JP2016041688A - 血漿からの免疫グロブリンの精製 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】600〜1200μmol/gのアニオン基を有し、20〜250μmの平均粒径を有するポリビニルエーテルマトリクス粒子を分離体とするイオン交換クロマトグラフィーに血漿試料を供し、免疫グロブリン等の標的分子を分離精製する方法。
【選択図】なし
Description
ヒトおよび動物の血液は例えば治療特性を有する多くのタンパク質および酵素を含む。これらのタンパク質のいくつかは、赤血球において見出され得る一方、他は血漿または血清の溶液において見出される。かかるタンパク質は、ヒト治療剤としての使用のためのタンパク質の精製および標準化を目的とした大規模かつ特異的な単離のための標的である。治療使用のために単離された突出した血液タンパク質の例:アルブミン、免疫グロブリンG、第IX因子、第VIII因子およびアルファ−1−プロテイナーゼインヒビター。これらのタンパク質のいくつかは、年間数千kg(アルブミンおよびIgG)の規模で製造される一方、他は年間グラム〜キログラム規模のみで製造される。しかしながら、世界的な規模では、年間数百万リットルの血液がこれらのタンパク質を単離する目的のために処理される。
したがって、IgG製品を製造するための改善されかつより効率的な方法について需要が存在する。
所定の種類のクロマトグラフィー材料またはマトリクスは、血漿試料からの標的分子のアニオン交換精製のために極めて効果的に使用できることが見出されている。マトリクスは、600〜1200μmol/gのアニオン基を有する親水性のポリビニルエーテルである。標的分子は、極めて高収量および優れた純度で得ることができる。
a)標的分子を含む血漿試料を提供すること
b)600〜1200μmol/gのアニオン基を有するポリビニルエーテルマトリクス上のイオン交換クロマトグラフィーに対して前記血漿試料を供し、それによって精製された標的分子がマトリクスから溶出されること
によって血漿試料から標的分子を精製するための方法を対象とする。
a)が、式I
およびR4は、少なくとも1つのヒドロキシル基を有するラジカルである、
で表される少なくとも1つの親水性置換されたアルキルビニルエーテルであり、
ならびに
C1〜C10アルキルまたはシクロアルキルであり、ここで1または2以上の隣接していないメチレン基またはNのすぐ近傍に位置していないメチレン基は、O、C=O、S、S=O、SO2、NH、NOHまたはNによって置き換えてもよく、およびメチレン基の1または2以上のHは、互いに独立して、ヒドロキシル基、C1〜C6−アルキル、ハロゲン、NH2、C5〜C10−アリール、NH(C1〜C8)アルキル、N(C1〜C8)アルキル2、C1〜C6−アルコキシまたはC1〜C6アルキル−OHによって置換されてもよい、
Aは、2〜5個のC原子、好ましくは2または3個のC原子を有する二価のアルキルラジカルであり、式中、1または2以上の隣接していないメチレン基またはNのすぐ近傍に位置していないメチレン基は、O、C=O、S、S=O、SO2、NH、NOHまたはNによって置き換えてもよく、およびメチレン基の1または2以上のHは、互いに独立してヒドロキシル基、C1〜C6アルキル、ハロゲン、NH2、C5〜C10アリール、NH(C1〜C8)アルキル、N(C1〜C8)アルキル2、C1〜C6アルコキシまたはC1〜C6アルキル−OHによって置換されてもよい。
極めて好ましい態様において、マトリクスは、1,4−ブタンジオールモノビニルエーテル、1,5−ペンタンジオールモノビニルエーテル、ジエチレングリコールモノビニルエーテルまたはシクロヘキサンジメタノールモノビニルエーテルの群から選択される用いた親水性置換されたアルキルビニルエーテルの共重合によって形成され、および
架橋剤としてジビニルエチレン尿素(1,3−ジビニルイミダゾリン−2−オン)である。
好ましい態様において、イオン性基は、ポリビニルエーテルマトリクスをセリウム触媒グラフト重合に供することによってマトリクスに付加される。これは好ましくはUS 5453186の第9頁の例8によって行われ、ここで好ましくは荷電した基は正に荷電したトリメチルアンモニウムアルキル基である。
好ましい態様において、イオン交換クロマトグラフィーは、フロースルーモードにおいて行われる。
好ましい態様において、標的分子は、免疫グロブリン、好ましくはヒト免疫グロブリン、最も好ましくはヒト免疫グロブリンGである。
別の態様において、標的分子は、IgA、IgM、アルブミン、トランスフェリンおよび第XIa因子から分離される。
一態様において、試料は、リットルのマトリクス当たりの試料において、25〜150gのタンパク質の量のマトリクスに適用される。
好ましい態様において、ステップb)におけるマトリクスのローディングおよび溶出は、0.005〜1M酢酸を含む酢酸バッファーで行われる。
一態様において、マトリクスは、20〜250μmの平均粒径を有する粒子から作られる。
一態様において、孔半径は30〜150nmである。
一態様において、ステップb)におけるマトリクスからの標的分子の溶出後、後続ステップc)において、マトリクスは、ステップb)において使用されたバッファーのpHよりも低いpHを有するバッファーで処理され、それによってIgA、IgM、および第XIa因子はマトリクスから溶出される。
本発明を詳細に説明する前に、本発明は特定の組成物または方法ステップに限定されるものではないこと(それらが変化し得るため)を理解すべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるとおり、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が明確に指示しない限り複数のものを含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「リガンド」を指すことは、複数のリガンドを含み、「抗体」を指すことは複数の抗体などを含む。
特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、一般的に、本発明が関連する技術分野の当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。以下の用語は、本明細書に記載されるとおり、本発明の目的について定義される。
結合および溶出モードで分離カラムに「ローディング」するとき、バッファーは、標的分子(例えば、標的タンパク質を含有するFc領域)および1または2以上の不純物を含む試料または組成物をクロマトグラフィーカラム(例えば、イオン交換カラム)にロードするために使用される。バッファーは、標的分子がクロマトグラフィーマトリクスに結合する導電率および/またはpHを有し、一方、理想的にはすべての不純物は結合せずにカラムをフロースルーする。
典型的には、試料がマトリクスにロードされるバッファーは、ローディングバッファーまたは試料バッファーと称される。
用語「平衡化」は、標的分子をローディングする前にクロマトグラフィーマトリクスを平衡化するバッファーの使用を指す。典型的には、ローディングバッファーは平衡化のために使用される。
この場合、典型的には、洗浄バッファーおよびローディングバッファーは同一である。ウイルス不活性化バッファーを使用する場合、それは、標的分子を溶出する前に、所定の存在するウイルスを不活性化するために使用される。この場合、典型的には、ウイルス不活性化バッファーは、それが洗剤(単数)/洗剤(複数)を含有するか、または種々の特性(pH/導電率/塩およびそれらの量)を有してもよいため、ローディングバッファーとは異なる。
用語「平均孔径」は、累積孔径分布の50%における平均孔径分布値を意味する。
用語「フロースルー方法」、「フロースルーモード」および「フロースルー操作」は、本明細書で交換可能に使用されるとおり、試料中に1または2以上の不純物とともに含有された少なくとも1つの標的分子(例えば、タンパク質または抗体を含有するFc領域)が、通常1または2以上の不純物に結合するクロマトグラフィーマトリクスをフロースルーすることが意図された分離技術、ここで標的分子は通常結合せず(すなわち、フロースルーし)、ローディングバッファーでマトリクスから溶出される、を参照する。
本精製方法の出発材料は、精製された標的分子を含むあらゆる試料であり得る。典型的には、試料は、血液または血漿から得られるか、または得られたものである。有利には、それは免疫グロブリンを含有する血漿タンパク質フラクションである。このための出発材料は、通常のヒト血漿であり得、または高力価の特異的な抗体を有するドナーに由来してもよく、例えば過免疫血漿である。
本発明による所定の種類のクロマトグラフィーマトリクスの使用は、例えばMacro−Prep(登録商標)High Qのようなメタクリラートコポリマーベースの強アニオン交換体またはQ Sepharose FFのようなセファロースベースのアニオン交換体と比較して、とりわけ、より高い純度の標的分子と組み合わせて5〜10%のより高い収量をもたらすことが見出された。例えば、Q Sepharose FFと比較して、IgG標的フラクションにおけるIgAおよびIgMの合計として表現される純度は、典型的には5倍高く、Macro−Prep(登録商標)High Qと比較して標的タンパク質IgGの収量は、典型的には7.7%高い。参考のために表1を参照。
使用されるマトリクスは、好ましくは、
a)式I
およびR4は少なくとも1つのヒドロキシル基を有するラジカルである、
で表される少なくとも1つの親水性置換されたアルキルビニルエーテル
ならびに
C1〜C10アルキルまたはシクロアルキルであり、ここで、1または2以上の隣接していないメチレン基またはNのすぐ近傍に位置していないメチレン基が、O、C=O、S、S=O、SO2、NH、NOHまたはNによって置き換えてもよく、およびメチレン基の1または2以上のHが、ヒドロキシル基、C1〜C6アルキル、ハロゲン、NH2、C5〜C10アリール、NH(C1〜C8)アルキル、N(C1〜C8)アルキル2、C1〜C6アルコキシまたはC1〜C6アルキルOHによって互いに独立して置換されてもよく、
を少なくとも含むコポリマーに基づく親水性架橋ポリマーに基づく。
式IにおけるR4は、典型的には、少なくとも1つのヒドロキシル基を有する、アルキルラジカル、シクロ脂肪族ラジカルまたはアリールラジカルである。
直鎖または分枝のC1〜C10アルキルラジカル、式中、1または2以上の隣接していないメチレン基は、O、C=O、S、S=O、SO2、NH、NOH、Nによって置き換えてもよく、および/または、式中、1または2以上のH原子は、互いに独立してC1〜C6アルキル、C5〜C10アリール、ハロゲン、NH2、NH(C1〜C8)アルキル、N(C1〜C8)アルキル2、C1〜C6アルコキシまたはC1〜C6アルキルOHによって置換されていてもよく、および、式中、少なくとも1つのOH基がC1〜C10アルキルラジカルまたは置換基のいずれかに存在する、
C5〜C18ヘテロアリールラジカル、ここでヘテロアリールラジカルにおける1または2以上のH原子は、互いに独立して、ヒドロキシル基、C1〜C6アルキル、C5〜C10アリール、ハロゲン、NH2、NH(C1〜C8)アルキル、N(C1〜C8)アルキル2、C1〜C6アルコキシもしくはC1〜C6アルキルOHによって置換されてもよく、ここで少なくとも1つのOH基は、ヘテロアリールラジカルまたは側鎖もしくは置換基のいずれかに存在する、
である。
直鎖または分枝のC1〜C10アルキルラジカル、式中、1または2以上の隣接していないメチレン基は、O、S、SO2またはNHによって置き換えてもよく、および/または、式中、1または2以上のH原子は、互いに独立して、C1〜C6アルキル、C5〜C10アリール、C1〜C6アルコキシまたはC1〜C6アルキルOHによって置換されてもよく、および、式中、少なくとも1つのOH基はC1〜C10アルキルラジカルまたは置換基のいずれかに存在する、
または、典型的には5〜10個のC原子を有するシクロ脂肪族ラジカル、式中、1または2以上の隣接していないメチレン基は、O、S、SO2またはNHによって置き換えてもよく、および/または、式中、シクロ脂肪族ラジカルの1または2以上のH原子は、互いに独立して、C1〜C6アルキル、C5〜C10アリール、C1〜C6アルコキシまたはC1〜C6アルキルOHによって置換されてもよく、ここで少なくとも1つのOH基は、シクロ脂肪族環または側鎖もしくは置換基のいずれかに存在する、または
C6〜C14ヘテロアリールラジカル、式中、少なくとも1つのN原子がヘテロ原子として存在し、およびここでヘテロアリールラジカルにおける1または2以上のH原子が、互いに独立して、ヒドロキシル基、C1〜C6アルキル、C5〜C10アリール、C1〜C6アルコキシまたはC1〜C6アルキルOHによって置換されてもよく、ここで少なくとも1つのOH基はヘテロアリールラジカルまたは側鎖もしくは置換基のいずれかに存在する。
ポリマーの重量に関する親水性置換されたアルキルビニルエーテルの割合は、アルキルビニルエーテルがホモ重合しない場合、二官能性架橋剤に基づき、典型的には、1(重量)%〜90(重量)%であるか、または、2:1のモル比に相当するアルキルビニルエーテルの最大重量割合である。親水性置換されたアルキルビニルエーテルの割合は、好ましくは10〜80%(重量%)、特に好ましくは35〜60%である。したがって、架橋剤の割合は、10〜99(重量%)、好ましくは20〜90%、特に好ましくは40〜65%である。
別の態様において、ポリマーは、25〜250μm、最も好ましくは30〜90μmの平均粒径直径を有する粒子の形態である。
ポリマーは、アニオン交換基を含むリガンドを有する。
好ましい態様において、ポリマーは、グラフト重合によってポリマーに付加された構造によって誘導体化されている。
好ましい態様において、ポリマーは、セリウム(IV)触媒反応でのグラフト重合によって、好ましくはUS5453186の第9頁の例8によって、ポリマーに付加された構造によって誘導体化され、ここで好ましくは荷電した基は、正に荷電したトリメチルアンモニウムアルキル基である。
リガンドは、クロマトグラフィーの分野において当業者に知られている。リガンドは、基礎材料の合成間においてできるだけ早く、または基礎材料の合成に次いで、支持材料へ導入することができる置換基であり、支持材料の表面特性に影響を及ぼす。特に、支持材料のリガンドによる標的化された誘導体化は、所定のクロマトグラフィー特性を有する支持材料を製造する。特に、本発明において使用されるリガンドは、以下の末端基:
イオン性またはイオン化可能な基、例えば
−NR7R8または−NR7R8R9、
式中
R7およびR8、互いに独立して、
H、1〜5個のC原子を有するアルキル、
および
R9は、1〜5個のC原子を有するアルキル、
ただし、X=−NR7R8R9である場合、R7およびR8はHになり得ない、
−グアニジニウム、
を有することができる。
グラフトポリマーの製造のための好適なモノマーおよびグラフティング手順についてのさらなる詳細は、例えば、WO 2007/014591、EP 0337 144、とりわけ第12頁、例8およびUS 5453186の第9頁の例8に開示されている。
好ましいイオン性基は、正に荷電したトリメチルアンモニウムエチル基である。
マトリクスは、アニオン交換基に加えて疎水性または親水性基のような追加の他の官能基を有してもよいが、あらゆる場合において、それはアニオン交換基を有する。
試料は、好ましくは、免疫グロブリンG、好ましくはIgGの75〜99重量%を含む予備精製された血漿試料である。試料は、好ましくは、免疫グロブリンGの少なくとも80重量%、より好ましくは少なくとも85重量%、とりわけ好ましくは90重量%より大きい、最も好ましくは92〜98重量%を含む。「重量%」は、この場合、乾燥血漿試料の質量に関する。
洗浄は、任意に塩、例えばNaClを有する、酢酸バッファーのような適度に酸性のpH4.0〜5.5のバッファーによって行うことができる。バッファーは、典型的には、200〜1000mM/lの濃度を有する。
平衡は、pH4〜7.4の平衡バッファーで行われる。好ましくは、平衡バッファーのpHは、試料のpHと同一である。平衡バッファーの濃度は、典型的には0.005〜2Mol/lの範囲、好ましくは0.005〜0.05Mol/lの範囲である。
平衡バッファーでマトリクスを洗浄および/または平衡化する前に、10より大きい、好ましくはおよそ14のpHを有する基礎の水溶液でマトリクスを処理することができる。かかる処理は当業者に知られている。マトリクスから潜在的な不純物を除去することが好適である。好適な液体は、ナトリウムヒドロキシド水溶液またはカリウムヒドロキシド水溶液である。基礎の水溶液は、平衡バッファーで、または酢酸バッファーのように微酸性の水性洗浄バッファーで、好ましくは、例えば、200〜1000mM/lの酢酸濃度で、直接的にマトリクスから除去することができる。
バッファーは、典型的には、5〜500mmol/l、好ましくは5〜100mmol/l、最も好ましくは5〜50mmol/lの濃度において使用される。
試料フィードにおけるIgG濃度は、典型的には1〜50g/lに調節される。
マトリクスにロードされる試料の量は、広範囲において可変である。
フロースルーモードにおいて行われる本発明の方法は、IgA、IgM、アルブミンおよび第XIa因子のようなセリンプロテアーゼのような不純物から免疫グロブリンGを標的分子として分離することにとりわけ好適である。
本発明の方法は、単独の分離精製ステップとして使用できるが、好ましくは本発明の方法の前または後で行われる他の精製ステップと組み合わせることもまたできる。
本発明の方法は、既知の方法の1または2以上の精製ステップを置換するために良好に適用することができる。
アニオンクロマトグラフィー後、精製されたIgGは典型的にはナノ濾過され、配合される。
予想外なことに、クロマトグラフィーマトリクスの所定の種類の使用が、簡単なフロースルーイオン交換クロマトグラフィーで>95%の収量で極めて効果的にIgGのような標的分子を精製する可能性を提供するだけでなく、25mg/Lより低いIgA、25mg/Lより低いIgM、アルブミン(検出限界より低い)および第XIa因子(検出限界より低い)からのIgGの分離を保証することも見出されている。これらの物質からのIgGの極めて良好な分離は、極めて良好な純度および収量で1または2以上のそれらの物質をさらに単離するためにさらに使用することができる。
本明細書中に引用されたすべての出願、特許、および刊行物の全開示、ならびに2014年8月15日に出願されたEP 14002852.3に相当するものは、本明細書中に引用によって組み込まれる。
例1 IgGの精製
クロマトグラフィーマトリクス(Eshmuno(登録商標)QPX Hicap、Merck KGaA)は、500mM酢酸バッファー(pH6.5)で平衡化され、次いで25mM酢酸バッファー(pH6.5)で処理される。試料は、以下の不純物:25mM酢酸バッファー(pH6.5)中のIgA(1000mg/l)およびIgM(500mg/l)および第XIa因子(50pM/l)を有する、15g/lのIgGを含む溶液である。
一般的な手順:
フィード組成物:pH6.5の25mM酢酸バッファー中の20g/lのIgGおよび1g/lのIgAおよび1g/lのIgM。
予備平衡:pH6.5の500mM酢酸バッファー
平衡:pH6.5の25mM酢酸バッファー
ローディング/溶出:pH6.5の25mM酢酸バッファー
流速:>130cm/h
ローディング:5g/L(IgMおよびIgAの合計)
洗浄:pH4.5の250mM酢酸バッファー
Claims (14)
- 標的分子を血漿試料から精製する方法であって、
a)標的分子を含む血漿試料を提供すること
b)600〜1200μmol/gのアニオン基を有するポリビニルエーテルマトリクス上のイオン交換クロマトグラフィーに前記血漿試料を供し、それによって精製された標的分子がマトリクスから溶出されること
による前記方法。 - マトリクスが群a)からの少なくとも1つの化合物と群b)からの少なくとも1つの化合物との共重合によって得ることができるコポリマーであることを特徴とし、
a)が式I
およびR4は少なくとも1つのヒドロキシル基を有するラジカルである、
で表される、少なくとも1つの親水性置換されたアルキルビニルエーテルであり、
および
b)が式IIおよび/またはIIIおよび/またはIVに従う少なくとも1つの架橋剤であり、
C1〜C10アルキルまたはシクロアルキルであり、ここで1または2以上の隣接していないメチレン基、またはNのすぐ近傍に位置していないメチレン基は、O、C=O、S、S=O、SO2、NH、NOHまたはNによって置き換えてもよく、およびメチレン基の1または2以上のHは、互いに独立して、ヒドロキシル基、C1〜C6アルキル、ハロゲン、NH2、C5〜C10アリール、NH(C1〜C8)アルキル、N(C1〜C8)アルキル2、C1〜C6アルコキシまたはC1〜C6アルキル−OHによって置換されてもよい、
または、C6〜C18アリールであり、ここでアリールシステムにおける1または2以上のHは、互いに独立して、ヒドロキシル基、C1〜C6アルキル、ハロゲン、NH2、NH(C1〜C8)アルキル、N(C1〜C8)アルキル2、C1〜C6アルコキシまたはC1〜C6アルキル−OHによって置換されてもよく、および
Aは、2〜5個のC原子、好ましくは2または3個のC原子を有する二価のアルキルラジカルであり、ここで1または2以上の隣接していないメチレン基またはNのすぐ近傍に位置していないメチレン基は、O、C=O、S、S=O、SO2、NH、NOHまたはNによって置き換えてもよく、およびメチレン基の1または2以上のHは、互いに独立して、ヒドロキシル基、C1〜C6アルキル、ハロゲン、NH2、C5〜C10アリール、NH(C1〜C8)アルキル、N(C1〜C8)アルキル2、C1〜C6アルコキシまたはC1〜C6アルキル−OHによって置換されてもよい、
請求項1に記載の方法。 - マトリクスが、1,4−ブタンジオールモノビニルエーテル、1,5−ペンタンジオールモノビニルエーテル、ジエチレングリコールモノビニルエーテルまたはシクロヘキサンジメタノールモノビニルエーテルおよびジビニルエチレン尿素(1,3−ジビニルイミダゾリン−2−オン)の群から架橋剤として選択される親水性置換されたアルキルビニルエーテルの共重合によって得ることができることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
- セリウム触媒グラフト重合にポリビニルエーテルマトリクスを供することによってイオン性基がマトリクスに付加されることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- ポリビニルエーテルマトリクスが、700〜1100μmol/gの正に荷電したアニオン交換基を有するグラフトポリマーを有することを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- アニオン交換基が、トリメチルアンモニウムアルキルであることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- イオン交換クロマトグラフィーが、フロースルーモードにおいて行われることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 標的分子が、免疫グロブリンであることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 標的分子が、IgA、IgM、アルブミン、および第XIa因子から分離されることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- ステップb)におけるマトリクスが、pH4〜7.4を有するバッファーで溶出されることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 試料が、試料においてリットルのマトリクス当たり25〜150gのタンパク質の量でマトリクスに適用されることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- ステップb)におけるマトリクスのローディングおよび溶出が、0.005〜1Mの酢酸を含む酢酸バッファーで行われることを特徴とする、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- マトリクスが、20〜250μmの平均粒径を有する粒子から作られることを特徴とする、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 後続ステップc)におけるマトリクスからの標的分子の溶出後、マトリクスがステップb)において使用されるバッファーのpHより低いpHを有するバッファーで溶出され、それによってIgA、IgMおよび第XIa因子がマトリクスから溶出されることを特徴とする、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
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