CZ2007695A3 - Variantní formy urátoxidázy a jejich použití - Google Patents

Abstract

Rešení se týká geneticky modifikovaných proteinu s urikolytickou aktivitou. Konkrétne se též týká proteinu zahrnujících zkrácené urátoxidázy a zpusobu jejich prípravy, vcetne PEGylovaných proteinu zahrnujících urátoxidázy.

Description

1 ·· ···· 4 1 ·· ···· 4 Ή

Variantní formy urátoxidázy a jejich použití Oblast techniky Předkládaný vynález se týká geneticky modifikovaných proteinů s urikolytickou aktivitou. Konkrétně se vynález týká proteinů zahrnujících zkrácené urátoxidázy a způsobů jejich přípravy.

Dosavadní stav techniky Výrazy urátoxidáza a urikáza se zde používají zaměnitelně. Urátoxidázy (urikázy, E.C. 1.7.3.3) jsou enzymy, které katalyzují oxidaci kyseliny močové na rozpustnější produkt alantoin, což je purinový metabolit, který je snadněji vylučován. Kvůli několika mutacím v genu pro urikázu, získaným během evoluce vyšších primátů, lidé enzymově aktivní urikázu neprodukují, Wu, X et al., (1992) J.Mol.Evol 34:78-84, úplné znění je zde začleněno formou odkazu. V důsledku toho mohou nadměrné koncentrace kyseliny močové v krvi (hyperurikémie) vést u náchylných jedinců k bolestivé artritidě (dna), znetvořujícímu ukládání urátu (tofus) a selhání ledvin. Dostupné léky, např. allopurinol (inhibitor syntézy kyseliny močové) u některých postižených jedinců vyvolávají vedlejší účinky, které léčbu limitují, nebo dostatečně tyto chorobné stavy nezmírňují. Hande, KR et al:, (1984) Am.J.Med 76:4756, Fam, AG, (1990) Bailliere's Clin Rheumatol 4:177-192, úplné znění obou prací je zde začleněno formou odkazu. Injekce urikázy mohou hyperurikémii a hyperurikosurii alespoň přechodně snížit. Jelikož urikáza je pro člověka cizí protein, již první injekce nemodifikovaného proteinu z Aspergillus flavus vyvolala u několika procent léčených pacientů anafylaktické reakce (Pui, C-H et al., (1997) Leukemia 11:1813-1816, úplné znění je zde začleněno formou odkazu), a imunologické odpovědi její využitelnost pro chronickou nebo periodickou léčbu limitují. Donadio, D et al., (1981) Noův Presse Med 10:711-712, Leaustic, M et al., (1983) Rev Rhum Mal Osteoartic 50:553-554, úplné znění obou prací je zde začleněno formou odkazu.

Již několik desetiletí se připouští skutečnost, že dostupná léčba hyperurikémie není zcela optimální. Kissel, P et al., (1968) Nátuře 217:72-74, úplné znění je zde začleněno formou odkazu. Podobně se po mnoho let připouští možnost, že určitým skupinám pacientů s těžkou dnou by mohla pomoci bezpečná a účinná forma injikovatelné urikázy. Davis, FF et al., (1978) in GB Broun et al., (Eds.) Enzyme Engineering, Vol. 4 (pp. 169-173) New York,

Plenům Press, Nishimura, H et al., (1979) Enzyme 24:261-264, Nishimura, H et al., (1981) Enzyme 26:49-53, Davis, S et al., (1981) Lancet 2(8241):281-283, Abuchowski, A et al. (1981) J Pharmacol Exp Ther 219:352-3 54, Chen, RH-L et al. (1981) Biochim Biophys Acta 660:293-298, Chua, CC et al., (1988) Ann Int Med 109:114-117, Greenberg, ML et al., (1989) Anal Biochem 176:290-293, úplné znění těchto prací je zde začleněno formou odkazu. Urikázy odvozené ze zvířecích orgánů jsou v rozpouštědlech kompatibilních s bezpečným podáváním injekcí téměř nerozpustné. U.S. patent č. 3 616 231, v plném znění zde začleněn ve formě odkazu. V medicínsky přijatelných rozpouštědlech jsou rozpustnější určité urikázy odvozené z rostlin nebo z mikroorganismů. Injekce mikrobiálních enzymů však vyvolávají rychlé imunologické odpovědi, které mohou vést k životně nebezpečným alergickým reakcím nebo k inaktivaci a/nebo urychlení clearence urikázy z oběhu. Donadio et al., (1981), Leaustic et al., (1983). Kvůli problémům s imunogenitou a nerozpustností při fyziologickém pH nejsou vhodnými kandidáty pro klinické použití enzymy založené na aminokyselinových sekvencích odvozených z urikáz savců, včetně prasat a paviánů, nebo hmyzu, například Drosophila melanogaster nebo Drosophila pseudoobscura (Wallrath, LL et al., (1990) Mol Cell Biol 10:5114-5127, úplné znění je zde začleněno formou odkazu). Dříve se pro in vivo katalýzu konverze kyseliny močové na alantoin používala injekčně vpravená urikáza, viz Pui et al., (1997). Na této bázi se ve Francii a Itálii pro prevenci nebo dočasnou nápravu hyperurikémie spojené s cytotoxickou terapií hematologických malignancí a k přechodnému zlepšení těžké hyperurikémie u pacientů s dnou používá urikáza z houby Aspergillus flavus (Uricozyme©). Potaux, L et al., (1975) Noův Presse Med 4:1109-1112, Legoux, R et al., (1992) J.Biol.Chem 267:8565-8570, U.S. patenty 53 82 518 a 5 541 098, úplné znění obou je zde začleněno formou odkazu. Kvůli krátké životnosti v oběhu vyžaduje Uricozyme® denní injekce. Navíc kvůli své imunogenitě není dost vhodný pro dlouhodobou léčbu. Některé urikázy jsou použitelné pro přípravu konjugátů s polyethylenglykolem nebo polyethylenoxidem (oba označené jako PEG) pro výrobu terapeuticky účinných forem urikázy s prodlouženým poločasem proteinu a sníženou imunogenitou, viz U.S. patenty 4 179 337, 4 766 106, 4 847 325 a 6 576 235, U.S. patentová přihláška publikace US2003/0082786A1, úplné znění prací je zde začleněno formou odkazu. Byly popsány i konjugáty urikázy s polymery jinými než PEG, viz U.S. patent 4 460 683, úplné zněm je zde začleněno formou odkazu. V téměř všech popsaných pokusech o PEGylování urikázy (tzn. kovalentní navázání PEG na urikázu), je PEG připojen primárně na aminoskupiny, včetně zbytku na aminovém ··«· λ 3 konci a dostupných lysinových zbytků. V běžně používaných urikázách je celkový počet lyzinů v každé ze čtyř identických jednotek v rozmezí 25 (Aspergillus flavus, U.S. patent 5 382 518, úplné znění je zde začleněno formou odkazu) a 29 (Wu, X et al., (1989) Proč Nati Acad Sci USA 86:9412-9416, úplné zněm je zde začleněno formou odkazu). Některé z lyzinů jsou pro PEGylaci v nativní konformaci enzymu nedostupné. Nejběžnější přístup ke snížení imunogenity urikázy je spojovém velkého počtu vláken PEG s nízkou molekulovou hmotností. To má vždy za následek velký pokles v enzymové aktivitě výsledných konjugátů. U pěti lidských subjektů, u nichž průměrná koncentrace sérových urátů před injekcí byla 6,2 mg/dl, tedy v normálním rozsahu, snížila jediná intravenózní injekce přípravku obsahujícího urikázu z Candida utilis káplo vanou s 5kDa PEG sérový urát na nedetekovatelnou úroveň, viz Davis et al. (1981). O čtyři týdny později byla subjektům podána další injekce, ale jejich odezvy nebyly udány. S použitím relativně málo citlivého gelového difuzního testu nebyly po druhé (a poslední) injekci žádné protilátky na urikázu detekovány. Tento odkaz neuvádí žádné výsledky z léčby chronických nebo subchronických lidských pacientů nebo experimentálních zvířat. U jednoho pacienta s lymfomem, u kterého byla koncentrace sérového urátu před injekcí 15 mg/dl, byl k dočasné kontrole hyperurikémie použit přípravek obsahující urikázu z Arthrobacter protoformiae kaplovanou s 5kDa PEG, viz Chua et al., (1988). Kvůli kritickému stavu pacienta a krátkému trvám léčby (čtyři injekce během 14 dní) není možné vyhodnotit dlouhodobou účinnost ani bezpečnost konjugátu.

Vylepšená ochrana před rozpoznáním imunitním systémem je umožněna modifikováním všech podjednotek urikázy 2 až 10 vlákny PEG s vysokou molekulovou hmotností (>5 kDa - 120 kDa), viz Saifer et al., (U.S. patent 6 576 235, (1994), Adv. Exp.Med. Biol 366:377-387, v plném znění jsou zde začleněny formou odkazu). Tato strategie umožnila retenci > 75 % enzymové aktivity urikázy z různých druhů, PEGylace zvýšila životnost urikázy v oběhu a umožnila opakované injekce enzymu u myší a králíků bez vyvolání protilátek.

Hershfield a Kelly, viz mezinárodní patentová publikace WO 00/08196, U.S. přihláška č. 60/095 489, jejichž plné znění je zde začleněno formou odkazu, vyvinuli způsob pro poskytnutí proteinů rekombinantní savčí urikázy s optimálním počtem míst PEGylace. PCR technika byla použita ke zvýšení počtu dostupných lyzinových zbytků na vybraných bodech enzymu, který je navržen tak, aby umožnil snížené rozpoznávám imunitním systémem po následné PEGylaci, zatímco v podstatě zachovává enzymovou urikolytickou aktivitu. Některé z urikázových proteinů jsou zkrácené na karboxylovém a/nebo aminovém konci. Žádné další řízené specifické geneticky-indukované alterace v proteinu autoři neuvádějí. V této přihlášce se výraz "imunogenita" týká vyvolám imunitní odezvy injekčně vpraveným přípravkem obsahujícím PEG-modifikovanou nebo nemodifikovanou urikázu (antigen), zatímco "antigenita" se týká reakce antigenu s předem existujícími protilátkami. Souhrnně se antigenita a imunogenita označují jako "imunoreaktivita." V předchozích studiích s PEG-urikázou se imunoreaktivita stanovovala různými metodami, včetně: 1) reakce in vitro PEG-urikázy s předem vytvořenými protilátkami, 2) měření syntézy indukovaných protilátek, 3) zvýšená rychlost clearence po opakovaných injekcích. Dřívější pokusy eliminovat imunogenitu urikázy z různých zdrojů kaplingem různých počtů vláken PEG pomocí různých linkerů byly pouze omezeně úspěšné. Poprvé byly PEG-urikázy popsány FF Davisem a Y Inadou a jejich kolegy, viz Davis et al., (1978), U.S. patent 4 179 337, Nishimura et al., (1979), japonské patenty 55-99189 a 62-55079, jejich úplné znění je zde začleněno formou odkazu. Konjugát popsaný v U.S. patentu 4 179 337 byl syntetizován reakcí urikázy nespecifikovaného původu s 2 000 násobným molámím nadbytkem PEG 750 Da, což indikuje, že ke každé podjednotce urikázy může být připojeno velké množství molekul polymeru. U.S. patent 4 179 337 popisuje napojování buď PEG nebo polypropylenglykolu o molekulové hmotnosti 500 až 20 000 Da, výhodně 500 až 5 000 Da, za vzniku aktivních, ve vodě rozpustných, neimunogenních konjugátů různých polypeptidových hormonů a enzymů včetně oxidoreduktáz, z nichž urikáza je jedním ze tří příkladů. Kromě toho U.S. patent 4 179 337 zdůrazňuje napojování 10 až 100 polymemích vláken na molekulu enzymu, a zachování nejméně 40 % enzymové aktivity. Žádné výsledky testů rozšířených na spojování PEG s dostupnými aminoskupinami urikáz, reziduální specifickou urikolytickou aktivitu nebo imunoreaktivitu konjugátu uvedeny nebyly. V předchozích publikacích byly in vitro naměřené významné poklesy v urikolytické aktivitě způsobené kaplingem různého počtu vláken PEG na urikázu z Candida utilis. Kapling velkého počtu vláken 5kDa PEG na urikázu z prasečích jater poskytl podobné výsledky, jak je uvedeno v publikaci i v sympoziálním příspěvku, viz Chen et al., (1981), Davis et al., (1978). V sedmi předchozích studiích bylo popsáno snížení imunoreaktivity urikázy PEGylací, v pěti dalších studiích bylo popsáno její odstranění. Ve třech z těchto pěti studií je odstranění imunoreaktivity spojené s významným poklesem v urikolytické aktivitě - na 15,28 nebo 45 % počáteční aktivity, viz Nishimura et al., (1979 (15% aktivita), Chen et al., (1981 (28% aktivita) a Nishimura et al., (1981 (45% aktivita). Ve čtvrté zprávě je PEG kaplován na 61 % dostupných lysinových zbytků, ale reziduální specifická aktivita uvedena není, viz

Abuchowski et al., (1981). Avšak vědecký tým, mezi jehož členy patřili i dva vědci z této skupiny, při použití stejných metod popsal, že takovýto rozsah kaplingu vedl k zachování pouze 23 až 28 % reziduální aktivity, viz Chen et al., (1981). Publikace Abuchowski et al., (1981) a Chen et al. (1981) naznačují, že pro podstatnou redukci imunogenity urikázy musí být PEG kaplován na 60 % dostupných lysinových zbytků. Pátá publikace, která uvádí, že imunoreaktivita urikázy byla odstraněna, nepopisuje rozsah kaplingu PEG, ani reziduální urikolytickou aktivitu nebo povahu vazby PEG-protein, viz Veronese, FM et al., (1997) v Chemie polyethylenglykolu a biologické aplikace, ACS Symposium Série 680 (str. 182-192) JM Harris et al., (Eds.), Washington, DC, Americká chemická společnost, úplné znění je zde začleněno formou odkazu. U experimentálních zvířat konjugace PEG na menší frakci lyzinových zbytků v urikáze její imunoreaktivitu redukovala, ale neodstranila, viz Tsuji, J. et al., (1985), Int. J. Immunopharmacol. 7:725-730, (kaplováno 28 až 45 % aminoskupin), Yasuda, Y. et al., (1990) Chem Pharm Bull 38:2053-2056, (kaplováno 38 % aminoskupin), úplné znění obou prací je zde začleněno formou odkazu. Reziduální urikolytické aktivity odpovídajících aduktů byly v rozmezí < 33 % (Tsuji et al.) až 60 % (Yasuda et al.) jejich počátečních hodnot. Tsuji et al. kromě 5kDa PEG syntetizoval konjugáty PEG-urikáza s 7,5kDa a lOkDa PEG. Všechny výsledné konjugáty jsou do určité míry imunogenní a antigenní, přičemž vykazují znatelně snížené enzymové aktivity. U PEGylovaného přípravku obsahujícího urikázu z Candida utilis, který byl dvakrát bezpečně podán pěti lidem, je popsáno uchování pouze 11 % počáteční aktivity, viz Davis et al., (1981). O několik let později byla PEG-modifikovaná urikáza z Arthrobacter protoformiae podána čtyřikrát jednomu pacientu s pokročilým lymfomem a vážnou hyperurikémií, viz Chua et al., (1988). Zatímco reziduální aktivita enzymového přípravku měřená nebyla, Chua et al. prokázal nepřítomnost anti-urikázových protilátek v pacientově séru 26 dní po první injekci PEG-urikázy, s použitím metody ELISA (z angl. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). Předchozí studie PEGylované urikázy ukazují, že katalytická aktivita je výrazně potlačená kaplingem dostatečného počtu vláken PEG pro podstatné snížení její imunoreaktivity. Většina předchozích přípravků s PEG-urikázou se syntetizuje s použitím PEG aktivovaného kyanurchloridem, triazinovým derivátem (2,4,6-trichlor-l,3,5-triazin), u kterého bylo popsáno, že zavádí nové antigenní determinanty a indukuje vznik protilátek u králíků, viz Tsuji et al., (1985). • · · · • · ··· ·

Japonský patent č. 3-148298, jehož autorem je A Sáno et al. a jehož úplné znění je zde začleněno formou odkazu, popisuje modifikované proteiny včetně urikáz, derivatizované PEGem s molekulovou hmotností 1-12 kDa, které vykazují sníženou antigenitu a "vylepšené prodloužené" působení, a způsoby přípravy takových derivatizovaných peptidů. Nepopisují se však počty vláken, enzymové testy, biologické testy nebo význam "vylepšené prodloužené". Japonské patenty 55-99189 a 62-55079, jejichž autorem je Y Inada a jejichž úplné zněm je zde začleněno formou odkazu, popisují konjugáty urikáz připravené s PEG-triazinem nebo bis-PEG-triazinem (označené jako PEG2), viz Nishimura et al., (1979 a 1981). U prvního typu konjugátu jsou molekulové hmotnosti PEG 2 kDa a 5 kDa, u druhého typu se použil pouze 5kDa PEG. Nishimura et al., (1979) popisuje opětovné získám 15 % urikolytické aktivity po modifikaci 43 % dostupných lyzinů lineárním 5kDa PEG, zatímco Nishimura et al., (1981) popisuje opětovné získám 31 % nebo 45 % urikolytické aktivity po modifikaci 46 % nebo 36 % lyzinů, PEG2.

Drive studované urikázové proteiny byly buď přirozené, nebo rekombinantní proteiny. Avšak studie s použitím SDS-PAGE a/nebo Western technik ukázaly přítomnost nečekaných peptidů s nízkou molekulovou hmotností, které se zdají být produkty degradace a jejichž frekvence s časem narůstá. Předkládaný vynález se týká mutantních rekombinantních urikázových proteinů, které jsou zkrácené a mají zvýšenou strukturální stabilitu.

Podstata vynálezu Předkládaný vynález poskytuje nové rekombinantní urikázové proteiny. V jednom provedení jsou proteiny podle předkládaného vynálezu zkrácené a mají mutované aminokyseliny ve srovnám s přirozeně se vyskytujícími urikázovými proteiny. V konkrétních provedeních jsou mutace přímo nebo v okolí oblastí aminokyselin v poloze 7, 46, 291 a 301. Součástí vynálezu jsou také konzervativní mutace kdekoliv v peptidů.

Vynález poskytuje mutantní rekombinantní urikázu, která byla zkrácená o 1 - 20 aminokyselin a zachovává si urikolytickou aktivitu přirozeně se vyskytující urikázy. Zkrácení jsou přímo nebo v okolí konce sekvence takže protein může obsahovat koncové aminokyseliny. Tyto mutace a tato zkrácení mohou zvýšit stabilitu proteinu obsahujícího tyto mutace. V dalším provedení předkládaný vynález poskytuje prostředek pro metabolizaci kyseliny močové, kde je zahrnut nový rekombinantní urikázový protein s urikolytickou aktivitou. Urikolytická aktivita se zde používá v souvislosti s označením enzymové konverze kyseliny močové na alantoin.

Vynález dále poskytuje hostitelskou buňku schopnou produkovat urikázu zkrácenou o 1 až 20 aminokyselin, s mutovanými aminokyseliny a zachovanou urikolytickou aktivitou. V jednom provedení se poskytuje izolovaná zkrácená savčí urikáza obsahující aminokyselinovou sekvenci savčí urikázy zkrácenou na aminovém konci nebo na karboxylovém konci nebo na aminovém i na karboxylovém konci o 1 až 13 aminokyselin a dále obsahující substituci aminokyseliny v poloze 46. V konkrétních provedeních urikáza obsahuje na aminovém konci aminokyselinu, kterou je alanin, glycin, prolin, serin nebo threonin. Dále vynález poskytuje urikázu substituovanou v poloze 46 threoninem nebo alaninem. V jednom provedení urikáza obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 8. V dalším provedení je urikáza konjugovaná s polymerem například za vzniku konjugátu polyethylenglykol-urikáza. V jednotlivých provedeních konjugáty polyethylenglykol-urikáza obsahují 2 až 12 molekul polyethylenglykolu na každou podjednotku urikázy, výhodně 3 až 10 molekul polyethylenglykolu na podjednotku urikázy. V konkrétních provedeních má každá molekula polyethylenglykolu v konjugátu polyethylenglykol-urikáza molekulovou hmotnost v rozmezí 1 kDa až 100 kDa, 1 kDa až 50 kDa, 5 kDa až 20 kDa, nebo 10 kDa. Vynález dále poskytuje farmaceutické přípravky obsahující urikázu podle vynálezu, včetně konjugátu polyethylenglykol-urikáza. V dalším provedení je farmaceutický přípravek vhodný pro opakované podávám.

Vynález dále poskytuje způsob snížení hladiny kyseliny močové v biologické tekutině u subjektu s potřebou takové léčby, kdy se podává farmaceutický přípravek obsahující urikázu podle vynálezu. V konkrétním provedení je biologickou tekutinou krev. V jednom provedení urikáza obsahuje peptid se sekvencí v poloze 44 až 56 prasečí KS-ΔΝ (SEQ ID č. 14). V dalším provedení urikázový protein obsahuje N-koncový methionin. V konkrétním provedení urikáza obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 7.

Vynález dále poskytuje izolované nukleové kyseliny obsahující sekvenci nukleových kyselin, která kóduje urikázu podle vynálezu, například urikázu obsahující nebo zahrnující aminokyselinové sekvence SEQ ID č. 7, SEQ ID č. 8, SEQ ID č. 12 nebo SEQ ID č. 13. V dalším provedení je izolovaná nukleová kyselina účinně připojena k heterolognímu promotoru, například promotoru osmB. Vynález dále poskytuje vektory obsahující nukleové kyseliny kódující urikázu a hostitelské buňky, které tyto vektory obsahují. V jednom provedení nukleová kyselina má sekvenci SEQ ID č. 7. Vynález dále poskytuje způsob ·· ·♦ ····

výroby urikázy, kdy se hostitelská buňka kultivuje za takových podmínek, že je urikáza exprimovaná hostitelskou buňkou a exprimovaná urikáza se izoluje.

Stručný popis obrázků

Obrázek 1 zobrazuje strukturu plasmidu pOUR-P-ON-ks-1. Čísla vedle restrikčních míst označují polohu nukleotidu vzhledem k místu Haell, označenému jako 1. Restrikčm místa, která během klonování mizí, jsou uvedena v závorkách.

Obrázek 2 zobrazuje DNA a odvozené aminokyselinové sekvence urikázy prasečí KS-ΔΝ (SEQ ID č. 9 a SEQ ID č. 7). Číslování aminokyselin na Obrázku 2 se vztahuje k úplné sekvenci prasečí urikázy. V sekvenci prasečí urikázy za iniciačním methioninovým zbytkem nahrazuje aspartamovou kyselinu v poloze 7 threonin. Vyznačená jsou restrikčm místa, která se používají pro různé kroky subklonování. 3'-Netranslatované sekvence jsou označené malými písmeny. Hvězdička označuje stop kodon translace.

Obrázek 3 ukazuje relativní uspořádání odvozených aminokyselinových sekvencí různých rekombinantních sekvencí prasečí urikázy (SEQ ID č. 11), PBC-ANC (SEQ ID č. 12) a prasečí KS-ΔΝ (SEQ ID č. 7). Hvězdička označuje polohy, ve kterých jsou rozdíly v aminokyselinách u prasečí KS-ΔΝ ve srovnání s publikovanou sekvencí prasečí urikázy, kroužky označují polohy, ve kterých jsou rozdíly v aminokyselinách u prasečí KS-ΔΝ ve srovnám s PBC-ΔΝ. Čárkovaně jsou vyznačené delece aminokyselin.

Obrázek 4 zobrazuje SDS-PAGE prasečí urikázy a velmi čistých variant urikázy připravených podle příkladů 1 až 3. Pro každý vzorek je vyznačeno datum přípravy (měsíc/rok) a odpovídající číslo pásu, viz následující klíč. Na ose Y je vyznačená molekulová hmotnost pomocí markérů a nahoře na obrázku jsou vyznačená čísla pásů. Pás 1 - markéry molekulové hmotnosti, Pás 2 - prasečí KS-ΔΝ (7/98), Pás 3 - prasečí (9/98), Pás 4 - prasečí KS (6/99), Pás 5 - prasečí KS (6/99), Pás 6 - prasečí-ΔΝ (6/99), Pás 7 - prasečí KS-ΔΝ (7/99), Pás 8 - prasečí KS-ΔΝ (8/99).

Obrázek 5 zobrazuje farmakokinetické profily PEGylované (9x10 kDa) prasečí KS-ΔΝ urikázy na krysách následně po IM (intramuskulámí), SC (podkožní) a IV (intravenózní) injekci, stanovené sledováním enzymové aktivity v krevních vzorcích. Urikázová aktivita ve vzorcích plazmy, odebraných ve vyznačených časových úsecích, je stanovena s pomocí kolorimetrické analýzy. Hodnoty aktivity (mAU = jednotky miliabsorbance) představují rychlost enzymatické reakce v 1 μΐ vzorku plazmy. Biodostupnost (množství léku v oběhu ve srovnání s IV injekcí) IV aplikované urikázy byla spočítaná z plochy pod křivkou v grafu.

Obrázek 6 zobrazuje farmakokinetické profily PEGylované (9x lOkDa) prasečí KS-ΔΝ urikázy u králíků následně po IM (intramuskulámí), SC (podkožní) a IV (intravenózní) injekci, stanovené sledováním enzymové aktivity v krevních vzorcích. Urikázová aktivita ve vzorcích plazmy, odebraných ve vyznačených časových úsecích, je stanovena s pomocí kolorimetrické analýzy. Hodnoty aktivity (mAU = jednotky miliabsorbance) představují rychlost enzymatické reakce v 1 μΐ vzorku plazmy. Biodostupnost (množství léku v oběhu ve srovnání s IV injekcí) IV aplikované urikázy byla spočítaná z plochy pod křivkou v grafu.

Obrázek 7 zobrazuje farmakokinetické profily PEGylované (9xlOkDa) prasečí KS-ΔΝ urikázy u psů následně po IM (intramuskulámí), SC (podkožní) a IV (intravenózní) injekci stanovené sledováním enzymové aktivity v krevních vzorcích. Urikázová aktivita ve vzorcích plazmy, odebraných ve vyznačených časových úsecích, je stanovena s pomocí kolorimetrické analýzy. Hodnoty aktivity (mAU = jednotky miliabsorbance) představují rychlost enzymatické reakce v 1 μΐ vzorku plazmy. Biodostupnost (množství léku v oběhu ve srovnání s IV injekcí) IV aplikované urikázy byla spočítaná z plochy pod křivkou v grafu.

Obrázek 8 zobrazuje farmakokinetické profily PEGylované (9xlOkDa) prasečí KS-AN urikázy u prasat následně po EM (intramuskulámí), SC (podkožní) a IV (intravenózní) injekci stanovené sledováním enzymové aktivity v krevních vzorcích. Urikázová aktivita ve vzorcích plazmy, odebraných ve vyznačených časových úsecích, je stanovena s pomocí kolorimetrické analýzy. Hodnoty aktivity (mAU = jednotky miliabsorbance) představují rychlost enzymatické reakce v 1 μΐ vzorku plazmy. Biodostupnost (množství léku v oběhu ve srovnání s IV injekcí) IV aplikované urikázy byla spočítaná z plochy pod křivkou v grafu.

Detailní popis vynálezu Předchozí studie uvádějí, že pokud je podstatného poklesu imunogenity a/nebo antigenity urikázy dosaženo pomocí PEGylace, je to vždy spojeno se značnou ztrátou urikolytické aktivity. Negativním dopadem bezpečnosti, výhodnosti a rentability bioléčiv je vždy pokles jejich síly a výsledná potřeba zvýšit podávanou dávku. Proto jsou zapotřebí bezpečné účinné alternativní způsoby pro snížení zvýšených hladin kyseliny močové v tělesných tekutinách včetně krve. Předkládaný vynález poskytuje mutantní rekombinantní urikázu zkrácenou o 1 - 20 aminokyselin buď na aminovém konci, nebo na karboxylovém konci, nebo na obou koncích, která si v podstatě zachovává urikolytickou aktivitu přirozeně se vyskytující urikázy.

Pokud není stanoveno jinak, zde používaná urikáza zahrnuje jednotlivé podjednotky i tetramer.

Mutovaná urikáza se zde používá k označení molekul urikázy, jejichž aminokyseliny jsou zaměněné za jiné aminokyseliny.

Konzervativní mutace se zde používá k označení mutace jedné nebo více aminokyselin přímo v dané poloze nebo jejím okolí, která v podstatě nemění vlastnosti proteinu. Ve výhodném provedení má urikáza obsahující nejméně jednu konzervativní mutaci stejnou urikázovou aktivitu, jako má urikáza bez mutace. V jiných provedeních má urikáza obsahující nejméně jednu konzervativní mutaci v podstatě stejnou urikázovou aktivitu, s rozdílem 5 %, 10 % nebo 30 % aktivity urikázy bez takové mutace.

Konzervativní aminokyselinová substituce je definovaná jako změna v aminokyselinovém složení záměnou aminokyselin v peptidu, polypeptidu nebo proteinu, nebo jejich fragmentu. V konkrétních provedeních má urikáza jednu, dvě, tři nebo čtyři konzervativní mutace. Substituce se obecně provádí u aminokyselin s podobnými vlastnostmi (např. kyselé, bazické, aromatické, obdobně veliké, pozitivně nebo negativně nabité, polární, nepolární), aby taková substituce podstatně neměnila vlastnosti peptidu, polypeptidu nebo proteinu (např. náboj, IEF, afinitu, aviditu, konformaci, rozpustnost) nebo jejich aktivitu. Typické konzervativní aminokyselinové substituce lze provádět u následujících skupin aminokyselin: glycin (G), alanin (A), valin (V), leucin (L) a isoleucin (I) kyselina aspartamová (D) a kyselina glutamová (E) alanin (A), serin (S) a threonin (T) histidin (H), lysin (K) a arginin (R) asparagin (N) a glutamin (Q) fenylalanin (F), tyrosin (Y) a tryptofan (W)

Protein s jednou nebo více konzervativními substitucemi si zachovává strukturální stabilitu a může katalýzo vat reakci, i když sekvence jeho DNA není shodná s původním proteinem

Zkrácená urikáza se zde používá k označení molekul urikázy se zkrácenými primárními aminokyselinovými sekvencemi. Mezi možná zkrácení patří zkrácení přímo na nebo v okolí aminového a/nebo karboxylového konce. U specifického typu zkrácení mohou být ultimativní aminokyseliny (na aminovém a/nebo karboxylovém konci) přirozeně se vyskytujícího proteinu ve zkráceném proteinu přítomné. Zkrácení na aminovém konci může začít v poloze 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6. Výhodně zkrácení na aminovém konci začíná v poloze 2, •I ···· •I ···· ····

• · · · · • · · · • · · · · • · · · • ···· ·· * čímž je na aminovém konci ponechán methionin. Tento methionin může být odstraněn při posttranslační modifikaci. V konkrétních provedeních se methionin na aminovém konci odstraní po přípravě urikázy. V konkrétním provedení se methionin odstraní endogenní bakteriální aminopeptidázou.

Ve srovnání se sekvencí o plné délce má zkrácená urikáza vyjmutou jednu nebo více aminokyselinových sekvencí. Protein obsahující zkrácenou urikázu může kromě zkrácené sekvence urikázy obsahovat libovolnou aminokyselinovou sekvenci, ale nezahrnuje protein obsahující sekvenci urikázy obsahující další dodatečnou přirozenou aminokyselinovou sekvenci. Jinak řečeno, protein, který obsahuje zkrácenou urikázu, kde zkrácení začíná v poloze 6 (tzn. zkrácená urikáza začíná v poloze 7), nemá bezprostředně směrem vzhůru od zkrácené urikázy žádnou aminokyselinu, kterou má přirozená urikáza v poloze 6.

Pokud není stanoveno jinak konkrétním odkazem na jinou sekvenci nebo konkrétní SEQ ID č., číselné odkazy na polohy aminokyselin zde popsaných urikáz jsou uváděny podle číslování aminokyselinové sekvence prasečí urikázy. Aminokyselinová sekvence prasečí urikázy a číslování poloh aminokyselin v této sekvenci je uvedena na Obrázku 3. Odkaz na aminokyseliny nebo nukleové kyseliny „od polohy X do polohy Y“ se zde používá k označení sekvence začínající v poloze X a končící v poloze Y, včetně aminokyselin nebo nukleových kyselin v obou polohách X a Y.

Urikázové geny a proteiny byly identifikovány u několika druhů savců, například u prasete, paviána, krysy, králíka, myši a makaka rhesus. Sekvence různých urikázových proteinů jsou zde popsané formou odkazu na veřejná přístupová čísla jejich databáze viz: gi 150403728 | sp | P25689, gi 1205136341 dbj | BAB91555.1, gi 11766101 gb | AAA35395.1, gi 1205136541 dbj | BAB91557.1, gi 1475236061 ref | NP 999435.1, gi 166785091 ref | NP 033500.1, gi157463 |emb|CAA31490.1, gi1201273951ref|NP 446220.1, gi 1137107 |sp |PÍ 1645, gi | 514586611ref|XP 497688.1, gi1207619 |gb|AAA42318.1, gi 1263407701 dbj | BAC34047.1, a gi | 57459 | emb | CAA30378.1. Každá z těchto sekvencí a jejich anotací přístupných ve veřejných databázích prostřednictvím Národního centra pro biotechnologické informace (NCBI) je zde v plné míře začleněna formou odkazu. V jednom provedení vynálezu je urikáza na aminovém konci zkrácená o 4 až 13 aminokyselin. V dalším provedení vynálezu je urikáza na karboxylovém konci zkrácená o 4 až 13 aminokyselin. V dalším provedení vynálezu je urikáza zkrácená o 4 až 13 aminokyselin na karboxylovém i aminovém konci.

·« ···· • · · · · • · · · ··· ·· · V jednom provedení vynálezu je urikáza zkrácená na aminovém konci o 6 aminokyselin. V dalším provedení vynálezu je urikáza zkrácená na karboxylovém konci o 6 aminokyselin. V dalším provedení vynálezu je urikáza zkrácená o 6 aminokyselin na karboxylovém i aminovém konci. V konkrétním provedení obsahuje urikázový protein v poloze 13 až 292 aminokyselinovou sekvenci prasečí urikázy (SEQ ID č. 11). V dalším konkrétním provedení urikázový protein obsahuje v poloze 8 až 287 aminokyselinovou sekvenci PBC-ANC (SEQ ID č. 12). V dalším konkrétním provedení obsahuje urikázový protein v poloze 8 až 287 aminokyselinovou sekvenci prasečí KS-ΔΝ (SEQ ID č. 7). V dalším provedení urikázový protein obsahuje v poloze 44 až 56 aminokyselinovou sekvenci prasečí KS-ΔΝ (SEQ ID č. 14). Tato oblast urikázy je homologní se sekvencemi domény tunelového ohybu urikázy (T-fold) a má mutaci v poloze 46 (počítáno podle sekvence nativní prasečí urikázy). Překvapivě tato mutace urikázovou aktivitu proteinu podstatně nemění. V dalším provedení vynálezu jsou mutované aminokyseliny přímo v polohách 7, 46, 291 a 301 nebo v jejich blízkosti. Ve výhodném provedení vynálezu jsou mutované přímo aminokyseliny v polohách 7,46,291 a 301. V konkrétních provedeních je protein kódovaný nukleovou kyselinou, která kóduje N-koncový methionin. Výhodně za N-koncovým methioninem následuje kodon, který umožňuje odstranění N-koncového methioninu bakteriální methionin-aminopeptidázou (MAP), viz Ben-Bassat a Bauer (1987) Nátuře 326:315, úplné zněm je zde zahrnuto formou odkazu. Aminokyseliny, které umožňují co nejúplnější odstranění N-koncového methioninu, jsou alanin, glycin, prolin, serin a threonin. V jednom provedení vynálezu jsou aminokyseliny v poloze 7 a/nebo 46 nebo v jejich blízkosti substituované threoninem. Enzymová aktivita zkrácených urikáz připravených s těmito mutacemi je překvapivě podobná aktivitě nezkráceného enzymu. V dalším provedení vynálezu obsahují aminokyselinové mutace threonin, threonin, lysin a serin v polohách 7, 46, 291, respektive 301.

Zde popsané zkrácené savčí urikázy mohou na aminovém konci obsahovat methionin. Předposlední aminokyselina umožňuje odstranění N-koncového methioninu bakteriální methionin-aminopeptidázou (MAP). Aminokyselinami umožňujícími co nejúplnější odstranění N-koncového methioninu jsou alanin, glycin, prolin, serin a threonin. V konkrétním provedení urikáza na aminovém konci obsahuje dvě aminokyseliny, kterými jsou ·· ···· ····

• *· ·· · · · · • · · · · • · · ♦ · · • · ♦ · · «·# ···· ·· * methionin následovaný aminokyselinou vybranou ze skupiny skládající se z alaninu, glycinu, prolinu, šeřinu a threoninu. V dalším provedení vynálezu jsou substituované aminokyseliny nahrazeny threoninem. V jednom provedení vynálezu je urikáza savčí urikáza. V dalším provedení vynálezu savčí urikáza obsahuje sekvenci prasečí, hovězí, ovčí nebo paviání jatemí urikázy. V dalším provedem vynálezu je urikáza chimémí urikáza dvou nebo více savčích urikáz. V dalším provedení vynálezu jsou savčí urikázy vybrány z prasečí, hovězí, ovčí nebo paviání jatemí urikázy. V dalším provedem vynálezu urikáza obsahuje sekvenci SEQ ID č. 8. V dalším provedem vynálezu urikáza obsahuje sekvenci SEQ ID č. 13.

Vynález poskytuje nukleové kyseliny kódující urikázu obsahující sekvenci SEQ ID č. 10. V dalším provedem vynálezu urikáza obsahuje fungálm nebo mikrobiální urikázu. V jednom provedem vynálezu fungální nebo mikrobiální urikáza je urikáza Aspergillus flavus, Arthrobacter globiformis nebo Candida utilis. V dalším provedení vynálezu urikáza obsahuje urikázu z rodu bezobratlých. V dalším provedem vynálezu je urikáza zrodu bezobratlých urikáza Drosophila melanogaster nebo Drosophila pseudoobscura. V dalším provedení vynálezu urikáza zahrnuje rostlinnou urikázu. V dalším provedem vynálezu je rostlinnou urikázou urikáza z kořenových hlíz Glycin max

Vynález poskytuje sekvenci nukleových kyselin kódující urikázu.

Vynález poskytuje vektor obsahující sekvenci nukleových kyselin. V konkrétním provedení se urikáza izoluje. V dalším provedem se urikáza čistí. V dalších provedeních se urikáza izoluje a čistí.

Vynález poskytuje hostitelskou buňku obsahující vektor.

Vynález poskytuje způsob přípravy sekvence nukleových kyselin, kdy se sekvence nukleových kyselin kódující nezkrácenou urikázu modifikuje pomocí techniky PCR (polymerázová řetězová reakce). Odborník v oboru ví, že požadovaná sekvence nukleových kyselin se připravuje pomocí PCR přes syntetické oligonukleotidové primery, které jsou komplementární k oblastem cílové DNA (jeden pro každé vlákno), které mají být 14 14 ·· · ·· · • · • ♦ · ·· · • I · * · • ♦ ♦ · · · • · · · · • ·· ···· ·· · amplifikovány. Primery se přidávají k cílové DNA (nemusí být čištěná), v přítomnosti nadbytku deoxynukleotidů a Taq polymerázy, tepelně stálé DNA polymerázy. V sérii teplotních cyklů (typicky 30) se cílová DNA opakovaně denaturuje (při 90 °C), aneluje k primerům (typicky při 50-60 °C) a dceřiné vlákno se prodlužuje od primem (72 °C). Dceřiná vlákna sama o sobě působí jako templáty pro následné cykly, a tak jsou DNA fragmenty odpovídající oběma primerům amplifikované spíše exponenciálně než lineárně.

Vynález poskytuje způsob přípravy mutantní rekombinantní urikázy, kdy se hostitelská buňka transfektuje vektorem, přičemž hostitelská buňka exprimuje urikázu, mutantní rekombinantní urikáza se izoluje z hostitelské buňky, čištěná mutantní rekombinantní urikáza se izoluje s použitím chromatografických technik a mutantní rekombinantní urikáza se čistí. Urikázu lze připravit způsoby popsanými například v mezinárodní patentové publikaci č. WO 00/08196, jejíž úplné zněm je zde začleněno formou odkazu.

Urikázu lze izolovat a/nebo čistit libovolným způsobem známým odborníkům v obora. Exprimované polypeptidy podle vynálezu jsou obecně izolované v podstatě v čisté formě. Výhodně jsou polypeptidy izolované v čistotě nejméně 80 % hmotnostních, výhodněji v čistotě nejméně 95 % hmotnostních a nejvýhodněji v čistotě nejméně 99 % hmotnostních. Čištění se obecně provádí s použitím standardních technik, například frakcionace síranem amonným, SDS-PAGE elektroforézou a afínitm chromatografíí. Urikáza se výhodně izoluje s použitím kationtového surfaktantu, například cetylpyridinium-chloridu (CPC), způsobem popsaným v kopendující US patentové přihlášce podané 11. dubna 2005 pod číslem 60/670,520, patentová přihláška Č. 103864.146644, s názvem Čištění proteinů kationtovým surfaktantem, jejíž úplné znění je zde začleněno formou odkazu.

Ve výhodném provedení se hostitelská buňka upraví tak, aby exprimovala mutantní rekombinantní urikázu. Odborník v oboru ví, že transfekce buněk vektorem se obvykle provádí s použitím DNA vysrážené vápenatými ionty, ačkoliv mohou být použité i jiné metody (např. elektroporace). V dalším provedení vynálezu je vektor řízen promotorem citlivým k osmotickému tlaku. Promotor je oblast DNA, ke které se RNA polymerázy vážou před iniciací transkripce DNA na RNA. Promotor citlivý k osmotickému tlaku iniciuje transkripci jako výsledek zvýšeného osmotického tlaku zaznamenaného buňkou. V dalším provedení vynálezu je promotorem modifikovaný promotor osmB. V konkrétních provedeních je urikáza podle vynálezu konjugovaná s polymerem. 15 15 ·· Mil • t 9 0 · * · • · · · • · · · · • · · · • ···· ·· · V jednom provedení vynález poskytuje farmaceutický přípravek obsahující urikázu. V dalším provedení je přípravek roztok urikázy. Ve výhodném provedení je roztok sterilní a vhodný pro injekci. V jednom provedení přípravek obsahuje urikázu ve formě fyziologického roztoku pilířovaného fosfátem. V dalším provedení vynález poskytuje přípravek ve vialce, výhodně s gumovou injekční zátkou. V konkrétních provedeních přípravek obsahuje urikázu v roztoku o koncentraci 2 až 16 mg urikázy na ml roztoku, 4 až 12 mg/ml nebo 6 až 10 mg/ml. Ve výhodném provedení přípravek obsahuje urikázu o koncentraci 8 mg/ml. Výhodně se množství urikázy měří vzhledem k množství proteinu. Účinná schémata podávání přípravků podle vynálezu může určit odborník v oboru. Vhodné indikátory pro stanovém' účinnosti daného schématu jsou odborníkům v oboru známé. Příklady takových indikátorů zahrnují normalizaci nebo snížení hladiny kyseliny močové v plazmě (PUA) a snížení nebo udržení PUA na hodnotě 6,8 mg/dl nebo nižší, výhodně 6 mg/dl nebo nižší. Ve výhodném provedení má subjekt léčený přípravkem podle vynálezu hodnotu PUA 6 mg/ml nebo nižší alespoň 70 %, alespoň 80 % nebo alespoň 90 % z celkové doby léčení. Například při 24-týdenní léčbě má subjekt výhodně hodnotu PUA 6 mg/ml nebo nižší alespoň po 80 % doby z 24-týdenní léčby, tzn. alespoň po dobu rovnou 134,4 dní (24 týdnů x 7 dm' v týdnu x 0,8 = 134,4 dní). V konkrétních provedeních se podává 0,5 až 24 mg urikázy v roztoku jedenkrát každé 2 až 4 týdny. Urikáza se podává libovolným vhodným způsobem, který odborník v oboru zná, například intravenózně, intramuskulámě nebo podkožně. Při intravenózním podávání se podává 0,5 mg až 12 mg urikázy. Při podkožním podávání se podávají až 24 mg urikázy. Ve výhodném provedení se urikáza podává intravenózní infiizí po dobu 30 až 240 minut. V jednom provedení se podává 8 mg urikázy jednou každé dva týdny. V konkrétních provedeních lze infuzi provádět s použitím 100 až 500 ml fyziologického roztoku. Ve výhodném provedení se podává 8 mg urikázy v roztoku po dobu 120 minut jednou každé dva týdny nebo jednou každé 4 týdny, výhodně se urikáza pro infuzi rozpustí ve 250 ml fyziologického roztoku. V konkrétních provedeních se urikáza podává po dobu léčení 3 měsíce, 6 měsíců, 8 měsíců nebo 12 měsíců. V dalších provedeních je doba léčení 12 týdnů, 24 týdnů, 36 týdnů nebo 48 týdnů. V konkrétním provedení je doba léčení prodloužená, např. na 2 roky nebo delší, až po celou dobu života léčeného subjektu. Kromě toho lze použít mnohonásobné doby léčení přerušované obdobím bez léčby, např. 6 měsíců léčby následovaných 3 měsíci bez léčby, následovaných 6 dalšími měsíci léčby, atd. V některých provedeních mohou být pro odstranění nebo redukování výskytu reakcí na infuzi při podávání urikázy profylakticky podávané protizánětlivé sloučeniny. V jednom ·· ···· ····

« ·· ····»· · • · » # · • · · · · · • ♦ · · · ··· ···· ·« · provedení se tak podává alespoň jeden kortikosteroid, alespoň jedno antihistaminikum, alespoň jeden NSAID nebo jejich kombinace. Užitečné kortikosteroidy zahrnují betamethason, budesonid, kortison, dexamethason, hydrokortison, meťhylprednisolon, prednisolon, prednison a triamcinolon. Užitečné NSAID zahrnují ibuprofen, indomethacin, naproxen, aspirin, acetominofen, celecoxib a valdecoxib. Užitečná antihistaminika zahrnují azatadin, brompheniramin, cetirizin, chlorfeniramin, clemastin, cyproheptadin, desloratadin, dexchlorfeniramin, dimenhydrinat, difenhydramin, doxylamin, fexofenadin, hydroxyzin, loratadin a fenindamin.

Ve výhodném provedení je antihistaminikum fexofenadin, NSAID je acetaminofen a kortikosteroid je hydrokortison a/nebo prednison. Výhodně se kombinace všech tří (není nutno souběžně) podává před vlastní infuzí roztoku s urikázou. Ve výhodném provedem se NSAID a antihistaminikum podávají orálně 1 až 4 hodiny před infuzí urikázy. Vhodná dávka obsahuje 30 až 180 mg, 40 až 150 mg, 50 až 120 mg, 60 až 90 mg, 60 mg, výhodně 60 mg fexofenadinu. Vhodná dávka obsahuje 500 až 1500 mg, 700 až 1200 mg, 800 až 1100 mg, 1000 mg, výhodně 1000 mg acetaminofenu. Vhodná dávka obsahuje 100 až 500 mg, 150 až 300 mg, 200 mg, výhodně 200 mg hydrokortisonu. V jednom provedení není antihistaminikum difenhydramin. V dalším provedení NSAID není acetaminofen. Ve výhodném provedem se 60 mg fexofenadinu podává orálně noc před infuzí urikázy, 60 mg fexofenadinu a 1000 mg acetaminofenu se podává orálně příští ráno a konečně 200 mg hydrokortisonu se podává těsně před infuzí roztoku s urikázou. V jednom provedem se prednison podává den, výhodně večer, před podáním urikázy. Vhodná dávka obsahuje 5 až 50 mg, výhodně 20 mg prednisonu. V některých provedeních se tato profylaktická léčba pro odstranění nebo redukování výskytu reakcí na infuzí používá pro subjekty, které dostávají nebo budou dostávat urikázu, věetně PEGylované urikázy a nePEGylované urikázy. V konkrétních provedeních se tato profylaktická léčba používá pro subjekty, které dostávají nebo budou dostávat terapeutické peptidy jiné než urikáza, přičemž jiné terapeutické peptidy jsou PEGylované nebo nePEGylované. V jednom provedem vynálezu obsahuje farmaceutický přípravek urikázu, která byla modifikovaná konjugací s polymerem a modifikovaná urikáza si zachovává urikolytickou aktivitu. V konkrétním provedení se konjugáty polymer-urikáza připravují způsobem popsaným v mezinárodní patentové publikaci č. WO 01/59078 a U.S. přihlášce č. 5 09/501730, jejichž plné znění je zde zahrnuto formou odkazu. 17 ·»· 17 ·»· ··♦· i » • ·

·♦ MM • · · · e · • · · ♦ # ··· ···♦ ·· · V jednom provedení vynálezu je polymer vybrán ze skupiny skládající se z polyethylenglykolu, dextranu, polypropylenglykolu, hydroxypropylmethylcelulózy, karboxymethylcelulózy, polyvinylpyrolidonu a polyvinylalkoholu. V dalším provedem' vynálezu přípravek obsahuje 2-12 molekul polymeru na každou podjednotku urikázy, výhodně 3 až 10 molekul polymeru na podjednotku urikázy. V dalším provedení vynálezu má každá molekula polymeru molekulovou hmotnost v rozmezí 1 kDa až 100 kDa. V dalším provedení vynálezu má každá molekula polymeru molekulovou hmotnost v rozmezí 1 kDa až 50 kDa. Ve výhodném provedení vynálezu má každá molekula polymeru molekulovou hmotnost v rozmezí 5 kDa až 20 kDa, 8 kDa až 15 kDa, 10 kDa až 12 kDa, výhodně 10 kDa. Ve výhodném provedem má každá molekula polymeru molekulovou hmotnost 5 kDa nebo 20 kDa. V obzvláště výhodném provedení vynálezu má každá molekula polymeru molekulovou hmotnost 10 kDa. Uvažovány jsou také směsi molekul s různou hmotností. V dalším provedení vynálezu je přípravek vhodný pro opakované podávání. V konkrétním provedem konjugát urikázy s polymerem obsahuje vazby vybrané ze skupiny skládající se z urethanových vazeb, sekundárních aminových vazeb a amidových vazeb.

Vynález poskytuje buňku schopnou produkovat urikázu s aminokyselinovou sekvencí rekombinantní urikázy, která byla zkrácená o 1 - 20 aminokyselin a má mutované aminokyseliny a urikolytickou aktivitu.

Vynález poskytuje prostředek pro metabolizaci kyseliny močové s použitím urikázy.

Vynález poskytuje použití přípravku s urikázou pro snížení hladiny kyseliny močové v biologické tekutině. V jednom provedení vynálezu se přípravek obsahující urikázu používá pro snížení hladiny kyseliny močové v biologické tekutině zahrnující krev.

Vynález dále poskytuje nové molekuly nukleových kyselin kódující urikázové polypeptidy. Způsoby jejich přípravy jsou odborníkovi v oboru dobře známé. Sekvence nukleových kyselin urikázy mohou být modifikované libovolnou z mnoha strategií známých v oboru (Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, laboratorní manuál, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Sekvence může být štěpena na příslušných místech restrikční endonukleázou (endonukleázami), případně následuje další enzymatická modifikace, izolace a ligace in vitro. Při přípravě genu kódujícího urikázu je zapotřebí zajistit, aby modifikovaný gen zůstal uvnitř příslušného čtecího rámce translace, nepřerušený stop-signály translace. Sekvence nukleových kyselin kódující urikázu může být mutovaná in vitro 18 • · · · nebo in vivo, pro vytvoření a/nebo zrušení translačních, iniciačních a/nebo terminačních sekvencí nebo pro vytvoření variací v kódujících oblastech a/nebo vytvoření nových míst pro restrikční endonukleázu nebo zrušení již existujících, pro usnadnění další modifikace in vitro. Použitelná je libovolná technika pro mutagenezi známá v oboru, včetně, ale bez omezení na, in vitro místně řízenou mutagenezi (Hutchinson, C. et al., (1978, J. Biol. Chem 253:6551), použití TAB® linkerů (Pharmacia), atd.

Nukleotidová sekvence kódující urikázový protein může být vložena do příslušného expresního vektoru, tzn. vektoru, který obsahuje nezbytné prvky pro transkripci a translaci vložené sekvence kódující protein. Pro expresi sekvence kódující protein může být použito mnoho různých systémů hostitel-vektor. Tyto systémy zahrnují, ale nejsou omezeny na systémy savčích buněk infikovaných virem (např. virus vakcinie, adenovirus, atd.), systémy hmyzích buněk infikovaných virem (např. baculovirus), mikroorganismy, např. kvasinky obsahující vektory kvasinek nebo bakterie transformované bakteriofágovou DNA, plasmidovou DNA nebo kosmidovou DNA. Prvky exprese se u těchto vektorů liší v jejich síle a specifitě. V závislosti na použitém systému hostitel-vektor lze použít libovolný z mnoha vhodných prvků transkripce a translace.

Ke konstruování expresních vektorů obsahujících chimémí gen, který se skládá z příslušných regulačních signálů pro transkripci/translaci a sekvencí kódujících protein, lze použít libovolný způsob známý pro inzerci DNA fragmentů do vektoru. Tyto způsoby mohou zahrnovat in vitro DNA rekombinantní a syntetické techniky a rekombinace in vivo (genetické rekombinace). Exprese sekvence nukleových kyselin kódující urikázový protein může být řízena druhou aminokyselinovou sekvencí, takže urikázový protein je exprimovaný v hostiteli transformovaném molekulou rekombinantní DNA. Exprese urikázy může být řízena libovolným elementem promotor/enhancer, který je v oboru známý. Promotory, které lze použít pro řízem exprese urikázy, zahrnují, ale nejsou omezeny na, oblast SV40 raného promotoru (Bemoist a Chambon, 1981, Nátuře 290:304-310), promotor obsažený v dlouhé 3'-koncové repetici Rous sarkoma viru (Yamamoto et al., (1980, Cell 22:787-797), promotor herpes thymidinkinázy (Wagner et al., (1981, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78:144-1445), regulátorové sekvence genu metallothioninu (Brinster et al., (1982, Nátuře 296:39-42); prokaryotické expresní vektory, například promotor 3-laktamázy (Villa-Kamaroff et al., (1978, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731), promotor tac (DeBoer et al., (1983, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25) a promotor osmB. V konkrétních provedeních nukleová kyselina zahrnuje sekvenci nukleových kyselin kódující urikázu operativně připojenou k heterolognímu promotoru. 19 • · · ·· • ·♦·· ·» ♦ • ♦

Jakmile se připraví a izoluje konkrétní molekula rekombinantní DNA obsahující kódující sekvenci nukleových kyselin, lze k její propagaci použít různé způsoby v oboru známé. Jakmile je ustaven vhodný hostitelský systém a vhodné podmínky růstu, mohou být rekombinantní expresní vektory propagovány a připraveny ve velkém množství. Jak bylo výše vysvětleno, použitelné expresní vektory zahrnují, ale nejsou omezeny na následující vektory nebo jejich deriváty: lidské nebo zvířecí viry, např. virus vakcinie nebo adenovirus, hmyzí viry, např. baculovirus, kvasinkové vektory, bakteriofágové vektory (např. lambda) a plasmidové a kosmidové DNA vektory a další.

Kromě toho lze vybrat kmen hostitelské buňky, který moduluje expresi vložených sekvencí nebo modifikuje a požadovaným způsobem genový produkt upravuje. Exprese u určitých promotorů může být zvýšena v přítomnosti některých induktorů, takže lze kontrolovat expresi geneticky zkonstruovaného urikázového proteinu. Různé hostitelské buňky dále mají charakteristické a specifické mechanismy pro translační a posttranslační úpravy a modifikaci proteinů (např. glykosylace, štěpení). K zajištění požadované modifikace a úpravy exprimovaného cizího proteinu mohou být vybrány vhodné buněčné linie nebo hostitelské systémy. Různé systémy exprese vektor/hostitel mohou různou měrou ovlivnit reakce probíhající při úpravě, například proteolytické štěpení. V konkrétních provedeních vynálezu se exprese urikázy E. coli výhodně provádí s použitím vektorů obsahujících promotor osmB. Příklady provedení vynálezu Příklad 1

Konstrukce genu a expresního plasmidu pro expresi urikázy

Rekombinantní prasečí urikáza (urátoxidáza), prasečí KS-ΔΝ (protein prasečí urikázy zkrácený na aminovém konci nahrazující aminokyseliny v poloze 291 a 301 lysinem a serinem) byla exprimovaná na E. coli, K-12 kmen W3110 F-. Byla konstruována série plasmidů s výslednou pOUR-P-AN-ks-l, která po transformaci hostitelské buňky E. coli byla schopna řídit účinnou expresi urikázy.

Izolace a subklonování urikázy cDNA z prasečích a paviáních jater Z prasečích a paviáních jater byly izolací a subklonováním relevantní RNA připraveny urikázové cDNA. Z prasečích a paviáních jater byla extrahována veškerá buněčná RNA (viz Erlich, H. A. (1989), PCR Technologie, principy a aplikace pro DNA amplifikaci, Sambrook, ·· ··· · J. et al. (1989), Molekulární klonování: Laboratorní manuál, 2. vydání, Ausubel, F. M. et al. (1998), Současné protokoly v molekulární biologii), poté se provedla reverzní transkripce s použitím First-Strand cDNA Synthesis Kit (Pharmacia Biotech). PCR amplifikace byla provedena s použitím Taq DNA polymerázy (Gibco BRL, Life Technologies). V Tabulce 1 jsou uvedeny syntetické oligonukleotidové primery použité pro PCR amplifikaci prasečí a paviání urátoxidázy (urikázy).

Tabulka 1. Primery pro PCR Amplifikaci Urikázy cDNA

Prasečí jatemí urikáza sensní (SEQ ID č. 1) 5’ gcgcgaattccATGGCTCATTACCGTAATGACTACA 3' anti-sensní (SEQ ID č. 2) 5' gcgctctagaagcttccatggTCACAGCCTTGAAGTCAGC 3' Paviání (D3H) jatemí urikáza sensní (SEQ ID č. 3) 5' gcgcgaattccATGGCCCACTACCATAACAACTAT 3' anti-sensní (SEQ ID č. 4) 5' gcgcccatggtctagaTCACAGTCTTGAAGACAACTTCCT 3'

Sekvence restrikčních enzymů, zavedené na konce primerů a v Tabulce 1 označené malými písmeny, byly sen sní EcoRI a Ncol (prasečí a paviání) a anti-sensní Ncol, HindlII 5 a Xbal (prasečí), Xbal a Ncol (paviání). U paviáního sensního primeru byl třetí kodon GAC (aspartamová kyselina), přítomný v paviání urikáze, nahrazen kodonem CAC (histidin), který je v této poloze přítomný v kódující sekvenci pseudogenu lidské urátoxidázy. Rekombinantní konstrukt paviání urikázy generovaný s použitím těchto primerů je nazván D3H Paviání urikáza. PCR produkt prasečí urikázy byl natráven EcoRI a HindlII a klonování do pUC 18 za vzniku pUC 18 - Prasečí urikáza. PCR produkt D3H paviání urikázy byl nakloňován přímo do vektoru pCR™II, použil se TA Cloning™ (Invitrogen, Carlsbad, CA), za vzniku paviání urikázy pCR™II -D3H.

Pro transformaci kmene E. coli XLI-Blue (Stratagene, La Jolla, CA) byly použity ligo váné cDNA. Byla připravena plasmidová DNA obsahující klonovanou cDNA urikázu a byly selektovány a izolovány klony, které obsahují kódující sekvence DNA publikované urikázy (s výjimkou substituce D3H v paviání urikáze, viz Tabulka 1). Ve vybraném klonu paviání urikázy pCR™II - D3H byly, v důsledku delece sekvencí zavedených PCR, sekvence 21 • · pCR™II vedle stop-kodonu urikázy. V důsledku toho byla z 3'-netranslatované oblasti eliminována restrikční místa Xbal a Ncol, což na 5'-konci produktu PCR umožnilo poziční klonování s použitím Ncol a BamHI, který je odvozený od vektoru pCR™II.

Subklonovám urikázové cDNA do expresních vektorů pET

Subklonování paviání urikázy

Do expresního vektoru pET-3d (Novagen, Madison, WI) byla zavedena D3H paviání cDNA obsahující celou kódující sekvenci urikázy. pCR™II - D3H paviání urikáza byla natrávena Ncol a BamHI a izoloval se fragment 960 bp. Expresní plasmid pET-3d byl natráven Ncol a BamHI a izoloval se fragment 4600 bp. Ligací těchto dvou fragmentů byla vytvořena paviání pET-3d-D3H.

Subklonování chimémí urikázy prase-pavián

Pro získání vyšší exprese, stability a aktivity rekombinantního genu byla konstruována chimémí urikáza prase-pavián (PBC). PBC byla konstruována izolováním 4936 bp fragmentu Ncol-Apal z klonu paviání pET-3d-D3H a ligací izolovaného fragmentu s 624 bp fragmentem Ncol-Apal izolovaným z pUC 18 prasečí urikázy, čímž se vytvoří pET-3d-PBC. Urikázová PBC cDNA se skládá z kodonů 1 -225 prasečí urikázy spojených do rámce s kodony 226-304 paviání urikázy.

Subklonování prasečí KS urikázy

Pro vložení jednoho lysinového zbytku, který může poskytnout další místo pro PEGylaci, byla konstruována prasečí KS urikáza. KS znamená vložení aminokyseliny lysinu do prasečí urikázy v poloze 291, namísto argininu (R291K). Navíc byl threonin v poloze 301 nahrazen serinem (T301 S). Plasmid prasečí KS urikázy byl konstruován izolováním 4696 bp Ncol-Ndel fragmentu paviání pET-3d-D3H a následnou ligací s 864 bp Ncol-Ndel fragmentem izolovaným z prasečí urikázy pUC18, za vzniku pET-3d prasečí KS. Výsledná sekvence prasečí KS urikázy se skládá z kodonů 1-288 prasečí urikázy spojených do rámce s kodony 289-304 paviání urikázy.

Subklonovám urikázové sekvence regulované promotorem osmB

Gen urikázy byl subklonován do expresního vektoru obsahujícího promotor osmB (podle postupu z US patentu č. 5 795 776, jehož plné znění je zde zahrnuto formou odkazu). Tento vektor umožňuje indukci exprese proteinu jako odpověď na vysoký osmotický tlak 22 • · · · • · · · · nebo stárnutí kultury. Expresní plasmid pMFOA-18 obsahoval promotor osmB, sekvenci pro místo navázání rybozomu (rbs) a sekvenci pro terminátor transkripce (ter). Dodává rezistenci na ampicilin (AmpR) a exprimuje rekombinantní lidskou acetylcholin-esterázu (AChE).

Subklonování paviání D3H urikázy

Plasmid pMFOA-18 byl natráven Ncol a BamHI a izoloval se velký fragment. Konstrukt paviání pET-3d-D3H byl natráven Ncol a BamHI a izoloval se 960 bp fragment obsahující gen D3H paviání urikázy. Tyto dva fragmenty byly ligovány za vytvoření pMFOU18.

Expresní plasmid pMFXT133 obsahuje promotor osmB, rbs (deo operon E. coli), ter (TrypA E. coli), rekombinantní polypeptidový inhibitor faktoru Xa (Fxal) a dodává gen rezistence na tetracyklin (TetR). Kvůli změně genů rezistence na antibiotika by1 do tohoto plasmidu vložen gen paviání urikázy. Plasmid pMFOU18 byl natráven Ncol, vyplněn, poté natráven Xhol a izoloval se fragment 1030 bp. Plasmid pMFXT133 byl natráven Ndel, vyplněn, poté natráven Xhol a izoloval se velký fragment. Tyto dva fragmenty byly ligovány pro vytvoření expresního vektoru paviání urikázy pURBAló.

Subklonování chimémí urikázy prase-pavián

Plasmid pURBAló byl natráven Apal a AIwNI a izoloval se fragment 2320 bp. Plasmid pMFXT133 byl natráven Ndel, vyplněn, poté natráven AIwNI a izoloval se fragment 620 bp. Konstrukt pET-3d-PBC byl natráven Xbal, vyplněn, poté natráven Apal a izoloval se fragment 710 bp. Tyto tři fragmenty byly ligovány pro vytvoření pUR-PB, plasmidu exprimujícího PBC urikázu pod kontrolou promotoru osmB a rbs i T7 rbs, který byl odvozen z vektoru pET-3d. V dalším kroku byl T7 rbs odstraněn. pUR-PB byl natráven Ncol, vyplněn, poté digestován AIwNI a izoloval se fragment 3000 bp. Plasmid pMFXT133 byl natráven Ndel, vyplněn a poté natráven AIwNI a izoloval se fragment 620 bp. Tyto dva fragmenty byly ligovány za vzniku pDUR-PB, který exprimuje PBC pod kontrolou promotoru osmB.

Konstrukce pOUR-PB-ANC

Do urikázy cDNA bylo zavedeno několik změn, které vedly k podstatnému nárůstu stability rekombinantního enzymu. Byl konstruován plasmid pOUR-PBC-ANC, u kterého byly odstraněny N-koncový maturovaný peptid se šesti zbytky a tripeptid na C-konci, které působí in vivo jako peroxyzomální cílový signál. Toto se provedlo s použitím PCR ···· amplifikace PBC sekvence z plasmidu pDUR-PB a specifických oligonukleotidových primerů uvedených v Tabulce 2.

Tabulka 2. Primery pro PCR amplifikaci urikázy PBC-ANC

Urikáza PBC-ANC: Sensní 5' gcgcatATGACTTACAAAAAGAATGATGAGGTAGAG 3’ (SEQ ID č. 5) Antisensní 5' ccgtctagaTTAAGACAACTTCCTCTTGACTGTACCAGTAATTTTTCCGTATGG 3' (SEQ ID č. 6)

Zvýrazněné sekvence restrikčních enzymů zavedené na konce primerů nekódující oblasti jsou v Tabulce 2 označené malými písmeny. Ndel je sensní a Xbal je antisensní. Antisensní primer byl použit také pro eliminaci vnitřního místa restrikce Ndel zavedením bodové mutace (podtržené), která neovlivňuje aminokyselinovou sekvenci, a tak usnadňuje subklonování s použitím Ndel.

Fragment 900 bp (base-pair, spárovaných baží), generovaný PCR amplifikaci pDUR-PB, byl štěpen Ndel a Xbal a izolován. Získaný fragment byl poté vložen do deo-expresního plasmidu pDBAST-RAT-N, který obsahuje deo-PlP2 promotor a rbs odvozený z E. coli a konstitutivně exprimuje lidský rekombinantní prekurzor insulinu. Plasmid byl natráven Ndel a Xbal, fragment 4035 bp se izoloval a ligoval do PCR produktu PBC urikázy. Výsledný konstrukt pDUR-PB-ANC byl použit pro transformaci E. coli K 12 So733 (F- cytR strA), který exprimoval vyšší hladinu aktivní zkrácené urikázy.

Také dvojitě zkrácené sekvence PBC-ANC byly exprimované pod kontrolou promotoru osmB. Plasmid pDUR-PB-ANC byl natráven AlwNI - Ndel a izoloval se fragment 3459 bp. Výše popsaný plasmid pMFXT133 byl natráven Ndel AlwNI a izoloval se fragment 660 bp. Fragmenty byly poté ligované pro vytvoření pOUR PB-ANC, který byl zaveden do E. coli K-12 kmene W3110 F" a exprimoval vyšší hladinu aktivní zkrácené urikázy. 24 ·· ·· ♦··· • · • ·

Konstrukce expresního plasmidu urikázy pOUR-P-AN-ks-l

Tento plasmid byl konstruován pro vylepšení aktivity a stability rekombinantního enzymu. Prasečí urikáza KS-ΔΝ byla zkrácená pouze na N-konci (ΔΝ), kde byl odstraněn N-koncový maturovaný peptid se šesti zbytky, a obsahovala mutace S46T, R291K a T301S. V poloze 46 byl kvůli konzervativní mutaci, ke které došlo během PCR amplifikace a klonování, namísto šeřinu zbytek threoninový. Lysin v poloze 291 nahradil arginin a v poloze 301 byl namísto threoninu vložen serin. Obě záměny byly odvozené ze sekvence paviání urikázy. Modifikace R291 K a T301 S jsou označené KS a diskutované výše. Extra lysinový zbytek poskytl další místo pro potenciální PEGylaci.

Pro konstrukci pOUR-P-AN-ks-l (Obrázek 1) byl plasmid pOUR-PB-ANC natráven Apal - Xbal a izoloval se fragment 3873 bp. Plasmid pET-3d-PKS (konstrukce uvedena na Obrázku 4) byl natráven Apal - Spěl a izoloval se fragment 270 bp. Štěpení Spěl zanechalo extenzi 5' CTAG, která byla účinně ligovaná s fragmenty DNA generovanými Xbal. Tyto dva fragmenty byly ligo vány pro vytvoření pOUR-P-ON-ks-1. Po ligaci zanikla místa rekognice Spěl a Xbal (jejich umístění je na Obrázku 9 uvedeno v závorkách). Konstrukt pOUR-P-AN-ks-1 byl zaveden do E. coli K-12 kmene W3110 F\ prototrofní, ATCC # 27325. Výsledná prasečí urikáza KS-ΔΝ, exprimovaná pod kontrolou promotoru osmB, poskytla vysoké hladiny rekombinantního enzymu s vyšší aktivitou a stabilitou.

Obrázek 1 ukazuje strukturu plasmidu pOUR-P-AN-ks-l. Čísla u restrikčních míst ukazují polohu nukleotidu vzhledem k místu Haell, označenému jako 1. RestrikČm místa, která zanikla během klonování, jsou uvedena v závorkách. Plasmid pOUR-P-AN-ks-l, kódující prasečí urikázu KS-ΔΝ, je dlouhý 4143 párů baží (bp) a zahrnuje následující prvky: 1. fragment DNA o délce 113 bp, sahající od nukleotidu číslo 1 do místa Ndel (v poloze 113), který zahrnuje promotor osmB a vazebné místo pro ribozom (rbs). 2. Fragment DNA o délce 932 bp, sahající od Ndel (v poloze 113) do spojky Spel/Xbal (v poloze 1045), který zahrnuje: kódující oblast 900 bp prasečí KS-ΔΝ (sekvence nukleových kyselin proteinu prasečí urikázy zkráceného na aminovém konci, kde jsou aminokyseliny v poloze 291 a 301 nahrazeny lysinem a serinem) a 32 bp boční sekvenci odvozenou z pCR™ II, od místa klonování TA v protisměru do místa restrikce Spel/Xbal. 3. 25 bp sekvenci místa vícečetného klonování (MCS) od spojky Spel/Xbal (v poloze 1045) do HindlII (v poloze 1070). 4. Syntetický 40 bp oligonukleotid obsahující TrpA terminátor transkripce (ter) s konci HindlII (v poloze 1070) a AatlI (v poloze 1110). 25 i • ···· ·· * ·· ·· ···· 5. Fragment DNA o délce 1519 bp, sahající z místa AatlI (v poloze 1110) do MscI/Scal (v poloze 2629) na pBR.322, který obsahuje gen rezistence na tetracyklin (TetR). 6. Fragment DNA o délce 1514 bp, sahající z místa Seal (v poloze 2629) do Haell (v poloze 4143) na pBR322, který obsahuje počátek replikace DNA.

Obrázek 2 ukazuje DNA a odvozené aminokyselinové sekvence prasečí urikázy KS-ΔΝ. V tomto obrázku je číslování aminokyselin provedeno podle úplné sekvence prasečí urikázy. Za iniciačním methioninovým zbytkem byl namísto kyseliny aspartamové ze sekvence prasečí urikázy vložen threonin. Tento threoninový zbytek umožňuje odstranění methioninu bakteriální aminopeptidázou. Mezera v aminokyselinové sekvenci ukazuje odstraněný N-koncový maturovaný peptid. Vyznačená jsou restrikční místa, která byla použitá pro různé kroky subklonování různých sekvencí urikázy (Apal, Ndel, BamHI, EcoRI a Spěl). 3 '-Netranslatovaná sekvence, označená malými písmeny, byla odvozena ze sekvence pCR™II. Hvězdička označuje stop kodon translace.

Obrázek 3 ukazuje uspořádání aminokyselinových sekvencí různých rekombinantních sekvencí urikázy. Vrchní řada představuje prasečí urikázu s úplnou aminokyselinovou sekvencí. Druhá řádka je sekvence dvojitě zkrácené prasečí-pavián chimémí urikázy (PBC-ANC). Třetí řádka ukazuje sekvenci prasečí urikázy KS-ΔΝ, která je zkrácená pouze na N-konci a obsahuje mutace S46T a změny aminokyselin R291 K a T301 S, obě reflektující paviání původ karboxylového konce sekvence kódující urikázu. Hvězdička označuje polohy, kde jsou rozdíly v aminokyselinách u prasečí KS-ΔΝ ve srovnám s publikovanou sekvencí prasečí urikázy, kroužky označují polohy, kde jsou rozdíly v aminokyselinách v prasečí KS-ΔΝ ve srovnání s prasečí-paviání chimérou PBC-ΔΝ, a čárkovaně jsou vyznačené delece aminokyselin.

Pro klonování do E. coli byly konstruovány cDNA nativní urikázy, paviání, prasečí a králičí, s mutací Y97H a prasečí-paviání chiméra (PBC). Byly konstruovány klony exprimující vysoké hladiny urikázových variant a vybrány všechny E. coli W3110 F', u kterých je exprese regulovaná osmB. Izolovaly se plasmidové DNA, ověřily DNA sekvenční analýzou pomocí restrikčních enzymů a kultivovaly se buňky.

Konstrukce zkrácené urikázy, včetně prasečí-ΔΝ a prasečí KS-ΔΝ, byla provedena křížovou ligací mezi ΡΒΟΔΝΟ a prasečí KS, následným štěpením restrikčními endonukleázami Apal a Xbal a Apal plus Spěl. Lze odůvodněně předpokládat, že si tyto zkrácené mutanty zachovají svou aktivitu, neboť šest N-koncových zbytků, „maturovaný peptid“ (1-2) a C-koncový tripeptid, „peroxyzomální cílový signál“ (3-5), nemají ftmkce, které by podstatně ovlivnily enzymovou aktivitu, a že tyto sekvence budou imunogenní. Vybraly se klony exprimující velmi vysoké hladiny variantních urikáz. Příklad 2

Transformace expresního plasmidu do bakteriální hostitelské buňky A

Expresní plasmid pOUR-P-AN-ks-l byl zaveden do E. coli K-12 kmene W3110 F\ Bakteriální buňky byly připraveny pro růst spojený s transformací do fáze mid log u Luria broth (LB), poté byly buňky odděleny centrifiigací, promyty ve studené vodě, a suspendovány v 10% glycerolu ve vodě o koncentraci 3xl010 buňky/ml. Buňky byly uchovávané v alikvotech při -70 °C. Plasmidová DNA byla vysrážena v eťhanolu a rozpuštěna ve vodě.

Bakteriální buňky a plasmidová DNA byly smíchány a transformace byla provedena vysokonapěťovou elektroporační metodou s použitím Gene Pulser II z BIO-RAD (Trevors et al (1992). Electrotransformace bakterie plasmidovou DNA, viz Průvodce Elektroporace a Elektrofuze (D.C. Chang, B. M. Chassy, J. A. Saunders a A. E. Sowers, eds.), str. 265-290, Academie Press lne., San Diego, Hanahan et al (1991) Meth. Enzymol., 204, 63-113). Transformované buňky byly suspendované v médiu SOC (2% trypton, 0,5% kvasinkový extrakt, 10 mM NaCl, 2,5mM KC1, 10 mM MgCl2, 10 mM MgS04, 20 mM glukóza), inkubované 1 hodinu při 37°C, a vytříděné podle rezistence na tetracyklin. Byl vybrán klon s vysokou expresí. Příklad 3 Příprava rekombinantní urikázy

Bakterie stejného typu jako ty výše popsané transformované byly kultivovány v médiu obsahujícím glukózu, pH bylo udržováno na hodnotě 7,2 ± 0,2, při 37 °C.

Pro posledních 5-6 hodin kultivace byl do média přidán KC1 na konečnou koncentraci 0,3 M. Kultivace pokračovala, aby se umožnila akumulace urikázy.

Rekombinantní urikáza se akumulovala uvnitř bakteriálních buněk jako nerozpustný precipitát podobný inkluzním tělískům (IBs). Buněčná suspenze byla promytá centrifugací a suspendovaná v 50mM pufru Tris při pH 8,0 a 10 mM EDTA na konečný objem odpovídající 40-násobku suché hmotnosti buněk. IBs obsahující rekombinantní urikázu byly izolované centrifugací a následným rozrušením bakteriálních buněk s použitím lysozymu a vysokého tlaku. Reakce s lysozymem (2000-3000 jednotek/ml) byla provedena za míchání při pH 8,0 a 7 ± 3° C po dobu 16-20 hodin. Peleta byla promyta vodou a uchovávána při -20 °C až do použití.

Obohacené IBs byly po suspendování dále zpracovávány v 50 mM NaHC03 pufru při pH 10,3 ± 0,1. Kvůli solubilizaci urikázy odvozené od IB byla suspenze přes noc inkubovaná při teplotě místnosti, a následně vyčeřená centrifugách

Urikáza byla dále čištěná několika chromatografickými kroky. Nejprve byla chromatografie provedena na koloně Q-Sepharose FF. Kolona s látkou byla promyta bikarbonátovým pufřem obsahujícím 150 mM NaCl a urikáza byla eluovaná bikarbonátovým pufrem obsahujícím 250 mM NaCl. Pro odstranění minoritních nečistot z urikázového preparátu byla poté použita xanthin-agarózová pryskyřice (Sigma). Eluát po Q-Sepharose FF byl naředěn 50mM glycinovým pufrem o pH 10,3 ±0,1 na koncentraci proteinu 0,25 mg/ml a nanesen na kolonu. Kolona byla promyta bikarbonátovým pufrem při pH 10,3 ±0,1 obsahujícímlOOmM NaCl a urikáza byla eluovaná stejným pufrem doplněným 60 μΜ xanthinu. V tomto stádiu byla urikáza pro odstranění agregovaných forem přečištěná chromatografií na Q-Sepharose. Čistota všech urikázových přípravků je vyšší než 95 %, jak bylo stanoveno velikostně vylučující chromatografií. Při použití kolony Superdex 200 bylo ve všech přípravcích detekováno méně než 0,5 % agregovaných forem.

Tabulka 3 podává souhrn čištění prasečí urikázy KSAN z IBs získaných z fermentační půdy 25 L.

Tabulka 3. Čištění prasečí urikázy KSAN

Krok čištění Protein (mg) Aktivita (U) Specifická aktivita (U/mg) Rozpuštění IB 12 748 47 226 3,7 Vyčištěný roztok 11 045 44 858 4,1 Q-Sepharose I - hlavní podíl 7 590 32 316 4,3 Xanthin-Agaróza - hlavní podíl 4 860 26 361 5,4 Q-Sepharose II - hlavní podíl 4 438 22 982 5,2 Retentát 30 kDa UF 4 262 27 556 6,5 I 28 • ···· Μ · • · • · * • · ·· · · • Μ ·· · · • · • I · • · ·#· ···· • 4 M«l • · · • · · • i · • · · • 4 · Příklad 4

Charakteristiky rekombinantní urikázy

SDS-PAGE SDS-PAGE analýza vysoce čištěné variantní urikázy (Obrázek 4) odhalila charakteristický profil. Vzorky byly uchovávány při 4 °C v uhličitanovém pufhi při pH 10,3 až po dobu několika měsíců. Úplné prasečí, prasečí KS a PBC varianty vykazují akumulaci dvou hlavních degradačních produktů s molekulovou hmotností 20 a 15 kDa. Toto pozorování naznačuje, že alespoň jeden nick štěpí molekulu podjednotky urikázy. Rozdílný degradačm profil je detekován u klonů zkrácených na aminovém konci a v nižší míře také u králičí urikázy. N-konec králičí urikázy připomíná N-konec zkrácených klonů. Určeny byly N-koncové sekvence fragmentů urikázy generovaných během čištění a skladování.

Sekvencování peptidů

Dlouhé urikázové přípravky byly sekvenovány od N-konce s použitím Edmanovy degradace. Provedlo se deset cyklů. Rekombinantní prasečí urikáza (úplný klon) generovala větší množství degradačních fragmentů ve srovnám s prasečí KS-ΔΝ. Byla vyvozena tato místa štěpení vedoucí k degradačním fragmentům: 1) Majoritní místo v poloze 168 se sekvencí: -QSG i FEGFI-- 2) Minoritní místo v poloze 142 se sekvencí: --IRN i GPPVI— Výše uvedené sekvence nepřipomínají žádné známé proteolytické štěpem. Přesto ke štěpení mohlo dojít buď proteolýzou, nebo nějakou chemickou reakcí. Urikázy zkrácené na N-konci jsou překvapivě stabilnější než urikázy na N-konci nezkrácené. Také PBC-ANC měla stabilitu podobnou dalším ΔΝ molekulám a nižší než u PBC na N-konci nezkrácené. Účinnost

Aktivita urikázy byla měřena pomocí UV. Rychlost enzymatické reakce byla určena z měření poklesu absorbance při 292 nm následkem oxidace kyseliny močové na alantoin. Jednotka aktivity je definovaná jako množství urikázy nutné k oxidaci jednoho mikromolu kyseliny močové za minutu při 25 °C při specifikovaných podmínkách. Účinnost urikázy je vyjádřená v jednotkách aktivity na mg proteinu (U/mg). i i m ···· »· · • · • · « • · • Μ · « ·· ·· · ·· ·· · · • · • · ♦ · · • · • · · · • · 1 » · ··· ···· • 1 · 29

Extinkční koeficient lmM kyseliny močové při 292 nm je 12,2 nAfVm'1. Proto oxidace 1 mikromolu kyseliny močové na ml reakční směsi vedla k poklesu absorbance 12,2 Π1Α292. Změna v absorbanci s časem (ΔΑ292 za minutu) byla odvozená z lineárního úseku křivky.

Koncentrace proteinu byla stanovena s použitím modifikované Bradfordovy metody (Macart a Gerbaut, (1982) Clin Chim Acta 122, 93-101). Specifická aktivita (účinnost) urikázy byla vypočítaná vydělením aktivity v U/ml koncentrací proteinu v mg/ml. Výsledky enzymové aktivity různých rekombinantních urikáz jsou shrnuty v Tabulce 4. Jako referenční hodnoty jsou v této tabulce použity výsledky u komerčních přípravků. Z těchto výsledků je zřejmé, že zkrácení urikázových proteinů jejich enzymatickou aktivitu významně neovlivňuje.

Tabulka 4. Souhrn kinetických parametrů rekombinantních a nativních urikáz

Urikázy Koncentrace(1) zásobního roztoku (mg/ml) Specifická aktivita (U/mg)(2) Km(4) (μΜ kyseliny močové) Kcatp) (1/min) Rekombinantní Prasečí 0,49 7,41 4,39 905 Prasečí-ΔΝ 0,54 7,68 4,04 822 Prasečí KS 0,33 7,16 5,27 1085 Prasečí KS-ΔΝ 1,14 6,20 3,98 972 PBC 0,76 3,86 4,87 662 PBC-ANC 0,55 3,85 4,3 580 Králičí 0,44 3,07 4,14 522 Nativní Prasečí (Sigma) 2,70 3,26 5,85 901 A. flavus (Merck) 1,95 0,97 23,54 671

Poznámky k Tabulce 4: (1) Koncentrace proteinu byla stanovena z absorbance měřené při 278 nm, s použitím extinkčního koeficientu 11,3 pro roztok urikázy 10 mg/ml (Mahler, 1963). (2) 1 jednotka aktivity urikázy je definovaná jako množství enzymu, které oxiduje 1 mikromol kyseliny močové na alantoin za minutu při 25 °C. (3) Hodnoty specifické aktivity byly odvozené z Lineweaverovy a Burkovy rovnice, při koncentraci substrátu ekvivalentní 60 μΜ. • · · · ·· · · ·* • · · · ·· · · ·*

• · · • · · • I · • · · » · · (4) Reakční směsi byly složené z různých kombinací následujících zásobních roztoků lOOmM sodnoboritanový pufr, pH 9,2 300μΜ kyselina močová v 50 mM sodnoboritanovém pufru, pH 9,2 1 mg/ml BSA v 50mM sodnoboritanovém pufru, pH 9,2 (5) Kcat byla vypočítaná vydělením Vmax (vypočítaná zodpovídajících Lineweaverových a Burkových rovnic) koncentrací urikázy v reakční směsi (vyjádřené v molámích ekvivalentech, na základě tetramemí molekulové hmotnosti urikázy). Příklad 5

Konjugace urikázy s m-PEG (PEGylace)

Prasečí KS-ΔΝ urikáza byl konjugovaná s použitím m-PEG-NPC (monomethoxy poly(ethylenglykol)nitrofenyl karbonátu). Byly stanovené podmínky, při kterých vznikalo 2 až 12 vláken 5 kDa, 10 kDa, nebo 20kDa PEG na podjednotce urikázy. Do roztoku proteinu byl postupně přidáván m-PEG-NPC. Po ukončení přidávání byla reakční směs PEG urikáza / m-PEG-NPC inkubovaná při 2-8 °C po dobu 16-18 hodin, aby se maximální počet volných vláken m-PEG konjugoval s urikázou.

Počet PEG vláken na monomer PEG-urikázy byl stanoven pomocí velikostně vylučující chromatografie na Superose 6 (SEC), s použitím standardů PEG a urikázy. Počet PEG vláken navázaných na podjednotku byl stanoven pomocí následujícího vztahu: PEG 3,42 x množství PEG v injikováném vzorku (pg) vlákna/podjednotka množství proteinu v injikovaném vzorku (pg)

Koncentrace jednotek PEG a proteinu ve vzorku PEG-urikázy byla stanovena velikostně vylučující chromatografií (SEC) s použitím UV a sériově uspořádaných refrakčních (RI) detektorů (viz Kunitani et al., (1991)). Byly generované tři kalibrační křivky: křivka proteinu (absorpce měřená při 220 nm), křivka proteinu (měřená RI), a křivka PEG (měřená RI). Poté byly s použitím stejného systému analyzovány vzorky PEG-urikázy. Pro výpočet koncentrací PEG a proteinu bylo použito srovnám výsledných hodnot oblasti UV a RI maxim experimentálních vzorků s kalibračními křivkami. Index 3,42 je poměr mezi molekulovou hmotností monomeru urikázy (34 192 Daltonů) a molekulovou hmotností lOkDa PEG. 31

Navázané PEG vylepšily rozpustnost urikázy v roztocích s fyziologickými hodnotami pH. Tabulka 5 ukazuje variabilitu mezi šaržemi produktu obsahujícího PEGylovanou prasečí urikázu KS-ΔΝ. Mezi počtem navázaných vláken PEG a uchovanou specifickou aktivitou (SA) enzymu je obecně inverzní vztah.

Tabulka 5. Enzymová aktivita konjugátů PEGylované prasečí KS-ΔΝ urikázy Šarže konjugátu PEG MW (kDa) Vlákna PEG na podjednotku urikázy Urikáza SA (U/mg) SA procento kontroly ΔΝ-prasečí KS 8,2 100 1-17# 5 9,7 5,8 70,4 LP-17 10 2,3 7,8 94,6 1-15# 10 5,1 6,4 77,9 13# 10 6,4 6,3 76,9 14# 10 6,5 6,4 77,5 5-15# 10 8,8 5,4 65,3 5-17# 10 11,3 4,5 55,3 4-17# 10 11,8 4,4 53,9 1-18# 20 11,5 4,5 54,4 Příklad 6

PEGylace urikázy s 1000D a 100 000D PEG

Prasečí urikáza KS-ΔΝ byla konjugovaná s použitím 1000D a 100 000D m-PEG-NPC postupem popsaným v Příkladu 5. Byly použity podmínky pro zavedení 2 až 11 vláken PEG na podjednotku urikázy. Po ukončení přidávání PEG byla reakční směs urikáza/m-PEG-NPC inkubovaná při 2-8 °C po dobu 16-18 hodin, aby se maximální počet volných vláken m-PEG konjugoval s urikázou.

Počet PEG vláken na monomer PEG-urikázy byl stanoven postupem popsaným výše.

Navázané PEG vylepšily rozpustnost urikázy v roztocích s fyziologickými hodnotami pH. 32 Příklad 7

Farmakokinetika konjugátu prasečí urikázy KS-ΔΝ s PEG

Pro stanovení optimálního rozsahu a velikosti PEGylace potřebné k poskytnutí terapeutického účinku byly provedeny biologické experimenty. Při farmakokinetických studiích na krysách s použitím i.v. injekcí 0,4 mg (2U) na kg tělesné hmotnosti nemodifikované urikázy, podávaných v den 1 a den 8, byl poločas v cirkulaci 10 minut. Avšak studie rychlosti clearence na krysách u 2 až 11 x lOkDa PEGylované prasečí urikázy KS ΔΝ, i po 9 týdenních injekcích ukázaly, že clearence nezávisí na počtu PEG vláken (v tomto rozmezí) a zůstala během doby studie relativně konstantní (viz Tabulka 6, poločas 30 hodin). Rozdíly mezi týdny jsou v rámci experimentální chyby. Stejný profil je zřejmý po 9 injekcích 10 x 5kD PEG a 10 x 20kD PEG - urikázových konjugátu. Výsledky získané na krysím modelu ukazují, že biologické účinky byly podobné nezávisle na použitém rozsahu PEGylace urikázy. 33 • · · · • · · · · · • · · · · ······· ·· ·

Tabulka 6. Poločasy přípravků PEGylované prasečí urikázy KS-ΔΝ na krysách

Rozsah modifikace (PEG vlákna na podjednotku urikázy) 5kDPEG lOkDaPEG 20kD PEG Týden lOx 2x 5x 7x 9x llx lOx 1 25,7 29,4 37,7 37,6 36,9 31,4 21,6 ±1,7 ±3,4 ±3,1 ±3,9 ±4,3 ±4,3 ±1,5 (5) (5) (5) (5) (5) (5) (5) 2 - - - 26,7 28,4 ±3,0 ±1,6 (5) (5) 3 27,5 29,0 29,9 32,7 26,3 11,8 14,5 ±3,8 ±2,6 ±11,7 ± 11,1 ±4,7 ±3,3 ±2,7 (5) (5) (5) (5) (5) (5) (5) 4 - - 27,1 18,4 19,7 - ±5,3 ±2,2 ±5,6 (5) (4) (4) 5 28,6 22,5 34,3 37,3 30,4 30,5 19,3 ±1,7 ±2,7 ±3,9 ±3,0 ±3,6 ±1,3 ±2,5 (5) (5) (4) (5) (5) (5) (5) 6 - 35,4 27,1 30,7 - ± 3,1 ±3,6 ±2,9 (14) (13) (13) 7 16,5 32,5 - - - 16,12 25,8 ±4,9 ± 4,3 ±2,7 ±2,5 (5) (5) (5) (5) 8 - - - - - - - 9 36,8 28,7 34,0 24,2 31,0 29,3 26,7 ±4,0 ±2,7 ±2,4 ±3,4 ± 2,6 ±1,4 ± 0,5 (15) (15) (13) (13) (13) (15) (15)

Poznámky k Tabulce 6: Výsledky jsou vyznačené v hodinách ± střední chyba. Čísla v závorkách udávají počet testovaných zvířat.

Krysám byly týdně podávány i.v. injekce 0,4 mg/kilogram tělesné hmotnosti prasečí urikázy KS-ΔΝ, jejíž modifikace jsou vyznačené v tabulce. V každé skupině bylo nejprve 15 krys, které byly střídavě odebírané v podskupinách po 5. V průběhu studie kvůli anestezi několik krys zemřelo. Poločasy byly stanoveny měřením urikázové aktivity (kolorimetrické stanovení) ve vzorcích plazmy odebíraných po 5 minutách a 6,24 a 48 hodin po injekci.

Tabulka 5 popisuje šarže PEGylované urikázy použité ve studii.

Studie biodostupnosti 6 x 5kD PEGylované prasečí urikázy KS-ΔΝ u králíků naznačují, že po první injekci je poločas v cirkulaci 98,2 ± 1,8 hodiny (i.v.) a biodostupnost • · · 34 • · po i.m. a podkožní (s.c.) injekci byla 71 % a 52 %. Po druhé i.m. a s.c. injekci byly však u všech králíků detekovány signifikantní titry protilátek, a po následných injekcích byla clearence zrychlená. Injekce stejného konjugátu u krys poskytla výsledný poločas 26 ± 1,6 hodiny (i.v.) a biodostupnost po i.m. a s.c. injekcích byla 33 % a 22 %.

Studie na krysách prováděné s9 x lOkDa PEGylovanou prasečí urikázou KS-ΔΝ naznačují, že po první injekci je poločas v cirkulaci 42,4 hodiny (i.v.) a biodostupnost po i.m. a s.c. injekci byla 28,9 % a 14,5 % (viz Obrázek 5 a Tabulka 7). Po čtvrté injekci byl poločas v cirkulaci 32,1 ± 2,4 hodiny a biodostupnost po i.m. a s.c. injekci byla 26,1 % a 14,9 %.

Podobné farmakokinetické studie prováděné u králíků s9 x lOkDa PEGylovanou prasečí urikázou KS-ΔΝ naznačují, že následně po injekci tohoto konjugátu (po dobu 4 týdnů byla podávána injekce dvakrát týdně) nebyla žádná zrychlená clearence pozorovaná. U těchto zvířat byl po první injekci poločas v cirkulaci 88,5 hodiny (i.v.) a biodostupnost po i.m. a s.c. injekci byla 98,3 % a 84,4 % (viz Obrázek 6 a Tabulka 7). Po čtvrté injekci byl poločas v cirkulaci 141,1±15,4 hodiny a biodostupnost po i.m. a s.c. injekcích byla 85 % a 83 %.

Podobně byly provedeny studie s 9x10 kDa PEGylovanou prasečí urikázou KS-ΔΝ pro stanovém biodostupnosti u psů beaglů (v každé skupině byli 2 samci a 2 samice). Po první i.v. injekci byl naměřen poločas v cirkulaci 70 ± 11,7 hodiny a biodostupnost po i.m. a s.c. injekcích byla 69,5 % a 50,4 % (viz Obrázek 7 a Tabulka 7).

Byly provedeny studie s přípravky obsahujícími 9 x lOkDa PEGylovanou prasečí urikázu KS-ΔΝ na prasatech. Pro i.v., s.c. a i.m. způsoby podávám byla použita tři zvířata ve skupině. Po první i.v. injekci byl naměřen poločas v cirkulaci 178 ± 24 hodiny a biodostupnost po i.m. a s.c. injekcích byla 71,6 % a 76,8 % (viz Obrázek 8 a Tabulka 7). 35

Tabulka 7. Farmakokinetická studie provedená s9xl0kDa PEGylovanou prasečí urikázou KS-ΔΝ

Injekce # Poločas (hodiny) Biodostupnost i.v. i.m. s.c. Krysy 1 42,4 ±4,3 28,9 % 14,5 % 2 24,1 ± 5,0 28,9 % 14,5 % 4 32,1 ± 2,4 26,1 % 14,9 % Králíci 1 88,5 ± 8,9 98,3 % 84,4 % 2 45,7 ±40,6 100% 100 % 4 141,1 ± 15,4 85% 83% Psi 1 70,0 ±11,7 69,5 % 50,4 % Prasata 1 178 ±24 71,6% 76,8 %

Studie absorpce, distribuce, metabolismu a vylučování (ADME) byly provedeny po jodaci 9 x lOkDa PEGylované prasečí urikázy KS-ΔΝ s použitím 125I způsobem dle Boltona & Huntera. Značený konjugát byl injikován 7 skupinám po 4 krysách (2 samci a 2 samice). Distribuce radioaktivity byla analyzována po 1 hodině a každých 24 hodin po dobu 7 dní (s výjimkou pro den 5). Všechny skupiny byly postupně usmrceny a byly vyjmuty a analyzovány různé orgány. Sedmá skupina byla držena v metabolické kleci, ze které byla sbírána moč a výkaly. Distribuce látky ve zvířecím těle byla určená po změření celkové radioaktivity v každém orgánu a poměrné části (v ledvinách, játrech, plicích a slezině), která se srážela s TCA (tzn. navázaný protein, normalizováno na velikost orgánu). Žádný z vyjmutých orgánů neměl specifickou radioaktivitu vyšší než ostatní, takže žádná významná akumulace ani v játrech nebo ledvinách pozorována nebyla. Do 7. dne bylo vyloučeno 70 % radioaktivity. 36 • · *0 Φ ·· · ·· · Příklad 8 Výsledky klinické studie

Randomizovaná, otevřená, multicentrická studie s paralelní skupinou byla provedena za účelem získám urátové odezvy a farmakokinetického a bezpečnostního profilu PEG-urikázy (Purikase®, Safient Pharmaceuticals) u lidských pacientů s hyperurikémií a těžkou dnou, u kterých nebyla odezva na konvenční léčbu nebo ktéto léčbě nebyli tolerantní. Průměrná délka choroby byla 14 let a 70 % studované populace trpělo jedním nebo více tofy. Při této studii bylo 41 pacientů (průměrný věk 58,1 let) randomizováno pro 12-týdenní léčbu intravenózní PEG-urikázou v jednom ze čtyř dávkovačích režimů: 4 mg každé dva týdny (7 pacientů), 8 mg každé dva týdny (8 pacientů), 8 mg každé čtyři týdny (13 pacientů), nebo 12 mg každé čtyři týdny (13 pacientů). V definovaných intervalech byla měřena aktivita urikázy v plazmě a hladiny urátů. Z analýzy aktivity urikázy a hladiny urátů byly odvozené farmakokinetické parametry, střední koncentrace urátů v plazmě a v procentech byla vyjádřena doba, po kterou byly uráty v plazmě nižší nebo rovné 6 mg/dl.

Největší pokles hladiny PUA pod 6 mg/dl po 92 % doby léčby byl zaznamenán u pacientů, kteří dostávali 8 mg PEG-urikázy každé dva týdny (před zahájením léčby byla koncentrace urátů v plazmě 9,1 mg/dl vs. střední koncentrace urátů v plazmě 1,4 mg/dl po 12 týdnech).

Také u dalších skupin léčených jinými dávkami PEG-urikázy bylo pozorováno podstatné a trvalé snížení hladiny urátů v plazmě: PUA nižší než 6 mg/ml po 86 % doby léčby ve skupině dostávající 8 mg každé čtyři týdny (koncentrace urátů v plazmě před zahájením léčby 9,1 mg/dl vs. průměrná koncentrace urátů v plazmě 2,6mg/dl po 12 týdnech), PUA nižší než 6 mg/ml po 84 % doby léčby ve skupině dostávající 12 mg každé čtyři týdny (koncentrace urátů v plazmě před zahájením léčby 8,5 mg/dl vs. průměrná koncentrace urátů v plazmě 2,6 mg/dl po 12 týdnech), a PUA nižší než 6 mg/ml po 73 % doby léčby ve skupině dostávající 4 mg každé dva týdny (koncentrace urátů v plazmě před zahájením léčby 7,6 mg/dl vs. průměrná koncentrace urátů v plazmě 4,2 mg/dl po 12 týdnech). Během prvních 24 hodin dávkování PEG-urikázy byl maximální procentuální pokles kyseliny močové v plazmě 72 % z výchozí hodnoty u subjektů, kterým byly podávány 4 mg / 2 týdny (p rovno .0002); 94 % u subjektů, kterým bylo podáváno 8 mg / 2 týdny (p menší než .0001), 87 % u subjektů, kterým bylo podáváno 8 mg / 4 týdny (p menší než .0001), a 93 % u subjektů, kterým bylo podáváno 12 mg / 4 týdny (p menší než .0001). 37 ·Μ· ·· ···· • · • ·

Během 12-týdenní léčby byl procentuální pokles kyseliny močové v plazmě z výchozí hodnoty 38 % u subjektů, kterým byly podávány 4 mg / 2 týdny (p rovno .0002), 86 % u subjektů, kterým bylo podáváno 8 mg / 2 týdny (p menší než .0001), 58 % u subjektů, kterým bylo podáváno 8 mg / 4 týdny (p rovno .0003) a 67 % u subjektů, kterým bylo podáváno 12 mg / 4 týdny (p menší než .0001). Překvapivě se u některých subjektů, kterým byla podávána PEG-urikáza, projevil vedlejší účinek spojený s infuzí, tzn. reakce na infiizi. Tyto reakce se vyskytly u 14 % z celkového počtu infuzí.

Plné zněm všech zde citovaných odkazů je zde zahrnuto formou odkazu ve smyslu stejného rozsahu, jako by zde bylo u každé individuální publikace nebo patentu nebo patentové přihlášky specificky uvedeno, že je začleněná formou odkazu ve smyslu plného znění.

Jak bude odborníkovi v oboru zřejmé, u předkládaného vynálezu lze provést mnoho modifikací a variací, aniž by se překročil jeho duch nebo rozsah. Zde popsaná specifická provedení jsou nabídnuta pouze jako ilustrativní příklad a vynález je limitován pouze přiloženými nároky společně s plným rozsahem analogie podstaty, na který jsou nároky vedeny.

Průmyslová využitelnost

Geneticky modifikované proteiny s urikolytickou aktivitou připravené podle předkládaného vynálezu jsou použitelné ke snížení hladiny kyseliny močové v biologické tekutině včetně krve.

Seznam sekvencí <110> Savient Pharmaceuticals, lne.

Hartman, Jacob Mendelovitz, Simona <120> Variantní formy urátoxidázy a jejich použití <130 103864-146638 <150>US 60/670 573 <151> 2005-04-11 <160> 16 <170> Patentln verze 3.3 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Urikáza z prasečích jater (sensní) <400> 1 gcgcgaattc catggctcat taccgtaatg actaca <210> 2 <211> 40

<212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Urikáza z prasečích jater (antisensní) <400>2 gcgctctaga agcttccatg gtcacagcct tgaagtcagc <210> 3 <211> 35

<212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Urikáza z paviáních jater DH3 (sensní) <400> 3 gcgcgaattc catggcccac taccataaca actat <210> 4 <211> 40

<212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Urikáza z paviáních jater DH3 (antisensní) <400> 4 gcgcccatgg tctagatcac agtcttgaag acaacttcct

<210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220 <223> urikáza PBC-ANC (sensní) <400> 5 gcgcatatga cttacaaaaa gaatgatgag gtagag <210> 6 <211> 54

<212> DNA <213> Umělá sekvence <220 <223> urikáza PBC-ANC (antisensní) <400> 6 ccgtctagat taagacaact tcctcttgac tgtaccagta atttttccgt atgg <210 7 <211> 299

<212> PRT <213> Umělá sekvence <220 <223> Prasečí-KS-ΔΝ <400>7

Met Thr Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe Val Arg Thr Gly Tyr 1 5 10 15

Gly Lys Asp Met ile Lys Val Leu His Ile Gin Arg Asp Gly Lys Tyr 20 25 30

His Ser ile Lys Glu Val Ala Thr Thr Val Gin Leu Thr Leu Ser Ser 35 40 45

Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn ser Asp Val ile Pro Thr Asp 50 55 60

Thr ile Lys Asn Thr val Asn val Leu Ala Lys Phe Lys Gly Ile Lys 65 70 75 80

Ser ile Glu Thr phe Ala val Thr ile Cys Glu His Phe Leu Ser Ser 85 90 95

Phe Lys His Val ile Arg Ala Gin Val Tyr val Glu Glu Val Pro Trp 100 105 110

Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly val Lys His val His Ala Phe Ile Tyr 115 120 125

Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu val Glu Gin Ile Arg Asn Gly 130 135 140

Pro Pro val Ile His ser Gly ile Lys Asp Leu Lys val Leu Lys Thr 145 150 155 160 41 V #·· • ···· Μ · • · • · • · ·Ι· · ·· · · • · • a • a ··· aaaa a· a a a · a a a a a a a a a a aa a

Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gin Phe Thr Thr Leu 165 170 175

Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin Val Tyr cys Lys Trp 180 185 190

Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr 195 200 205 val Arg ser ile Val Leu Gin Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly 210 215 220

Glu Tyr Ser Pro ser val Gin Lys Thr Leu Tyr Asp ile Gin Val Leu 225 230 235 240

Thr Leu Gly Gin val Pro Glu Ile Glu Asp Met Glu ile ser Leu Pro 245 250 255

Asn Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met ser Lys Met Gly Leu ile Asn 260 265 270

Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys ile Thr 275 280 285

Gly Thr val Lys Arg Lys Leu Ser ser Arg Leu 290 295 <210 8 <211> 298 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220 <223> Prasečí-KS-ΔΝ bez startovacího Met <400> 8

Thr Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe val Arg Thr Gly Tyr Gly 15 10 15

Lys Asp Met Ile Lys val Leu His Ile Gin Arg Asp Gly Lys Tyr His 20 25 30

Ser Ile Lys Glu val Ala Thr Thr val Gin Leu Thr Leu Ser Ser Lys 35 40 45

Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn ser Asp val Ile Pro Thr Asp Thr 50 55 60 ile Lys Asn Thr val Asn Val Leu Ala Lys Phe Lys Gly Ile Lys ser 65 70 75 80 42 42 ·«·« ¥ ·· ♦ # • • * • · • · • · • · • · · · • • · • · · • · ··· ···· 4« ·

Ile Glu Thr Phe Ala val Thr ile Cys Glu His Phe Leu ser ser Phe 85 90 95

Lys His val Ile Arg Ala Gin val Tyr Val Glu Glu Val Pro Trp Lys 100 105 110

Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val His Ala Phe ile Tyr Thr 115 120 125

Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu Gin Ile Arg Asn Gly Pro 130 135 140

Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys val Leu Lys Thr Thr 145 150 155 160

Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gin Phe Thr Thr Leu Pro 165 170 175

Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin val Tyr cys Lys Trp Arg 180 185 190

Tyr His Gin Gly Arg Asp val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr val 195 200 205

Arg ser Ile Val Leu Gin Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly Glu 210 215 220

Tyr ser Pro Ser val Gin Lys Thr Leu Tyr Asp Ile Gin val Leu Thr 225 230 235 240

Leu Gly Gin val Pro Glu ile Glu Asp Met Glu ile ser Leu Pro Asn 245 250 255

Ile His Tyr Leu Asn ile Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn Lys 260 265 270

Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr Gly 275 280 285

Thr val Lys Arg Lys Leu Ser ser Arg Leu 290 295 <210> 9 <211> 897 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Prasečí-KS-ΔΝΑ <400> 9 atgacttaca aaaagaatga tgaggtagag tttgtccgaa ctggctatgg gaaggatatg 60 ataaaagttc tccatattca gcgagatgga aaatatcaca gcattaaaga ggtggcaact 120 acagtgcaac tgactttgag ctccaaaaaa gattacctgc atggagacaa ttcagatgtc 180 atccctacag acaccatcaa gaacacagtt aatgtcctgg cgaagttcaa aggcatcaaa 240 agcatagaaa cttttgctgt gactatctgt gagcatttcc tttcttcctt caagcatgtc 300 atcagagctc aagtctatgt ggaagaagtt ccttggaagc gttttgaaaa gaatggagtt 360 aagcatgtcc atgcatttat ttatactcct actggaacgc acttctgtga ggttgaacag 420 ataaggaatg gacctccagt cattcattct ggaatcaaag acctaaaagt cttgaaaaca 480 acccagtctg gctttgaagg attcatcaag gaccagttca ccaccctccc tgaggtgaag 540 gaccggtgct ttgccaccca agtgtactgc aaatggcgct accaccaggg cagagatgtg 600 gactttgagg ccacctggga cactgttagg agcattgtcc tgcagaaatt tgctgggccc 660 tatgacaaag gcgagtactc gccctctgtc cagaagacac tctatgacat ccaggtgctc 720 accctgggcc aggttcctga gatagaagat atggaaatca gcctgccaaa tattcactac 780 ttaaacatag acatgtccaa aatgggactg atcaacaagg aagaggtctt gctaccttta 840 gacaatccat atggaaaaat tactggtaca gtcaagagga agttgtcttc aagactg 897 <210> 10 <211> 894

<212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <223> Prasečí-KS-ΔΝΑ bez startovacího ATG <400> 10 44 ·· ♦ ··♦ acttacaaaa agaatgatga ggtagagttt gtccgaactg gctatgggaa ggatatgata 60 aaagttctcc atattcagcg agatggaaaa tatcacagca ttaaagaggt ggcaactaca 120 gtgcaactga ctttgagctc caaaaaagat tacctgcatg gagacaattc agatgtcatc 180 cctacagaca ccatcaagaa cacagttaat gtcctggcga agttcaaagg catcaaaagc 240 atagaaactt ttgctgtgac tatctgtgag catttccttt cttccttcaa gcatgtcatc 300 agagctcaag tctatgtgga agaagttcct tggaagcgtt ttgaaaagaa tggagttaag 360 catgtccatg catttattta tactcctact ggaacgcact tctgtgaggt tgaacagata 420 aggaatggac ctccagtcat tcattctgga atcaaagacc taaaagtctt gaaaacaacc 480 cagtctggct ttgaaggatt catcaaggac cagttcacca ccctccctga ggtgaaggac 540 cggtgctttg ccacccaagt gtactgcaaa tggcgctacc accagggcag agatgtggac 600 tttgaggcca cctgggacac tgttaggagc attgtcctgc agaaatttgc tgggccctat 660 gacaaaggcg agtactcgcc ctctgtccag aagacactct atgacatcca ggtgctcacc 720 ctgggccagg ttcctgagat agaagatatg gaaatcagcc tgccaaatat tcactactta 780 aacatagaca tgtccaaaat gggactgatc aacaaggaag aggtcttgct acctttagac 840 aatccatatg gaaaaattac tggtacagtc aagaggaagt tgtcttcaag actg 894 <210> 11 <211> 304 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 11 45 • ·· ·

Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu val Glu Phe 15 10 15 val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys val Leu His Ile Gin 20 25 30

Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser ile Lys Glu val Ala Thr ser val Gin 35 40 45

Leu Thr Leu ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp 50 55 60 val ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr val Asn Val Leu Ala Lys 65 70 75 80

Phe Lys Gly ile Lys ser ile Glu Thr Phe Ala val Thr ile Cys Glu 85 90 95

His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His val ile Arg Ala Gin val Tyr val 100 105 110

Glu Glu val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val 115 120 125

His Ala Phe ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu val Glu 130 135 140

Gin ile Arg Asn Gly Pro Pro val ile His ser Gly ile Lys Asp Leu 145 150 155 160

Lys Val Leu Lys Thr Thr Gin ser Gly phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp 165 170 175

Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin 180 185 190

Val Tyr cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp val Asp Phe Glu 195 200 205

Ala Thr Trp Asp Thr val Arg ser ile val Leu Gin Lys Phe Ala Gly 210 215 220

Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr ser Pro Ser val Gin Lys Thr Leu Tyr 225 230 235 240 ·· · 46 ♦ ♦

Asp ile Gin val Leu Thr Leu Gly Gin val Pro Glu Ile Glu Asp Met 245 250 255

Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys 260 265 270

Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro 275 280 285

Tyr Gl£ Arg Ile Thr Gly Thr val Lys Arg Lys Leu Thr ser Arg Leu <210> 12 <211> 296 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> PBC-ANC <400> 12 47 • · · ·

·· • · ·· ·· % • « • • · • • ···♦

Met Thr Tyr Lys Lys Asn Asp Glu val Glu Phe val Arg Thr Gly Tyr 15 10 15

Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gin Arg Asp Gly Lys Tyr 20 25 30

His ser Ile Lys Glu val Ala Thr Thr val Gin Leu Thr Leu ser ser 35 40 45

Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp val ile Pro Thr Asp 50 55 60

Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn val Leu Ala Lys Phe Lys Gly ile Lys 65 70 75 80

Ser ile Glu Thr Phe Ala val Thr Ile Cys Glu His Phe Leu ser Ser 85 90 95

Phe Lys His val Ile Arg Ala Gin val Tyr val Glu Glu val Pro Trp 100 105 110

Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly val Lys His val His Ala Phe ile Tyr 115 120 125

Thr Pro Thr Gly Thr His Phe cys Glu val Glu Gin ile Arg Asn Gly 130 135 140 pro Pro val ile His Ser Gly ile Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Thr 145 150 155 160

Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly phe ile Lys Asp Gin Phe Thr Thr Leu 165 170 175 • · 48

Pro Glu val Lys Asp Arg cys Phe Ala Thr Gin val Tyr cys Lys Trp 180 185 190

Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp val Asp Phe Glu Ala Thr Trp asd Thr 195 200 205

Val Arg ser ile Val Leu Gin Lys Phe Ala Gly pro Tyr Asp Lys Gly

Glu Tyr ser pro Ser val Gin Lys Thr Leu Tyr Asp ile Gin val Leu 225 230 235 240

Ser Leu ser Arg val Pro Glu ile Glu Asp Met Glu ile Ser Leu Pro 245 250 255

Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys Met Gly Leu ile Asn 260 265 270

Lys Glu Glu val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly lvs ile Thr 275 280 285

Gly Thr val Lys Arg Lys Leu Ser 290 295

<210> 13 <211> 295 <212>PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> PBC-ANC bez startovacího Met <400> 13

Thr Tyr Lys Lys Asn Asp Glu val Glu Phe Val Arg Thr Gly Tyr Gly 1 5 10 15

Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gin Arg Asp Gly Lys Tyr His 20 25 30

Ser ile Lys Glu val Ala Thr Thr val Gin Leu Thr Leu Ser ser Lys 35 40 45

Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp val ile Pro Thr Asp Thr 50 55 60 ile Lys Asn Thr val Asn val Leu Ala Lys Phe Lys Gly ile Lys Ser 65 70 75 80 ile Glu Thr Phe Ala val Thr ile Cys Glu His Phe Leu ser Ser Phe 85 90 95

49

Lys His val Ile Arg Ala Gin val Tyr val Glu Glu val Pro Trp Lys 100 105 110

Arg Phe Glu Lys Asn Gly val Lys His val His Ala Phe ile Tyr Thr 115 120 125

Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu Gin Ile Arg Asn Gly Pro 130 135 140

Pro val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Thr Thr 145 150 155 160

Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe ile Lys Asp Gin Phe Thr Thr Leu Pro 165 170 175

Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin val Tyr Cys Lys Trp Arg 180 185 190

Tyr His Gin Gly Arg Asp val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr val 195 200 205

Arg ser ile val Leu Gin Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly Glu 210 215 220

Tyr ser Pro ser val Gin Lys Thr Leu Tyr Asp Ile Gin val Leu Ser 225 230 235 240

Leu Ser Arg val Pro Glu ile Glu Asp Met Glu ile Ser Leu Pro Asn 245 250 255 ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn Lys 260 265 270

Glu Glu val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr Gly 275 280 285

Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser 290 295

<210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> PBC-ANC (Fragment 44-56 PBC-ANC) <400> 14

Ala Thr Thr val Gin Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp <210> 15 <211> 936

<212> DNA <213> Papio hamadryas (pavián hamadryas) <400> 15 ccagaagaaa atggccgact accataacaa ctataaaaag aatgatgaat tggagtttgt 60 ccgaactggc tatgggaagg atatggtaaa agttctccat attcagcgag atggaaaata 120 tcacagcatt aaagaggtgg caacttcagt gcaacttact ctgagttcca aaaaagatta 180 cctgcatgga gataattcag atatcatccc tacagacacc atcaagaaca cagttcatgt 240 cttggcaaag tttaagggaa tcaaaagcat agaagccttt ggtgtgaata tttgtgagta 300 ttttctttct tcttttaacc atgtaatccg agctcaagtc tacgtggaag aaatcccttg 360 gaagcgtctt gaaaagaatg gagttaagca tgtccatgca tttattcaca ctcccactgg 420 aacacacttc tgtgaagttg aacaactgag aagtggaccc cccgtcatta cttctggaat 480 caaagacctc aaggtcttga aaacaacaca gtctggattt gaaggtttca tcaaggacca 540 gttcaccacc ctccctgagg tgaaggaccg atgctttgcc acccaagtgt actgcaagtg 600 gcgctaccac cagtgcaggg atgtggactt cgaggctacc tggggcacca ttcgggacct 660 tgtcctggag aaatttgctg ggccctatga caaaggcgag tactcaccct ctgtgcagaa 720 gaccctctat gatatccagg tgctctccct gagccgagtt cctgagatag aagatatgga 780 aatcagcctg ccaaacattc actacttcaa tatagacatg tccaaaatgg gtctgatcaa 840 caaggaagag gtcttgctgc cattagacaa tccatatgga aaaattactg gtacagtcaa 900 gaggaagttg tcttcaagac tgtgacattg tggcca 936

<210 16 <211> 304 <212> PRT <213> Papio hamadryas (pavián hamadryas) <400 16 51

Met 1 Ala Asp Tyr His 5 Asn Asn Tyr Lys Lys 10 Asn Asp Glu Leu Glu 15 Phe val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met val Lys Val Leu His Ile Gin 20 25 30 Arg Asp Gly Lys Tyr HiS Ser Ile Lys Glu val Ala Thr Ser val Gin 35 40 45 Leu Thr Leu ser Ser Lys Lys ASp Tyr Leu His Gly ASp Asn Ser Asp 50 55 60 Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr val His val Leu Ala Lys 65 70 75 80 Phe Lys Gly Ile Lys ser ile Glu Ala Phe Gly val Asn ile cys Glu 85 90 95 F ♦ • · · · · ·· · ·· · F ♦ • · · · · ·· · ·· · ι· · 52 • · · · • · · · · • · · · •·· » ·······

Tyr phe Leu ser ser Phe Asn His val Ile Arg Ala Gin val Tyr val 100 105 110

Glu Glu Ile Pro Trp Lys Arg Leu Glu Lys Asn Gly val Lys His Val 115 120 125

His Ala Phe Ile His Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu val Glu 130 135 140

Gin Leu Arg Ser Gly pro Pro val ile Thr ser Gly ile Lys Asp Leu 145 150 155 160

Lys val Leu Lys Thr Thr Gin ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp 165 170 175

Gin Phe Thr Thr Leu pro Glu val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin 180 185 190 val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Cys Arg Asp Val Asp Phe Glu 195 200 205

Ala Thr Trp Gly Thr ile Arg Asp Leu Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly 210 215 220

Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser val Gin Lys Thr Leu Tyr 225 230 235 240

Asp Ile Gin Val Leu Ser Leu Ser Arg val Pro Glu Ile Glu Asp Met 245 250 255

Glu ile Ser Leu Pro Asn ile His Tyr Phe Asn ile Asp Met Ser Lys 260 _________265 270 ______________

Met Gly Leu ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro 275 280 285 T^r L^s I^e T^r T^r Va^ Lys Ar9 Lys Leu Ser ser Arg Leu 290 295 300

Claims (24)

1. PATENTOVÉ NÁROKY έ9Γ 7s Izolovaná zkrácená savčí urikáza, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci savc urikázy zkrácené na aminovém konci, nebo karboxylovém konci, nebo na aminovém i karboxylovém konci o 1 - 13 aminokyselin, a dále obsahuje substituci aminokyšelmy v poloze 46. Urikáza podle nároku 1, která na aminovém konci obsahuje aminokyselinu, přičemž touto aminokyselinou je alanin, glycin, prolin, serin nebo threonin. Urikáza podle nároku 2, kde aminokyselina na aminovém konci je threonin. Urikáza podle nároku 1, kde substituce je provedena threoninem nebo alaninem. Urikáza podle nároku 3, kde substituce je provedena threoninem. Urikáza podle nároku 5, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 8. Urikáza podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, která je konjugovaná s polymerem. Konjugát polyethylenglykol-urikáza, který obsahuje urikázu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6. Konjugát podle nároku 8, který obsahuje 2 až 12 molekul polyethylenglykolu na každé podjednotce urikázy. Konjugát podle nároku 9, který obsahuje 3 až 10 molekul polyethylenglykolu na podjednotku urikázy. Konjugát podle nároku 8, kde každá molekula polyethylenglykolu má molekulovou hmotnost v rozmezí 1 až 100 kDa. Konjugát podle nároku 11, kde každá molekula polyethylenglykolu má molekulovou hmotnost v rozmezí 1 až 50 kDa. 54 1 4 • · ··· · • ···· · ·· Μ · ···»·· · • · · · · · · • · · · · · · ··· t ······♦ ·· ·
2. 13. Konjugát podle nároku 12, kde každá molekula polyeťhylenglykolu má molekulovou hmotnost v rozmezí 5 až 20 kDa.
3. 14. Konjugát podle nároku 13, kde každá molekula polyethylenglykolu má molekulovou hmotnost 10 kDa.
4. 15. Farmaceutický přípravek, vyznačující se t í m, že obsahuje urikázu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5.
5. 16. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje konjugát podle nároku 8.
6. 17. Přípravek podle nároku 15, vyznačující se tím, že je vhodný pro opakované podávání.
7. 18. Přípravek podle nároku 16, v y z n a č u j í c í se t í m, že je vhodný pro opakované podávám.
8. 19. Způsob snížení hladiny kyseliny močové v biologické tekutině u subjektu s touto potřebou, vyznačující se t í m, že se subjektu podává přípravek podle nároku 15.
9. 20. Způsob snížení hladiny kyseliny močové v biologické tekutině u subjektu s touto potřebou, vyznačující se t í m, že se subjektu podává přípravek podle nároku 16.
10. 21. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že biologická tekutina je krev.
11. 22. Způsob podle nároku 20, v y z n a č u j í c í se t í m, že biologická tekutina je krev.
12. 23. Izolovaná urikáza obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 14. 55

    φφ φφφ · φ • φ Φ Φ Φ φ Φ φ φφφ ΦΦ·Φ φ φ
13. 24. Izolovaná zkrácená savčí urikáza podle nároku 1, kde N-koncovou aminokyselinou je methionin.
14. 25. Urikáza podle nároku 24, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 7.
15. 26. Izolovaná nukleová kyselina, která obsahuje sekvenci nukleových kyselin kódující urikázu podle nároku 1, nároku 3, nároku 6, nároku 24 nebo nároku 25.
16. 27. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 26, kde sekvence nukleových kyselin je operativně připojena k heterolognímu promotoru. 8. Nukleová kyselina podle nároku 27, kde promotor je promotor osmB.
17. 29. Vektor obsahující nukleovou kyselinu podle nároku 27.
18. 30. Hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 29.
19. 31. Izolovaná nukleová kyselina, která obsahuje sekvenci nukleových kyselin kódující urikázu obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 7 nebo SEQ ID č. 8.
20. 32. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 31, kde sekvence nukleových kyselin obsahuje sekvenci SEQ ID č. 9 nebo SEQ ID č. 10.
21. 33. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 31, kde sekvence nukleových kyselin je operativně připojena k heterolognímu promotoru.
22. 34. Nukleová kyselina podle nároku 33, kde promotor je promotor osmB.
23. 35. Vektor obsahuj ící nukleovou kyselinu podle nároku 3 3. 36. Hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 35. Λ • ·««· · ·* ·· Mkl ·· · ······ · • * · · · · · 56 9· * · ····· • · · · · # · ··· » ··· *··· ·· ·
24. 37. Způsob přípravy urikázy, vyznačující se t í m, že se hostitelská buňka podle nároku 30 nebo nároku 36 kultivuje za podmínek, kdy hostitelská buňka exprimuje sekvenci nukleových kyselin, a exprimovaná urikáza se izoluje.