤에 로딩하였다. BioSpectrum imaging system(UVP, Upland, CA)을 이용하여 in-gel fluorescence를 측정하였다. λex = 480 nm의 조도에서, 510 nm이상의 방출된 빛이 캡쳐되었다. 저장버퍼에 30 의 농도로 맞춘 Uox-W160.174AzF를 150 의 DBCO-PEG4-DBCO와 실온에서 6시간 동안 반응시킴으로써 DBCO-PEG4의 컨쥬케이션(conjugation)을 수행하였으며, 이를 Uox-PEG4-DBCO로 명명하였다. PD-10으로 염(salt)을 제거한 다음, 15-azidopentadecanoic acid와 Uox-PEG4-DBCO를 1:5 몰 비율로 섞은 후 실온에서 2시간 동안 반응시켜 Uox-PEG4-palmitic acid를 만들었다.
원편광
이색성
분광측정법(
Circular
dichroism
,
CD
) 및 데이터 분석
Uox-WT 와 Uox-W160.174AzF의 이차구조를 분석하기 위하여 0.03 mg/mL의 농도의 단백질을 Jasco 710 spectropolarimeter을 이용하였다. DichroWeb online CD analysis software server[52,53]와 SELCON3 analysis program (Set #4 reference set)[54,55]을 이용하여 데이터를 분석하였다.
Uox
-
HSA
복합단백질(
conjugate
) 제작
동결건조된 인간 혈청 알부민(Human serum albumin, HSA)을 PBS에 녹인 다음, 음이온 교환 칼럼인 UNO Q1을 이용하여 정제하였다. 정제된 HSA(50 )을 티올-말레인이미드 커플링(thiol-maleimide coupling)에 의해 DBCO-PEG4-MAL(200 )에 컨쥬케이션한 다음, 20 mM 인산나트륨 버퍼(pH 6.0)로 교환하여 HSA-PEG4-DBCO를 만들었다.
SPAAC에 의한 Uox-HSA 복합단백질을 합성하기 위하여, Uox-W160.174AzF를 20 mM 인산나트륨 버퍼(pH 6.0)에서 1;1 몰 비율로HSA-PEG4-DBCO와 혼합시키고 최종 단백질 농도가 10 mg/mL이 되도록 농축시켰다. 실온에서 7시간 동안 반응시킨 다음, 혼합물을 2단계 칼럼 크로마토그래피를 진행하였다. 2단계 칼럼 크로마토그래피는 반응하지 않고 남은 HSA-PEG4-DBCO를 제거하기 위한 양이온 교환 칼럼(HiTrap SP-HP)를 먼저 진행한 다음, 반응하지 않고 남은 Uox-W160.174AzF를 제거하기 위한 음이온 교환 칼럼(UNO Q1)을 진행하였으며, NaCl gradient를 적용하여 용출하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE로 분석하거나 사이즈-배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography, Superdex 200 10/300 GL)을 진행하였다.
Uox
-
HSA
효소 활성측정
Uox-WT와 Uox-HSA의 kinetic 상수를 결정하기 위하여 분광분석방법을 사용하였다[46]. 60 nM의 Uox-WT 또는 Uox-HSA를 다양한 농도의 요산(uric acid)과 200 ㎕의 분석용 버퍼(50 mM sodium borate pH 9.5, 0.2 M NaCl)에서 반응시켰다. 요산이 5-hydroxyisourate로 전환되는 것에 기인하는 293 nm에서의 환원을 SynergyTM four multimode microplate reader(BioTek, Winooski, VT)을 사용하여 분석하였다. 요산의 소비비율(consumption rate, nmol/min) 값은 OD 변화값(min-1)의 비율을 요산의 몰 흡광계수(12,300 M-1cm-1)와 path 길이(0.56 cm)로 나눈 다음, 여기에 분석버퍼 부피(2.0× 105 nL)를 곱함으로써 얻을 수 있었다. 각 기질 농도에서의 평균 소비비율을 일반적인 MichaelisMenten 커브에 적용하여 Vmax 및 Km 값을 얻을 수 있었다.
혈액 내에서 효소의 활성을 측정하기 위하여, 10 ㎕ 혈청을 100 요산을 포함하고 있는 190 ㎕ 분석용 버퍼와 혼합한 다음, 상기 방법과 같이 분석하였다. 효소의 활성은 요산의 소비비율 값을 혈청의 부피값으로 나눈 값으로 나타내었으며(mU/mL), 여기서 mU는 실온에서 1분당 1 nM 요산의 산화반응을 촉매할 수 있는 효소의 양으로 정의하였다.
생체 내에서의 효소 활성 분석
생체 내에서의 Uox-WT와 Uox-HSA의 효소 활성을 분석하기 위하여, 각각의 단백질을 200 ㎕의 PBS에 5.7 nM 농도로 맞추어서 어린 암컷 C57BL/6 마우스(n = 4)의 꼬리 정맥에 주사하였다. Uox-WT의 경우, 주사 후 0.5, 1, 2 및 4 시간 후 혈액샘플을 채취하였으며, Uox-HSA의 경우 주사 후 0.5, 1, 2, 4, 8, 12 및 24 시간 후 혈액샘플을 채취하여 분석하였다.
실험결과
위치 특이적으로 두 곳의 위치에
AzF
가 포함된
Uox
의 제작
Uox에 HSA를 연결시키기 위한 링커로 DBCO-PEG4-MAL을 사용하였다. DBCO-PEG4-MAL은 이형의 서로 다른 기능을 가지고 있는 친수성 링커로서, DBCO(Dibenzocyclooctyne)는 strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) 반응을 통해 아지드 작용기(azide functional group)에 화학 선택적으로 연결될 수 있다. 한편, p-azido-L-phenylalanine(AzF)는 아지드기(azide group)를 포함하고 있는 비천연 아미노산(Non natural amino acid, NNAA)이다. 따라서 Uox의 특정 위치에 AzF가 포함되도록 유전공학적으로 조작하면, Uox가 DBCO에 대해 반응하도록 만들 수 있다(도 1).
Uox에 AzF를 포함시키더라도 본래 Uox의 구조와 기능에 가능한 영향을 미치지 않아야 하므로, 최적의 위치를 결정하기 위하여, AzF와 구조적으로 유사한 방향족 아미노산(Phe, Trp, Tyr)을 잠정적인 타겟으로 선택하였다. 천연형 Uox에는 10개의 페닐알라닌, 7개의 트립토판, 10개의 타이로신이 있었다. 또한, 높은 용매접근성을 가지고 있는 위치가 AzF를 포함시키기에 더 적합하였는데, 왜냐하면 링커인 DBCO와와의 충돌 가능성이 높아질수록 컨쥬게이션이 더 효율적으로 이루어질 수 있기 때문이었다. 10개의 페닐알라닌, 7개의 트립토판, 10개의 타이로신 대해 용매 접근성을 ASA-View server[61]을 이용하여 분석한 결과, 네 개의 위치(W160, W174, F258, W264)가 상대적으로 높은 용매 접근성을 나타내었다(도 2). 이 중에서 F258과 W264는 위치상 Uox 서브유닛의 멀티 복합체형성에 영향을 미칠 수 있는 곳에 위치하였기 때문에 배제하였고, 결과적으로 각각 0.46 및 0.62의 용매 접근성을 나타낸 W160과 W174를 AzF를 포함시키기 위한 위치로 선택하였다. W160 과 W174의 경우, 이전까지 Uox의 구조/기능에서 중요한 역할을 한다는 것이 보고된 바가 없었기 때문에 더욱 적합한 위치라고 판단하였다.
Uox는 4합체(teteramer)를 이루어 작용하는데, Uox 단일체(monomer) 당 두 개의 AzF가 포함되기 때문에, 결과적으로 4합체인 Uox(tetrameric Uox)에 총 8개의 AzF가 포함되었다.
Uox내 두 개의 위치에 AzF가 정확히 포함되었는지를 확인하기 위하여, Uox-W160.174AzF을 트립신으로 분해(tryptic digestion)한 후, MALDI-TOF로 분석하였다(도 3). 대조군으로 Uox-WT를 사용하였다. Uox-WT의 경우, W160 및 W174, 두 곳에서 트립신에 의해 분해된 것을 확인할 수 있었다. W160을 X로 표시하였으며, W174를 Y로 표시하였다. 분석 결과 X의 경우, 1342.8 m/z(이론값 m/z = 1342.7), Y의 경우, 706.3 m/z(이론값 m/z = 706.3)로 나와 이론적으로 계산한 값과 동일한 값을 얻을 수 있었다. 한편, Uox-WT의 트립토판(204.2 Da)을 AzF (206.2 Da)로 대체할 경우, 이론적으로는 m/z 값이 2만큼 변화할 것으로 기대되었다. 즉, X의 경우 1344.7 m/z가, Y의 경우 708.3 m/z 값이 나올 것으로 기대하였다. 그러나 각각의 경우 모두 예상보다 낮은 m/z 값을 나타내었다(X: 1318.4 m/z, Y: 682.1 m/z).
이러한 결과가 MALDI-TOF 분석과정에서 Uox-W160.174AzF의 단편화(fragmentation)에 의한 것인지 아니면 세포 배양과정에서 AzF의 대사로 인한 전환(metabolic conversion) 때문인지를 확인하고자 하였다. 이를 위하여, Uox-W160.174AzF를 DBCO-기능화 폴리머인 DBCO-PEG4-palmitic acid와 반응시켰다. Uox-W160.174AzF의 AzF가 대사로 전환된 것이 아니라면 DBCO-PEG4-palmitic와 반응하여 SPAAC에 의해 연결될 것이기 때문에, 이를 통해 AzF의 대사전환여부를 확인할 수 있었다. 확인결과 X의 경우, 2482.5 m/z, Y의 경우 1846.6 m/z가 나왔다. 이론적으로 DBCO-PEG4-palmitic이 연결될 경우, X는 2483.0 m/z, Y는 1846.7 m/z가 나와야 하므로, 이러한 결과는 AzF가 DBCO-PEG4-palmitic과 반응하여 연결되었다는 것을 나타내는 것이었다. 따라서 이와 같은 결과를 통해 AzF가 대산전환된 것이 아니며, 상기 Uox-W160.174AzF의 MALDI-TOF 분석결과는 단편화로 인한 것이라는 것을 알 수 있었다.
한편, Uox-W160.174AzF의 높은 SPACC 반응성을 dye-labeling에 의해 시각화할 수 있었다. DBCO-PEG4-carboxyrhodamine(880.9 Da)을 각각 Uox-WT 또는 Uox-W160.174AzF와 반응시킨 다음, 젤(gel)에서의 이동 및 형광반응을 분석하였다. Uox-WT는 형광을 나타내지 않은 반면, Uox-W160.174AzF는 높은 형광을 나타내었으며 Uox-WT에 비해 이동속도가 느렸다(도 4). 이러한 결과는 Uox-WT는 DBCO-PEG4-carboxyrhodamine와 반응을 하지 않은 반면, Uox-W160.174AzF는 포함하고 있는 AzF가 하나 또는 두 개의 위치에서 DBCO-PEG4-carboxyrhodamine와 반응하였기 때문에 나타난 것이다.
Uox
-
W160
.174
AzF
의 이차구조 분석
Uox에 AzF 가 포함되는 것에 의해 어떤 구조적인 변화가 있었는지를 확인하고자 Circular dichroism spectroscopy(CD)를 수행하였다. CD는 타겟 단백질의 이차구조의 변화를 연구하는데 있어 효과적으로 사용되는 방법이다[53,66]. Uox-WT와 Uox-W160.174AzF에 대한 CD를 수행하여 Uox-WT와 Uox-W160.174AzF의 이차구조를 비교하였다. 분석결과, Uox-W160.174AzF의 CD spectrum은 Uox-WT와 큰 차이를 나타내지 않았다(도 5). 또한, Uox-WT와 Uox-W160.174AzF의 이차구조 구성요소를 분석한 결과, 두 단백질 사이에는 거의 차이가 없었다(표 1).
| α- helix | β- sheet | β- turn | unordered | |
| Uox - WT | 0.557 | 0.093 | 0.124 | 0.237 |
| Uox - W160 .174 AzF | 0.549 | 0.097 | 0.126 | 0.227 |
이러한 결과는 Uox에 이중으로 AzF를 포함시키더라도 이차구조에는 영향이 없다는 것을 보여주는 것이다.
Uox
-
HSA
제작
Uox-HSA 제작하기 위한 링커로 이중기능성 링커인 DBCO-PEG4-MAL을 이용하였다. HSA의 Cystein 34(C34) 위치에 DBCO-PEG4-MAL을 티올과 말레인이미드 사이의 마이클첨가(Michael addition)를 통해 연결하여 HSA-PEG4-DBCO를 만들었다. HSA의 34번 위치의 시스테인(Cysteine, C34)은 유일하게 자유로운 시스테인이며 FcRn-결합 도메인으로부터 떨어져 위치하고 있기 때문에 티올-말레인이미드 교차결합(thiol-maleimide crosslinking)에 이용될 수 있었다(도 1) [59,60].
Uox에 위치 특이적으로 HSA를 연결하기기 위하여 strain-promoted azide-alkyne cycloaddition(SPAAC)을 이용하였다. SPAAC는 구리이온이 없는 조건에서 strain-promoted 싸이클로옥탄그룹이 아자이드(azide) 그룹과 결합되는 클릭화학반응이다.
Uox-W160.174AzF와 HSA-PEG4-DBCO를 혼합하여 반응시킨 다음, 정제하여 Uox-HSA를 얻을 수 있었다. SDS-PAGE로 분석한 결과, 150 kDa 사이즈의 새로운 밴드가 생긴 것을 확인할 수 있었다(도 6).
Uox
-
HSA
의 활성분석
HSA 컨쥬게이션(HSA conjugation)이 Uox 효소의 활성에 미친 영향을 Michaelis-Menten kinetics에 의해 분석하였다. 기질인 요산의 농도를 다양하게 달리하면서 Uox-HSA와 Uox-WT의 반응속도(reaction rate)를 측정하였고(도 7), Vmax 값과 Km 값을 계산하였다(표 2).
|
V
max
( nmo / min ) |
K
m
(μM) |
|
| Uox - WT | 1.74 ± 0.18 | 164.6 ± 35.2 |
| Uox - HSA | 1.76 ± 0.16 | 125.5 ± 25.6 |
분석결과, Uox-HSA의 Vmax 값은 Uox-WT의 Vmax 값과 거의 차이가 없었다. Uox-HSA의 Km 값은 Uox-WT의 Km 값보다 낮게 나왔지만 표준편차를 고려했을 때 의미가 있을 정도의 차이는 아니었다. 이러한 결과는 HSA 컨쥬게이션(HSA conjugation)이 Uox 효소의 활성에 거의 영향을 미치지 않으며, Uox-HSA의 활성이 HSA와 관계없이 유지되고 있다는 것을 보여주는 것이다.
생체 내
Uox
-
HSA
의 활성분석
알부미내이션(albumination)의 약물학적인 효능을 생체 내에서 확인하기 위하여, Uox-WT 또는 Uox-HSA를 각각 마우스에 정맥 주사한 다음, 요산 분해활성 분석(uric acid-degradation assay)방법으로 Uox 효소의 활성을 분석하였다. 혈액샘플을 시간대별로 채취하여 혈청 내에 존재하는 Uox-WT 또는 Uox-HSA의 활성을 분석하여 반감기를 계산하였는데, Uox-WT는 0.5, 1 2, 4시간대별로, Uox-HSA는 0.5, 1 2, 4, 8, 12, 24시간대별로 샘플을 채취하여 분석하였다(도 8). 분석결과, Uox-WT의 반감기(t1 /2)는 1.3시간이었으며, Uox-HSA의 반감기(t1 /2)는 8.8시간이었다. 즉, 혈청 내에서 Uox-HSA의 반감기가 Uox-WT에 비해 6.8배 정도 연장되었다는 것을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
참고문헌
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<130> PN150063
<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 927
<212> DNA
<213> Aspergillus flavus_Uox
<400> 1
atgtctgctg tgaaggccgc aagatatggc aaggataatg tgagggtgta caaggtgcat 60
aaggacgaaa agactggcgt gcagacagtg tacgagatga ccgtgtgcgt cctgctggag 120
ggcgaaatcg agacttctta taccaaagcc gacaactccg tgattgtggc cacagattct 180
atcaagaaca ctatctatat caccgccaaa cagaacccag tgacaccacc tgaactgttc 240
ggcagcattc tcggcacaca ctttattgag aagtacaacc acatccatgc tgcacacgtg 300
aatatcgtgt gtcatcgctg gacccgcatg gacatcgacg gaaagccaca cccccactct 360
tttatcagag actctgaaga aaagagaaac gtgcaggtcg acgtggtgga gggaaaaggt 420
atcgacatca agagctcact ctccggcctg accgtgctga agagtaccaa ttcacagttt 480
tgggggtttc tgagagacga atacactaca ctgaaggaga cttgggatag aatcctgagt 540
accgacgtgg atgcaacctg gcagtggaag aatttttccg ggctgcagga agtgcggtcc 600
cacgtgccca agtttgatgc aacctgggca accgcaaggg aggtgacact gaaaaccttt 660
gccgaggaca actccgctag cgtgcaggcc acaatgtaca agatggccga acagatcctg 720
gccagacagc agctgattga gactgtggag tactctctgc ctaacaagca ctatttcgaa 780
atcgacctgt cctggcacaa gggactgcag aatactggta aaaacgcaga ggtgttcgcc 840
cctcagagtg atcccaatgg tctgatcaaa tgcacagtgg ggagatcctc tctgaagagc 900
aagctgcacc atcaccatca ccattaa 927
Claims (13)
- 다음을 포함하는 요산 산화효소와 알부민의 융합 단백질:
(a) 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 요산 산화효소의 8번째 타이로신(tyrosine), 16번째 타이로신, 30번째 타이로신, 46번째 타이로신, 65번째 타이로신, 79번째 페닐알라닌(phenylalanine), 87번째 페닐알라닌, 91번째 타이로신, 106번째 트립토판, 120번째 페닐알라닌, 159번째 페닐알라닌, 160번째 트립토판, 162번째 페닐알라닌, 167번째 타이로신, 174번째 트립토판, 186번째 트립토판, 188번째 트립토판, 191번째 페닐알라닌, 204번째 페닐알라닌, 208번째 트립토판, 219번째 페닐알라닌, 233번째 타이로신, 251번째 타이로신, 258번째 타이로신, 259번째 페닐알라닌, 265번째 트립토판 및 279번째 페닐알라닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기가 비천연 아미노산인 p-Azido-L-phenylalanine(AzF), p-ethynyl-phenylalanine(pEthF), 또는 p-propargyloxyphenylalanine(pPa)로 대체된 요산 산화효소(urate oxidase); 및
(b) 상기 요산 산화효소에서 비천연 아미노산으로 대체된 위치에 링커를 통하여 컨쥬게이션(conjugation)된 알부민으로서 상기 링커는 상기 알부민의 34번째 시스테인(Cystein) 아미노산 잔기에 결합하는 것을 특징으로 한다.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 아미노산 잔기는 160번째 트립토판, 174번째 트립토판 또는 160번째 트립토판과 174번째 트립토판인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 다음의 단계를 포함하는 알부민을 링커를 통하여 요산 산화효소(urate oxidase)에 컨쥬게이션(conjugation)하는 방법.
(a) 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 요산 산화효소의 8번째 타이로신(tyrosine), 16번째 타이로신, 30번째 타이로신, 46번째 타이로신, 65번째 타이로신, 79번째 페닐알라닌(phenylalanine), 87번째 페닐알라닌, 91번째 타이로신, 106번째 트립토판, 120번째 페닐알라닌, 159번째 페닐알라닌, 160번째 트립토판, 162번째 페닐알라닌, 167번째 타이로신, 174번째 트립토판, 186번째 트립토판, 188번째 트립토판, 191번째 페닐알라닌, 204번째 페닐알라닌, 208번째 트립토판, 219번째 페닐알라닌, 233번째 타이로신, 251번째 타이로신, 258번째 타이로신, 259번째 페닐알라닌, 265번째 트립토판 및 279번째 페닐알라닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기를 비천연 아미노산인 p-Azido-L-phenylalanine(AzF), p-ethynyl-phenylalanine(pEthF), 또는 p-propargyloxyphenylalanine(pPa)로 대체하는 단계; 및
(b) 링커를 통하여 알부민을 상기 비천연 아미노산에 컨쥬게이션하는 단계로서 상기 링커는 상기 알부민의 34번째 시스테인(Cystein) 아미노산 잔기에 결합하는 것을 특징으로 한다.
- 제 10 항에 있어서, 상기 아미노산 잔기는 160번째 트립토판, 174번째 트립토판 또는 160번째 트립토판과 174번째 트립토판인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 10 항에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 p-Azido-L-phenylalanine(AzF)인 것을 특징으로 하는 방법.
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