ES2920381T3

ES2920381T3 - Purificación de inmunoglobulinas a partir de plasma

Info

Publication number: ES2920381T3
Application number: ES15002179T
Authority: ES
Inventors: Annika Aldinger; Achim Schwaemmle; Matthias Joehnck; Dirk Mueller; Marc Mazur
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2014-08-15
Filing date: 2015-07-23
Publication date: 2022-08-03
Anticipated expiration: 2035-07-23
Also published as: CA2900249A1; KR20160021050A; EP2985076A3; CN105367650B; JP6769695B2; JP2016041688A; US20160046664A1; CA2900249C; CN105367650A; EP2985076B1; KR102446468B1; US9975920B2; EP2985076A2

Abstract

La presente invención se relaciona con la purificación de moléculas diana como las inmunoglobulinas del plasma. El uso de un cierto tipo de intercambiador de iones basado en un polivinílico reticulado da como resultado rendimientos especialmente altos de la molécula objetivo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Purificación de inmunoglobulinas a partir de plasma

La presente invención se refiere a la purificación de moléculas diana como inmunoglobulinas a partir de plasma. El uso de un determinado tipo de intercambiador iónico basado en una resina de polivinil éter hidrófilo químicamente estable da como resultado rendimientos especialmente altos de la molécula diana.

Antecedentes de la invención

La sangre humana y animal comprende muchas proteínas y enzimas, que presentan por ejemplo propiedades terapéuticas. Algunas de estas proteínas pueden encontrarse en los glóbulos rojos, mientras que otras se encuentran en disolución en plasma o suero. Tales proteínas son la diana del aislamiento específico y a gran escala con el objetivo de purificar y normalizar las proteínas para su uso como agentes terapéuticos humanos. Ejemplos de proteínas sanguíneas destacadas que se aíslan para uso terapéutico: albúmina, inmunoglobulina G, factor IX, factor VIII e inhibidor de proteinasa alfa-1. Algunas de estas proteínas se producen en la escala de varios miles de kg al año (albúmina e IgG), mientras que otras se producen solo en la escala de gramo a kilogramo al año. Sin embargo, a nivel mundial se procesan muchos millones de litros de sangre al año con el fin de aislar estas proteínas.

La sangre, el plasma sanguíneo y el suero sanguíneo son disoluciones que contienen proteínas extremadamente complicadas que comprenden muchos otros tipos de compuestos distintos de la(s) proteína(s) o enzima(s) de interés. El aislamiento de moléculas diana específicas a partir de este tipo de muestra requiere procedimientos de purificación complicados y, a menudo, de múltiples etapas.

En Andre Kiesewetter etal., “Purification of plasma proteins with Eshmuno™ tentacle resins”, Research Disclosure, Mason Publications, Hampshire, GB, vol. 557, n.° 12, 1 de septiembre de 2010, página 843, se da a conocer un método para purificar IgG a partir de plasma en el modo de flujo continuo usando cromatografía de intercambio iónico.

Un problema común con los métodos de producción actuales, especialmente de inmunoglobulina G, es la pérdida sustancial de inmunoglobulina G durante el procedimiento de purificación, que se estima que es al menos del 30% al 35% del contenido total de IgG del material de partida. Un desafío es mantener la calidad de la inactivación viral y la ausencia de impurezas que puedan causar reacciones adversas, al mismo tiempo que se aumenta el rendimiento de IgG. Con los niveles de producción actuales de IgG, lo que podrían considerarse aumentos pequeños en el rendimiento, son de hecho altamente significativos. Incluso un aumento del 2% en la eficacia generaría un aumento notable en el rendimiento y la productividad.

Como tal, existe la necesidad de métodos mejorados y más eficaces para fabricar productos de IgG.

Breve descripción de la invención

Se ha encontrado que puede usarse muy eficazmente un determinado tipo de material cromatográfico o matriz para la purificación por intercambio aniónico de moléculas diana a partir de muestras de plasma. La matriz es un polivinil éter hidrófilo que porta entre 600 y 1200 ^mol/g de grupos de intercambio aniónico. Las moléculas diana pueden obtenerse en rendimientos muy altos y purezas excelentes.

La presente invención se refiere por tanto a un método para purificar una molécula diana a partir de una muestra de plasma

a) proporcionando una muestra de plasma que comprende la molécula diana

b) sometiendo dicha muestra de plasma a una cromatografía de intercambio iónico en una matriz de polivinil éter que porta entre 600 y 1200 ^mol/g de grupos de intercambio aniónico, mediante lo cual la molécula diana purificada se eluye de la matriz,

mediante lo cual la molécula diana es una inmunoglobulina, la cromatografía de intercambio iónico se realiza en el modo de flujo continuo y la matriz en la etapa b) se eluye con un tampón que tiene un pH de entre 4 y 7,4.

En una realización preferida, la matriz es un copolímero formado mediante la copolimerización de al menos un compuesto de los grupos a) y b)

siendo a) al menos un alquil vinil éter hidrófilamente sustituido de fórmula I

donde R1, R2, R3, independientemente entre sí, son H o alquilo de C1 a C6, preferiblemente H o -CH3, y R4 es un radical que porta al menos un grupo hidroxilo y

siendo b) al menos un agente de reticulación conforme a la fórmula II y/o III y/o IV con

donde X es un radical alquilo divalente que tiene de 2 a 5 átomos de C, preferiblemente de 2 a 3 átomos de C, en el que uno o más grupos metileno que no son adyacentes y no están ubicados en proximidad directa con N pueden estar reemplazados por O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH o N y uno o más átomos de H de los grupos metileno pueden estar sustituidos, independientemente entre sí, por grupos hidroxilo, alquilo C1-C6, halógeno, NH2, arilo C5-C10, NH-alquilo (C1-C8), N-alquilo2 (C1-C8), alcoxilo C1-C6 o alquil C1-C6-OH, y

donde Y1 e Y2 en las fórmulas III y IV son, independientemente entre sí, alquilo o cicloalquilo de C1 a C10, donde uno o más grupos metileno no adyacentes o grupos metileno que no están ubicados en proximidad directa con N pueden estar reemplazados por O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH o N y uno o más H de los grupos metileno pueden estar sustituidos, independientemente entre sí, por grupos hidroxilo, alquilo C1-C6, halógeno, NH2, arilo C5-C10, NH-alquilo (C1-C8), N-alquilo2 (C1-C8), alcoxilo C1-C6 o alquil C1-C6-OH,

o arilo de C6 a C18, donde uno o más H en el sistema de arilo pueden estar sustituidos, independientemente entre sí, por grupos hidroxilo, alquilo C1-C6, halógeno, NH2, NH-alquilo (C1-C8), N-alquilo2 (C1-C8), alcoxilo C1-C6 o alquil C1-C6-OH y

A es un radical alquilo divalente que tiene de 2 a 5 átomos de C, preferiblemente de 2 a 3 átomos de C, en el que uno o más grupos metileno no adyacentes o grupos metileno que no están ubicados en proximidad directa con N pueden estar reemplazados por O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH o N y uno o más H de los grupos metileno pueden estar sustituidos, independientemente entre sí, por grupos hidroxilo, alquilo C1-C6, halógeno, NH2, arilo C5-C10, NH-alquilo (C1-C8), N-alquilo2 (C1-C8), alcoxilo C1-C6 o alquil C1-C6-OH.

R4 en la fórmula I es normalmente un radical alquilo, un radical cicloalifático o un radical arilo que porta al menos un grupo hidroxilo.

En una realización muy preferida, la matriz se forma mediante la copolimerización de un alquil vinil éter hidrófilamente sustituido empleado seleccionado del grupo de monovinil éter de 1,4-butanodiol, monovinil éter de 1,5-pentanodiol, monovinil éter de dietilenglicol o monovinil éter de ciclohexanodimetanol y diviniletilenurea (1,3-divinilimidazolin-2-ona) como agente de reticulación.

En una realización preferida, los grupos iónicos se han unido a la matriz sometiendo la matriz de polivinil éter a polimerización por injerto catalizada por cerio. Esto se realiza preferiblemente según el documento US 5453186, página 9, ejemplo 8, donde preferiblemente el grupo cargado es el grupo trimetilamonioalquilo cargado positivamente.

En una realización preferida, el grupo de intercambio iónico es un grupo trimetilamonioalquilo cargado positivamente.

En otra realización, la molécula diana se separa de IgA, IgM, albúmina, transferrina y factor Xla.

En una realización, la muestra se aplica a la matriz en una cantidad de 25 a 150 g de proteína en la muestra por litro de matriz.

En una realización preferida, la carga y la elución de la matriz en la etapa b) se realizan con un tampón acetato que comprende acetato entre 0,005 y 1 M.

En una realización, la matriz está hecha de partículas con diámetros de tamaño de partícula promedio de entre 20 y 250 |im.

Los tamaños de poro (por ejemplo, radios de poro) de la matriz se refieren a los tamaños de poro de las partículas antes de la reacción de modificación de superficie y se determinan mediante cromatografía de exclusión molecular inversa. En la bibliografía se describen procedimientos para la determinación (Journal of Chromatography A, volumen 1037, ediciones 1-2, páginas 273-282).

En una realización, los radios de poro son de entre 30 y 150 nm.

En una realización, después de la elución de la molécula diana de la matriz en la etapa b), en una etapa posterior c) la matriz se eluye con un tampón que tiene un pH por debajo del pH del tampón usado en la etapa b) mediante lo cual se eluye de la matriz un producto que contiene IgM.

En una realización, después de la elución de la molécula diana de la matriz en la etapa b), en una etapa posterior c) la matriz se trata con un tampón que tiene un pH por debajo del pH del tampón usado en la etapa b) mediante lo cual se eluyen IgA, IgM y factor XIa de la matriz.

Definiciones

Antes de describir la presente invención en detalle, ha de entenderse que esta invención no se limita a composiciones o etapas de procedimiento específicas, ya que estas pueden variar. Cabe señalar que, tal como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, la forma singular “un”, “una” y “el/la” incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “un ligando” incluye una pluralidad de ligandos y la referencia a “un anticuerpo” incluye una pluralidad de anticuerpos y similares.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la técnica a la que refiere esta invención. Los siguientes términos se definen para los fines de la invención tal como se describe en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, el término “molécula diana” se refiere a una inmunoglobulina. En el procedimiento de producción y/o purificación, la molécula diana normalmente está presente en un líquido. El líquido puede ser agua, un tampón, un disolvente no acuoso como etanol o cualquier mezcla de los mismos. Además de la molécula diana, dicho líquido puede comprender una o más impurezas. La composición del líquido puede cambiar durante la producción y/o purificación dependiendo de las etapas de procedimiento que se realicen. Después de una etapa cromatográfica, el líquido normalmente comprende otros disolventes distintos a los anteriores, debido al eluyente usado en la etapa cromatográfica. Normalmente, solo después de la última etapa de purificación, la molécula diana puede secarse para preparar la forma de dosificación final.

El término “anticuerpo” se refiere a una proteína que tiene la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. “Anticuerpo” o “IgG” se refiere además a un polipéptido codificado sustancialmente por un gen de inmunoglobulina o genes de inmunoglobulina, o fragmentos de los mismos, que se une y reconoce específicamente a un analito (antígeno). Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como la infinidad de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.

Una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) a modo de ejemplo está compuesta por dos pares de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena “ligera” (aproximadamente 25 kD) y una cadena “pesada” (aproximadamente 50-70 kD), estando estabilizadas dichas cadenas, por ejemplo, por enlaces disulfuro intercatenarios. El extremo N-terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos, responsable principalmente del reconocimiento del antígeno. Los términos cadena ligera variable (V L) y cadena pesada variable (V H) se refieren a estas cadenas ligera y pesada, respectivamente.

Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden existir en forma monomérica o polimérica, por ejemplo, anticuerpos IgM que existen en forma pentamérica y/o anticuerpos IgA que existen en forma monomérica, dimérica o multimérica. Los anticuerpos también pueden incluir anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos siempre que conserven, o se modifiquen para comprender, un dominio de unión específico de ligando. El término “fragmento” se refiere a una parte o porción de un anticuerpo o cadena de anticuerpo que comprende menos residuos de aminoácidos que un anticuerpo o cadena de anticuerpo intacto o completo. Los fragmentos pueden obtenerse mediante tratamiento químico o enzimático de un anticuerpo o cadena de anticuerpo intacto o completo. Los fragmentos también pueden obtenerse por medios recombinantes. Cuando se producen de manera recombinante, los fragmentos pueden expresarse solos o como parte de una proteína más grande denominada proteína de fusión. Los fragmentos a modo de ejemplo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fc y/o Fv. Las proteínas de fusión a modo de ejemplo incluyen proteínas de fusión Fc. Según la presente invención, las proteínas de fusión también están englobadas por el término “anticuerpo”.

En algunas realizaciones, un anticuerpo es una proteína que contiene una región Fc, por ejemplo, una inmunoglobulina. En algunas realizaciones, una proteína que contiene una región Fc es una proteína recombinante que incluye la región Fc de una inmunoglobulina fusionada con otro polipéptido o un fragmento del mismo. Los polipéptidos a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, renina; una hormona de crecimiento, incluyendo la hormona de crecimiento humana y la hormona de crecimiento bovina; factor de liberación de hormona de crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante de tiroides; lipoproteínas; a -1 -antitripsina; cadena a de insulina; cadena p de insulina; proinsulina; hormona foliculoestimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación tales como factor VIIIC, factor IX, factor tisular y factor de von Willebrand; factores anticoagulantes como proteína C; factor natriurético auricular; tensioactivo pulmonar; un activador de plasminógeno, tal como urocinasa o activador de plasminógeno de tipo tisular (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; factor de necrosis tumoral -a y -p; encefalinasa; RANTES (regulado en activación, normalmente expresado y secretado por células T); proteína inflamatoria de macrófagos humanos (MIP-1-a); una albúmina sérica tal como albúmina sérica humana; sustancia inhibidora mulleriana; cadena a de relaxina; cadena p de relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como plactamasa; ADNasa; IgE; un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA) (por ejemplo, CTLA-4); inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico tal como factor neurotrófico derivado de hueso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5 o -6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6), o un factor de crecimiento nervioso tal como NGF-P; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos tal como aFGF y pFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-p, incluyendo TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3, TGF-p4 o TGF-p5; factor de crecimiento similar a la insulina I y II (IGF-I e IGF-II); des(I-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de unión al factor de crecimiento similar a la insulina (IGF^bP); proteínas CD tales como CD3, CD4, CD8, C^d19, CD20, CD34 y CD40; eritropoyetina; factores osteoinductivos; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón tal como interferón-a, -p y -y; factores estimulantes de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, IL-I a iL-IO; superóxido dismutasa; receptores de células T; proteínas de membrana de superficie; factor acelerador de la degradación; antígeno viral tal como, por ejemplo, una parte de la envoltura del virus del SIDA; proteínas de transporte; receptores de la migración dirigida; adresinas; proteínas reguladoras; integrinas tales como CDI la, CDI Ib, CDI Ic, Cd 18, una ICAM, VLA-4 y VCAM; un antígeno asociado a tumor tal como el receptor HER2, HER3 o HER4; y fragmentos y/o variantes de cualquiera de los polipéptidos enumerados anteriormente. Además, un anticuerpo según la presente invención es cualquier proteína o polipéptido, fragmento o variante del mismo, que se une específicamente a cualquiera de los polipéptidos enumerados anteriormente.

Tal como se usa en el presente documento, y a menos que se indique lo contrario, el término “muestra” se refiere a cualquier composición o mezcla que contiene una molécula diana. Las muestras pueden derivarse de fuentes biológicas o de otro tipo. Las fuentes biológicas incluyen fuentes eucariotas como animales o seres humanos. Las muestras preferidas son muestras de sangre o plasma derivadas de mamíferos. La muestra también puede incluir diluyentes, tampones, detergentes y especies contaminantes y similares que se encuentran mezclados con la molécula diana. La muestra puede estar “parcialmente purificada” (es decir, haberse sometido a una o más etapas de purificación, tales como etapas de filtración o centrifugación) o puede obtenerse directamente de un organismo que produce la molécula diana. Una muestra de plasma es cualquier muestra que comprende plasma o partes de plasma.

El término “impureza” o “contaminante”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molécula extraña u objetable, incluyendo una macromolécula biológica tal como ADN, ARN, una o más proteínas, ácidos nucleicos, endotoxinas, lípidos de la célula huésped, impurezas de origen sintético y uno o más aditivos que pueden estar presentes en una muestra que contiene la molécula diana que está separándose de una o más de las moléculas extrañas u objetables. El término “impureza” o “contaminante”, tal como se usa en el presente documento, también puede aplicarse a determinadas inmunoglobulinas que es necesario separar de la molécula diana, como la inmunoglobulina A que provoca reacciones alérgicas en pacientes, así como la inmunoglobulina M. Además, tal impureza puede incluir cualquier reactivo que se use en una etapa del procedimiento de producción y/o purificación.

Los términos “purificar”, “separar” o “aislar”, tal como se usan indistintamente en el presente documento, se refieren al aumento del grado de pureza de una molécula diana al separarla de una composición o muestra que comprende la molécula diana y uno o más componentes, por ejemplo impurezas. Normalmente, el grado de pureza de la molécula diana aumenta eliminando (total o parcialmente) al menos una impureza de la composición.

El término “cromatografía” se refiere a cualquier tipo de técnica que separa un analito de interés (por ejemplo, una molécula diana) de otras moléculas presentes en una mezcla. Habitualmente, la molécula diana se separa de otras moléculas como resultado de las diferencias en las velocidades a las que las moléculas individuales de la mezcla migran a través de un medio estacionario o matriz bajo la influencia de una fase móvil, o en procedimientos de unión y elución. Ejemplos de procedimientos de separación cromatográfica son cromatografía de fase inversa, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrófoba y cromatografía de modo mixto.

Un “tampón” es una disolución que resiste cambios en el pH por la acción de sus componentes conjugados ácido-base. Diversos tampones que pueden emplearse dependiendo, por ejemplo, del pH deseado del tampón se describen en Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975)). Los ejemplos no limitativos de tampones incluyen tampones MES, MOPS, MOPSO, Tris, HEPES, fosfato, acetato, citrato, succinato y amonio, así como combinaciones de estos.

Los términos “matriz” o “matriz de cromatografía” se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a cualquier tipo de sorbente, resina o fase sólida de material particulado que en un procedimiento de separación separa una molécula diana (por ejemplo, una proteína que contiene una región Fc tal como una inmunoglobulina) de otras moléculas presentes en una mezcla. Habitualmente, la molécula diana se separa de otras moléculas como resultado de las diferencias en las velocidades a las que las moléculas individuales de la mezcla migran a través de la matriz bajo la influencia de una fase móvil, o en procedimientos de unión y elución. La matriz que consiste en partículas de resina puede colocarse en columnas o cartuchos. Normalmente, la matriz porta uno o más tipos de ligandos.

Un “ligando” es un grupo funcional que se une a la matriz de cromatografía y que determina las propiedades de unión de la matriz. Los ejemplos de “ligandos” incluyen, pero no se limitan a, grupos de intercambio iónico, grupos de interacción hidrófoba, grupos de interacción hidrófila, grupos de interacción tiófila, grupos de afinidad por metales, grupos de afinidad, grupos de bioafinidad y grupos de modo mixto (combinaciones de los mencionados anteriormente). Los ligandos preferidos que pueden usarse en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, grupos de intercambio aniónico fuerte, tales como cloruro de trimetilamonio. El término “intercambio iónico” y “cromatografía de intercambio iónico” se refiere al procedimiento cromatográfico en el que una molécula diana (por ejemplo, una proteína diana que contiene una región Fc) en una mezcla interacciona con un compuesto cargado unido (tal como por unión covalente) a una matriz de intercambio iónico de tal manera que la molécula diana interacciona de manera no específica con el compuesto cargado más o menos que las impurezas o contaminantes de soluto en la mezcla. Las impurezas en la mezcla eluyen de una columna del material de intercambio iónico más rápido o más lento que la molécula diana o se unen a o se excluyen de la resina en relación con la molécula diana. La “cromatografía de intercambio iónico” incluye específicamente cromatografía de intercambio catiónico, intercambio aniónico y de intercambio iónico de modo mixto. La cromatografía de intercambio aniónico puede unir la molécula diana (por ejemplo, una proteína diana que contiene una región Fc) seguido por elución o puede unir predominantemente las impurezas mientras la molécula diana “fluye de manera continua” de la columna. Preferiblemente, la etapa de cromatografía de intercambio aniónico se realiza en un modo de flujo continuo.

La expresión “matriz de intercambio iónico” se refiere a una matriz de cromatografía que está cargada negativamente (es decir, una resina de intercambio catiónico) o cargada positivamente (es decir, una resina de intercambio aniónico). La carga puede proporcionarse uniendo uno o más ligandos cargados a la matriz, por ejemplo mediante unión covalente. Alternativamente, o además, la carga puede ser una propiedad inherente de la matriz.

El término “matriz de intercambio aniónico” se usa en el presente documento para referirse a una matriz de cromatografía que está cargada positivamente, por ejemplo que tiene uno o más ligandos cargados positivamente, tales como grupos amino cuaternarios, unidos a la misma.

Cuando se “carga” una columna de separación en modo de unión y elución, se usa un tampón para cargar la muestra o composición que comprende la molécula diana (por ejemplo, una proteína diana que contiene una región Fc) y una o más impurezas en una columna de cromatografía (por ejemplo, una columna de intercambio iónico). El tampón tiene una conductividad y/o pH tal que la molécula diana se une a la matriz de cromatografía mientras que, idealmente, ninguna de las impurezas se une y fluyen de manera continua de la columna.

Cuando se “carga” una columna de separación para que “fluya de manera continua” una molécula diana, se usa un tampón para cargar la muestra o composición que comprende la molécula diana (por ejemplo, una proteína diana que contiene una región Fc) y una o más impurezas sobre una columna de cromatografía (por ejemplo, una columna de intercambio iónico). El tampón tiene una conductividad y/o pH tal que la molécula diana no se une a la matriz de cromatografía y fluye de manera continua de la columna, mientras que, idealmente, todas las impurezas se unen a la columna.

Normalmente, el tampón en el que se carga la muestra en la matriz se denomina tampón de carga o tampón de muestra.

El término “equilibrar” se refiere al uso de un tampón para equilibrar la matriz de cromatografía antes de cargar la molécula diana. Normalmente, el tampón de carga se usa para equilibrar.

Por “lavar” o “lavado de” una matriz de cromatografía quiere decirse hacer pasar un líquido apropiado, por ejemplo un tampón, a través de o sobre la matriz. Normalmente, el lavado se usa para retirar los contaminantes débilmente unidos de la matriz antes de eluir la molécula diana y/o para retirar la molécula diana no unida o débilmente unida después de la carga.

En este caso, normalmente, el tampón de lavado y el tampón de carga son el mismo. En caso de que se use tampón de inactivación de virus, se usa para inactivar determinados virus presentes antes de eluir la molécula diana. En este caso, normalmente el tampón de inactivación de virus difiere del tampón de carga, ya que puede contener detergente/detergentes o tener propiedades diferentes (pH/conductividad/sales y sus cantidades).

El lavado también puede usarse para retirar contaminantes de la matriz después de la elución de la molécula diana. Esto se realiza haciendo pasar un líquido apropiado, por ejemplo un tampón, a través o sobre la matriz después de la elución de la molécula diana. En este caso, normalmente, el tampón de lavado difiere del tampón de carga. Puede contener detergente/detergentes o tener propiedades diferentes (pH/conductividad/sales y sus cantidades). El tampón de lavado es, por ejemplo, un tampón ácido.

“Eluir” una molécula (por ejemplo, un polipéptido de interés como inmunoglobulina G o una impureza) de una matriz de cromatografía significa retirar la molécula de la misma. La elución puede tener lugar directamente en el modo de flujo continuo cuando la molécula diana se eluye con el frente del disolvente del tampón de carga o alterando las condiciones de disolución de modo que un tampón diferente del tampón de carga compita con la molécula de interés por los sitios de ligando en el resina de cromatografía. Un ejemplo no limitativo es eluir una molécula de una resina de intercambio iónico alterando la fuerza iónica del tampón que rodea el material de intercambio iónico, de manera que el tampón compita con la molécula por los sitios cargados en el material de intercambio iónico.

El término “diámetro de tamaño de partícula promedio” o d50 significa el valor de distribución de tamaño de partícula promedio al 50% de la distribución acumulada de tamaño de partícula. El tamaño de partícula se determina por difracción láser, preferiblemente con el dispositivo “Master Sizer” de Malvern.

El término “tamaño de poro promedio” significa el valor de distribución de tamaño de poro promedio al 50% de la distribución acumulada de tamaño de poro.

Los términos “procedimiento de flujo continuo”, “modo de flujo continuo” y “operación de flujo continuo”, tal como se usan indistintamente en el presente documento, se refieren a una técnica de separación en la que se pretende que al menos una molécula diana (por ejemplo, un anticuerpo o una proteína que contiene una región Fc) contenida en una muestra junto con una o más impurezas fluya a través de una matriz de cromatografía, a la que habitualmente se une la una o más impurezas, donde la molécula diana habitualmente no se une (es decir, fluye de manera continua) y se eluye de la matriz con el tampón de carga.

Los términos “modo de unión y elución” y “procedimiento de unión y elución”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a una técnica de separación en la que al menos una molécula diana contenida en una muestra (por ejemplo, una proteína que contiene una región Fc) se une a una matriz de cromatografía adecuada (por ejemplo, un medio de cromatografía de intercambio iónico) y posteriormente se eluye con un tampón diferente del tampón de carga.

Descripción detallada de la invención

El material de partida del presente procedimiento de purificación puede ser cualquier muestra que comprenda la molécula diana que va a purificarse. Normalmente, la muestra se obtiene o se ha obtenido a partir de sangre o plasma. Ventajosamente, es una fracción de proteína plasmática que contiene inmunoglobulina. El material de partida para esto puede ser plasma humano normal o puede originarse de donantes con altos títulos de anticuerpos específicos, por ejemplo, plasma hiperinmune.

Según el método de la presente invención, tal muestra que comprende la molécula diana se somete al menos a una etapa de purificación en la que la muestra se carga sobre una matriz de cromatografía que comprende funcionalidades de intercambio aniónico.

Se ha encontrado que el uso de un determinado tipo de matriz de cromatografía según la presente invención da como resultado rendimientos especialmente más altos del 5-10% combinados con una mayor pureza de la molécula diana en comparación con, por ejemplo, intercambiadores aniónicos fuertes basados en copolímeros de metacrilato como Macro-Prep® High Q o intercambiadores aniónicos basados en Sepharose como Q Sepharose FF. Por ejemplo, en comparación con Q Sepharose FF, la pureza expresada como la suma de IgA e IgM en la fracción diana de IgG normalmente es 5 veces mayor, en comparación con Macro-Prep® High Q, el rendimiento de la proteína diana IgG es normalmente un 7,7% más alto, véase la tabla 1 como referencia.

Este notable efecto se logra mediante el uso de una matriz de polivinil éter hidrófilo que porta entre 600 y 1200 ^mol/g de grupos de intercambio aniónico. La matriz que va a usarse se basa preferiblemente en un polímero reticulado hidrófilo a base de un copolímero que comprende al menos

a) al menos un alquil vinil éter hidrófilamente sustituido de fórmula I

b) al menos un agente de reticulación conforme a la fórmula II y/o III y/o IV con

donde Y1 e Y2 en las fórmulas III y IV son, independientemente entre sí,

alquilo o cicloalquilo de C1 a C10, donde uno o más grupos metileno no adyacentes o grupos metileno que no están ubicados en proximidad directa con N pueden estar reemplazados por O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH o N y uno o más H de los grupos metileno pueden estar sustituidos, independientemente entre sí, por grupos hidroxilo, alquilo C1-C6, halógeno, NH2, arilo C5-C10, NH-alquilo (C1-C8), N-alquilo2 (C1-C8), alcoxilo C1-C6 o alquil C1-C6-OH, o arilo de C6 a C18, donde uno o más H en el sistema de arilo pueden estar sustituidos, independientemente entre sí, por grupos hidroxilo, alquilo C1-C6, halógeno, NH2, NH-alquilo (C1-C8), N-alquilo2 (C1-C8), alcoxilo C1-C6 o alquil C1-C6-OH y

Esto significa que el polímero se forma mediante la copolimerización de al menos un compuesto del grupo de los alquil vinil éteres hidrófilamente sustituidos de fórmula I y al menos un compuesto del grupo de los agentes de reticulación de fórmula II y/o III y/o IV. Preferiblemente, solo se emplea un compuesto del grupo de los alquil vinil éter hidrófilamente sustituidos de fórmula I y un compuesto del grupo de los agentes de reticulación de fórmula II, III o IV.

En una realización preferida, R4 en la fórmula I es

un radical alquilo de C1 a C10 de cadena lineal o ramificado, en el que uno o más grupos metileno no adyacentes pueden estar reemplazados por O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH, N y/o en el que uno o más átomos de H pueden estar sustituidos, independientemente entre sí, por alquilo C1-C6, arilo C5-C10, halógeno, NH2, NH-alquilo (C1-C8), N-alquilo2 (C1-C8), alcoxilo C1-C6 o alquil C1-C6-OH y en el que está presente al menos un grupo OH o bien en el radical alquilo de C1 a C10 o bien en un sustituyente,

o un radical cicloalifático, que tiene normalmente de 5 a 10 átomos de C, en el que uno o más grupos metileno no adyacentes pueden estar reemplazados por O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH, N y/o en el que uno o más átomos de H del radical cicloalifático pueden estar sustituidos, independientemente entre sí, por alquilo C1-C6, arilo C5-C10, halógeno, NH2, NH-alquilo (C1-C8), N-alquilo2 (C1-C8), alcoxilo C1-C6 o alquil C1-C6-OH, donde está presente al menos un grupo OH o bien en el anillo cicloalifático o bien en una cadena lateral o sustituyente, o un

radical arilo de C6 a C18, donde uno o más átomos de H en el radical arilo pueden estar sustituidos, independientemente entre sí, por grupos hidroxilo, alquilo C1-C6, arilo C5-C10, halógeno, NH2, NH-alquilo (C1-C8), N-alquilo2 (C1-C8), alcoxilo C1-C6 o alquil C1-C6-OH, donde está presente al menos un grupo OH o bien en el radical arilo o bien en una cadena lateral o sustituyente, o un

radical heteroarilo de C5 a C18, donde uno o más átomos de H en el radical heteroarilo pueden estar sustituidos, independientemente entre sí, por grupos hidroxilo, alquilo C1-C6, arilo C5-C10, halógeno, NH2, NH-alquilo (C1-C8), N-alquilo2 (C1-C8), alcoxilo C1-C6 o alquil C1-C6-OH, donde está presente al menos un grupo OH o bien en el radical heteroarilo o bien en una cadena lateral o sustituyente.

En una realización particularmente preferida, R4 en la fórmula I es

un radical alquilo de C1 a C10 de cadena lineal o ramificado, en el que uno o más grupos metileno no adyacentes pueden estar reemplazados por O, S, SO2 o NH y/o en el que uno o más átomos de H pueden estar sustituidos, independientemente entre sí, por alquilo C1-C6, arilo C5-C10, alcoxilo C1-C6 o alquil C1-C6-OH y en el que está presente al menos un grupo OH o bien en el radical alquilo de C1 a C10 o bien en un sustituyente,

o un radical cicloalifático, que tiene normalmente de 5 a 10 átomos de C, en el que uno o más grupos metileno no adyacentes pueden estar reemplazados por O, S, SO2 o NH y/o en el que uno o más átomos de H del radical cicloalifático pueden estar sustituidos, independientemente entre sí, por alquilo C1-C6, arilo C5-C10, alcoxilo C1-C6 o alquil C1-C6-OH, donde está presente al menos un grupo OH o bien en el anillo cicloalifático o bien en una cadena lateral o sustituyente, o un

radical arilo de C6 a C14, donde uno o más átomos de H en el radical arilo pueden estar sustituidos, independientemente entre sí, por grupos hidroxilo, alquilo C1-C6, arilo C5-C10, alcoxilo C1-C6 o alquil C1-C6-OH, donde está presente al menos un grupo OH o bien en el radical arilo o bien en una cadena lateral o sustituyente, o un

radical heteroarilo de C6 a C14, en el que al menos un átomo de N está presente como heteroátomo y donde uno o más átomos de H en el radical heteroarilo pueden estar sustituidos, independientemente entre sí, por grupos hidroxilo, alquilo C1-C6, arilo C5-C10, alcoxilo C1-C6 o alquil C1-C6-OH, donde está presente al menos un grupo OH o bien en el radical heteroarilo o bien en una cadena lateral o sustituyente.

En una realización preferida, el alquil vinil éter hidrófilamente sustituido empleado es un compuesto de fórmula I en el que R4 es un radical que porta un grupo hidroxilo.

En una realización preferida, el alquil vinil éter hidrófilamente sustituido empleado es monovinil éter de 1,2-etanodiol, monovinil éter de 1,3-propanodiol, monovinil éter de 1,4-butanodiol, monovinil éter de 1,5-pentanodiol, monovinil éter de 1,6-hexanodiol o monovinil éter de dietilenglicol y el vinil éter cicloalifático empleado es monovinil éter de ciclohexanodimetanol, de manera particularmente preferible monovinil éter de 1,4-butanodiol, monovinil éter de 1,5-pentanodiol, monovinil éter de dietilenglicol o monovinil éter de ciclohexanodimetanol.

Los agentes de reticulación empleados son preferiblemente compuestos de fórmula II. Se da preferencia al uso de divinilpropilenurea (1,3-divinil-tetra-hidropirimidin-2-ona) o de manera particularmente preferible diviniletilenurea (1,3-divinilimidazolin-2-ona).

La proporción de los alquil vinil éteres hidrófilamente sustituidos con respecto al peso del polímero es normalmente de entre el 1% (en peso) y el 90% (en peso) o una proporción máxima en peso del alquil vinil éter que corresponde a una razón molar de 2:1, basándose en un agente de reticulación bifuncional, si el alquil vinil éter no se homopolimeriza. La proporción de los alquil vinil éteres hidrófilamente sustituidos es preferiblemente de entre el 10 y el 80% (% en peso), de manera particularmente preferible de entre el 35 y el 60%. Por consiguiente, la proporción del agente de reticulación es de entre el 10 y el 99 (% en peso), preferiblemente de entre el 20 y el 90%, de manera particularmente preferible de entre el 40 y el 65%.

En otra realización preferida, el polímero es poroso teniendo tamaños de poro de entre 2 y 200 nm, más preferido de entre 30 y 150 nm.

En otra realización, el polímero está en forma de partículas que tienen diámetros de tamaño de partícula promedio de entre 25 y 250 |im, lo más preferido de entre 30 y 90 |im.

El polímero porta ligandos que comprenden un grupo de intercambio aniónico.

En una realización preferida, el polímero se ha derivatizado por medio de estructuras que se han unido al polímero mediante polimerización por injerto.

En una realización preferida, el polímero se ha derivatizado por medio de estructuras que se han unido al polímero mediante polimerización por injerto con catálisis por cerio (IV), preferiblemente según el documento US5453186, página 9, ejemplo 8, donde preferiblemente el grupo cargado es el grupo trimetilamonioalquilo cargado positivamente.

Pueden encontrarse detalles adicionales sobre el material que va a usarse en el método de la presente invención y sobre su producción en el documento WO 2007/014591.

El experto en la técnica conoce los ligandos en el campo de la cromatografía. Los ligandos son sustituyentes que pueden introducirse en el material de soporte ya durante la síntesis del material de base o posteriormente y que influyen en las propiedades de superficie del material de soporte. En particular, la derivatización dirigida de los materiales de soporte por medio de ligandos produce materiales de soporte que tienen determinadas propiedades cromatográficas. En particular, los ligandos que van a usarse en la presente invención pueden tener los siguientes grupos terminales:

un grupo iónico o ionizable, por ejemplo

-NR7R8 o -NR7R8R9,

en el que

R7 y R8, independientemente entre sí,

son H, alquilo que tiene 1-5 átomos de C

y

R9 es alquilo que tiene 1-5 átomos de C

con la condición de que, si X = -NR7R8R9, R7 y R8 no pueden ser H, - guanidinio

En una realización preferida, el polímero que va a usarse como matriz en el método de la presente invención se derivatiza mediante polimerización por injerto con estructuras similares a tentáculos, que a su vez pueden portar los ligandos correspondientes o funcionalizarse mediante estos últimos. El injerto se lleva a cabo preferiblemente según el documento EP 0337 144, página 12, ejemplo 8 o el documento US 5453186, página 9, ejemplo 8 usando N-(2-trimetilamoniometil)-acrilamida. El catalizador de polimerización empleado son iones de cerio (IV), ya que este catalizador forma sitios de radicales libres en la superficie del material de base, a partir de los cuales se inicia la polimerización por injerto de los monómeros.

La polimerización se termina por reacciones de terminación que implican las sales de cerio. Por este motivo, la longitud de cadena (promedio) puede verse influida por las razones de concentración del material de base, el iniciador y los monómeros. Además, pueden emplearse monómeros uniformes o también mezclas de diferentes monómeros; en este último caso, se forman copolímeros injertados.

Los monómeros adecuados para la preparación de los polímeros de injerto y otros detalles sobre el procedimiento de injerto se dan a conocer, por ejemplo, en los documentos WO 2007/014591, EP 0337 144, especialmente en la página 12, ejemplo 8 y en el documento US 5453186, página 9, ejemplo 8.

Preferentemente, la matriz se derivatiza con grupos iónicos mediante polimerización por injerto mediante lo cual las cadenas resultantes que se injertan en la matriz polimérica de base tienen una longitud de entre 2 y 100, preferentemente 5 y 60, en particular entre 10 y 30 unidades monoméricas, portando cada unidad normalmente un grupo iónico.

Los grupos iónicos preferidos son grupos trimetilamoniometilo cargados positivamente.

La matriz puede portar otros grupos funcionales adicionales como grupos hidrófobos o hidrófilos además de los grupos de intercambio aniónico, pero en cualquier caso tiene grupos de intercambio aniónico.

La capacidad iónica de la matriz de intercambio aniónico que va a usarse en la presente invención normalmente es de entre 600 y 1200 |imol/g, preferiblemente entre 700 y 1000 |imol/g, lo más preferiblemente entre 800 y 1000 |imol/g. Los materiales adecuados que van a usarse en el método de la invención son Eshmuno® QPX y Eshmuno® QPX Hicap de Merck KGaA, Alemania. Esas resinas comprenden perlas de polivinil éter sintetizadas según el procedimiento dado a conocer en el documento WO 2007/014591, a las que se injertan estructuras poliméricas utilizando técnicas de injerto según el documento EP 0337144, página 12, ejemplo 8 y el documento US 5453186, página 9, ejemplo 8 y produciendo estructuras poliméricas superficiales que portan grupos trimetilamoniometilo cargados positivamente, donde la densidad de carga en el caso de las resinas Eshmuno QPX y Eshmuno QPX Hicap se ajusta a de 600 a 1200 |imol/g.

Para realizar el método de la presente invención, la muestra se somete a una cromatografía de intercambio aniónico, mediante lo cual la matriz de cromatografía es un polivinil éter hidrófilo funcionalizado con grupos de intercambio aniónico tal como se describió anteriormente.

La muestra es preferiblemente una muestra de plasma purificada previamente que comprende inmunoglobulina G, preferiblemente del 75 al 99% en peso de IgG. Las muestras comprenden preferiblemente al menos el 80% en peso, más preferido al menos el 85% en peso, especialmente preferido más del 90% en peso, lo más preferido entre el 92 y el 98% en peso de inmunoglobulina G. El “% en peso” se refiere en este caso a la masa de la muestra de plasma seca.

Antes de aplicar la muestra a la matriz, la matriz puede lavarse y/o equilibrarse.

El lavado puede realizarse con un tampón moderadamente ácido de pH 4,0-5,5 como el tampón acetato, opcionalmente con sal, por ejemplo NaCl. El tampón normalmente tiene una concentración de entre 200 y 1000 mM/l.

El equilibrado se realiza con un tampón de equilibrado con un pH de entre 4 y 7,4. Preferiblemente, el pH del tampón de equilibrado es el mismo que el pH de la muestra. La concentración del tampón de equilibrado está normalmente en el intervalo de 0,005 a 2 Mol/l, preferiblemente en el intervalo de 0,005 a 0,05 Mol/l.

El tampón de equilibrado normalmente es idéntico al tampón de muestra.

Antes de lavar y/o equilibrar la matriz con el tampón de equilibrado, es posible tratar la matriz con un líquido acuoso básico que tiene un pH de más de 10, preferiblemente de alrededor de 14. Un experto en la técnica conoce un tratamiento de este tipo. Es adecuado para retirar posibles impurezas de la matriz. Los líquidos adecuados son hidróxido de sodio acuoso o hidróxido de potasio acuoso. El líquido acuoso básico puede retirarse de la matriz directamente con el tampón de equilibrado o con un tampón de lavado acuoso ligeramente ácido como el tampón ácido acético, preferiblemente en, por ejemplo, una concentración de acetato de entre 200 y 1000 mM/l.

La muestra normalmente se aplica a la matriz de cromatografía en un tampón (también denominado tampón de carga o tampón de muestra). El tampón tiene preferentemente un pH de entre 4,0 y 7,4. Los tampones adecuados son tampón ácido carbónico/silicato, tampones ácido acético, tampones citrato, tampones fosfato, tampones glicina y/o tampones ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES). El más preferido es un tampón acetato.

Los tampones normalmente se usan en concentraciones de entre 5 y 500 mmol/l, preferiblemente entre 5 y 100 mmol/l, lo más preferido entre 5 y 50 mmol/l.

La concentración de IgG en la alimentación de muestra normalmente se ajusta a entre 1 y 50 g/l.

La cantidad de muestra que va a cargarse en la matriz es variable en un amplio intervalo.

La matriz puede cargarse con cantidades muy pequeñas de la muestra, como por ejemplo 10 g de muestra por 1 litro de volumen de matriz. También es posible cargar hasta 150 g de muestra por litro de volumen de matriz. Preferiblemente, se cargan más de 25 g/l de volumen de matriz, lo más preferido entre 25 y 100 g/l.

La purificación cromatográfica de la muestra se realiza en modo de flujo continuo. En el modo de flujo continuo, la molécula diana esencialmente no se une ni se adsorbe a la matriz. Eso significa que la molécula diana se mueve a través de la matriz esencialmente con el frente de disolvente, es decir, el frente del tampón de carga, y se recupera de la matriz esencialmente junto con el frente de disolvente. Se ha encontrado que, cuando se usa la matriz según la presente invención en el modo de flujo continuo, la molécula diana puede eluirse normalmente de la matriz con un volumen de cinco veces, preferiblemente tres veces, de manera muy preferida dos veces, de eluyente con respecto al volumen de la matriz. El eluyente es en este caso idéntico al tampón de carga. Las impurezas quedan retenidas en la matriz. Con el modo de flujo continuo, al menos el 80%, preferiblemente más del 90%, lo más preferido más del 95% de la molécula diana puede recuperarse de la matriz.

Se ha encontrado además que la unión de las impurezas a la matriz es muy estable siempre que la matriz se eluya con el tampón de carga. Esto ofrece la posibilidad de aumentar también el volumen del tampón de carga usado para la elución de la molécula diana a más de 5 veces el volumen de la matriz, si es necesario, de modo que la molécula diana pueda eluirse casi por completo (aproximadamente el 97% de rendimiento) mientras que su pureza sigue siendo muy alta (normalmente >99,5%).

El método de la presente invención realizado en el modo de flujo continuo es especialmente adecuado para separar la inmunoglobulina G como molécula diana de impurezas como IgA, IgM, albúmina y serina proteasas como el factor Xla.

Pero también es adecuado para el aislamiento de un producto que contiene IgM o para el aislamiento de IgA, IgM y/o factor Xla. Se ha encontrado que, cuando se realiza la purificación cromatográfica en el modo de flujo continuo, la inmunoglobulina G se eluye esencialmente con el frente de disolvente. Después de la elución de IgG, el tampón de elución (que para la elución de IgG es idéntico al tampón de carga) puede cambiarse para soportar la elución de otras moléculas diana secundarias como IgA, IgM y factor Xla. Por ejemplo, las moléculas diana secundarias pueden ser una mezcla de IgA e IgM. Para ello, normalmente se aumenta la acidez del tampón de elución. Preferiblemente, el tampón de elución para esta aplicación tiene un pH de entre 4 y 5,5, mediante lo cual el pH es en cualquier caso inferior al pH del tampón de carga. Normalmente, el pH del tampón usado para eluir IgA, IgM y/o factor Xla es de entre 0,5 y 2 unidades de pH por debajo del pH del tampón de carga.

Por consiguiente, el método de la presente invención no solo permite purificar una molécula diana, como por ejemplo IgG, sino también dos o más moléculas diana, como IgG así como IgA, IgM y/o factor Xia, por ejemplo IgG así como una mezcla de IgA e IgM.

El método de la presente invención puede usarse como una sola etapa de purificación independiente, pero también puede combinarse preferiblemente con otras etapas de purificación que se realizan antes o después del método de la invención.

La molécula diana preferida que va a purificarse con el método de la invención es IgG. Los procedimientos conocidos para la purificación de IgG normalmente comprenden varias etapas que incluyen etapas de precipitación, filtración y cromatográficas. Tales métodos se dan a conocer, por ejemplo, en “Production of Plasma Proteins for Therapeutic Use”, editado por J. Bertolini, N. Goss, J. Curling; John Wiley and sons Inc., 2013. Véase, por ejemplo, el capítulo 13.

El método de la presente invención puede aplicarse favorablemente para sustituir una o más de las etapas de purificación de los métodos conocidos.

Preferiblemente, la muestra de plasma en bruto se somete en primer lugar a una etapa de precipitación en la que una proporción importante de proteínas distintas de IgG, especialmente las de mayor peso molecular, las inmunoglobulinas agregadas y otras proteínas agregadas, así como partículas potencialmente infecciosas, precipitan sin una precipitación sustancial de IgG monomérica. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante precipitación con etanol que produce productos intermedios enriquecidos en IgG denominados fracción I+II+III o fracción iI+III o fracción II. Después de las etapas de precipitación con ácido y filtración, puede obtenerse la alimentación para la cromatografía de intercambio aniónico.

También es posible realizar etapas cromatográficas adicionales.

Después de la cromatografía aniónica, la IgG purificada normalmente se somete a nanofiltración y se formula.

Inesperadamente, se ha encontrado que el uso de determinado tipo de matriz cromatográfica no solo ofrece la posibilidad de purificar moléculas diana como IgG de manera muy eficaz con rendimientos > 95% mediante cromatografía de intercambio iónico de flujo continuo, sino que también garantiza la separación de IgG de IgA por debajo de 25 mg/l, IgM por debajo de 25 mg/l, albúmina (por debajo del límite de detección) y factor Xla (por debajo del límite de detección). La muy buena separación de IgG de estas sustancias puede usarse además para aislar adicionalmente una o más de esas sustancias también con muy buena pureza y rendimiento.

La pureza y el rendimiento que pueden lograrse con la matriz cromatográfica que va a usarse según la presente invención son mejores en comparación con etapas de intercambio aniónico equivalentes en diferentes matrices. Mientras que los procedimientos conocidos a menudo combinan una etapa de purificación por intercambio aniónico con una etapa de pulido por intercambio catiónico sucesiva, tal etapa de pulido normalmente no es necesaria cuando la purificación por intercambio aniónico se realiza según la presente invención.

Las divulgaciones completas de todas las solicitudes, patentes y publicaciones citadas anteriormente y a continuación, así como el documento correspondiente EP 14002852.3, presentado el 15 de agosto de 2014, se incorporan al presente documento como referencia.

Ejemplos

Ejemplo 1 - purificación de IgG

La matriz cromatográfica (Eshmuno® QPX Hicap, Merck KGaA) se equilibra con tampón acetato 500 mM (pH 6,5) y posteriormente se trata con tampón acetato 25 mM (pH 6,5). La muestra es una disolución que contiene IgG 15 g/l con las siguientes impurezas: IgA (1000 mg/l) e IgM (500 mg/l) y factor XIa (50 pM/l) en tampón acetato 25 mM (pH 6,5).

La muestra se aplica a la matriz equivalente a una carga de proteína de 75 g/l de la matriz a 130 cm/h. Entonces se eluye la matriz con tampón acetato 25 mM, pH 6,5, hasta que la IgG se eluye completamente de la matriz. La IgG se recupera con un rendimiento de más del 95%, por lo que la IgG purificada comprende menos de 25 mg/l de IgM e IgA. La cantidad de factor XIa puede reducirse hasta 0,0 pM. Pueden obtenerse además IgM e IgA de la matriz con una pureza de más del 95% y con un rendimiento de más del 95% mediante elución con un tampón ácido (tampón acetato 300 mM, pH 4,5). Todas las etapas se realizan a una velocidad lineal de 130 cm/h.

Ejemplo 2 - purificación de IgG en diversas matrices

Procedimiento general:

Composición de alimentación: IgG 20 g/l e IgA 1 g/l e IgM 1 g/l en acetato 25 mM, pH 6,5.

Pre-Equilibrado: tampón acetato 500 mM, pH 6,5

Equilibrado: tampón acetato 25 mM, pH 6,5

Carga/elución: tampón acetato 25 mM, pH 6,5

Velocidad de flujo: > 130 cm/h

Carga: 5 g/l (suma de IgM e IgA)

Lavado: tampón acetato 250 mM, pH 4,5

La tabla 1 muestra los datos de rendimiento, pureza (concentración de impurezas) y recuperación.

Tabla 1

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para purificar una molécula diana a partir de una muestra de plasma

a) proporcionando una muestra de plasma que comprende la molécula diana

b) sometiendo dicha muestra de plasma a una cromatografía de intercambio iónico en una matriz de polivinil éter que porta entre 600 y 1200 ^mol/g de grupos de intercambio aniónico, mediante lo cual la molécula diana purificada se eluye de la matriz, caracterizado porque la molécula diana es una inmunoglobulina, la cromatografía de intercambio iónico se realiza en el modo de flujo continuo y la matriz en la etapa b) se eluye con un tampón que tiene un pH de entre 4 y 7,4.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la matriz es un copolímero que puede obtenerse mediante la copolimerización de al menos un compuesto del grupo a) y un compuesto del grupo b)

donde R1, R2, R3, independientemente entre sí, son H o alquilo de C1 a C6, preferiblemente H o-CH3,

y R4 es un radical que porta al menos un grupo hidroxilo

y

donde Y1 e Y2 en las fórmulas III y IV son, independientemente entre sí,

alquilo o cicloalquilo de C1 a C10, donde uno o más grupos metileno no adyacentes o grupos metileno que no están ubicados en proximidad directa con N pueden estar reemplazados por O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH o N y uno o más H de los grupos metileno pueden estar sustituidos, independientemente entre sí, por grupos hidroxilo, alquilo C1-C6, halógeno, NH2, arilo C5-C10, NH-alquilo (C1-C8), N-alquilo2 (C1-C8), alcoxilo C1-C6 o alquil C1-C6-OH,

3. Método según las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque la matriz puede obtenerse mediante la copolimerización de un alquil vinil éter hidrófilamente sustituido seleccionado del grupo de monovinil éter de 1,4-butanodiol, monovinil éter de 1,5-pentanodiol, monovinil éter de dietilenglicol o monovinil éter de ciclohexanodimetanol y diviniletilenurea (1,3-divinilimidazolin-2-ona) como agente de reticulación.

4. Método según una o más de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los grupos iónicos se han unido a la matriz sometiendo la matriz de polivinil éter a polimerización por injerto catalizada por cerio.

5. Método según una o más de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la matriz de polivinil éter porta polímeros de injerto con de 700 a 1100 |imol/g de grupos de intercambio aniónico cargados positivamente.

6. Método según una o más de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el grupo de intercambio aniónico es trimetilamonioalquilo.

7. Método según una o más de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la molécula diana se separa de IgA, IgM, albúmina y factor Xla.

8. Método según una o más de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la muestra se aplica a la matriz en una cantidad de 25 a 150 g de proteína en la muestra por litro de matriz.

9. Método según una o más de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la carga y la elución de la matriz en la etapa b) se realizan con un tampón acetato que comprende acetato entre 0,005 y 1 M.

10. Método según una o más de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la matriz está hecha de partículas con diámetros de tamaño de partícula promedio de entre 20 y 250 |im.

11. Método según una o más de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque después de la elución de la molécula diana de la matriz en una etapa posterior c) la matriz se eluye con un tampón que tiene un pH por debajo del pH del tampón usado en la etapa b) mediante lo cual se eluyen IgA, IgM y factor XIa de la matriz.