KR102446468B1 - 혈장으로부터의 면역글로불린의 정제 - Google Patents

혈장으로부터의 면역글로불린의 정제 Download PDF

Info

Publication number
KR102446468B1
KR102446468B1 KR1020150113871A KR20150113871A KR102446468B1 KR 102446468 B1 KR102446468 B1 KR 102446468B1 KR 1020150113871 A KR1020150113871 A KR 1020150113871A KR 20150113871 A KR20150113871 A KR 20150113871A KR 102446468 B1 KR102446468 B1 KR 102446468B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
alkyl
matrix
target molecule
buffer
group
Prior art date
Application number
KR1020150113871A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160021050A (ko
Inventor
아니카 알딩거
아힘 슈베믈레
마티아스 왼크
디르크 뮐러
마르크 마추어
Original Assignee
메르크 파텐트 게엠베하
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 메르크 파텐트 게엠베하 filed Critical 메르크 파텐트 게엠베하
Publication of KR20160021050A publication Critical patent/KR20160021050A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102446468B1 publication Critical patent/KR102446468B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/363—Anion-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/26—Synthetic macromolecular compounds
    • B01J20/264—Synthetic macromolecular compounds derived from different types of monomers, e.g. linear or branched copolymers, block copolymers, graft copolymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/26—Synthetic macromolecular compounds
    • B01J20/265—Synthetic macromolecular compounds modified or post-treated polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/282—Porous sorbents
    • B01J20/285—Porous sorbents based on polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J41/00—Anion exchange; Use of material as anion exchangers; Treatment of material for improving the anion exchange properties
    • B01J41/08—Use of material as anion exchangers; Treatment of material for improving the anion exchange properties
    • B01J41/12—Macromolecular compounds
    • B01J41/14—Macromolecular compounds obtained by reactions only involving unsaturated carbon-to-carbon bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J41/00—Anion exchange; Use of material as anion exchangers; Treatment of material for improving the anion exchange properties
    • B01J41/20—Anion exchangers for chromatographic processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Manufacture Of Macromolecular Shaped Articles (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본 발명은 혈장으로부터의 면역글로불린과 같은 표적 분자의 정제에 관한 것이다. 가교된 폴리비닐에테르 기재의 특정한 유형의 이온 교환기의 사용은 특히 고수율의 표적 분자를 도모한다.

Description

혈장으로부터의 면역글로불린의 정제 {PURIFICATION OF IMMUNOGLOBULINS FROM PLASMA}
본 발명은 혈장으로부터의 면역글로불린과 같은 표적 분자의 정제에 관한 것이다. 친수성의 화학적으로 안정한 폴리비닐에테르 수지 기재의 특정한 유형의 이온 교환기의 사용은 특히 고수율의 표적 분자를 도모한다.
인간 및 동물 혈액은, 예를 들어 치료적 특성을 갖는 수많은 단백질 및 효소를 포함한다. 이들 단백질의 일부가 적혈구에서 발견될 수 있지만, 그 밖의 것들은 혈장 또는 혈청의 용액 중에서 발견된다. 상기 단백질은 인간 치료제로서 사용하기 위한 단백질의 정제 및 표준화를 목적으로 하는, 대규모 및 특정한 단리를 위한 표적이다. 치료적 사용을 위해 단리되는 중요한 혈액 단백질의 예는 하기이다: 알부민, 면역글로불린 G, 인자 IX, 인자 VIII 및 알파-1-프로테이나아제 저해제. 이들 단백질의 일부가 년 마다 수 천 kg 규모로 제조되지만 (알부민 및 IgG), 그 밖의 것들은 년 마다 단지 그램 내지 킬로그램의 규모로만 제조된다. 그러나, 전 세계적인 기준으로, 년 마다 수 백만 리터의 혈액이 이들 단백질의 단리 목적을 위해 가공된다.
혈액, 혈장 및 혈청은 목적하는 단백질(들) 또는 효소(들) 이외의 수많은 기타 유형의 화합물을 포함하는 용액을 포함하는 극히 복잡한 단백질이다. 상기 유형의 샘플로부터의 특정한 표적 단백질의 단리는 정교한 및 종종 다단계 정제 절차를 요구한다.
특히 면역글로불린 G 의 현 제조 방법이 갖는 하나의 흔한 문제는 출발 물질의 전체 IgG 함량의 적어도 30% 내지 35% 인 것으로 추정되는, 정제 방법시 면역글로불린 G 의 상당한 손실이다. 하나의 과제는 IgG 의 수율을 확대하면서 역반응을 야기할 수 있는 불순물의 결핍 및 바이러스 불활성화의 양을 유지하는 것이다. IgG 의 현 제조 수준에서, 수율에서 작은 증가인 것으로 고려될 수 있는 것이 사실상 매우 중요하다. 심지어, 효율성의 2% 증가는 수율 및 생산성의 두드러진 증가를 발생시킬 것이다.
상기와 같이, IgG 생성물의 개선되고 보다 효율적인 제조 방법에 대한 필요성이 존재한다.
특정한 유형의 크로마토그래피 물질 또는 매트릭스가 혈장 샘플로부터 표적 분자의 음이온 교환 정제에 매우 효과적으로 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 매트릭스는 600 내지 1200 μmol/g 음이온 교환기를 보유한 친수성 폴리비닐에테르이다. 표적 분자는 매우 고수율 및 탁월한 순도로 수득될 수 있다.
본 발명은 따라서 하기에 의한 혈장 샘플로부터의 표적 분자의 정제 방법에 관한 것이다:
a) 표적 분자를 포함하는 혈장 샘플을 제공하고,
b) 상기 혈장 샘플을 600 내지 1200 μmol/g 음이온 교환기를 보유한 폴리비닐에테르 매트릭스 상의 이온 교환 크로마토그래피에 적용시킴으로써 정제된 표적 분자를 매트릭스로부터 용리시킴.
바람직한 구현예에서, 매트릭스는 군 a) 및 b) 로부터의 하나 이상의 화합물의 공중합에 의해 형성되는 공중합체이다:
a) 하나 이상의 하기 식 I 의 친수성 치환된 알킬 비닐 에테르:
Figure 112015078217285-pat00001
[식 중, R1, R2, R3 은 서로 독립적으로 H 또는 C1 내지 C6 알킬, 바람직하게는 H 또는 -CH3 일 수 있고,
R4 는 하나 이상의 히드록실기를 보유한 라디칼임]
및
b) 하나 이상의 하기 식 II 및/또는 III 및/또는 IV 에 따른 가교제:
Figure 112015078217285-pat00002
[식 중, X 는 2 내지 5 개의 C 원자, 바람직하게는 2 또는 3 개의 C 원자를 갖는 2 가 알킬 라디칼이며, 이때 N 의 직접적인 부근에 위치해 있지 않고 인접하지 않은 하나 이상의 메틸렌기는 O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH 또는 N 에 의해 대체될 수 있고, 메틸렌기의 하나 이상의 H 원자는 서로 독립적으로 히드록실기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, C5-C10-아릴, NH-(C1-C8)-알킬, N-(C1-C8)-알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있음], 및
Figure 112015078217285-pat00003
[식 중, 식 III 및 IV 에서의 Y1 및 Y2 는 서로 독립적으로
C1 내지 C10 알킬 또는 시클로알킬이며, 여기서 N 의 직접적인 부근에 위치해 있지 않은 메틸렌기 또는 비인접한 메틸렌기 하나 이상은 O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH 또는 N 에 의해 대체될 수 있고, 메틸렌기의 하나 이상의 H 는 서로 독립적으로 히드록실기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, C5-C10-아릴, NH(C1-C8)알킬, N(C1-C8)알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있거나,
또는 C6 내지 C18 아릴이며, 여기서 아릴 시스템에서의 하나 이상의 H 는 서로 독립적으로 히드록실기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, NH(C1-C8)알킬, N(C1-C8)알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있고,
A 는 2 내지 5 개의 C 원자, 바람직하게는 2 또는 3 개의 C 원자를 갖는 2 가 알킬 라디칼이며, 여기서 N 의 직접적인 부근에 위치해 있지 않은 메틸렌기 또는 비인접한 메틸렌기 하나 이상은 O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH 또는 N 에 의해 대체될 수 있고, 메틸렌기의 하나 이상의 H 는 서로 독립적으로 히드록실기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, C5-C10-아릴, NH(C1-C8)알킬, N(C1-C8)알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있고,
식 I 에서의 R4 는 전형적으로 하나 이상의 히드록실기를 보유한 아릴 라디칼, 지환족 라디칼 또는 알킬 라디칼임].
매우 바람직한 구현예에서, 매트릭스는 1,4-부탄디올 모노비닐 에테르, 1,5-펜탄디올 모노비닐 에테르, 디에틸렌 글리콜 모노비닐 에테르 또는 시클로헥산디메탄올 모노비닐 에테르의 군으로부터 선택되는, 활용되는 친수성 치환된 알킬 비닐 에테르 및 가교제로서의 디비닐에틸렌우레아 (1,3-디비닐이미다졸린-2온) 의 공중합에 의해 형성된다.
바람직한 구현예에서, 이온기는 폴리비닐에테르 매트릭스를 세륨 촉매화된 그래프트 중합에 적용시킴으로써 매트릭스에 부착되었다. 이는 바람직하게는 US 5453186, 9 쪽 실시예 8 에 따라 수행되며, 여기서 바람직하게는 하전된 기는 양전하(positively charged) 트리메틸암모늄알킬기이다.
바람직한 구현예에서, 이온 교환기는 양전하 트리메틸암모늄알킬기이다.
바람직한 구현예에서, 이온 교환 크로마토그래피는 통과(flow-through) 모드로 수행된다.
바람직한 구현예에서, 표적 분자는 면역글로불린, 바람직하게는 인간 면역글로불린, 가장 바람직하게는 인간 면역글로불린 G 이다.
또 다른 구현예에서, 표적 분자는 IgA, IgM, 알부민, 트랜스페린 및 인자 XIa 로부터 분리된다.
또 다른 구현예에서, 단계 b) 의 매트릭스는 pH 4 내지 7.4 의 완충액으로 용리된다.
하나의 구현예에서, 샘플은 매트릭스 리터 당 샘플내 단백질 25 내지 150 g 의 양으로 매트릭스에 적용된다.
바람직한 구현예에서, 단계 b) 의 매트릭스의 로딩 및 용리는 0.005 내지 1 M 아세테이트를 포함하는 아세테이트 완충액으로 수행된다.
하나의 구현예에서, 매트릭스는 평균 입자 크기 직경이 20 내지 250 μm 인 입자로 구성된다.
매트릭스의 기공 크기 (예, 기공 반경) 는 표면 개질 반응 이전의 입자의 기공 크기로 칭하고, 역 크기 배제 크로마토그래피로 측정된다. 측정 절차가 문헌 (Journal of Chromatography A, Volume 1037, Issues 1-2, Pages 273-282) 에 기재되어 있다.
하나의 구현예에서, 기공 반경은 30 내지 150 nm 이다.
하나의 구현예에서, 단계 b) 에서 매트릭스로부터 표적 분자의 용리 후에, 이후의 단계 c) 에서 매트릭스를 단계 b) 에 사용된 완충액의 pH 미만의 pH 를 갖는 완충액으로 용리시킴으로써 IgM 포함 생성물을 매트릭스로부터 용리시킨다.
하나의 구현예에서, 단계 b) 에서 매트릭스로부터 표적 분자의 용리 후에, 이후의 단계 c) 에서 매트릭스를 단계 b) 에 사용된 완충액의 pH 미만의 pH 를 갖는 완충액으로 처리함으로써 IgA, IgM 및 인자 XIa 를 매트릭스로부터 용리시킨다.
정의
본 발명을 상세히 기재하기 전에, 본 발명이 가변적인 것으로서, 특정한 조성 또는 방법 단계에 제한되지 않는 것으로 여겨져야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형은 달리 맥락상 명백히 지시되지 않는한 복수형을 포함하는 것에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어 "리간드" 로 언급하는 것은 복수의 리간드를 포함하고, "항체" 로 언급하는 것은 복수의 항체 등을 포함한다.
달리 정의되지 않는한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 관련된 업계에서 통상적인 기술 중 하나로 흔히 여겨지는 바와 동일한 의미를 갖는다. 하기 용어는 본 발명의 목적상 본원에 기재된 바와 같이 정의된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "표적 분자" 는 샘플내 하나 이상의 기타 성분, 예를 들어 불순물로부터 단리, 분리 또는 정제되어야 하는 임의의 분자, 물질 또는 화합물로 칭한다. 표적 분자의 예는 항체, 단편 항원 결합부 (Fab), 단편 불변부 (Fc), 단백질, 펩티드, 재조합 단백질, 기타 천연 화합물이다. 바람직한 구현예에서, 표적 분자는 단백질이다. 매우 바람직한 구현예에서, 표적 분자는 항체이다. 특히 바람직한 구현예에서, 표적 분자는 면역글로불린이다. 제조 및/또는 정제 방법에서, 표적 분자는 전형적으로 액체 중에 존재한다. 액체는 물, 완충액, 비수성 용매, 예컨대 에탄올 또는 그 임의의 혼합물일 수 있다. 표적 분자 이외에, 상기 액체는 하나 이상의 불순물을 포함할 수 있다. 액체의 조성은 수행되는 방법 단계에 따라 제조 및/또는 정제 동안 변화될 수 있다. 크로마토그래피 단계 후에, 크로마토그래피 단계에 사용되는 용리액으로 인해, 액체는 전형적으로 이전과는 다른 용매를 포함한다. 전형적으로, 매우 최종의 정제 단계 후에만, 표적 분자가 최종 투여 형태의 제조를 위해 건조될 수 있다.
용어 "항체" 는 항원에 특이적 결합되는 능력을 갖는 단백질로 칭한다. "항체" 또는 "IgG" 는 분석물 (항원) 을 특이적으로 결합하고 인지하는, 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들에 의해 실질적으로 인코딩된 폴리펩티드 또는 그 단편으로 추가로 칭한다. 인지되는 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변부 유전자, 뿐만 아니라 무수한 면역글로불린 가변부 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되며, 차례로 면역글로불린 클래스로서 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 로 정의된다.
예시적인 면역글로불린 (항체) 구조 단위는 두 쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성되며, 각각의 쌍은 하나의 "경"쇄 (약 25 kD) 및 하나의 "중"쇄 (약 50-70 kD) 를 갖고, 상기 사슬은 예를 들어 사슬간 디술파이드 결합에 의해 안정화된다. 각 사슬의 N-말단은 항원 인지의 일차적 원인이 되는 약 100 내지 110 개 이상의 아미노산의 가변부로 정의된다. 용어 가변 경쇄 (V L) 및 가변 중쇄 (V H) 는 각각 이들 경쇄 및 중쇄로 칭한다.
항체는 단일클론 또는 다클론일 수 있고, 단량체성 또는 중합체성 형태로 존재할 수 있으며, 예를 들어 IgM 항체는 오량체성 형태로 존재하고/하거나 IgA 항체는 단량체성, 이량체성 또는 다량체성 형태로 존재한다. 항체는 유지된다면 항체 단편들 및 다특이적 항체 (예, 이중특이적 항체) 를 또한 포함할 수 있거나, 또는 개질되어 리간드-특이적 결합 도메인을 포함한다. 용어 "단편" 은 무결 또는 완전 항체 또는 항체 사슬보다 적은 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체 사슬의 부분 또는 일부로 칭한다. 단편은 무결 또는 완전 항체 또는 항체 사슬의 화학 또는 효소적 처리를 통해 수득될 수 있다. 단편은 또한 재조합 방식에 의해 수득될 수 있다. 재조합으로 생성되는 경우, 단편은 단독으로 또는 융합 단백질로 불리는 거대 단백질의 부분으로서 발현될 수 있다. 예시적 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fc 및/또는 Fv 단편을 포함한다. 예시적 융합 단백질은 Fc 융합 단백질을 포함한다. 본 발명에 따라, 융합 단백질은 또한 용어 "항체" 를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체는 Fc 영역 포함 단백질, 예를 들어 면역글로불린이다. 일부 구현예에서, Fc 영역 포함 단백질은 또 다른 폴리펩티드 또는 그 단편에 융합된 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 재조합 단백질이다. 예시적 폴리펩티드는, 예를 들어 레닌; 성장 호르몬 (인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬 포함); 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질단백질; α-1-항트립신; 인슐린 α-사슬; 인슐린 β-사슬; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰빌레브란트 인자; 항응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성화제, 예컨대 우로키나아제 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성화제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 엔케팔리나아제; RANTES (활성화시 조절 정상적 T-세포 발현 및 분비); 인간 대식세포 염증 단백질 (MIP-1-α); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러리안(Muellerian)-저해 물질; 렐락신 α-사슬; 렐락신 β-사슬; 프로렐락신; 마우스 성선자극호르몬-관련 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 β-락타마아제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원 (CTLA) (예, CTLA-4); 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자를 위한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류머티즘성 인자; 신경영양성 인자, 예컨대 골-유래 신경영양성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β.; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자, 예컨대 αFGF 및 βFGF; 상피 성장 인자 (EGF); 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-β (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 또는 TGF-β5 포함); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); 데스(l-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 (IGFBP); CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34, 및 CD40; 에리스로포이에틴; 골전도성 인자; 항체독소; 골 형태발생 단백질 (BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-α, -β, 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터류킨 (IL), 예를 들어 IL-I 내지 IL-IO; 초산화물 디스뮤타아제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 부식 촉진 인자; 바이러스 항원, 예를 들어 AIDS 엔빌로프(envelope) 의 일부; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CDl Ia, CDl Ib, CDl Ic, CD 18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련 항원, 예컨대 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 및 상기 나열된 폴리펩티드 중 어느 하나의 단편 및/또는 변이체를 포함한다. 추가로, 본 발명에 따른 항체는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드, 그 단편 또는 변이체이며, 이는 상기 나열된 폴리펩티드 중 어느 하나에 특이적으로 결합된다.
본원에 사용된 바와 같고 달리 언급되지 않는한, 용어 "샘플" 은 표적 분자를 포함하는 임의의 조성물 또는 혼합물로 칭한다. 샘플은 생물학적 또는 기타 공급원 유래일 수 있다. 생물학적 공급원은 원핵 공급원, 예컨대 동물 또는 인간을 포함한다. 바람직한 샘플은 포유류 유래의 혈액 또는 혈장 샘플이다. 샘플은 또한 표적 분자와 함께 혼합되어 발견되는 희석제, 완충액, 세제, 및 오염 종 등을 포함할 수 있다. 샘플은 "부분 정제" 될 수 있거나 (즉, 하나 이상의 정제 단계, 예컨대 여과 또는 원심분리 단계에 속함), 표적 분자를 생성하는 유기체로부터 직접 수득될 수 있다. 혈장 샘플은 혈장 또는 혈장의 일부를 포함하는 임의의 샘플이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "불순물" 또는 "오염물" 은 생물학적 매크로분자, 예컨대 DNA, RNA, 하나 이상의 호스트 세포 단백질, 핵산, 내독소, 지질, 합성 기원의 불순물, 및 외래 또는 부적당한 분자 중 하나 이상으로부터 분리된 표적 분자를 포함하는 샘플에 존재할 수 있는 하나 이상의 첨가제를 포함해 임의의 외래 또는 부적당한 분자로 칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "불순물" 또는 "오염물" 은 또한 환자에 알레르기 반응을 야기하는 면역글로불린 A, 뿐만 아니라 면역글로불린 M 과 같은 표적 분자로부터 분리될 필요가 있는 특정한 면역글로불린에 적용될 수 있다. 추가로, 상기 불순물은 제조 및/또는 정제 방법 단계에 사용되는 임의의 시약을 포함할 수 있다.
본원에서 상호교환되어 사용되는 바와 같은 용어 "정제" "분리" 또는 "단리" 는 표적 분자 및 하나 이상의 기타 성분, 예를 들어 불순물을 포함하는 조성물 또는 샘플로부터 분리에 의해 표적 분자의 순도를 증가시키는 것으로 칭한다. 전형적으로, 표적 분자의 순도는 조성물로부터 하나 이상의 불순물을 (완전히 또는 부분) 제거함으로써 증가된다.
용어 "크로마토그래피" 는 혼합물에 존재하는 기타 분자로부터 관심있는 분석물 (예, 표적 분자) 을 분리시키는 임의 종류의 기법으로 칭한다. 통상적으로, 표적 분자는 상기 혼합물의 개별 분자가 이동상의 영향 하에 고정 배지 또는 매트릭스를 통해 이동하는 속도, 또는 결합 및 용리 프로세스의 차이의 결과로서 기타 분자로부터 분리된다. 크로마토그래피 분리 방법을 위한 예는 역상 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 혼합 모드 크로마토그래피이다.
"완충액" 은 그 산-염기 콘주게이트 성분의 작용에 의한 pH 의 변화에 저항하는 용액이다. 예를 들어, 완충액의 목적하는 pH 에 따라 활용될 수 있는 각종 완충액이 [Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975)] 에 기재되어 있다. 완충액의 비제한적 예는 MES, MOPS, MOPSO, Tris, HEPES, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트, 및 암모늄 완충액, 뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다.
용어 "매트릭스" 또는 "크로마토그래피 매트릭스" 는 본원에서 상호교환되어 사용되고, 분리 방법에서 혼합물에 존재하는 기타 분자로부터 표적 분자 (예, 면역글로불린과 같은 Fc 영역 포함 단백질) 를 분리시키는 임의 종류의 특정한 흡수제, 수지 또는 고체상으로 칭한다. 통상적으로, 표적 분자는 혼합물의 별개 분자 가 이동상의 영향 하에 매트릭스를 통해 이동하는 속도, 또는 결합 및 용리 방법의 차이의 결과로서 기타 분자로부터 분리된다. 수지 입자로 이루어진 매트릭스는 컬럼 또는 카트리지에 놓일 수 있다. 전형적으로, 매트릭스는 하나 이상의 유형의 리간드를 보유한다.
"리간드" 는 매트릭스의 결합 특성을 결정하고 크로마토그래피 매트릭스에 부착된 관능기이다. "리간드" 의 예는 이온 교환기, 소수성 상호작용기, 친수성 상호작용기, 친황성 상호작용기, 금속 친화기, 친화기, 바이오친화기 및 혼합 모드 기 (상기 언급된 것들의 조합) 를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 사용될 수 있는 바람직한 리간드는 강음이온 교환기, 예컨대 트리메틸암모늄 클로라이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 용어 "이온-교환" 및 "이온-교환 크로마토그래피" 는 혼합물 중 표적 분자 (예, Fc 영역 포함 표적 단백질) 가 혼합물 중 용질 불순물 또는 오염물보다 많거나 적은 하전된 화합물과 비특이적으로 상호작용하도록 이온 교환 매트릭스에 (예컨대, 공유결합에 의해) 연결된 하전된 화합물과 상호작용하는 크로마토그래피 방법으로 칭한다. 혼합물 중 불순물은 표적 분자보다 빠르거나 느린 이온 교환 물질의 컬럼으로부터 용리되거나, 표적 분자에 있어서는 수지에 결합 또는 그로부터 배제된다. "이온-교환 크로마토그래피" 는 구체적으로 양이온 교환, 음이온 교환 및 혼합 모드 이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 음이온 교환 크로마토그래피가 표적 분자 (예, Fc 영역 포함 표적 단백질) 를 결합한 후 용리시킬 수 있거나, 불순물을 대부분 결합할 수 있지만 표적 분자는 컬럼을 "통과" 한다. 바람직하게는, 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 통과 모드로 수행된다.
상 "이온 교환 매트릭스" 는 음전하 (즉, 양이온 교환 수지) 또는 양전하 (즉, 음이온 교환 수지) 인 크로마토그래피 매트릭스로 칭한다. 전하는 하나 이상의 하전된 리간드를 예를 들어 공유결합에 의해 매트릭스에 부착시킴으로써 제공될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 전하는 매트릭스의 고유의 특성일 수 있다.
용어 "음이온 교환 매트릭스" 는, 예를 들어 매트릭스에 부착된, 하나 이상의 양전하 리간드, 예컨대 4 차 아미노기를 갖는, 양전하인 크로마토그래피 매트릭스를 칭하는 것으로 본원에서 사용된다.
결합 및 용리 모드로 분리 컬럼을 "로딩(loading)" 시, 완충액은 표적 분자 (예, Fc 영역 포함 표적 단백질) 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플 또는 조성물을 크로마토그래피 컬럼 (예, 이온 교환 컬럼) 에 로딩하는데 사용된다. 완충액은 표적 분자가 크로마토그래피 매트릭스에 결합되지만 이상적으로는 모든 불순물이 결합되지 않고 컬럼을 통과하도록 하는 전도도 및/또는 pH 를 갖는다.
표적 분자의 "통과" 를 위해 분리 컬럼을 "로딩" 시, 완충액은 표적 분자 (예, Fc 영역 포함 표적 단백질) 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플 또는 조성물을 크로마토그래피 컬럼 (예, 이온 교환 컬럼) 에 로딩하는데 사용된다. 완충액은 표적 분자가 크로마토그래피 매트릭스에 결합되지 않고 컬럼을 통과하지만 이상적으로는 모든 불순물이 컬럼에 결합되도록 하는 전도도 및/또는 pH 를 갖는다.
전형적으로, 샘플을 매트릭스에 로딩시키는 완충액은 로딩 완충액 또는 샘플 완충액으로 불린다.
용어 "평형화" 는 표적 분자의 로딩 이전에 크로마토그래피 매트릭스를 평형화시키기 위해 완충액을 사용하는 것으로 칭한다. 전형적으로, 로딩 완충액은 평형화를 위해 사용된다.
크로마토그래피 매트릭스의 "세정" 또는 이를 "세정하는 것" 은 매트릭스를 통해 또는 그 위에 적절한 액체, 예를 들어 완충액을 통과시키는 것을 의미한다. 전형적으로, 세정은 표적 분자의 용리 이전에는 매트릭스로부터 약하게 결합된 오염물을 제거하고/하거나 로딩 후에는 비결합되거나 약하게 결합된 표적 분자를 제거하는데 사용된다.
상기 경우에, 전형적으로, 세정 완충액 및 로딩 완충액은 동일한 것이다. 바이러스 불활성화 완충액이 사용되는 경우, 표적 분자의 용리 이전에 특정한 존재하는 바이러스를 불활성화시키는데 사용된다. 상기 경우에, 전형적으로, 바이러스 불활성화 완충액은 로딩 완충액과 차이가 있는데, 세제/세제들을 포함할 수 있거나 상이한 특성 (pH/전도도/염 및 그 양) 을 가질 수 있기 때문이다.
세정은 또한 표적 분자의 용리 후에 매트릭스로부터 오염물을 제거하는데 사용될 수 있다. 상기는 표적 분자의 용리 후에 매트릭스를 통해 또는 그 위에 적절한 액체, 예를 들어 완충액을 통과시킴으로써 수행된다. 상기 경우에, 전형적으로, 세정 완충액은 로딩 완충액과 차이가 있다. 이는 세제/세제들을 포함할 수 있거나, 상이한 특성 (pH/전도도/염 및 그 양) 을 가질 수 있다. 세정 완충액은 예를 들어 산성 완충액이다.
크로마토그래피 매트릭스로부터 분자 (예, 면역글로불린 G 와 같은 목적하는 폴리펩티드 또는 불순물) 를 "용리" 시키는 것은 그로부터 분자를 제거하는 것을 의미한다. 표적 분자를 로딩 완충액의 용매 프론트(front) 로 용리시키는 경우 통과 모드로 직접, 또는 로딩 완충액과 상이한 완충액이 크로마토그래피 수지 상의 리간드 부위에 있어서 목적하는 분자와 경쟁하도록 용액 조건을 변경함으로써 용리가 일어날 수 있다. 비제한적인 예는 완충액이 이온 교환 물질 상의 하전된 부위에 있어서 분자와 경쟁하도록 이온 교환 물질을 둘러싸는 완충액의 이온 강도를 변경함으로써 이온 교환 수지로부터 분자를 용리시키는 것이다.
용어 "평균 입자 크기 직경" 또는 d50 은 누적 입자 크기 분포의 50% 에서의 평균 입자 크기 분포 값을 의미한다. 입자 크기는 바람직하게는 Malvern 'Master Sizer' 를 사용하는, 레이저-회절로 측정된다.
용어 "평균 기공 크기" 는 누적 기공 크기 분포의 50% 에서의 평균 기공 크기 분포 값을 의미한다.
본원에서 상호교환되어 사용된 바와 같은 용어 "통과 방법", "통과 모드" 및 "통과 작업" 은 하나 이상의 불순물과 함께 샘플에 포함된 하나 이상의 표적 분자 (예, Fc-영역 포함 단백질 또는 항체) 가 통상적으로 하나 이상의 불순물을 결합하는 크로마토그래피 매트릭스를 통과하도록 하는데, 여기서 표적 분자가 통상적으로 결합되지 않고 (즉, 통과하고) 로딩 완충액으로 매트릭스로부터 용리되는 분리 기법으로 칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "결합 및 용리 모드" 및 "결합 및 용리 방법" 은 샘플에 포함된 하나 이상의 표적 분자 (예, Fc 영역 포함 단백질) 가 적합한 크로마토그래피 매트릭스 (예, 이온 교환 크로마토그래피 매질) 에 결합되고 이어서 로딩 완충액과 상이한 완충액으로 용리되는 분리 기법으로 칭한다.
본 발명의 상세한 설명
본 정제 방법의 출발 물질은 정제되어야 하는 표적 분자를 포함하는 임의의 샘플일 수 있다. 전형적으로, 샘플은 혈액 또는 혈장이거나, 그로부터 수득되었다. 유리하게는, 이는 면역글로불린-포함 혈장 단백질 단편이다. 상기를 위한 출발 물질은 정상 인간 혈장일 수 있거나, 높은 역가의 특정한 항체, 예를 들어 고도면역 혈장을 갖는 공여체 유래일 수 있다.
본 발명의 방법에 따라, 표적 분자를 포함하는 상기 샘플은 샘플이 음이온 교환 관능기를 포함하는 크로마토그래피 매트릭스에 로딩되는 하나 이상의 정제 단계를 거친다.
본 발명에 따른 특정한 유형의 크로마토그래피 매트릭스의 사용이, 예를 들어 Macro-Prep® High Q 와 같은 메타크릴레이트 공중합체 기재 강음이온 교환기 또는 Q Sepharose FF 와 같은 세파로오스 기재 음이온 교환기와 비교시 5-10% 의 특히 보다 높은 수율을 표적 분자의 보다 높은 순도와 함께 유도하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, Q Sepharose FF 와 비교시, IgG 표적 단편에서 IgA 및 IgM 을 제외한 합계로 표현되는 순도는 전형적으로 5 배 더 높고, Macro-Prep® High Q 와 비교시, 표적 단백질 IgG 의 수율은 전형적으로 7.7% 더 높은데, 참조를 위해 표 1 을 참조하라.
상기 두드러진 효과는 600 내지 1200 μmol/g 음이온 교환기를 보유한 친수성 폴리비닐에테르 매트릭스를 사용함으로써 달성된다.
사용되는 매트릭스는 바람직하게는 적어도 하기를 포함하는 공중합체 기재의 친수성 가교된 중합체를 기준으로 한다:
a) 하나 이상의 하기 식 I 의 친수성 치환된 알킬 비닐 에테르:
Figure 112015078217285-pat00004
[식 중, R1, R2, R3 은 서로 독립적으로 H 또는 C1 내지 C6 알킬, 바람직하게는 H 또는 -CH3 일 수 있고,
R4 는 하나 이상의 히드록실기를 보유한 라디칼임]
및
b) 하나 이상의 하기 식 II 및/또는 III 및/또는 IV 에 따른 가교제:
Figure 112015078217285-pat00005
[식 중, X 는 2 내지 5 개의 C 원자, 바람직하게는 2 또는 3 개의 C 원자를 갖는 2 가 알킬 라디칼이며, 이때 N 의 직접적인 부근에 위치해 있지 않고 인접하지 않은 하나 이상의 메틸렌기는 O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH 또는 N 에 의해 대체될 수 있고, 메틸렌기의 하나 이상의 H 원자는 서로 독립적으로 히드록실기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, C5-C10-아릴, NH-(C1-C8)-알킬, N-(C1-C8)-알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있음], 및
Figure 112015078217285-pat00006
[식 중, 식 III 및 IV 에서의 Y1 및 Y2 는 서로 독립적으로 C1 내지 C10 알킬 또는 시클로알킬이며, 여기서 N 의 직접적인 부근에 위치해 있지 않은 메틸렌기 또는 비인접한 메틸렌기 하나 이상은 O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH 또는 N 에 의해 대체될 수 있고, 메틸렌기의 하나 이상의 H 는 서로 독립적으로 히드록실기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, C5-C10-아릴, NH(C1-C8)알킬, N(C1-C8)알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있거나,
또는 C6 내지 C18 아릴이며, 여기서 아릴 시스템에서의 하나 이상의 H 는 서로 독립적으로 히드록실기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, NH(C1-C8)알킬, N(C1-C8)알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있고,
A 는 2 내지 5 개의 C 원자, 바람직하게는 2 또는 3 개의 C 원자를 갖는 2 가 알킬 라디칼이며, 여기서 N 의 직접적인 부근에 위치해 있지 않은 메틸렌기 또는 비인접한 메틸렌기 하나 이상은 O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH 또는 N 에 의해 대체될 수 있고, 메틸렌기의 하나 이상의 H 는 서로 독립적으로 히드록실기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, C5-C10-아릴, NH(C1-C8)알킬, N(C1-C8)알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있고,
식 I 에서의 R4 는 전형적으로 하나 이상의 히드록실기를 보유한 아릴 라디칼, 지환족 라디칼 또는 알킬 라디칼임]
이는 중합체가 식 I 의 친수성 치환된 알킬 비닐 에테르의 군으로부터의 하나 이상의 화합물 및 식 II 및/또는 III 및/또는 IV 의 가교제의 군으로부터의 하나 이상의 화합물의 공중합에 의해 형성되는 것을 의미한다. 바람직하게는, 식 I 의 친수성 치환된 알킬 비닐 에테르의 군으로부터의 단 하나의 화합물 및 식 II, III 또는 IV 의 가교제의 군으로부터의 하나의 화합물이 활용된다.
바람직한 구현예에서, 식 I 의 R4 는 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C10 알킬 라디칼이며, 이때 하나 이상의 비인접한 메틸렌기는 O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH, N 에 의해 대체될 수 있고/있거나 하나 이상의 H 원자는 서로 독립적으로 C1-C6-알킬, C5-C10-아릴, 할로겐, NH2, NH(C1-C8)알킬, N(C1-C8)알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있고, 하나 이상의 OH 기는 C1 내지 C10 알킬 라디칼 또는 치환기 상에 존재하거나,
또는 전형적으로 5 내지 10 개의 C 원자를 갖는 지환족 라디칼이며, 이때 하나 이상의 비인접한 메틸렌기는 O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH, N 에 의해 대체될 수 있고/있거나 지환족 라디칼의 하나 이상의 H 원자는 서로 독립적으로 C1-C6-알킬, C5-C10-아릴, 할로겐, NH2, NH(C1-C8)알킬, N(C1-C8)알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있으며, 여기서 하나 이상의 OH 기는 지환족 고리 또는 측쇄 또는 치환기 상에 존재하거나,
또는 C6 내지 C18 아릴 라디칼이며, 이때 아릴 라디칼의 하나 이상의 H 원자는 서로 독립적으로 히드록실기, C1-C6-알킬, C5-C10-아릴, 할로겐, NH2, NH(C1-C8)알킬, N(C1-C8)알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있으며, 여기서 하나 이상의 OH 기는 아릴 라디칼 또는 측쇄 또는 치환기 상에 존재하거나,
또는 C5 내지 C18 헤테로아릴 라디칼이며, 여기서 헤테로아릴 라디칼의 하나 이상의 H 원자는 서로 독립적으로 히드록실기, C1-C6-알킬, C5-C10-아릴, 할로겐, NH2, NH(C1-C8)알킬, N(C1-C8)알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있으며, 여기서 하나 이상의 OH 기는 헤테로아릴 라디칼 또는 측쇄 또는 치환기 상에 존재한다.
특히 바람직한 구현예에서, 식 I 의 R4 는 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C10 알킬 라디칼이며, 이때 하나 이상의 비인접한 메틸렌기는 O, S, SO2 또는 NH 에 의해 대체될 수 있고/있거나 하나 이상의 H 원자는 서로 독립적으로 C1-C6-알킬, C5-C10-아릴, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있고, 하나 이상의 OH 기는 C1 내지 C10 알킬 라디칼 또는 치환기 상에 존재하거나,
또는 전형적으로 5 내지 10 개의 C 원자를 갖는 지환족 라디칼이며, 이때 하나 이상의 비인접한 메틸렌기는 O, S, SO2 또는 NH 에 의해 대체될 수 있고/있거나 지환족 라디칼의 하나 이상의 H 원자는 서로 독립적으로 C1-C6-알킬, C5-C10-아릴, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있으며, 여기서 하나 이상의 OH 기는 지환족 고리 또는 측쇄 또는 치환기 상에 존재하거나,
또는 C6 내지 C14 아릴 라디칼이며, 여기서 아릴 라디칼의 하나 이상의 H 원자는 서로 독립적으로 히드록실기, C1-C6-알킬, C5-C10-아릴, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있으며, 여기서 하나 이상의 OH 기는 아릴 라디칼 또는 측쇄 또는 치환기 상에 존재하거나,
또는 C6 내지 C14 헤테로아릴 라디칼이며, 이때 하나 이상의 N 원자는 헤테로원자로서 존재하고, 헤테로아릴 라디칼의 하나 이상의 H 원자는 서로 독립적으로 히드록실기, C1-C6-알킬, C5-C10-아릴, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있으며, 여기서 하나 이상의 OH 기는 헤테로아릴 라디칼 또는 측쇄 또는 치환기 상에 존재한다.
바람직한 구현예에서, 활용되는 친수성 치환된 알킬 비닐 에테르는 R4 가 히드록실기를 보유한 라디칼인 식 I 의 화합물이다.
바람직한 구현예에서, 활용되는 친수성 치환된 알킬 비닐 에테르는 1,2-에탄디올 모노비닐 에테르, 1,3-프로판디올 모노비닐 에테르, 1,4-부탄디올 모노비닐 에테르, 1,5-펜탄디올 모노비닐 에테르, 1,6-헥산디올 모노비닐 에테르 또는 디에틸렌 글리콜 모노비닐 에테르이고, 활용되는 지환족 비닐 에테르는 시클로헥산디메탄올 모노비닐 에테르, 특히 바람직하게는 1,4-부탄디올 모노비닐 에테르, 1,5-펜탄디올 모노비닐 에테르, 디에틸렌 글리콜 모노비닐 에테르 또는 시클로헥산디메탄올 모노비닐 에테르이다.
활용되는 가교제는 바람직하게는 식 II 의 화합물이다. 바람직한 것은 디비닐프로필렌우레아 (1,3-디비닐-테트라-히드로피리미딘-2-온) 또는 특히 바람직하게는 디비닐에틸렌우레아 (1,3-디비닐이미다졸린-2-온) 을 사용하는 것이다.
중합체의 중량에 있어서, 친수성 치환된 알킬 비닐 에테르의 비율은 전형적으로 1% (중량 기준) 내지 90% (중량 기준), 또는 알킬 비닐 에테르가 단일중합되지 않는다면 2 관능성 가교제를 기준으로 몰비 2:1 에 상응하는 알킬 비닐 에테르의 최대 중량비이다. 친수성 치환된 알킬 비닐 에테르의 비율은 바람직하게는 10 내지 80% (중량%), 특히 바람직하게는 35 내지 60% 이다. 따라서, 가교제의 비율은 10 내지 99% (중량%), 바람직하게는 20 내지 90%, 특히 바람직하게는 40 내지 65% 이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 중합체는 기공 크기가 2 내지 200 nm, 더 바람직하게는 30 내지 150 nm 로서 다공성이다.
또 다른 구현예에서, 중합체는 평균 입자 크기 직경이 25 내지 250 μm, 가장 바람직하게는 30 내지 90 μm 인 입자 형태이다.
중합체는 음이온 교환기를 포함하는 리간드를 보유한다.
바람직한 구현예에서, 중합체는 그래프트 중합에 의해 중합체에 부착된 구조로 유도체화되었다.
바람직한 구현예에서, 중합체는 바람직하게는 US5453186, 9 쪽 실시예 8 에 따라 (여기서, 바람직하게는 하전된 기는 양전하 트리메틸암모늄알킬기임) 세륨(IV) 촉매작용으로 그래프트 중합에 의해 중합체에 부착된 구조로 유도체화되었다.
본 발명의 방법에 사용되는 물질 및 그 제조에 관한 추가 세부사항이 WO 2007/014591 에 밝혀져 있을 수 있다.
리간드는 크로마토그래피의 분야의 당업자에 공지되어 있다. 리간드는 기재의 합성 동안에 이미 또는 이후에 지지체 물질 내에 도입될 수 있는 치환기이고, 지지체 물질의 표면 특성에 영향을 미친다. 특히, 리간드에 의한 지지체 물질의 표적 유도체화는 특정한 크로마토그래피 특성을 갖는 지지체 물질을 생성한다. 특히, 본 발명에 사용되는 리간드는 하기 말단기를 가질 수 있다:
이온 또는 이온가능한 기, 예를 들어
-NR7R8 또는 -NR7R8R9
[식 중,
R7 및 R8 은 서로 독립적으로 H, 1-5 개의 C 원자를 갖는 알킬이고,
R9 는 1-5 개의 C 원자를 갖는 알킬이며,
단, X = -NR7R8R9 인 경우, R7 및 R8 은 H, -구아니디늄일 수 없음].
바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법에서 매트릭스로서 사용되는 중합체는 척수-유사 구조로 그래프트 중합에 의해 유도체화되는데, 이는 결국에는 그에 의해 관능기화될 수 있거나, 상응하는 리간드를 보유할 수 있다. 그래프팅은 바람직하게는 N-(2-트리메틸암모늄메틸)-아크릴아미드를 사용해 EP 0 337 144, 12 쪽 실시예 8 또는 US 5453186, 9 쪽 실시예 8 에 따라 수행된다. 활용되는 중합 촉매는 세륨(IV) 이온인데, 상기 촉매가 기재의 표면 상에 유리-라디칼 부위를 형성하며, 그로부터 단량체의 그래프트 중합이 개시되기 때문이다.
중합은 세륨 염을 포함하는 종결 반응에 의해 종결된다. 상기 이유로, (평균) 사슬 길이는 기재, 개시제 및 단량체의 농도비에 의해 영향을 받을 수 있다. 나아가, 단일한 단량체 또는 또한 상이한 단량체들의 혼합물이 활용될 수 있고; 후자의 경우에, 그래프팅된 공중합체가 형성된다.
그래프트 중합체의 제조에 적합한 단량체 및 그래프팅 절차에 관한 추가의 세부사항이, 예를 들어 WO 2007/014591, EP 0337 144, 특히 12 쪽, 실시예 8 및 US 5453186, 9 쪽, 실시예 8 에 개시되어 있다.
바람직하게는, 매트릭스는 그래프트 중합에 의해 이온기로 유도체화되며, 이로써 베이스 폴리머 매트릭스에 그래프팅된 수득한 사슬의 길이는 2 내지 100, 바람직하게는 5 내지 60, 특히 10 내지 30 개의 단량체 단위를 갖고, 각각의 단위는 전형적으로 하나의 이온기를 보유한다.
바람직한 이온기는 양전하 트리메틸암모늄메틸기이다.
매트릭스는 음이온 교환기 이외에 추가의 기타 관능기, 예컨대 소수성 또는 친수성기를 보유할 수 있지만, 임의의 경우에는 음이온 교환기를 갖는다.
본 발명에 사용되는 음이온 교환 매트릭스의 이온 용량은 전형적으로 600 내지 1200 μmol/g, 바람직하게는 700 내지 1000 μmol/g, 가장 바람직하게는 800 내지 1000 μmol/g 이다.
본 발명의 방법에 사용되는 적합한 물질은 Eshmuno(R) QPX 및 Eshmuno(R) QPX Hicap (Merck KGaA, Germany) 이다. 이들 수지는 WO 2007/014591 에 개시된 절차에 따라 합성되는 폴리비닐에테르 비드(bead) 를 포함하며, 여기에 중합체 구조는 EP 0337 144, 12 쪽 실시예 8 및 US 5453186, 9 쪽 실시예 8 에 따른 그래프팅 기법을 활용해 그래프팅되어 양전하 트리메틸암모늄메틸기를 보유한 표면 중합체 구조를 수득하는데, 여기서 Eshmuno QPX 및 Eshmuno QPX Hicap 의 경우에는 전하 밀도가 600 내지 1200 μmol/g 으로 조정된다.
본 발명의 방법을 수행하기 위해, 샘플은 음이온 교환 크로마토그래피를 거치는데, 여기서 크로마토그래피 매트릭스는 상기 기재된 바와 같이 음이온 교환기로 관능기화된 친수성 폴리비닐에테르이다.
샘플은 바람직하게는 면역글로불린 G, 바람직하게는 75 내지 99 중량% 의 IgG 를 포함하는 예비-정제된 혈장 샘플이다. 샘플은 바람직하게는 80 중량% 이상, 더 바람직하게는 85 중량% 이상, 특히 바람직하게는 90 중량% 초과, 가장 바람직하게는 92 내지 98 중량% 의 면역글로불린 G 를 포함한다. "중량%" 는 상기 경우에 건조시킨 혈장 샘플의 질량에 관련된다.
샘플을 매트릭스에 적용하기 전에, 매트릭스는 세정 및/또는 평형화될 수 있다.
세정은 적절하게 산성인 pH 4.0-5.5 완충액, 예컨대 아세테이트 완충액, 임의로는 염, 예를 들어 NaCl 을 사용해 수행될 수 있다. 완충액은 전형적으로 200 내지 1000 mM/l 의 농도를 갖는다.
평형화는 4 내지 7.4 의 pH 를 갖는 평형화 완충액으로 수행된다. 바람직하게는, 평형화 완충액의 pH 는 샘플의 pH 와 동일하다. 평형화 완충액의 농도는 전형적으로 0.005 내지 2 Mol/l 범위, 바람직하게는 0.005 내지 0.05 Mol/l 범위이다.
평형화 완충액은 전형적으로 샘플 완충액과 동일하다.
평형화 완충액으로 매트릭스를 세정 및/또는 평형화하기 전에, pH 가 10 초과, 바람직하게는 대략 14 인 염기성 수성 액체로 매트릭스를 처리할 수 있다. 상기와 같은 처리가 당업자에 공지되어 있다. 매트릭스로부터 잠재적 불순물을 제거하기에 적합하다. 적합한 액체는 수성 수산화나트륨 또는 수성 수산화칼륨이다. 염기성 수성 액체는 평형화 완충액으로 직접 또는 약간 산성인 수성 세정 완충액, 예컨대 아세트산 완충액으로, 바람직하게는 예를 들어 아세테이트 농도가 200 내지 1000 mM/l 인 것으로 매트릭스로부터 제거될 수 있다.
샘플은 전형적으로 완충액 (로딩 완충액 또는 샘플 완충액으로도 칭함) 중의 크로마토그래피 매트릭스에 적용된다. 완충액은 바람직하게는 4.0 내지 7.4 의 pH 를 갖는다. 적합한 완충액은 탄산/실리케이트 완충액, 아세트산 완충액, 시트레이트 완충액, 포스페이트 완충액, 글리신 완충액 및/또는 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (MES) 완충액이다. 가장 바람직한 것은 아세테이트 완충액이다.
완충액은 전형적으로 5 내지 500 mmol/l, 바람직하게는 5 내지 100 mmol/l, 가장 바람직하게는 5 내지 50 mmol/l 의 농도로 사용된다.
샘플 공급물의 IgG 농도는 전형적으로 1 내지 50 g/l 로 조정된다.
매트릭스에 로딩되는 샘플의 양은 광범위하게 가변적이다.
매트릭스는 예를 들어 매트릭스 부피 1 리터 당 10 g 샘플과 같이 매우 소량의 샘플로 로딩될 수 있다. 또한, 매트릭스 부피의 리터 당 150 g 이하의 샘플을 로딩할 수 있다. 바람직하게는 매트릭스 부피 l 당 25 g 초과가 로딩되고, 가장 바람직하게는 25 내지 100 g/l 가 로딩된다.
샘플의 크로마토그래피 정제는 결합 및 용리 모드 또는 바람직하게는 통과 모드로 수행될 수 있다. 통과 모드에서, 표적 분자는 본질적으로 매트릭스에 결합 또는 흡수되지 않는다. 이는, 표적 분자가 본질적으로 용매 프론트, 즉 로딩 완충액의 프론트를 사용함으로 매트릭스를 통과하고, 본질적으로 용매 프론트와 함께 매트릭스로부터 회수되는 것을 의미한다. 통과 모드로 본 발명에 따른 매트릭스를 사용하는 경우, 표적 분자가 전형적으로 매트릭스의 부피에 대해 5 배, 바람직하게는 3 배, 매우 바람직하게는 2 배 부피의 용리액으로 매트릭스로부터 용리될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 용리액은 상기 경우에 로딩 완충액과 동일하다. 불순물이 매트릭스에 보유되어 있다. 통과 모드로, 80% 이상, 바람직하게는 90% 초과, 가장 바람직하게는 95% 초과의 표적 분자가 매트릭스로부터 회수될 수 있다.
매트릭스가 로딩 완충액으로 용리되는한 매트릭스에 대한 불순물의 결합이 매우 안정한 것으로 추가로 밝혀졌다. 상기는 표적 분자가 거의 완전히 용리될 수 있지만 (수율 약 97%) 그 순도가 여전히 매우 높도록 (전형적으로 >99.5%) 표적 분자의 용리에 사용되는 로딩 완충액의 부피를 필요하다면 매트릭스의 5 배 부피 초과로 또한 확장시키는 가능성을 제공한다.
통과 모드로 수행되는 본 발명의 방법은 불순물, 예컨대 IgA, IgM, 알부민 및 세린 프로테아제, 예컨대 인자 XIa 로부터 표적 분자로서 면역글로불리 G 를 분리시키기에 특히 적합하다.
그러나, 이는 또한 IgA, IgM 및/또는 인자 XIa 의 단리 또는 IgM 포함 생성물의 단리에 적합하다. 통과 모드로 크로마토그래피 정제의 수행시, 면역글로불린 G 는 본질적으로 용매 프론트로 용리되는 것으로 밝혀졌다. IgG 의 용리 후에, 용리 완충액 (이는 IgG 의 용리에서의 로딩 완충액과 동일함) 은 IgA, IgM 및 인자 XIa 와 같은 추가의 2 차 표적 분자의 용리를 지지하는 것으로 변화될 수 있다. 예를 들어, 2 차 표적 분자는 IgA 및 IgM 의 혼합물일 수 있다. 이를 위해, 용리 완충액의 산도를 전형적으로 증가시킨다. 바람직하게는, 상기 적용을 위한 용리 완충액의 pH 는 4 내지 5.5 로서, pH 는 임의의 경우에 로딩 완충액의 pH 보다 낮다. 전형적으로, IgA, IgM 및/또는 인자 XIa 를 용리시키는데 사용되는 완충액의 pH 는 로딩 완충액의 pH 보다 0.5 내지 2 pH 단위 낮다.
그 결과, 본 발명의 방법은 하나의 표적 분자, 예를 들어 IgG, 뿐만 아니라 2 개 이상의 표적 분자, 예컨대 IgG 또한 IgA, IgM 및/또는 인자 XIa, 예를 들어 IgG 또한 IgA 와 IgM 의 혼합물의 정제를 가능하게 한다.
본 발명의 방법은 단일, 별개의 정제 단계로서 사용될 수 있지만, 또한 바람직하게는 본 발명의 방법 전 또는 후에 수행되는 기타 정제 단계와 합쳐질 수 있다.
본 발명의 방법으로 정제되는 바람직한 표적 분자는 IgG 이다. IgG 의 정제를 위한 공지된 절차는 전형적으로 침전, 여과 및 크로마토그래피 단계를 포함하는 수개의 단계를 포함한다. 상기 방법이, 예를 들어 ["Production of Plasma Priteins for Therapeutic Use", edited by J. Bertolini, N. Goss, J. Curling; John Wiley and sons Inc., 2013] 에 개시되어 있으며, 예를 들어 챕터 13 을 참조하라.
본 발명의 방법은 바람직하게는 공지된 방법의 정제 단계들 중 하나 이상을 대체하도록 적용될 수 있다.
바람직하게는, 미정제 혈장 샘플은 우선 침전 단계를 거치는데, 이때 대부분의 비-IgG-단백질, 특히 보다 고분자량의 것들, 응집된 면역글로불린 및 기타 응집된 단백질, 뿐만 아니라 잠재적으로 감염성이 있는 입자가 단량체성 IgG 의 상당한 침전 없이도 침전된다. 이는, 예를 들어 단편 I + II + III 또는 단편 II + III 또는 단편 II 로 불리는 IgG 농축된 중간체를 산출하는 에탄올 침전에 의해 달성될 수 있다. 산 침전 및 여과 단계 후에, 음이온 교환 크로마토그래피용 공급물이 수득될 수 있다.
또한, 추가의 크로마토그래피 단계를 수행할 수 있다.
음이온 크로마토그래피 후에, 정제된 IgG 는 전형적으로 나노여과 및 제형화된다.
예상외로, 특정한 유형의 크로마토그래피 매트릭스의 사용이 단순 통과 이온 교환 크로마토그래피에 의해 수율 >95% 로 매우 효과적으로 IgG 와 같은 표적 분자를 정제하는 가능성을 제공할 뿐만 아니라 IgA (25 mg/L 미만), IgM (25 mg/L 미만), 알부민 (검출 한계 미만) 및 인자 XIa (검출 한계 미만) 로부터 IgG 의 분리를 보장하는 것으로 밝혀졌다. 이들 물질로부터의 IgG 의 매우 양호한 분리가 또한 매우 양호한 순도 및 수율로 이들 물질 중 하나 이상을 추가적으로 단리시키는데 추가로 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 크로마토그래피 매트릭스로 달성될 수 있는 순도 및 수율은 상이한 매트릭스에서 동등한 음이온 교환 단계와 비교시 보다 양호하다. 공지된 절차가 종종 음이온 교환 정제 단계를 연이은 양이온 교환 폴리싱(polishing) 단계와 조합시키지만, 상기와 같은 폴리싱 단계는 전형적으로 음이온 교환 정제가 본 발명에 따라 수행되는 경우에는 필요치 않다.
상기 및 하기에 인용된 모든 출원, 특허 및 공문, 뿐만 아니라 2014 년 8 월 15 일자로 제출된 상응하는 EP 14002852.3 의 전 개시내용이 본원에서 참조로 포함되어 있다.
실시예
실시예 1 - IgG 의 정제
크로마토그래피 매트릭스 (Eshmuno® QPX Hicap, Merck KGaA) 를 500 mM 아세테이트 완충액 (pH 6.5) 으로 평형화시킨 후, 25 mM 아세테이트 완충액 (pH 6.5) 으로 처리한다. 샘플은 하기 불순물과 함께 15 g/l IgG 를 포함하는 용액이다: 25 mM 아세테이트 완충액 (pH 6.5) 중에 IgA (1000 mg/l) 및 IgM (500 mg/l) 및 인자 XIa (50 pM/l).
샘플을 130 cm/h 에서 매트릭스에의 단백질 로딩을 75 g/l 로 하여 매트릭스에 적용한다. 이후, IgG 를 매트릭스로부터 완전히 용리시킬 때까지 매트릭스를 25 mM 아세테이트 완충액, pH 6.5 로 용리시킨다. IgG 를 95% 초과의 수율로 회수하였는데, 이로써 정제된 IgG 는 25 mg/l 미만의 IgM 및 IgA 를 포함한다. 인자 XIa 의 양을 0.0 pM 으로 감소시킬 수 있다. IgM 및 IgA 를 산성 완충액 (300 mM 아세테이트 완충액, pH 4.5) 으로의 용리에 의해 95% 초과의 순도 및 95% 초과의 수율로 매트릭스로부터 추가로 수득할 수 있다. 모든 단계는 130 cm/h 선속도로 시행된다.
실시예 2 - 각종 매트릭스에서의 IgG 의 정제
일반 절차:
공급물 조성: 25 mM 아세테이트, pH 6.5 중의 20 g/l IgG 및 1 g/l IgA 및 1 g/l IgM.
예비-평형화: 500 mM 아세테이트 완충액, pH 6.5
평형화: 25 mM 아세테이트 완충액, pH 6.5
로딩/용리: 25 mM 아세테이트 완충액, pH 6.5
유속: >130 cm/h
로딩: 5 g/L (IgM 및 IgA 의 합계)
세정: 250 mM 아세테이트 완충액, pH 4.5
표 1 은 수율, 순도 (불순물의 농도) 및 회수 데이터를 나타낸다.
Figure 112015078217285-pat00007

Claims (14)

  1. 하기에 의한 혈장 샘플로부터의 표적 분자의 정제 방법:
    a) 표적 분자를 포함하는 혈장 샘플을 제공하고,
    b) 상기 혈장 샘플을, 600 내지 1200 μmol/g 의 음이온 교환기를 보유한 폴리비닐에테르 매트릭스 상의 이온 교환 크로마토그래피에 적용시킴으로써 정제된 표적 분자를 매트릭스로부터 용리시킴,
    여기서, 상기 방법은, 표적 분자가 면역글로불린이고, 이온 교환 크로마토그래피가 통과 모드 (flow-through mode) 로 수행되고, 단계 b) 의 매트릭스가 4 내지 7.4 사이의 pH 를 갖는 완충액으로 용리되는 것을 특징으로 함.
  2. 제 1 항에 있어서, 매트릭스가 군 ⅰ) 로부터의 하나 이상의 화합물 및 군 ⅱ) 로부터의 하나의 화합물의 공중합에 의해 수득가능한 공중합체인 것을 특징으로 하는 혈장 샘플로부터의 표적 분자의 정제 방법:
    ⅰ) 하나 이상의 하기 식 I 의 친수성 치환된 알킬 비닐 에테르:
    Figure 112022044288576-pat00008

    [식 중, R1, R2, R3 은 서로 독립적으로 H 또는 C1 내지 C6 알킬, 또는 -CH3 이고,
    R4 는 하나 이상의 히드록실기를 보유한 라디칼임]
    및
    ⅱ) 하나 이상의 하기 식 II 및/또는 III 및/또는 IV 에 따른 가교제:
    Figure 112022044288576-pat00009

    [식 중, X 는 2 내지 5 개의 C 원자, 또는 2 또는 3 개의 C 원자를 갖는 2 가 알킬 라디칼이며, 이때 N 의 직접적인 부근에 위치해 있지 않고 인접하지 않은 하나 이상의 메틸렌기는 O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH 또는 N 에 의해 대체될 수 있고, 메틸렌기의 하나 이상의 H 원자는 서로 독립적으로 히드록실기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, C5-C10-아릴, NH-(C1-C8)-알킬, N-(C1-C8)-알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있음], 및
    Figure 112022044288576-pat00010

    [식 중, 식 III 및 IV 에서의 Y1 및 Y2 는 서로 독립적으로
    C1 내지 C10 알킬 또는 시클로알킬이며, 여기서 N 의 직접적인 부근에 위치해 있지 않은 메틸렌기 또는 비인접한 메틸렌기 하나 이상은 O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH 또는 N 에 의해 대체될 수 있고, 메틸렌기의 하나 이상의 H 는 서로 독립적으로 히드록실기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, C5-C10-아릴, NH(C1-C8)알킬, N(C1-C8)알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있거나,
    또는 C6 내지 C18 아릴이며, 여기서 아릴 시스템에서의 하나 이상의 H 는 서로 독립적으로 히드록실기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, NH(C1-C8)알킬, N(C1-C8)알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있고,
    A 는 2 내지 5 개의 C 원자, 또는 2 또는 3 개의 C 원자를 갖는 2 가 알킬 라디칼이며, 여기서 N 의 직접적인 부근에 위치해 있지 않은 메틸렌기 또는 비인접한 메틸렌기 하나 이상은 O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH 또는 N 에 의해 대체될 수 있고, 메틸렌기의 하나 이상의 H 는 서로 독립적으로 히드록실기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, C5-C10-아릴, NH(C1-C8)알킬, N(C1-C8)알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있음].
  3. 제 1 항에 있어서, 매트릭스가 1,4-부탄디올 모노비닐 에테르, 1,5-펜탄디올 모노비닐 에테르, 디에틸렌 글리콜 모노비닐 에테르 또는 시클로-헥산디메탄올 모노비닐 에테르의 군으로부터 선택되는 친수성 치환된 알킬 비닐 에테르 및 가교제로서의 디비닐에틸렌우레아 (1,3-디비닐이미다졸린-2-온) 의 공중합에 의해 수득가능한 것을 특징으로 하는 혈장 샘플로부터의 표적 분자의 정제 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 이온기가 폴리비닐에테르 매트릭스를 세륨 촉매화된 그래프트 중합에 적용시킴으로써 매트릭스에 부착된 것을 특징으로 하는 혈장 샘플로부터의 표적 분자의 정제 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 폴리비닐에테르 매트릭스가 700 내지 1100 μmol/g 양전하(positively charged) 음이온 교환기를 갖는 그래프트 중합체를 보유한 것을 특징으로 하는 혈장 샘플로부터의 표적 분자의 정제 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 음이온 교환기가 트리메틸암모늄알킬인 것을 특징으로 하는 혈장 샘플로부터의 표적 분자의 정제 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 분자가 IgA, IgM, 알부민 및 인자 XIa 로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 혈장 샘플로부터의 표적 분자의 정제 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 매트릭스 리터 당 샘플내 단백질 25 내지 150 g 의 양으로 매트릭스에 적용되는 것을 특징으로 하는 혈장 샘플로부터의 표적 분자의 정제 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b) 의 매트릭스의 로딩 및 용리가 0.005 내지 1 M 아세테이트를 포함하는 아세테이트 완충액으로 수행되는 것을 특징으로 하는 혈장 샘플로부터의 표적 분자의 정제 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 매트릭스가 20 내지 250 μm 의 평균 입자 크기 직경을 갖는 입자로 구성되는 것을 특징으로 하는 혈장 샘플로부터의 표적 분자의 정제 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 매트릭스로부터의 표적 분자의 용리 후에, 이후의 단계 c) 에서 매트릭스가 단계 b) 에 사용되는 완충액의 pH 미만의 pH 를 갖는 완충액으로 용리되고, 이로써 IgA, IgM 및 인자 XIa 가 매트릭스로부터 용리되는 것을 특징으로 하는 혈장 샘플로부터의 표적 분자의 정제 방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
KR1020150113871A 2014-08-15 2015-08-12 혈장으로부터의 면역글로불린의 정제 KR102446468B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14002852 2014-08-15
EP14002852.3 2014-08-15

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160021050A KR20160021050A (ko) 2016-02-24
KR102446468B1 true KR102446468B1 (ko) 2022-09-22

Family

ID=51690170

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150113871A KR102446468B1 (ko) 2014-08-15 2015-08-12 혈장으로부터의 면역글로불린의 정제

Country Status (7)

Country Link
US (1) US9975920B2 (ko)
EP (1) EP2985076B1 (ko)
JP (1) JP6769695B2 (ko)
KR (1) KR102446468B1 (ko)
CN (1) CN105367650B (ko)
CA (1) CA2900249C (ko)
ES (1) ES2920381T3 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110709696B (zh) * 2017-06-22 2022-01-04 昭和电工株式会社 寡核苷酸的混合物的分离分析方法
WO2019173731A1 (en) * 2018-03-08 2019-09-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Anionic exchange-hydrophobic mixed mode chromatography resin
WO2021001387A1 (en) * 2019-07-03 2021-01-07 Merck Patent Gmbh Antibody drug conjugate purification
EP4025336A4 (en) 2019-09-05 2024-01-17 Bio-Rad Laboratories, Inc. ANION EXCHANGE/HYDROPHOBIC RESINS FOR MIXED MODE CHROMATOGRAPHY

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4430496A (en) * 1980-01-17 1984-02-07 Varian Associates, Inc. Strong anion exchange composition and methods
FR2543448A1 (fr) * 1983-04-01 1984-10-05 Rhone Poulenc Spec Chim Procede de fractionnement du plasma
DE3811042A1 (de) 1988-03-31 1989-10-19 Merck Patent Gmbh Ionenaustauscher
SE9303790D0 (sv) * 1993-11-17 1993-11-17 Pharmacia Lkb Biotech A method for separation and synthetic polymers that can be used as separation media in the method
CN101258175B (zh) 2005-08-03 2011-11-16 默克专利股份公司 亲水交联聚合物
SG10201604559TA (en) * 2011-06-08 2016-07-28 Emd Millipore Corp Chromatography matrices including novel staphylococcus aureus protein a based ligands
CN102250240B (zh) * 2011-06-27 2013-07-31 山东泰邦生物制品有限公司 一种从血浆分离组分ⅰ+ⅲ中纯化人免疫球蛋白的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Kiesewetter, A., et al., Research Disclosure, Mason Publications, Hampshire, GB, 2010, vol. 557, no. 12, pp. 843 (2010.09.01.) 1부.*

Also Published As

Publication number Publication date
ES2920381T3 (es) 2022-08-03
JP2016041688A (ja) 2016-03-31
JP6769695B2 (ja) 2020-10-14
CN105367650A (zh) 2016-03-02
CA2900249C (en) 2023-04-25
EP2985076A3 (en) 2016-03-23
CA2900249A1 (en) 2016-02-15
US20160046664A1 (en) 2016-02-18
CN105367650B (zh) 2020-12-01
EP2985076A2 (en) 2016-02-17
KR20160021050A (ko) 2016-02-24
EP2985076B1 (en) 2022-03-30
US9975920B2 (en) 2018-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101415660B1 (ko) 샘플 중의 1 이상의 불순물로부터 표적 단백질을 정제하는 방법
JP5243450B2 (ja) 水溶性の非イオン性有機高分子の存在下での混合モードクロマトグラフィーによる抗体の能力の増大および精製方法
CN107383161B (zh) 生物分子的纯化
CN111423488B (zh) 在蛋白质纯化过程中降低样品中的一种或多种杂质的水平的方法
EP2855504B1 (en) Chromatographic purification of immunoglobulin g preparations with particles having multimodal functionalities
KR102446468B1 (ko) 혈장으로부터의 면역글로불린의 정제
EP2935309B1 (en) Copolymers for protein precipitation
EP3993887B1 (en) Glycoform purification
AU2012269240B2 (en) Single unit chromatography antibody purification
CN118291432A (zh) 一种利用非亲和层析捕获技术纯化蛋白的方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right