DE69919701T2

DE69919701T2 - Abtrennung von antikörper-monomeren von deren multimeren mittels ionaustausch-chromatographie

Info

Publication number: DE69919701T2
Application number: DE69919701T
Authority: DE
Inventors: Deborah Ansaldi; Philip Lester
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1998-06-01
Filing date: 1999-05-24
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2019-05-25
Also published as: IL139609A0; DK1084136T3; JP2002517406A; JP2006071646A; EP1084136A1; EP1084136B1; CA2333747A1; JP2004175806A; AU4205999A; US20020010319A1; CA2333747C; WO1999062936A1; DE69919701D1; ATE274522T1; IL139609A; US20040116674A1; US6620918B2; AU750977B2; PT1084136E; IL173432A0

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abtrennen von Antikörpermonomeren von Dimeren und/oder anderen Multimeren unter Verwendung von Ionenaustauschchromatographie.
Beschreibung des Hintergrundes und des verwandten Stands der Technik
Versuche, authentisches, richtig gefaltetes Protein von rekombinanten Wirtszellen zu reinigen, sind aufgrund der Tertiärstruktur des Moleküls enttäuschend gewesen. In dieser Hinsicht führt die Reinigung der rekombinant hergestellten Moleküle oft zu einer heterogenen Mischung, die zu großen Teilen aus inaktiven, falsch gefalteten, unlöslichen und/oder löslichen Dimeren, Multimeren und Disulfid-verbundenen Aggregaten besteht. Andere abartige Moleküle wie Fragmente, mit Strangbrüchen versehene, oxidierte und glykosierte Formen können auch vorhanden sein. Die Reinigung ist daher schwierig und die Ausbeuten an authentischem Monomer sind oft gering. Siehe beispielsweise Elliott et al., J. Protein Chem., 9: 95-104 (1990).
Verschiedene Techniken sind verwendet worden, um diese Probleme zu korrigieren. Beispielsweise beschreiben Chang & Swartz, Protein Folding: in vivo and in vitro (American Chemical Society, 1993), Seiten 178-188, ein Verfahren zum Lösen von aggregiertem IGF-1, das in E. coli hergestellt worden war, unter Verwendung von geringen Konzentrationen an Harnstoff und Dithiothreitol (DTT) in einem alkalischen Puffer. US-Patent Nr. 5,231,178 beschreibt ein Verfahren für die Reinigung von korrekt gefaltetem, monomerem IGF-1 von P. pastoris unter Verwendung einer Kombination von Kationenaustausch-, hydrophober Interaktions- und Gel-Filtrationschromatographie. WO 96/40776 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von authentischem, richtig gefaltetem IGF aus Hefe unter Verwendung einer ersten Kationenaustauschchromatographie mit dem Hefezellenmedium, Denaturierung und Chromatographie, und Durchführen von Revers-Phasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie (reverse phase high performance liquid chromatography).
Das Abtrennen von Protein und Peptidmonomeren von deren Dimeren, Tetrameren und Multimeren stellt eine ernsthafte Herausforderung für den Abtrennungs-Wissenschaftler dar. Größen-Ausschluss-Chromatographie (Sizeexclusion chromatography (SEC)) und tangentiale Flussfiltration (tangential-flow filtration (TFF)) (US-Patente Nr. 5,256,294 und 5,490,937) sind dazu verwendet worden, Monomere von Aggregaten abzutrennen, haben aber Einschränkungen. SEC kann Monomere von Multimeren abtrennen, und in manchen Fällen Monomere von Dimeren. Die hauptsächlichen Beschränkungen von SEC sind 1) beschränkte Ladevolumen (typischerweise 5% des Bett-Volumens) erfordern große Säulen oder eine Vielzahl von Zyklen, 2) und die Ladeproteinkonzentration (tiefe Konzentration der zuzuführenden Stammlösungen erfordern vorhergehende Konzentration oder eine Vielzahl von Zyklen auf der Säule. Höhere Proteinkonzentrationen können visköser sein, wodurch die Abtrennungseffizienz reduziert wird). Historisch gesehen kann TFF Proteinmultimere abtrennen, die 10 Mal größer als das Monomer sind. US-Patent Nr. 5,256,294.
US-Patente Nr. 4,228,154 und 5,250,663 offenbaren Abtrennungen von Albumin von Mischungen. US-Patent Nr. 4,228,154 beschreibt die Verwendung sowohl von Kationenaustausch- als auch Anionenaustauschchromatographie-Schritten für die Reinigung, ohne Abtrennung des Monomers von Multimeren.
Die japanische Patentanmeldung H7-285885 beschreibt ein Verfahren zum Abtrennen von Immunoglobulinmonomer von einer Mischung enthaltend Monomer und Polymere, bei dem die Mischung der Immunoglobuline auf ein Kationenaustauschharz aufgetragen wird. Dieses Verfahren schließt eine Filtration ein, aber nicht eine Elution irgendwelcher Stoffe.
Jiskoot W., et al. J. Immunol. Methods, 124(1): 143-56 (1989) beschreiben die Reinigung eines monoklonalen Antikörpers des IgG1-Isotyps aus Zellkulturüberstand durch ein chromatographisches Verfahren mit zwei Schritten, einschließlich Protein-A-Affinitätschromatographie und Q-Sepharose-Anionenaustauschchromatographie. Die Trennung eines Monomers von seinen Dimeren oder Multimeren ist nicht beschrieben.
Lynch, P. und Londo, T. Genetic Engineering News, November 1, 1997: 17 beschreiben, dass Kationenaustauschchromatographie bei der Trennung von aggregierten Formen von monomeren Formen von monoklonalen Antikörpern wirksam ist. Die Trennung eines Monomers von seinen Dimeren oder Multimeren ist nicht beschrieben.
Karlson, E. et al. in „Protein Purification, Principles, High-Resolution Methods, and Applications", Janson, J.-C. und Ryden, L., Hrsg., John Wiley & Sons, Inc., Zweite Auflage, stellen das Gebiet der Ionenaustauschchromatographie in einem Übersichtsartikel dar. Auf Seite 158 wird offenbart, dass die Dimere eines Kobra-Neurotoxins ein anderes chromatographisches Verhalten als die monomere Form zeigen, wenn sie auf Bio-Rex 70 bei pH 6,5 oder auf CM 52 bei pH 5,2 chromatographiert werden.
Es besteht ein Bedürfnis für eine Abtrennung von Monomeren von Dimeren und Multimeren, die zufriedenstellend ist, nur die Verwendung eines Ionenaustauschschrittes benötigt und die nicht die Beschränkungen von SEC oder TFF aufweist.
Zusammenfassung der Erfindung
Dementsprechend betrifft diese Erfindung ein Verfahren zum Abtrennen eines Antikörpermonomers von einer Mischung umfassend Dimere und/oder Multimere, wobei das Verfahren das Auftragen der Mischung auf entweder ein Kationenaustausch- oder ein Anionenaustauschchromatographieharz in einem Puffer umfasst, wobei, falls das Harz ein Kationenaustauscher ist, der pH des Puffers etwa 4-7 ist, und wobei, falls das Harz ein Anionenaustauscher ist, der pH des Puffers etwa 6-9 ist, und das Eluieren der Mischung bei einem Gradienten von 0-1 M eines Elutionssalzes, wobei das Monomer von den in der Mischung vorhandenen Dimeren und/oder Multimeren abgetrennt wird, wobei, falls Citrat als Puffer verwendet wird, dieses bei einer Konzentration von unter 20 mM verwendet wird, wie in den Ansprüchen bestimmt.
In dieser Studie wird gezeigt, dass Ionenaustauschchromatographie – entweder Anionen oder Kationen – ein effektives Mittel zum Abtrennen von Protein- oder Antikörpermonomeren von deren Dimeren und/oder Multimeren darstellt. Die Abtrennungen werden unter Verwendung einer schrittweisen oder linearen Gradientenelution durchgeführt. Ionenaustausch hat verschiedene Vorteile gegenüber den oben beschriebenen SEC- und TFF-Verfahren. Zunächst ist die Abtrennung unabhängig von der Polypeptid-Konzentration in dem Lademittel und daher ist keine vorhergehende Konzentration erforderlich. Zweitens können die Harze mit mehr als 30 mg Polypeptid/ml Harz beladen werden und erreichen dennoch hervorragende Abtrennungen. Drittens sind Ionenaustauschharze billig und einfach zu verwenden. Typische Abtrennungen erreichen eine Anreicherung von Monomer bis mehr als 99,5% Reinheit und Ausbeuten oberhalb von 90 %.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A und 1B zeigen die Abtrennung von U226 IgE Monomer von Dimeren und Multimeren auf einer RESOURCE Q^TM Anionenaustauschsäule. Die Säule wurde in 25 mM Tris/pH8 equilibriert und mit einem Gradienten von 0-0,5 M Natriumchlorid über 10 Säulenvolumen eluiert. 1A zeigt den ganzen Bereich, 1B ist eine nähere Ansicht, um die Dimere und Multimere zu zeigen.
2A1, 2A2, 2B und 2C zeigen die Abtrennung von anti-IgE monoklonalem Antikörper-Monomer von Dimeren und Multimeren. 2A1 und 2A2 wurden auf einer RESOURCE Q^TM Anionenaustauschsäule laufen gelassen. 2A1 zeigt den ganzen Bereich, 2A2 ist eine nähere Ansicht, um die Dimere und Multimere zu zeigen. 2B ist ein Lauf auf einem Q-SEPHAROSE FAST-FLOW^TM Harz. 2C stellt Monomere und Dimere/Multimere dar, die in Fraktionen beobachtet wurden, wobei die offenen Punkte Monomere und die gefüllten Punkte Dimere darstellen. Die Monomere und Dimere/Multimere wurden unter Verwendung einer SUPERDEX 200 HR^TM 10/30 analytischen Größenausschlusssäule (Pharmacia Biotech.) bestimmt. In allen Fällen wurden die Säulen in 25 mM Tris/pH 8 equilibriert. Der in 2A verwendete Gradient war 0-0,5 M Natriumchlorid über 40 Säulenvolumen. Der für 2B verwendete Gradient (Q-SEPHAROSE FAST-FLOW^TM) war 0.05-0.2 M NaCl über 10 Säulenvolumen.
3A–3C zeigen die Abtrennung von BSA Monomer und Dimer über eine RESOURCE Q^TM Anionenaustauschsäule bei pH B. Die Säule wurde in 25 mM Tris/pH 8 equilibriert und mit einem Gradienten von 0,125-0,275 M Natriumchlorid über 40 Säulenvolumen eluiert. 3A ist ein gereinigtes Monomer. 3B ist ein gereinigtes Dimer und 3C ist eine kommerzielle Präparation von BSA (Bayer), die sowohl Monomere wie auch Dimere enthält.
4A–4C zeigen die Abtrennung von BSA Monomer und Dimer auf einer RESOURCE Q^TM Anionenaustauschsäule bei pH 6. Die Säule wurde in 20 mM Natriumphosphat/pH 6 equilibriert und mit einem linearen Gradienten von 0-0,5 M Natriumchlorid über 10 Säulenvolumen eluiert. 4A ist gereinigtes Monomer, 4B ist gereinigtes Dimer und 4C ist eine kommerzielle Präparation von BSA (Bayer), die sowohl Monomer wie Dimer enthält.
5A und 5B zeigen die Abtrennung von Anti-IgE monoklonalem Antikörper-Monomer von Dimeren und Multimeren auf einer RESOURCE S^TM Kationenaustauschsäule bei pH 6. Die Säule wurde in 20 mM Natriumphosphat/pH 6 equilibriert und mit einem linearen Gradienten von 0-0,05 M Natriumchlorid über 30 Säulenvolumen eluiert. 5A ist das Chromatogramm von der Abtrennung, und 5B ist eine Darstellung von Monomeren und Dimeren/Multimeren, die in Fraktionen beobachtet wurden, unter Verwendung derselben Methode wie in 2 beschrieben, wobei die offenen Punkte Monomere und die gefüllten Punkte Dimere darstellen.
6A und 6B zeigen die Abtrennung von BSA Monomer und Dimer auf einer RESOURCE S^TM Kationenaustauschsäule bei pH 4,3. Die Säule wurde in 20 mM Natriumacetat/pH 4,3 equilibriert, dann mit einem Gradienten von 0-1 M Natriumchlorid über 20 Säulenvolumen eluiert. 6A ist gereinigtes Monomer, und 6B ist gereinigtes Dimer.
Genaue Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Definitionen
Wie hier verwendet, bezieht sich „Polypeptid" im Allgemeinen auf Peptide und Proteine mit mehr als 10 Aminosäuren. Vorzugsweise sind die Proteine „exogen", was bedeutet, dass sie „heterolog" sind, d. h. fremd für die verwendete Wirtszelle, wie ein humanes, in E. coli hergestelltes Protein. Sie können allerdings auch von nativen Quellen abstammen, in denen sie natürlicherweise vorhanden sind.
Beispiele von Säuger-Polypeptiden schließen Moleküle ein, wie beispielsweise Renin, ein Wachstumshormon einschließlich humanem Wachstumshormon; bovinem Wachstumshormon; Wachstumshormon-Releasing-Factor, parathyroidem Hormon, Thyroid stimulierendem Hormon, Lipoproteine, 1-Antitrypsin; Insulin A-Kette; Insulin B-Kette, Proinsulin; Thrombopoietin; follikelstimulierendes Hormon; Calcitonin; luteinisierendes Hormon; Glucagon; Gerinnungsfaktoren wie Faktor VIIIC, Faktor IX, Gewebefaktor, und Phon-Willebrand-Faktor; Antigerinnungsfaktoren wie Protein C; atrialer naturietischer Faktor; Lungensurfactant; ein Plasminogenaktivator wie eine Urokinase oder ein humaner Plasminogenaktivator (t-PA) vom urinären oder Gewebetyp; Bombesin; Thrombin, hämopoetischer Wachstumsfaktor; Tumor Necrose Faktor-Alpha und – Beta; Enkephalinase; ein Serum Albumin wie humanes Serum Albumin; mullerianinhibierende Substanz; Relaxin A-Kette; Relaxin B-Kette; Prorelaxin; Maus-Gonadotropin-assoziiertes Peptid; ein mikrobielles Protein wie Beta-Lactamase; DNase; Inhibin; Activin; vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF); Rezeptoren für Hormone oder Wachstumsfaktoren; Integrin; Protein A oder D; rheumatoide Faktoren; ein neurotropher Faktor wie gehirnabstammender neurotropher Faktor (Brain Derived Neurotrophic Factor, BDNF); Neurotrophin-3, -4, -5, oder -6 (NT-3, NT-4, NT-5 oder NT-6), oder ein Nervenwachstumsfaktor wie NGF; Cardiotrophine (Cardiac Hypertrophy Factor) wie Cardiotrophin-1 (CT-1); von Blutplättchen stammender Wachstumsfaktor (Platelet-Derived Growth Factor (PDGF)); Fibroblasten-Wachstumsfaktor (Fibroblast Growth Factor) wie aFGF und bFGF; Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF); transformierender Wachstumsfaktor (Transforming Growth Factor (TGF)) wie TGF-α und TGF-β, einschließlich TGF1, TGF2, TGF3, TGF4 oder TGFS; insulinähnlicher Wachstumsfaktor I und II (Insulin-like Growth Factor I and II, IGF-I und IGF-II), des(1-3)-IGF-I (Gehirn IGF-I); Bindungsproteine für insulinähnlichen Wachstumsfaktor (Insulin-like Growth Factor Binding Proteins); CD Proteine wie CD-3, CD-4, CD-8 und CD-19; Erythropoetin; osteoinduktive Faktoren; Immunotoxine; ein knochenmorphogenetisches Protein (a bone morphogenetic protein, BMP); ein Interferon wie Interferon-Alpha, -Beta und -Gamma; Serum Albumin wie humanes Serum Albumin (HSA) oder bovines Serum Albumin (BSA); koloniestimulierende Faktoren (Colony Stimulating Factors, CSFs), z. B. M-CSF, GM-CSF und G-CSF; Interleukine (ILs) z. B. IL-1 bis IL-10; Anti-HER-2 Antikörper; Superoxid-Dismutase; T-Zell-Rezeptoren; Oberflächenmembranproteine; abbauverstärkender Faktor (Decay Accelerating Factor); virale Antigene wie beispielsweise ein Teil der AIDS-Hülle; Transportproteine; Homing Rezeptoren; Addressine; Regulatorische Proteine; Antikörper; und Fragmente von irgendeinem der oben aufgeführten Polypeptide. Beispiele von Säuger-Polypeptiden schließen Enzyme, Hormone, Cytokine, Albumine, Chemokine, Immunotoxine, virale Komponenten, Antikörper, Neutrophine und Antigene ein. Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind Antikörper und Fragmente davon.
Die bevorzugten Antikörper von Interesse sind Säugerantikörper. Solche geeigneten Antikörper schließen Antikörper ein wie anti-IgE, anti-CD20, anti-IgG, anti-CD11a, anti-CD18, anti-VEGF und anti-HER-2. Besonders bevorzugte Säugerantikörper schließen beispielsweise ein anti-HER-2, anti-CD11a, anti-CD18, antiVEGF, anti-CD20, anti-IgE und anti-IgG. Als Antikörper ist besonders bevorzugt anti-IgE, anti-IgG, anti-HER-2, anti-CD11a, anti-CD18, anti-CD20 oder anti-VEGF.
Für die vorliegenden Zwecke enthält die „Mischung" Monomere und entweder Dimere oder Multimere oder sowohl Dimere als auch Multimere. Typischerweise ist die Mischung eine biologische Flüssigkeit, was irgendeine Flüssigkeit bezeichnet, die von Zellen, Zellkomponenten oder Zellprodukten abstammt oder diese enthält. Biologische Flüssigkeiten schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Fermentationsmedien, Zellkulturüberstände, Zelllysate, gereinigte Zelllysate, Zellextrakte, Gewebsextrakte, Blut, Plasma, Serum, Sputum, Samenflüssigkeit, Mucus, Milch und Fraktionen davon. Diese Definition schließt zellkonditioniertes Kulturmedium ein, was ein Nährmedium bezeichnet, in dem Zellen kultiviert worden sind und das Zellprodukte enthält.
Für die vorliegenden Zwecke bezieht sich „Ionenaustauschchromatographieharz" auf ein Chromatographiemedium für die Anionen- oder Kationenaustauschabtrennung.
Wie hier verwendet, bezieht sich „Elutionssalz" auf ein Erdalkali-, Alkalimetall- oder Ammoniumsalz, d. h. ein Salz, das ein Kation von Erdalkali oder Alkalimetallelementen oder ein Ammoniumkation aufweist und das ein anorganisches oder organisches (auf Kohlenwasserstoff basierendes) Anion aufweist. Beispiele solcher Salze schließen Natriumchlorid, Ammoniumchlorid, Natriumcitrat, Kaliumcitrat, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid, Kalciumchlorid, Natriumphosphat, Kalciumphosphat, Ammoniumphosphat, Magnesiumphosphat, Kaliumphosphat, Natriumsulfat, Ammoniumsulfat, Katiumsulfat, Magnesiumsulfat, Kalciumsulfat etc. ein. Bevorzugte Salze sind hier Chloride oder Sulfate. Das hier am meisten bevorzugte Salz ist Natriumchlorid.
Wie hier verwendet, bezieht sich „Multimer" auf n-mere, bei denen n 3-10 ist, d.h. Polymere, die nicht Dimere sind, aber Aggregate ausschließen. Im Gegensatz zu Multimeren haben Aggregate einen Wert für n größer als 10 und/oder ein Molekulargewicht von größer als 2 Mio. Dalton und/oder sind Spezies, die in einem Ausschlussvolumen von analytischen Größen-Ausschluss-Chromatographie-Säulen wie von SUPEROSE 6^TM (Pharmacia) enthalten sind.
Möglichkeiten zum Ausführen der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abtrennen von Monomeren von Antikörpern von deren Dimeren oder Multimeren oder von beiden. Das Verfahren schließt das Platzieren der Mischung von Monomeren und Dimern und/oder Multimeren, von irgendeiner Quelle, in einem Equilibrierungspuffer bei einem pH im Bereich von etwa 4 und 9 ein, abhängig davon, ob das Harz, das für die chromatographische Abtrennung verwendet wird, ein Kationen- oder ein Anionenaustauschharz ist. Die resultierende Mischung wird entweder auf ein Kationenaustausch- oder ein Anionenaustauschchromatographieharz geladen, um all die n-mere (Monomere, Dimere, Trimere, Tetramere etc.) zu fangen, die in der Mischung vorhanden sind. Bei der Ionenaustauschsäulenchromatographie können Liganden mit allgemeiner Affinität verwendet werden, um die gewünschten Selektivitäten und Bindungseigenschaften zu erreichen. Das Beladen findet in einem Puffer bei einem pH-Wert von etwa 6-9 statt, falls das Harz ein Anionenaustauscher ist, und etwa 4-7, falls das Harz ein Kationenaustauscher ist. Der exakte pH-Wert hängt beispielsweise vom isoelektrischen Punkt des Antikörpers ab.
Falls das Harz ein Kationenaustauschharz ist, kann vor dem Laden der Mischung die Matrix unter Verwendung mehrerer Säulenvolumen einer verdünnten, schwachen Säure equilibriert werden (z.B. 4 Säulenvolumen von 20 mM Essigsäure, pH3, oder von 20 mM Phosphorsäure, pH etwa 2,8). Nach der Equilibrierung wird die Mischung hinzugefügt und die Säule kann ein bis mehrmals gewaschen werden, vor der Elution der Mischung, ebenfalls unter Verwendung einer schwachen Säurelösung, wie schwacher Essigsäure oder Phosphorsäurelösung. Der Puffer, der zu diesem Zweck verwendet wird, hängt beispielsweise von dem Antikörper und der anionischen oder kationischen Natur des Harzes ab. Für Anionenaustausch ist der Puffer vorzugsweise TRIS oder Phosphatpuffer; für Kationenaustausch ist der Puffer vorzugsweise Acetat- oder Phosphatpuffer.
Ionenaustauschchromatographie wird typischerweise bei einer Temperatur von etwa 18-25°C durchgeführt, vorzugsweise bei etwa 20°C (Raumtemperatur). Die bevorzugte Säulenbeladung ist etwa 1 ml Harz pro 20-30 mg Gesamtpolypeptid.
Nach der Absorption der n-mer Moleküle an den Ionenaustauscher wird die Mischung durch Inkontaktbringen des Harzes mit einem Elutionssalz eluiert, das eine geeignete Innenstärke aufweist, um das Monomer von der Matrix zu entfernen. Verwendet wird ein Elutionssalzgadient von etwa 0-1 M. Der Gradient kann linear oder stufenweise sein. Bevorzugt ist der Gradient von etwa 0-500 mM Elutionssalz, besonders bevorzugt von 50-200 mM Elutionssalz und ganz besonders bevorzugt von 0-50 mM Elutionssalz. Vorzugsweise ist das Elutionssalz ein Natriumsalz, wie Natriumchlorid, obwohl andere Elutionssalze und Konzentrationsgradienten, die dem Fachmann bekannt sind, auch hier Verwendung finden. Die Menge an Elutionspuffer kann stark variieren und wird im Allgemeinen im Bereich von etwa 2-40 Säulenvolumen sein, bevorzugt 10-40 Säulenvolumen. Nach der Elution kann das Eluat bezüglich der Konzentration an Gesamtmonomeren getestet werden.
Hier geeignete Kationenaustauschharze schließen eine große Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Materialien ein, einschließlich diejenigen, die in der Lage sind, Polypeptide über einen weiten pH-Bereich zu binden. Beispielsweise sind carboxymetylierte, sulfonierte, auf Agarose basierende, oder polymerische Polystyren/divinyl-Benzol-Kationenaustauschmatrizen besonders bevorzugt. Andere geeignete Matrixmaterialien schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Cellulosematrizen, wie fibröse, microgranuläre und auf Kugeln basierende Matrizen; Dextran-, Polyacrylat-, Polyvinyl-, Polystyren-, Siliciumoxid- und Polyether-Matrizen; und Kompositen. Diese Matrizen schließen beispielsweise ein CM52 CELLULOSE^TM (Whatman, Inc.); S-HYPERD^TM und CM SPHERODEX^TM (Sepractor); SP SEPHAROSE FF^TM, DEAE SEPHAROSE FF^TM, CM-SEPHAROSE^TM und RESOURCE S^TM (Amersham Pharmacia Biotech AB); und JT BAKER CSx^TM (J. T. Baker, Inc.), genauso wie diejenigen, die den funktionellen Liganden R-SO₃ ^– enthalten, vorzugsweise Sulfopropyl-Harze, wie TOYOPEARL SP550C^TM (Tosohaas) und FRACTOGEL EMD^TM SO₃ ^– -650(m) (Merck). Andere für die Verwendung in der Kationenaustauschchromatographie geeignete Materialien sind dem Fachmann bekannt.
Anionenaustauschchromatographie wird unter Verwendung von dafür geeigneten Medien durchgeführt, wie im Stand der Technik bekannt. Geeignete Medien schließen beispielsweise ein polymerische Polystyren/divinyl-Benzolharze und auf Agarose basierende Harze, genauso wie Agarose-Kügelchen, Dextran-Kügelchen, Polystyrol-Kügelchen, Medien, die einen unlöslichen, partikulären Träger umfassen, derivatisiert mit tertiären oder quartären Aminogruppen und Träger, derivatisiert mit Trimethylaminoethylgruppen. Beispiele solcher geeigneter Medien schließen ein DE92^TM (Diethylaminoethylcellulose, Whatman); DEAE-CELLULOSE^TM (Sigma), BAKERBOND ABX 40 mu^TM (J. T. Baker, Inc.); DEAE Harze wie FRACTOGEL EMD DEAE-650^TM (EM Auftrennungen), FRACTOGEL EMD TMAE-650(S)^TM (EM Science, Gibbstown, NJ), TSK Gel DEAE-SPW^TM (Tosohaas), DEAE-SEPHAROSE CL-6B^TM und chelierende SEPHAROSE^TM (Amersham Pharmacia Biotech AB), DEAE MERE SEP. 1000^TM (Millipore), und DEAE SPHERODEX^TM (Sepractor); RESOURCE Q^TM und Q SEPHAROSE^TM (QSFF) (Amersham Pharmacia Biotech AB); MACRO-PEP Q^TM (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA); Q-HYPERD^TM (BioSepra. Inc., Marlborough, Mass); und ähnliche. Andere geeignete Anionenaustauschchromatographiematerialien genauso wie die Auswahl und die Verwendung dieser Materialien für die vorliegende Anwendung sind im Stand der Technik bekannt.
Gereinigte Fraktionen von durch die Ionenaustauschchromatographie erhaltenem Monomer können weiter verarbeitet werden, indem man sie irgendeiner geeigneter Technik unterwirft, die für nachfolgendes Verarbeiten und Reinigen bestimmt ist. Dies hängt weitgehend vom Typ des Antikörpers und seiner beabsichtigten Verwendung ab. Nur ein Ionenaustauschschritt ist notwendig, um die gewünschte Abtrennung von Monomer von Dimer und/oder Multimeren in einer Mischung zu bewirken, obwohl die Erfindung nicht ausschließt, mehrere solcher Schritte zu verwenden, wenn dies im vorangehenden oder nachfolgenden Verarbeiten des Antikörpers gewünscht ist.
Die Erfindung wird besser mit Bezugnahme auf die folgenden Beispiele vollständig verstanden werden. Diese sind allerdings nicht dazu gedacht, den Schutzbereich der Erfindung zu beschränken.
Beispiel 1
Dieses Beispiel zeigt die Abtrennung von anti-IgE Monomeren und – zu Vergleichszwecken – bovinen Serum-Albumin-Monomeren von Dimeren und Multimeren.
Materialien und Methoden:
Harze:
Pharmacia Q-SEPHAROSE FAST FLOW^TM: 4 ml-235 l evaluiertes Bettvolumen Pharmacia RESOURCE S und RESOURCE Q^TM: 1 ml vorgepackte Säulen JT Baker CSx^TM: 0,46 × 5 cm, 5 μm Partikel
Proteine:

A: Humanisierte anti-IgE monoklonale Antikörper (IgG₁) erhältlich von Genentec, Inc.: pI ~7,5, bezeichnet als E25 und E26. WO 93104173, veröffentlicht am 4. März 1993, beschreibt humanisierte anti-IgE Antikörper, bei denen ein muriner Antikörper gerichtet gegen humanes IgE(MaE11) verwendet wurde, um die CDR Regionen bereitzustellen, die in ein IgG1 Immunoglobulin Gerüst ersetzt wurden (rhuMaE25). Siehe auch Cacia et al., Biochemistry, 35: 1897-1903 (1996) im Hinblick auf Studien und weitere Beschreibungen von E25.
B: Monoclonale anti-IgE Antikörper, hergestellt von den Kulturüberständen einer immortalisierten humanen Myeloma Zelllinie U266B1 (ATCC TIB 196) unter Verwendung von Affinitätschromatographiereinigung auf einem isolierten anti-IgE Antikörper (Genentech MAE1). Genauer wurden 5 weibliche BALB/c Mäuse, Alter 6 Wochen, in ihren Fußballen mit 10 μg gereinigten IgE in Ribi's Adjuvanz immunisiert. Nachfolgende Injektionen wurden auf dieselbe Weise nach einer und drei Wochen nach den anfänglichen Immunisierungen durchgeführt. Drei Tage nach der letzten Injektion wurden die inguinalen und poplitealen Lymphknoten entfernt und vereinigt, und eine Einzelzellsuspension wurde durch Passieren des Gewebes durch Stahlwolle hergestellt. Die Zellen wurden bei einem Verhältnis von 4:1 mit Maus Myeloma P3X63-Ag8.653(ATCC CRL1580) in hoher Glukose (DMEM) enthaltend 50% w/v Polyethylenglycol 4000 fusioniert. Alternativ wurden die Immunisierungen auf dieselbe Weise durchgeführt mit der Ausnahme, dass 30 μg IgE pro Injektion verwendet wurden und IgE-Fragment 315-347 (Kabat) als Prefusionsbooster getestet wurde, oder Injektionen wurden subkutan in zwei Dosen von 100 μg und einem finalen Booster von 50 μg verabreicht, und Milzzellen wurden für die Fusionierung verwendet.

Die fusionierten Zellen wurden dann bei einer Dichte von 2·10⁵ pro Vertiefung (engl. „well") in Gewebskulturplatten mit 96 Vertiefungen ausplattiert. Nach 24 h wurde HAT selektives Medium (Hypoxanthin/Aminopterin/Thymidin, Sigma, #H0262) zugefügt. Von 1440 ausplattierten Vertiefungen enthielten 365 nach der HAT Selektion wachsende Zellen.
15 Tage nach der Fusion wurden die Überstände auf das Vorhandensein von für humanes IgE spezifischen Antikörpern unter Verwendung eines Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) getestet. Der ELISA wurde wie folgt durchgeführt, wobei alle Inkubationen bei Raumtemperatur durchgeführt wurden. Testplatten (Nunc Immunoplate) wurden 2 h lang mit Ratte anti-MausIgG (Boehringer Mannheim, #605-500) bei 1 μg/ml in 50 mM Natriumcarbonatpuffer pH 9,6 beschichtet, dann mit 0,5 % bovinem Serum Albumin in Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) 30 Minuten lang blockiert, dann 4 Mal mit PBS enthaltend 0,05% TWEEN 20^TM (PBST) gewaschen. Testüberstände wurden hinzugefügt und zwei Stunden lang unter Schütteln inkubiert, dann 4 Mal mit PBST gewaschen. Humanes IgE (gereinigt von U266 Zellen wie oben beschrieben) wurde bei 0,5 μg/ml hinzugefügt und eine Stunde unter Schütteln inkubiert, dann 4 Mal mit PBST gewaschen. Meerrettich-Peroxidase-konjugierte-anti-Mensch-IgE (Krikegarrd & Perra Labs, #14-10-04, 0,5 mg/ml) wurde bei einer Verdünnung von 1:2500 hinzugefügt und für eine Stunde inkubiert, dann 4 Mal mit PBST gewaschen. Die Platten wurden durch Zugabe von 100 μl/well einer Lösung enthaltend 10 mg o-Phenylendiamin Dihydrochlorid (Sigma, #P8287) und 10 μl einer Wasserstoffperoxidlösung in 25 ml Phosphat-Citrat-Puffer, pH 5,0 entwickelt, und 15 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 μl/well 2,5 M Schwefelsäure gestoppt. Daten wurden durch Lesen der Platten in einem automatisierten ELISA Plattenleser bei einer Absorption von 490 nm erhalten. Für einen Antikörper wurden 365 Überstände getestet und 100 waren für humanes IgE spezifisch. Ähnliche Frequenzen von IgE Spezifität wurden bei Screening nach anderen Antikörpern erhalten.

C: Bovines Serum Albumin: pl 4,7 und 4,9 (Radola, Biochim. Biophys Acta, 295: 412-428 (1973))
– Bayer Corp. P/N 81-042-2, "Bovine Albumin, Sulfhydryl Modified" (BSA Mix, blockiert)
– ICN Biomedical Inc. P/N 810013, "Albumin Bovine" (BSA Mix, nativ)
– BSA Monomer und Dimer hergestellt im Haus aus Bayer BSA (BSA Monomer und BSA Dimer)

Chromatographiesysteme:

Hewlett-Packard 1090TM HPLC
PharmaciaTM FPLC
Nachweis bei 215 oder 280 nm

Puffer: (siehe Tabelle 1 für Details)

Gereinigtes Wasser
Tris-HCl
Natriumacetat
Natriumchlorid
Natriumphosphat
Natriumcitrat und Zitronensäure

Probenherstellung:
Die Proben wurden mit dem für die Equilibrierung verwendeten Puffer verdünnt (angegeben in Tabelle 1 unten), um sicherzustellen, dass pH und Leitfähigkeit den Säulenbedingungen zu Beginn entsprechen. Alle Proben wurden vor dem Laden 0,2 μm filtriert.
Chromatographie:
Die Proben wurden in die Säule entweder unter Verwendung eines automatischen oder einen manuellen Injektionsmittels eingeführt. Alle Läufe wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Fraktionen wurden manuell oder mit einem PHARMACIA FRAC 100^TM Sammler gesammelt.
Die chromatographische Abtrennungsleistung wurde durch Vergleich von Elutionsprofilen von BSA Stammreagenz und gereinigten BSA Monomer und Dimer evaluiert; dasselbe wurde für IgE und die monoklonalen Antikörper (MAb) durchgeführt. Abtrennung von IgE und MAb von deren Dimeren und Multimeren wurde außerdem durch Analysieren einer Elutionsfraktion unter Verwendung analytischer Größen-Ausschluss-Chromatographie evaluiert. Das Molekulargewicht von MAb vs. der Fraktionsnummer wurde aufgetragen. Die Wiedergewinnung von IgE und MAb wurde spektrophotometrisch durch Messen der Absorption bei 280 nm bestimmt.
Ergebnisse:
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 unten zusammengefasst.
Tabelle 1 Monomer-Dimer/Multimer Abtrennungen
Die Abtrennungen wurden unter Verwendung von polymerischen Polystyrol/ Divinyl Benzol-Harzen (RESOURCE Q und S^TM) evaluiert, einem auf Siliciumoxid basierenden Harz (JT BAKER CSX^TM) und einem auf Agarose basierenden Harz (Q-SEPHAROSE FAST FLOW^TM; QSFF). Obwohl Abtrennungen mit jedem dieser Harze durchgeführt werden konnten, konnten mit Q-SEPHAROSE FAST FLOW, RESOURCE Q^TM und RESOURCE S^TM besonders gute Abtrennungen erzielt werden. Die Abtrennung von BSA Monomer und BSA Dimer von beiden Lieferanten erschien sehr ähnlich, was zu der Annahme führte, dass das „Sulfhydryl-modifizierte" Material von Bayer das Protein nicht derart veränderte, dass die Spezies leichter abzutrennen waren. Es ist ersichtlich, dass der Phosphatpuffer bei pH 6 gut funktionierte, aber dass kein Protein an die Kationen- oder Anionenaustauschsäulen gebunden wurde, wenn 20 mM Citratpuffer bei pH 6 als Equilibrationspuffer verwendet wurde. Von Citratpuffer wird erwartet, dass er sowohl bei Anionen- als auch bei Kationenaustausch bei einer geringeren Konzentration, z.B. etwa 5 mM funktioniert.
Die Ausbeute an monomerischen IgE und MAbs für IgE an Anionenaustauschharzen war typischerweise größer als 90% bei einer Reinheit von größer als 99,5%. 1A und 1B zeigen Anionenaustauschchromtogramme (RESOURCE Q^TM) bei der Abtrennung von IgE Monomeren von Dimeren und Multimeren. 2A1 und 2A2 zeigen Anionenaustauschchromatogramme (RESOURCE Q^TM) bei der Abtrennung von anti-IgE MAb Monomeren von Dimeren und Multimeren. 2B zeigt ein Anionenaustauschchromatogramm (Q SEPHAROSE FAST FLOW^TM) bei der Abtrennung von anti-IgE MAb Monomeren von Dimeren und Multimeren. SEC (SUPERDEX 200 HR 10/30^TM) wurde als analytische Methode verwendet, um die Menge an Monomer und Multimer in den Proben von der Ionenaustauschabtrennung zu bestimmen, und 2C zeigt die SEC-Analyse der Fraktionen von 2B. Abtrennung von BSA Monomer vom Dimer wurde leicht auf Anionenaustauschharzen bei pH 8 und pH 6 erreicht. Siehe 3A–3C und 4A–4C für Chromatogramme der Abtrennung von BSA Monomeren von Dimeren und Multimeren durch Anionenaustausch (RESOURCE Q^TM) bei pH 8 (Tris-Puffer) und bei pH 6 (Phosphatpuffer).
Ausbeute und Reinheit von MAb Monomer von dem Kationenaustauschharz war mit denjenigen des Anionenaustauschharzes vergleichbar. 5A–5B zeigen Kationenaustauschchromatogramme (RESOURCE S^TM) bei der Abtrennung von anti-IgE MAb Monomeren von Dimeren und Multimeren bei pH 6 (Phosphatpuffer). Abtrennung von BSA auf Kationenaustauschharzen konnte bei pH 4,6 und 4,3 durchgeführt werden, wobei 4,3 etwas besser war. 6A und 6B zeigen Kationenaustauschchromatogramme (RESOURCE S^TM) bei der Abtrennung von BSA Monomeren von Dimeren und Multimeren bei pH 4,3 (Acetatpuffer).
Zusammengefasst wurden Mischungen von Polypeptid-meren Kationen- oder Anionenaustauschchromatographie unter Verwendung einer Vielzahl von Harzen und einer Vielzahl von pH- und Elutionssalz-Bedingungen unterworfen und eine erfolgreiche Abtrennung wurde erreicht. Basierend auf den Resultaten von 4 Proteinen mit basischen und sauren isoelektrischen Punkten (2IgG₁ MAbs, IgE und – zu Vergleichszwecken – Serum Albumin), zeigt die Methode die generelle Anwendbarkeit für die Abtrennung von Antikörper-Monomeren von deren Dimeren und Multimeren.

Claims

Verfahren zum Abtrennen eines Antikörpermonomers von einem Gemisch umfassend Monomere des Antikörpers und Dimere des Antikörpers oder n-mere des Antikörpers, wobei n 3-10 ist, oder beides, bei dem das Verfahren den Schritt des Auftragens des Gemisches auf ein Kationenaustausch- oder Anionenaustauschchromatographieharz in einem Puffer umfasst, wobei, falls das Harz ein Kationenaustauscher ist, der pH-Wert des Puffers etwa 4-7 ist und, wobei wenn das Harz ein Anionenaustauscher ist, der pH-Wert des Puffers etwa 6-9 ist, und Eluieren des Gemisches mit einem Gradienten von etwa 0-1 M eines Elutionssalzes, wobei das Monomer von den Dimeren oder Multimeren oder beiden, die in dem Gemisch vorhanden sind, abgetrennt wird; wobei, falls Citrat als Puffer verwendet wird, es bei einer Konzentration von unterhalb 20 mM verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Antikörper anti-IgE, anti-IgG, anti-HER-2, anti-CD11a, anti-CD18, anti-CD20 oder anti-VEGF ist, oder ein Antikörperfragment.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, bei dem das Ionenaustauschharz ein Kationenaustauschharz ist, oder bei dem das Ionenaustauschharz ein Anionenaustauschharz ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1-3, bei dem der Gradient linear oder stufenweise ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Elutionssalz ein Natriumsalz ist, insbesondere, bei dem das Elutionssalz Natriumchlorid ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Gradient von 0-500 mM Elutionssalz ist, insbesondere, bei dem der Gradient von 50-200 mM Elutionssalz ist, oder bei dem der Gradient von 0-50 mM Elutionssalz ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem, falls Citrat als Puffer verwendet wird, dieses bei einer Konzentration von etwa 5 mM verwendet wird.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das abgetrennte Monomer mit einer Ausbeute von größer als 90% erhalten wird.
Verfahren zum Abtrennen eines Antikörpermonomers von einem Gemisch umfassend Monomere des Antikörpers und Dimere des Antikörpers oder n-mere des Antikörpers, wobei n 3-10 ist, oder beides, bei dem das Verfahren den Schritt des Auftragens des Gemisches auf ein Anionenaustauschchromatographieharz in einem Puffer umfasst, wobei der pH-Wert des Puffers etwa 6-9 ist, und Eluieren des Gemisches mit einem Gradienten von etwa 0-1 M eines Elutionssalzes, wobei das Monomer von den Dimeren oder Multimeren oder beiden, die in dem Gemisch vorhanden sind, abgetrennt wird, wobei, falls Citrat als Puffer verwendet wird, dieses bei einer Konzentration von unter 20 mM angewendet wird.
Verfahren nach Anspruch 9, ferner umfassend die Merkmale wie definiert in irgendeinem der Ansprüche 2 und 4-8.
Verfahren zum Abtrennen eines Antikörpermonomers von einem Gemisch umfassend Monomere des Antikörpers und Dimere des Antikörpers oder n-mere des Antikörpers, wobei n 3-10 ist, oder beides, wobei das Verfahren den Schritt des Auftragens des Gemisches auf ein Kationenaustausch- oder ein Anionenaustauschchromatographieharz in einem Puffer umfasst, wobei, falls das Harz ein Kationenaustauscher ist, der pH-Wert des Puffers etwa 4-7 ist und wobei, falls das Harz ein Anionenaustauscher ist, der pH-Wert des Puffers etwa 6-9 ist, und Eluieren des Gemisches mit einem Gradienten von etwa 0-1M eines Elutionssalzes, wobei das Monomer von den Dimeren oder Multimeren, die im Gemisch beim Kationenaustausch-Schritt vorhanden sind, oder beiden, abgetrennt wird, wobei, falls Citrat als Puffer verwendet wird, dieses bei einer Konzentration von unter 20 mM angewendet wird; und wobei das abgetrennte Monomer eine Reinheit von größer als 99,5% aufweist.
Verfahren nach Anspruch 11, ferner umfassend die Merkmale wie definiert in irgendeinem der Ansprüche 2-8.
Verwendung eines Ionenaustauschharzes zum Abtrennen eines Antikörpermonomers von einem Gemisch umfassend Monomere des Antikörpers und Dimere des Antikörpers oder n-mere des Antikörpers, wobei n 3-10 ist, oder beides, durch Ionenaustauschchromatographie in einem Puffer, umfassend das Auftragen des Gemisches auf das Harz, und Eluieren des Gemisches mit einem Gradienten von etwa 0-1 M eines Elutionssalzes; wobei, falls Citrat als Puffer verwendet wird, dieses bei einer Konzentration von unter 20 mM angewendet wird.
Verwendung nach Anspruch 13 zum Abtrennen des Antikörpermonomers mit einer Ausbeute von mehr als 90%.